小鼠无创气管内脂多糖滴注

Summary

在这里，我们提出了通过无创口咽气管插管 输送 气管内脂多糖（LPS）的方案。这种方法最大限度地减少了动物外科手术的创伤，并准确地将LPS输送到气管，然后输送到肺部。

Abstract

由脂多糖（LPS）或内毒素诱导的急性肺损伤（ALI）小鼠模型仍然是急性肺损伤或急性炎症动物研究中最常用的模型之一。目前急性肺损伤小鼠模型中最常用的方法是腹膜内注射LPS和气管切开术用于LPS的气管输注。然而，前一种方法缺乏肺部靶向并损害其他器官，后一种方法诱发手术创伤，感染风险大，生存率低。在这里，我们推荐一种无创口咽气管插管方法在小鼠中滴注LPS。在这种方法中，LPS通过口咽腔无创地引入气管，在气管插管装置的帮助下滴入肺部。这种方法不仅可以确保肺部靶向，还可以避免动物的损伤和死亡风险。我们预计这种方法将在急性肺损伤领域得到广泛应用。

Introduction

急性肺损伤（ALI）是一种常见的临床综合征。在多种致病因素作用下，肺上皮细胞和血管内皮细胞生理屏障的破坏导致肺泡通透性增加，从而引起肺顺应性下降、肺水肿和严重低氧血症¹。急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是最严重的ALI形式。不受控制的炎症和氧化应激损伤被认为是ALI和更严重的ARDS^{的主要原因}2。当肺泡上皮细胞因创伤直接受损时，肺泡巨噬细胞的炎症反应链被激活，导致肺部炎症³。在全球范围内，每年有超过300万急性ARDS患者，约占重症监护病房入院人数的10%;此外，严重病例的死亡率高达46%^4,5,6。因此，有必要建立合适的ALI动物模型来研究其发病机制。小鼠是ALI研究中最常用的实验动物，因为它的呼吸道可以很好地模拟人类呼吸道进行ALI研究。此外，ALI 表现为大量炎性细胞浸润、肺血管通透性增加和肺水肿。血清中炎性细胞因子的变化和肺干湿重比反映了ALI⁷的程度。

目前，模拟小鼠LPS诱导的ALI的主要方法包括鼻内和手术气管插管^8,9。在这里，我们提出了一种通过无创口咽插管将LPS输送到气管中的新方法。该方法使用照明插管器找到小鼠的气管，然后将LPS输送到气管和肺部。这种方法比鼻内输送方法更准确地将LPS输送到肺部。与手术气管插管相比，该方法不需要手术，避免引起伤口，减轻小鼠疼痛¹⁰。因此，该方法可用于建立更有说服力的ALI小鼠模型。

Protocol

动物实验方案经成都中医药大学管委会审核通过（备案号：2021-11）。雄性C57 / BL小鼠（20-25g，6-8周龄）用于本研究。小鼠被饲养在动物室中，在实验过程中可以自由饮水和进食。

1. 准备

1. 确保插管平台由底座、立管、回形针、两根橡皮筋和一些绳子组成。取一根绳子，将绳子穿过立管顶部的两个孔，并将绳子的两端分别绑在立管顶部的小突起上。
   注意：为鼠标头部在字符串和两个孔之间留出空间。
2. 将两个橡皮筋绑在回形针的两端，并将回形针与橡皮筋粘在立管的背面。最后，将转接卡固定在底座上，角度为90°（图1）。
3. 选择适当大小和长度的套管。对于 20−30 g 小鼠，可以使用 22 G 导管（2.5−3.8 cm 长）¹¹.将套管组装到套管笔上，然后打开笔的指示灯（图2）。
4. 准备小手术钳和巴斯德移液器，用70%的酒精消毒。

2. 测试化合物的制备

1. 将 3 mg LPS 称重并溶解在 1 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS，pH 7.2） 中，形成浓度为 3 mg/mL 的 LPS 溶液。
2. 称取10mg戊巴比妥钠并溶解在1mL生理盐水中，形成1%戊巴比妥钠溶液。使用0.45μm注射器过滤器对溶液进行过滤灭菌。

3.无创口咽滴注

1. 用腹膜内注射1%戊巴比妥钠以50mg / kg的剂量麻醉小鼠^12,13。通过对扶正反射无反应来确定麻醉深度。
2. 将麻醉小鼠放在插管平台上。用线固定上门牙，用橡皮筋固定两个前脚掌（图3）。
3. 用镊子将舌头拉出，用左手握住。沿着嘴慢慢地推动套管，右手向上，到下颌会厌。使用套管笔的光找到气管，然后将其慢慢插入气管（图4）。
4. 将套管插入气管后，慢慢取出插管笔，并将套管留在里面。将巴斯德移液器插入套管接头，然后按压头部（图5）。
   注意：如果鼠标胸部凸起，则插管成功（图6）。
5. 气管插管成功后，使用平头微型注射器^14,15通过套管向小鼠滴注3mg / mL LPS，浓度为3mg / kg（图7）。
6. 完成后，取出套管和微量注射器。从支架上取下鼠标，并将其单独放入笼子中恢复。观察小鼠的呼吸状态，直到它恢复并恢复清醒。
   注意：在LPS气管滴注后12小时，按照动物伦理委员会批准的程序对小鼠实施安乐死。使用标准程序进行血清TNF-α测定和干湿肺重测量。

Representative Results

通过评估LPS滴注后12 h炎症细胞因子TNF-α的表达和肺干湿重比，验证了所提出的LPS滴注小鼠方法。实验中有四组：空白对照（无任何治疗），手术插管¹⁶，鼻内^17,18和无创口咽插管（n = 6）。与空白对照组相比，无创口咽插管组血清TNF-α水平显著升高（图8A）。肺干湿重量比也增加（图8B），达到与手术气管插管组相同的水平。使用未配对方差分析和事后多重比较Tukey Kramer检验对数据集进行统计分析。所有数据均以平均±SEM表示，p < 0.05的水平被认为具有统计学意义。

图 1：插管平台配件和组件。 该平台由底座、立管、回形针、两根橡皮筋和一些绳子组成。 请点击此处查看此图的大图。

图 2：插管套件。 该图显示了插管套件及其组件。这包括笔灯、光纤和套管。 请点击此处查看此图的大图。

图3：鼠标固定。 请点击此处查看此图的大图。

图 4：定位气管。 请点击此处查看此图的大图。

图 5：巴斯德移液器泵验证。 请点击此处查看此图的大图。

图 6：显示插管成功的胸部前后图像 。 （A）插管前的胸部。（二）插管后胸部;显示胸部凸起的区域用红色圆圈标记。 请点击此处查看此图的大图。

图 7：用于输送 LPS 的平头微量进样器。 请点击此处查看此图的大图。

图8：评估无创LPS滴注的有效性 。 （A）气管内注射LPS后12小时C57BL / 6小鼠血清中TNF-α的表达。（二）肺组织干湿重量比数据分析。 请点击此处查看此图的大图。

Discussion

最初，我们查看口腔内部以找到气管^{的位置 19}.然而，在此过程中，我们发现C57 / BL小鼠的气管很窄，这使得在没有内窥镜²⁰等设备的帮助下很难通过这种方法找到正确的位置。经过进一步探索，我们发现插管灯的光线可以穿透身体表面，使操作员能够确定套管²¹的位置。

为了检查管子是否进入气管，最初，我们尝试使用一个小镜子，将其放在冰上冷却。插管后，我们用镜子接近套管开口。如果镜子上出现雾气，则认为插管成功。但是，我们发现这种检查方法无法准确确定套管是否进入气管。首先，套管头靠近老鼠的嘴巴，无法确定镜子上出现的雾气是否是由嘴里呼出的气体引起的。其次，镜子需要冷却。在持续使用的情况下，冷却镜子所需的时间也导致实验时间的增加。然后，我们使用巴斯德移液器将空气泵入气管;如果将套管插入气管，小鼠的胸部会肿胀，如果插入食道，右下腹部会肿胀²²。因此，我们用这种方法作为判断插管是否成功的依据。

与手术气管插管相比，无创口咽插管避免了手术伤口，提高了实验动物的存活率²³。与鼻内插管相比，无创口咽插管可使套管更准确地进入支气管^和肺部24。但是，掌握这些技术技能需要大量的练习。对于体型较小的小鼠，将套管插入气管是困难的，并且在手术过程中很容易划伤气管。因此，我们建议选择体型较大的小鼠进行实验。

该方法还可用于将其他液体药物输送到支气管和肺，因此这意味着它具有广泛的应用潜力^25,26。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lipopolysaccharide	MERK	L4130	LPS
Microliter Syringes	SHANGHAI GAOGE INDUSTRY AND TRADE CO., LTD	10028505008124	To deliver LPS
Mouse cannula	RWD Life Science	803-03008-00	Mouse cannula
Mouse intubation kit	RWD Life Science	903-03027-00	Including a base, a riser, a intubator, a surgical forceps and some strings
Pasteur pipette	Biosharp life science	BS-XG-03	To verify the success of intubation
Pentobarbital sodium	Beijing Chemical Co., China	20220918	To anesthetize mice