Summary
هنا ، نقترح بروتوكولا لتوصيل عديد السكاريد الدهني داخل القصبة الهوائية (LPS) عن طريق التنبيب الرغامي الفموي البلعومي غير الباضع. تقلل هذه الطريقة من صدمة الإجراء الجراحي للحيوان وتوصل بدقة LPS إلى القصبة الهوائية ثم إلى الرئتين.
Abstract
لا يزال نموذج فأر إصابة الرئة الحادة (ALI) الناجم عن عديد السكاريد الدهني (LPS) أو الذيفان الداخلي من بين النماذج الأكثر استخداما في الدراسات التي أجريت على الحيوانات لإصابة الرئة الحادة أو الالتهاب الحاد. الطرق الحالية الأكثر استخداما في نماذج الفئران المصابة بإصابات الرئة الحادة هي الحقن داخل الصفاق من LPS وفغر القصبة الهوائية لتسريب القصبة الهوائية من LPS. ومع ذلك ، فإن الطريقة الأولى تفتقر إلى استهداف الرئة وتلف الأعضاء الأخرى ، والطريقة الأخيرة تحفز الصدمة الجراحية ، وخطر العدوى ، وانخفاض معدل البقاء على قيد الحياة. هنا ، نوصي بطريقة التنبيب الرغامي الفموي البلعومي غير الغازية لتقطير LPS في الفئران. في هذه الطريقة ، يتم إدخال LPS بشكل غير جراحي في القصبة الهوائية من خلال تجويف البلعوم الفموي ليتم غرسه في الرئة بمساعدة جهاز للتنبيب الرغامي. لا تضمن هذه الطريقة استهداف الرئة فحسب ، بل تتجنب أيضا الضرر وخطر الموت في الحيوانات. نتوقع أن يصبح هذا النهج مستخدما على نطاق واسع في مجال إصابة الرئة الحادة.
Introduction
إصابة الرئة الحادة (ALI) هي متلازمة سريرية شائعة. في ظل مجموعة متنوعة من العوامل المسببة للأمراض ، يؤدي تعطيل الحاجز الفسيولوجي للخلايا الظهارية الرئوية والخلايا البطانية الوعائية إلى زيادة نفاذية السنخية ، مما يؤدي إلى انخفاض امتثال الرئة ، وذمة رئوية ، ونقص الأكسجة الشديد1. متلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS) هي أشد أشكال ALI. يعتبر الالتهاب غير المنضبط وتلف الإجهاد التأكسدي من الأسباب الرئيسية ل ALI ومتلازمة الضائقة التنفسية الحادة2 الأكثر حدة. عندما تصاب الخلايا الظهارية السنخية مباشرة بسبب الصدمة ، يتم تنشيط سلسلة الاستجابة الالتهابية للبلاعم السنخية ، مما يؤدي إلى التهاب في الرئة3. على الصعيد العالمي ، هناك أكثر من 3 ملايين مريض يعانون من متلازمة الضائقة التنفسية الحادة سنويا ، وهم يمثلون حوالي 10٪ من حالات دخول وحدة العناية المركزة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن معدل الوفيات في الحالات الشديدة يصل إلى 46٪ 4,5,6. لذلك ، هناك حاجة لإنشاء نموذج حيواني مناسب ل ALI لدراسة التسبب فيه. الفأر هو التجارب الأكثر استخداما في دراسة ALI لأن الجهاز التنفسي يمكن أن يحاكي الجهاز التنفسي البشري جيدا لدراسات ALI. علاوة على ذلك ، يظهر ALI على شكل تسلل هائل للخلايا الالتهابية ، وزيادة نفاذية الأوعية الدموية الرئوية ، والوذمة الرئوية. تعكس التغيرات في السيتوكينات الالتهابية في المصل ونسبة الوزن الجاف الرطب للرئة درجة ALI7.
في الوقت الحاضر ، تشمل الطرق الرئيسية لنمذجة ALI الناجم عن LPS في الفئران التنبيب الرغامي داخل الأنف والجراحة 8,9. هنا ، نقترح طريقة جديدة لتوصيل LPS إلى القصبة الهوائية عن طريق التنبيب الفموي البلعومي غير الباضع. تستخدم هذه الطريقة منبيبا مضيئا للعثور على القصبة الهوائية للفأر ثم توصيل LPS إلى القصبة الهوائية والرئة. هذه الطريقة يسلم LPS إلى الرئتين بشكل أكثر دقة من طريقة التسليم عن طريق الأنف. بالمقارنة مع التنبيب الرغامي الجراحي ، لا تتطلب هذه الطريقة جراحة ، وتتجنب التسبب في الجروح ، وتقلل الألم في الفئران10. لذلك ، يمكن استخدام هذه الطريقة لإنشاء نموذج ماوس أكثر إقناعا ل ALI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت مراجعة بروتوكول التجارب على الحيوانات والموافقة عليه من قبل لجنة إدارة جامعة تشنغدو للطب الصيني التقليدي (سجل رقم 2021-11). تم استخدام ذكور الفئران C57 / BL (20-25 جم ، 6-8 أسابيع) في هذه الدراسة. تم الاحتفاظ بالفئران في غرفة الحيوانات وكانت حرة في الشرب والأكل أثناء التجربة.
1. التحضير
- تأكد من أن منصة التنبيب تتكون من قاعدة ورافع ومشبك ورق وشريطين مطاطيين وبعض الأوتار. خذ خيطا ، وقم بتمرير الخيط عبر الفتحتين في الجزء العلوي من الناهض ، واربط طرفي الخيط ، على التوالي ، بالنتوءات الصغيرة في الجزء العلوي من الناهض.
ملاحظة: اترك مساحة لرأس الماوس للمرور بين الخيط والفتحتين. - اربط شريطين مطاطيين بكل طرف من طرفي مشبك الورق ، وقم بلصق مشبك الورق بالأربطة المطاطية في الجزء الخلفي من الناهض. أخيرا ، ثبت الناهض على القاعدة عند 90 درجة (الشكل 1).
- حدد قنية من الحجم والطول المناسبين. بالنسبة للفأر 20-30 جم ، يمكن استخدام قسطرة 22 جم (بطول 2.5-3.8 سم)11. قم بتجميع القنية على قلم قنية ، وقم بتشغيل ضوء القلم (الشكل 2).
- تحضير ملقط جراحي صغير وماصة باستور عن طريق تطهيرها بالكحول بنسبة 70٪.
2. تحضير مركب الاختبار
- الوزن وإذابة 3 ملغ من LPS في 1 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS ، درجة الحموضة 7.2) لتشكيل محلول LPS بتركيز 3 ملغ / مل.
- وزن وإذابة 10 ملغ من الصوديوم بنتوباربيتال في 1 مل من المياه المالحة العادية لتشكيل 1٪ محلول الصوديوم بنتوباربيتال. قم بتعقيم المحلول باستخدام مرشح حقنة 0.45 ميكرومتر.
3. تقطير البلعوم الفموي غير الغازي
- تخدير الفئران بحقن داخل الصفاق من 1٪ بنتوباربيتال الصوديوم بجرعة 50 ملغم / كغم12,13. تحديد عمق التخدير من خلال عدم الاستجابة لرد الفعل الصحيح.
- ضع الماوس المخدر على منصة التنبيب. ثبت الأسنان الأمامية العلوية بالخيط والقدمين الأماميتين بالأشرطة المطاطية (الشكل 3).
- اسحب اللسان بملاقط ، وأمسكه باليد اليسرى. ادفع القنية ببطء ، على طول الفم ، مع رفع اليد اليمنى ، إلى لسان المزمار الفك السفلي. استخدم ضوء قلم القنية للعثور على القصبة الهوائية ، وأدخله ببطء في القصبة الهوائية (الشكل 4).
- بعد إدخال القنية في القصبة الهوائية ، اسحب قلم التنبيب ببطء ، واترك القنية بالداخل. أدخل ماصة باستور في مفصل القنية ، واضغط على الرأس (الشكل 5).
ملاحظة: إذا انتفخ صدر الفأر ، فإن التنبيب ناجح (الشكل 6). - بعد التنبيب الرغامي الناجح ، قم بغرس الفئران ب 3 مجم / مل LPS عند 3 مجم / كجم من خلال القنية باستخدام حقنة مجهرية مسطحة الرأس14,15 (الشكل 7).
- بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بإزالة القنية والمحقنة الدقيقة. أخرج الماوس من السقالة ، وضعه في قفص منفصل للتعافي. راقب الحالة التنفسية للفأر حتى يتعافى ويستعيد وعيه.
ملاحظة: في الساعة 12 بعد تقطير القصبة الهوائية LPS ، قم بالقتل الرحيم للفئران باتباع الإجراء الذي وافقت عليه لجنة أخلاقيات الحيوان. تم إجراء فحوصات مصل TNF-α وقياسات وزن الرئة الجافة الرطبة باستخدام الإجراءات القياسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم التحقق من الطريقة المقترحة لتقطير LPS في الفئران من خلال تقييم التعبير عن السيتوكين الالتهابي TNF-α ونسبة الوزن الجاف الرطب للرئة بعد 12 ساعة من تقطير LPS. كانت هناك أربع مجموعات في التجربة: التحكم الفارغ (بدون أي علاج) ، التنبيب الجراحي16 ، داخل الأنف17،18 ، والتنبيب الفموي البلعومي غير الباضع (ن = 6). بالمقارنة مع المجموعة الضابطة الفارغة ، زادت مستويات TNF-α المصل في مجموعة التنبيب الفموي البلعومي غير الباضع بشكل ملحوظ (الشكل 8 أ). كما زادت نسبة الوزن الجاف إلى الرطب في الرئة (الشكل 8 ب) ، لتصل إلى نفس المستوى في مجموعة التنبيب الرغامي الجراحي. تم تحليل مجموعات البيانات إحصائيا باستخدام اختبارات ANOVA غير المقترنة والمقارنات المتعددة اللاحقة Tukey Kramer. يتم تقديم جميع البيانات كمتوسط ± SEM ، واعتبر مستوى p < 0.05 ذا دلالة إحصائية.
الشكل 1: تجهيزات وتجميع منصة التنبيب. تتكون المنصة من قاعدة ، ورافع ، ومشبك ورق ، وشريطين مطاطيين ، وبعض الأوتار. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مجموعة التنبيب. يوضح هذا الشكل مجموعة التنبيب وتجميعها. يتضمن ذلك مصباح قلم وألياف بصرية وقنية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تثبيت الماوس. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: تحديد موقع القصبة الهوائية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: التحقق من مضخة ماصة باستور. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 6: صورة للصدر قبل وبعد توضح التنبيب الناجح. أ: الصدر قبل التنبيب. (ب) الصدر بعد التنبيب؛ يتم تمييز المنطقة التي تظهر انتفاخ الصدر بدائرة حمراء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: أخذ العينات المجهرية ذات الرأس المسطح لتوصيل LPS. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 8: تقييم صلاحية تقطير LPS غير الباضع . (أ) التعبير عن عامل نخر الورم - α في مصل الفئران C57BL / 6 بعد 12 ساعة من حقن القصبة الهوائية من LPS. (ب) تحليل بيانات نسبة الوزن الجاف إلى الرطب لأنسجة الرئة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في البداية ، نظرنا داخل تجويف الفم للعثور على موقع القصبة الهوائية19. ومع ذلك ، خلال هذه العملية ، اكتشفنا أن القصبة الهوائية للفئران C57 / BL ضيقة ، مما يجعل من الصعب العثور على الموقع الصحيح بهذه الطريقة دون مساعدة من معدات مثل المنظار الداخلي20. عند إجراء مزيد من الاستكشاف ، وجدنا أن الضوء الصادر من مصباح التنبيب يمكن أن يخترق سطح الجسم ، مما يسمح للمشغل بتحديد موضع القنية21.
للتحقق مما إذا كان الأنبوب قد دخل القصبة الهوائية ، في البداية ، حاولنا استخدام مرآة صغيرة ، تم تبريدها بوضعها على الجليد. بعد التنبيب ، استخدمنا مرآة للاقتراب من فتحة القنية. إذا ظهر الضباب على المرآة ، فقد اعتبر التنبيب ناجحا. ومع ذلك ، وجدنا أن طريقة الفحص هذه لا يمكن أن تحدد بدقة ما إذا كانت القنية قد دخلت القصبة الهوائية. أولا ، كان رأس القنية قريبا من فم الفأر ، ولا يمكن تحديد ما إذا كان الضباب الذي ظهر على المرآة ناتجا عن غاز الزفير من الفم. ثانيا ، يجب تبريد المرآة. عند الاستخدام المستمر ، أدى الوقت اللازم لتبريد المرآة أيضا إلى زيادة وقت التجربة. ثم استخدمنا ماصة باستور لضخ الهواء في القصبة الهوائية. سوف ينتفخ صدر الفأر إذا تم إدخال القنية في القصبة الهوائية ، وإذا تم إدخالها في المريء ، فإن أسفل البطن الأيمن سوف ينتفخ22. لذلك ، استخدمنا هذه الطريقة كأساس للحكم على ما إذا كان التنبيب ناجحا.
بالمقارنة مع التنبيب الرغامي الجراحي ، فإن التنبيب الفموي البلعومي غير الجراحي يتجنب الجروح الجراحية ويحسن معدل بقاء التجارب23. بالمقارنة مع التنبيب الأنفي ، يؤدي التنبيب الفموي البلعومي غير الباضع إلى دخول أكثر دقة للقنية إلى الشعب الهوائية والرئتين24. ومع ذلك ، فإن إتقان هذه المهارات التقنية يتطلب الكثير من الممارسة. في حالة الفئران ذات أحجام الجسم الصغيرة ، يكون إدخال القنية في القصبة الهوائية أمرا صعبا ، ويمكن للمرء بسهولة خدش القصبة الهوائية أثناء العملية. لذلك ، نقترح أنه يجب اختيار الفئران ذات أحجام الجسم الأكبر للتجربة.
يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لتوصيل أدوية سائلة أخرى إلى الشعب الهوائية والرئة ، مما يعني أن لديها إمكانات تطبيق واسعة25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم: 81903902) ، ومؤسسة علوم ما بعد الدكتوراه الصينية (رقم: 2019M663457) ، وبرنامج سيتشوان للعلوم والتكنولوجيا (رقم: 2020YJ0172) ، ومشروع Xinglin Scholar Research Premotion التابع لجامعة تشنغدو في الطب الصيني التقليدي (رقم: QJRC2022053).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipopolysaccharide | MERK | L4130 | LPS |
| Microliter Syringes | SHANGHAI GAOGE INDUSTRY AND TRADE CO., LTD | 10028505008124 | To deliver LPS |
| Mouse cannula | RWD Life Science | 803-03008-00 | Mouse cannula |
| Mouse intubation kit | RWD Life Science | 903-03027-00 | Including a base, a riser, a intubator, a surgical forceps and some strings |
| Pasteur pipette | Biosharp life science | BS-XG-03 | To verify the success of intubation |
| Pentobarbital sodium | Beijing Chemical Co., China | 20220918 | To anesthetize mice |
References
- Xia, Y., et al. Protective effect of human amnion epithelial cells through endotracheal instillation against lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice. Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi. 33 (1), 7-11 (2017).
- Butt, Y., Kurdowska, A., Allen, T. C. Acute lung injury: A clinical and molecular review. Archives of Pathology and Lab Medicine. 140 (4), 345-350 (2016).
- Ware, L. B., Matthay, M. A. The acute respiratory distress syndrome. The New England Journal of Medicine. 342 (18), 1334-1349 (2000).
- Fan, E., Brodie, D., Slutsky, A. S. Acute respiratory distress syndrome: Advances in diagnosis and treatment. JAMA. 319 (7), 698-710 (2018).
- Meyer, N. J., Gattinoni, L., Calfee, C. S.
- An, N., Yang, T., Zhang, X. X., Xu, M. X. Bergamottin alleviates LPS-induced acute lung injury by inducing SIRT1 and suppressing NF-κB. Innate Immunity. 27 (7-8), 543-552 (2021).
- Liu, L., et al. Comparative study of trans-oral and trans-tracheal intratracheal instillations in a murine model of acute lung injury. The Anatomical Record. 295 (9), 1513-1519 (2012).
- Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. Journal of Visualized Experiments. (52), e2581 (2011).
- Li, J., et al. Panaxydol attenuates ferroptosis against LPS-induced acute lung injury in mice by Keap1-Nrf2/HO-1 pathway. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 96 (2021).
- Zhou, Y., et al. Soluble epoxide hydrolase inhibitor attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung injury and improves survival in mice. Shock. 47 (5), 638-645 (2017).
- Nosaka, N., et al. Optimal tube length of orotracheal intubation for mice. Laboratory Animals. 53 (1), 79-83 (2019).
- Cicero, L., Fazzotta, S., Palumbo, V. D., Cassata, G., Lo Monte, A. I. Anaesthesia protocols in laboratory animals used for scientific purposes. Acta Bio-Medica: Atenei Parmensis. 89 (3), 337-342 (2018).
- Ehrentraut, H., Weisheit, C. K., Frede, S., Hilbert, T. Inducing acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation. Journal of Visualized Experiments. (149), e59999 (2019).
- Yang, H., et al. STAT6 inhibits ferroptosis and alleviates acute lung injury by regulating P53/SLC7A11 pathway. Cell Death & Disease. 13 (6), 530 (2022).
- Aramaki, O., et al. Induction of operational tolerance and generation of regulatory cells after intratracheal delivery of alloantigen combined with nondepleting anti-CD4 monoclonal antibody. Transplantation. 76 (9), 1305-1314 (2003).
- Lan, W. Activation of mammalian target of rapamycin (mTOR) in a murine model of lipopolysaccharide (LPS) -induced acute lung injury (ALI). Peking Union Medical College. , PhD Thesis (2010).
- Lv, H., et al. Tenuigenin ameliorates acute lung injury by inhibiting NF-κB and MAPK signalling pathways. Respiratory Physiology & Neurobiology. 216, 43-51 (2015).
- Yang, H., Lv, H., Li, H., Ci, X., Peng, L. Oridonin protects LPS-induced acute lung injury by modulating Nrf2-mediated oxidative stress and Nrf2-independent NLRP3 and NF-κB pathways. Cell Communication and Signaling. 17 (1), 62 (2019).
- Im, G. H., et al. Improvement of orthotopic lung cancer mouse model via thoracotomy and orotracheal intubation enabling in vivo imaging studies. Laboratory Animals. 48 (2), 124-131 (2014).
- Hamacher, J., et al. Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: description, evaluation and comparison with transillumination. Laboratory Animals. 42 (2), 222-230 (2008).
- Nelson, A. M., Nolan, K. E., Davis, I. C.
- Zhang, S., et al. Microvesicles packaging IL-1β and TNF-α enhance lung inflammatory response to mechanical ventilation in part by induction of cofilin signaling. International Immunopharmacology. 63, 74-83 (2018).
- Feng, Z. Comparative study of different intratracheal instillation in acute lung injury model of mice. Jilin University. , Master's Thesis (2010).
- Chen, J. H., et al. Comparison of acute lung injury mice model established by intranasal and intratracheal instillation of lipopolysaccharide. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (02), 222-227 (2022).
- Luckow, B., Lehmann, M. H. A simplified method for bronchoalveolar lavage in mice by orotracheal intubation avoiding tracheotomy. BioTechniques. 71 (4), 534-537 (2021).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).
