Summary
Her foreslår vi en protokol for intratracheal lipopolysaccharid (LPS) levering via ikke-invasiv orofaryngeal endotracheal intubation. Denne metode minimerer traumet ved den kirurgiske procedure for dyret og leverer nøjagtigt LPS til luftrøret og derefter til lungerne.
Abstract
Den akutte lungeskade (ALI) musemodel induceret af lipopolysaccharid (LPS) eller endotoksin er stadig blandt de mest almindeligt anvendte modeller i dyreforsøg med akut lungeskade eller akut inflammation. De nuværende mest almindeligt anvendte metoder i musemodeller for akut lungeskade er en intraperitoneal injektion af LPS og trakeostomi til trakeal infusion af LPS. Den førstnævnte metode mangler imidlertid lungemålretning og beskadiger andre organer, og sidstnævnte metode inducerer operativt traume, infektionsrisiko og en lav overlevelsesrate. Her anbefaler vi en ikke-invasiv orofaryngeal endotracheal intubationsmetode til LPS-instillation hos mus. I denne metode indføres LPS ikke-invasivt i luftrøret gennem orofaryngeal hulrum, der skal indføres i lungen ved hjælp af et apparat til endotracheal intubation. Denne metode sikrer ikke kun lungemålretning, men undgår også skader og risikoen for død hos dyrene. Vi forventer, at denne tilgang vil blive udbredt inden for akut lungeskade.
Introduction
Akut lungeskade (ALI) er et almindeligt klinisk syndrom. Under en række patogene faktorer fører forstyrrelsen af den fysiologiske barriere i lungeepitelcellerne og vaskulære endotelceller til øget alveolær permeabilitet og derved forårsager nedsat lungeoverensstemmelse, lungeødem og alvorlig hypoxæmi1. Akut respiratorisk distress syndrom (ARDS) er den mest alvorlige form for ALI. Ukontrolleret inflammation og oxidativ stressskade anses for at være hovedårsagerne til ALI og den mere alvorlige ARDS2. Når alveolære epitelceller er direkte skadet på grund af traumer, aktiveres den inflammatoriske responskæde af alveolære makrofager, hvilket fører til betændelse i lungen3. Globalt er der mere end 3 millioner patienter med akut ARDS om året, og de tegner sig for ca. 10% af indlæggelserne på intensivafdelinger; Derudover er dødeligheden i alvorlige tilfælde så høj som 46%4,5,6. Der er derfor behov for at etablere en passende dyremodel for ALI til undersøgelse af dets patogenese. Musen er det mest almindeligt anvendte forsøgsdyr i studiet af ALI, da dets luftveje kan simulere de menneskelige luftveje godt til ALI-undersøgelser. Desuden manifesterer ALI sig som massiv inflammatorisk celleinfiltration, øget pulmonal vaskulær permeabilitet og lungeødem. Ændringerne i inflammatoriske cytokiner i serum og forholdet mellem tør og våd vægt i lungerne afspejler graden af ALI7.
På nuværende tidspunkt inkluderer de vigtigste metoder til modellering af LPS-induceret ALI hos mus intranasal og kirurgisk trakeal intubation 8,9. Her foreslår vi en ny metode til at levere LPS i luftrøret via ikke-invasiv orofaryngeal intubation. Denne metode bruger en oplyst intubator til at finde musens luftrør og leverer derefter LPS ind i luftrøret og lungen. Denne metode leverer LPS til lungerne mere præcist end den intranasale leveringsmetode. Sammenlignet med kirurgisk trakeal intubation kræver denne metode ikke kirurgi, undgår at forårsage sår og reducerer smerter hos mus10. Derfor kan denne metode bruges til at etablere en mere overbevisende musemodel af ALI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøgsprotokollen blev gennemgået og godkendt af forvaltningskomitéen for Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (Record No. 2021-11). C57/BL-hanmus (20-25 g, 6-8 uger gamle) blev anvendt til nærværende undersøgelse. Musene blev holdt i et dyrekammer og var frie til at drikke og spise under forsøget.
1. Forberedelse
- Sørg for, at intubationsplatformen består af en base, en stigerør, en papirclips, to elastikker og nogle strenge. Tag en snor, før snoren gennem de to huller øverst på stigrøret, og bind henholdsvis de to ender af snoren til de små fremspring øverst på stigrøret.
BEMÆRK: Giv plads til, at musens hoved kan passere igennem mellem snoren og de to huller. - Bind to elastikker til hver ende af papirclipsen, og tape papirclipsen med elastikkerne bag på stigrøret. Til sidst fastgøres stigrøret til basen ved 90 ° (figur 1).
- Vælg en kanyle af passende størrelse og længde. For en 20-30 g mus kan et 22 G kateter (2,5-3,8 cm langt) bruges11. Saml kanylen på en kanylepen, og tænd pennens lys (figur 2).
- Forbered små kirurgiske tang og en Pasteur-pipette ved at desinficere dem med 70% alkohol.
2. Fremstilling af teststoffet
- 3 mg LPS afvejes og opløses i 1 ml fosfatbufret saltvand (PBS, pH 7,2) til dannelse af en LPS-opløsning med en koncentration på 3 mg/ml.
- 10 mg pentobarbitalnatrium afvejes og opløses i 1 ml normalt saltvand til dannelse af en 1 % pentobarbitalnatriumopløsning. Filtrer opløsningen ved hjælp af et 0,45 μm sprøjtefilter.
3. Ikke-invasiv orofaryngeal instillation
- Bedøv musene med en intraperitoneal injektion af 1% pentobarbitalnatrium i en dosis på 50 mg/kg12,13. Bestem dybden af anæstesi ved manglende respons på den oprettende refleks.
- Placer den bedøvede mus på intubationsplatformen. Fastgør de øverste fortænder med tråden og de to forfødder med elastikkerne (figur 3).
- Træk tungen ud med pincet, og hold den med venstre hånd. Skub kanylen langsomt langs munden med højre hånd op til mandibular epiglottis. Brug kanylepennens lys til at finde luftrøret, og sæt det langsomt ind i luftrøret (figur 4).
- Når kanylen er indsat i luftrøret, skal du trække intubationspennen langsomt ud og lade kanylen være indeni. Indsæt Pasteur-pipetten i kanyleleddet, og tryk på hovedet (figur 5).
BEMÆRK: Hvis musens bryst buler, er intubationen vellykket (figur 6). - Efter vellykket endotracheal intubation påføres musene med 3 mg/ml LPS ved 3 mg/kg gennem kanylen ved hjælp af en fladhovedet mikrosprøjte14,15 (figur 7).
- Når du er færdig, skal du fjerne kanylen og mikrosprøjten. Fjern musen fra stilladset, og læg den i et bur separat for at komme sig. Overhold musens åndedrætstilstand, indtil den er kommet sig og genvundet samvittigheden.
BEMÆRK: 12 timer efter LPS-trakealinstillation aflives musene efter den procedure, der er godkendt af den dyreetiske komité. Serum-TNF-α-assays og tør-våde lungevægtmålinger blev udført ved hjælp af standardprocedurer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den foreslåede metode til LPS-instillation hos mus blev verificeret ved at evaluere ekspressionen af det inflammatoriske cytokin TNF-α og lungetør-vådvægtforholdet 12 timer efter LPS-instillation. Der var fire grupper i eksperimentet: blank kontrol (uden behandling), kirurgisk intubation16, intranasal17,18 og ikke-invasiv orofaryngeal intubation (n = 6). Sammenlignet med blindprøvegruppen var serum-TNF-α niveauerne i den ikke-invasive orofaryngeale intubationsgruppe signifikant øget (figur 8A). Forholdet mellem tør og våd lungevægt blev også øget (figur 8B) og nåede samme niveau som i den kirurgiske trakeale intubationsgruppe. Datasættene blev statistisk analyseret med en uparret ANOVA og post-hoc multiple-sammenligninger Tukey Kramer tests. Alle data præsenteres som gennemsnitlige ± SEM, og et niveau på p < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.
Figur 1: Intubationsplatformbeslag og montering. Platformen består af en base, en stigerør, en papirclips, to elastikker og nogle strenge. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Intubationssæt. Denne figur viser intubationssættet og dets samling. Dette inkluderer en penlygte, en optisk fiber og en kanyle. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Optagelse af mus. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Lokalisering af luftrøret. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Verifikation af pasteurpipettepumpe. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Før og efter billede af brystet, der viser vellykket intubation. (A) Bryst før intubation. (B) Bryst efter intubation; Området, der viser brystets udbulning, er markeret med en rød cirkel. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Mikrosampler med fladt hoved til levering af LPS. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Vurdering af validiteten af den ikke-invasive LPS-instillation . (A) Ekspression af TNF-α i serum hos C57BL/6-mus 12 timer efter en endotrakeal injektion af LPS. (B) Dataanalyse af forholdet mellem tør og våd vægt i lungevæv. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I første omgang kiggede vi inde i mundhulen for at finde placeringen af luftrøret19. Under denne proces opdagede vi imidlertid, at luftrøret hos C57/BL-mus er smalt, hvilket gør det vanskeligt at finde den rigtige placering ved denne metode uden hjælp fra udstyr såsom et endoskop20. Ved yderligere udforskning fandt vi, at lyset fra intubatorlampen kunne trænge ind i overfladen af kroppen, så operatøren kunne bestemme kanylens position21.
For at kontrollere, om røret var kommet ind i luftrøret, forsøgte vi i første omgang at bruge et lille spejl, som blev afkølet ved at placere det på is. Efter intubation brugte vi et spejl til at nærme os kanyleåbningen. Hvis der opstod tåge på spejlet, blev intubationen betragtet som vellykket. Vi fandt imidlertid, at denne undersøgelsesmetode ikke nøjagtigt kunne afgøre, om kanylen var kommet ind i luftrøret. For det første var kanylehovedet tæt på musens mund, og det kunne ikke bestemmes, om tågen, der optrådte på spejlet, var forårsaget af udåndet gas fra munden. For det andet skulle spejlet afkøles. Ved konstant brug førte den tid, der kræves for at afkøle spejlet, også til en stigning i eksperimenttiden. Vi brugte derefter en Pasteur-pipette til at pumpe luft ind i luftrøret; Musens bryst ville svulme, hvis kanylen blev indsat i luftrøret, og hvis den blev indsat i spiserøret, ville højre underliv svulme22. Derfor brugte vi denne metode som grundlag for at bedømme, om intubationen var vellykket.
Sammenlignet med kirurgisk trakeal intubation undgår ikke-invasiv orofaryngeal intubation kirurgiske sår og forbedrer forsøgsdyrenes overlevelsesrate23. Sammenlignet med intranasal intubation fører ikke-invasiv orofaryngeal intubation til mere præcis indtræden af kanylen i bronchus og lunger24. Men at mestre disse tekniske færdigheder kræver meget øvelse. I tilfælde af mus med små kropsstørrelser er det vanskeligt at indsætte kanylen i luftrøret, og man kan let ridse luftrøret under operationen. Derfor foreslår vi, at mus med større kropsstørrelser vælges til eksperimentet.
Metoden kan også bruges til at levere andre flydende lægemidler til bronchus og lungen, hvilket betyder, at den har et bredt anvendelsespotentiale25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr.: 81903902), China Postdoctoral Science Foundation (nr.: 2019M663457), Sichuan Science and Technology Program (nr.: 2020YJ0172) og Xinglin Scholar Research Premotion Project fra Chengdu University of TCM (nr.: QJRC2022053).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipopolysaccharide | MERK | L4130 | LPS |
| Microliter Syringes | SHANGHAI GAOGE INDUSTRY AND TRADE CO., LTD | 10028505008124 | To deliver LPS |
| Mouse cannula | RWD Life Science | 803-03008-00 | Mouse cannula |
| Mouse intubation kit | RWD Life Science | 903-03027-00 | Including a base, a riser, a intubator, a surgical forceps and some strings |
| Pasteur pipette | Biosharp life science | BS-XG-03 | To verify the success of intubation |
| Pentobarbital sodium | Beijing Chemical Co., China | 20220918 | To anesthetize mice |
References
- Xia, Y., et al. Protective effect of human amnion epithelial cells through endotracheal instillation against lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice. Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi. 33 (1), 7-11 (2017).
- Butt, Y., Kurdowska, A., Allen, T. C. Acute lung injury: A clinical and molecular review. Archives of Pathology and Lab Medicine. 140 (4), 345-350 (2016).
- Ware, L. B., Matthay, M. A. The acute respiratory distress syndrome. The New England Journal of Medicine. 342 (18), 1334-1349 (2000).
- Fan, E., Brodie, D., Slutsky, A. S. Acute respiratory distress syndrome: Advances in diagnosis and treatment. JAMA. 319 (7), 698-710 (2018).
- Meyer, N. J., Gattinoni, L., Calfee, C. S.
- An, N., Yang, T., Zhang, X. X., Xu, M. X. Bergamottin alleviates LPS-induced acute lung injury by inducing SIRT1 and suppressing NF-κB. Innate Immunity. 27 (7-8), 543-552 (2021).
- Liu, L., et al. Comparative study of trans-oral and trans-tracheal intratracheal instillations in a murine model of acute lung injury. The Anatomical Record. 295 (9), 1513-1519 (2012).
- Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. Journal of Visualized Experiments. (52), e2581 (2011).
- Li, J., et al. Panaxydol attenuates ferroptosis against LPS-induced acute lung injury in mice by Keap1-Nrf2/HO-1 pathway. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 96 (2021).
- Zhou, Y., et al. Soluble epoxide hydrolase inhibitor attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung injury and improves survival in mice. Shock. 47 (5), 638-645 (2017).
- Nosaka, N., et al. Optimal tube length of orotracheal intubation for mice. Laboratory Animals. 53 (1), 79-83 (2019).
- Cicero, L., Fazzotta, S., Palumbo, V. D., Cassata, G., Lo Monte, A. I. Anaesthesia protocols in laboratory animals used for scientific purposes. Acta Bio-Medica: Atenei Parmensis. 89 (3), 337-342 (2018).
- Ehrentraut, H., Weisheit, C. K., Frede, S., Hilbert, T. Inducing acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation. Journal of Visualized Experiments. (149), e59999 (2019).
- Yang, H., et al. STAT6 inhibits ferroptosis and alleviates acute lung injury by regulating P53/SLC7A11 pathway. Cell Death & Disease. 13 (6), 530 (2022).
- Aramaki, O., et al. Induction of operational tolerance and generation of regulatory cells after intratracheal delivery of alloantigen combined with nondepleting anti-CD4 monoclonal antibody. Transplantation. 76 (9), 1305-1314 (2003).
- Lan, W. Activation of mammalian target of rapamycin (mTOR) in a murine model of lipopolysaccharide (LPS) -induced acute lung injury (ALI). Peking Union Medical College. , PhD Thesis (2010).
- Lv, H., et al. Tenuigenin ameliorates acute lung injury by inhibiting NF-κB and MAPK signalling pathways. Respiratory Physiology & Neurobiology. 216, 43-51 (2015).
- Yang, H., Lv, H., Li, H., Ci, X., Peng, L. Oridonin protects LPS-induced acute lung injury by modulating Nrf2-mediated oxidative stress and Nrf2-independent NLRP3 and NF-κB pathways. Cell Communication and Signaling. 17 (1), 62 (2019).
- Im, G. H., et al. Improvement of orthotopic lung cancer mouse model via thoracotomy and orotracheal intubation enabling in vivo imaging studies. Laboratory Animals. 48 (2), 124-131 (2014).
- Hamacher, J., et al. Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: description, evaluation and comparison with transillumination. Laboratory Animals. 42 (2), 222-230 (2008).
- Nelson, A. M., Nolan, K. E., Davis, I. C.
- Zhang, S., et al. Microvesicles packaging IL-1β and TNF-α enhance lung inflammatory response to mechanical ventilation in part by induction of cofilin signaling. International Immunopharmacology. 63, 74-83 (2018).
- Feng, Z. Comparative study of different intratracheal instillation in acute lung injury model of mice. Jilin University. , Master's Thesis (2010).
- Chen, J. H., et al. Comparison of acute lung injury mice model established by intranasal and intratracheal instillation of lipopolysaccharide. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (02), 222-227 (2022).
- Luckow, B., Lehmann, M. H. A simplified method for bronchoalveolar lavage in mice by orotracheal intubation avoiding tracheotomy. BioTechniques. 71 (4), 534-537 (2021).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).
