Summary
כאן, אנו מציעים פרוטוקול להעברת ליפופוליסכריד תוך טרכאלי (LPS) באמצעות אינטובציה אנדוטרכאלית אורופרכאלית לא פולשנית. שיטה זו ממזערת את הטראומה של ההליך הכירורגי עבור החיה ומעבירה LPS מדויק לקנה הנשימה ולאחר מכן לריאות.
Abstract
מודל העכבר של פגיעה ריאתית חריפה (ALI) הנגרמת על ידי ליפופוליסכריד (LPS) או אנדוטוקסין הוא עדיין בין המודלים הנפוצים ביותר במחקרים בבעלי חיים של פגיעה ריאתית חריפה או דלקת חריפה. השיטות הנפוצות ביותר כיום במודלים של עכברים עם פגיעה ריאתית חריפה הן הזרקה תוך צפקית של LPS וטרכאוסטומיה לעירוי קנה הנשימה של LPS. עם זאת, השיטה הראשונה חסרה מיקוד ריאות ופוגעת באיברים אחרים, והשיטה השנייה גורמת לטראומה ניתוחית, סיכון לזיהום ושיעור הישרדות נמוך. כאן, אנו ממליצים על שיטת אינטובציה אנדוטרכאלית לא פולשנית של הלוע להחדרת LPS בעכברים. בשיטה זו, LPS הוא הציג באופן לא פולשני לתוך קנה הנשימה דרך חלל oropharyngeal להיות מוחדר לתוך הריאה בעזרת מכשיר עבור אינטובציה endotracheal. שיטה זו לא רק מבטיחה מיקוד ריאות אלא גם מונעת נזק וסיכון למוות אצל בעלי החיים. אנו צופים כי גישה זו תהפוך להיות בשימוש נרחב בתחום של פגיעה ריאתית חריפה.
Introduction
פגיעה ריאתית חריפה (ALI) היא תסמונת קלינית נפוצה. תחת מגוון גורמים פתוגניים, שיבוש המחסום הפיזיולוגי של תאי אפיתל הריאה ותאי אנדותל כלי הדם מוביל לחדירות מוגברת בנאדיות, ובכך גורם לירידה בהיענות הריאות, בצקת ריאות והיפוקסמיה חמורה1. תסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS) היא הצורה החמורה ביותר של ALI. דלקת בלתי מבוקרת ונזקי עקה חמצונית נחשבים לגורמים העיקריים ל- ALI ול- ARDS2 החמור יותר. כאשר תאי אפיתל מכתשית נפגעים ישירות עקב טראומה, שרשרת התגובה הדלקתית של מקרופאגים מכתשית מופעלת, מה שמוביל לדלקת בריאה3. ברחבי העולם, ישנם יותר מ -3 מיליון חולים עם ARDS חריף בשנה, והם מהווים כ -10% מהאשפוזים ביחידות טיפול נמרץ; בנוסף, שיעור התמותה בחולים קשים עומד על 46%4,5,6. לכן, יש צורך להקים מודל בעלי חיים מתאים של ALI כדי לחקור את הפתוגנזה שלה. העכבר הוא בעל החיים הניסיוני הנפוץ ביותר במחקר של ALI מאז דרכי הנשימה שלו יכול לדמות את דרכי הנשימה האנושיות היטב עבור מחקרי ALI. יתר על כן, ALI מתבטא בחדירה מסיבית של תאי דלקת, חדירות מוגברת של כלי דם ריאתיים ובצקת ריאות. השינויים בציטוקינים דלקתיים בסרום ויחס המשקל היבש-רטוב בריאה משקפים את דרגת ALI7.
כיום, השיטות העיקריות למידול ALI המושרה על ידי LPS בעכברים כוללות אינטובציה קנה הנשימה התוך-אפית והכירורגית 8,9. כאן, אנו מציעים שיטה חדשה להעברת LPS לקנה הנשימה באמצעות אינטובציה לא פולשנית של הלוע. שיטה זו משתמשת אינטובטור מואר כדי למצוא את קנה הנשימה של העכבר ולאחר מכן מעביר LPS לתוך קנה הנשימה והריאה. שיטה זו מספקת LPS לריאות בצורה מדויקת יותר מאשר שיטת המסירה intranasal. בהשוואה לאינטובציה כירורגית בקנה הנשימה, שיטה זו אינה דורשת ניתוח, נמנעת מגרימת פצעים ומפחיתה כאב בעכברים10. לכן, שיטה זו יכולה לשמש כדי להקים מודל עכבר משכנע יותר של ALI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול הניסויים בבעלי חיים נבדק ואושר על ידי ועדת הניהול של אוניברסיטת צ'נגדו לרפואה סינית מסורתית (רשומה מס' 2021-11). עכברי C57/BL זכרים (20-25 גרם, בני 6-8 שבועות) שימשו במחקר הנוכחי. העכברים הוחזקו בתא בעלי חיים והיו חופשיים לשתות ולאכול במהלך הניסוי.
1. הכנה
- ודא שפלטפורמת האינטובציה מורכבת מבסיס, הגבהה, אטב נייר, שתי גומיות וכמה מיתרים. קחו חוט, העבירו את החוט דרך שני החורים שבראש ההגבהה, וקשרו את שני קצוות המיתר, בהתאמה, לבליטות הקטנות שבראש ההגבהה.
הערה: השאר מקום לראש העכבר לעבור בין המיתר לשני החורים. - קשרו שתי גומיות לכל קצה של אטב הנייר, והדביקו את האטב עם הגומיות לחלק האחורי של ההגבהה. לבסוף, קבעו את ההגבהה לבסיס ב-90° (איור 1).
- בחר צינורית בגודל ובאורך המתאימים. עבור עכבר של 20-30 גרם, ניתן להשתמש בצנתר 22 גרם (2.5-3.8 ס"מ אורך)11. הרכיבו את הצינורית על עט צינורית והפעילו את האור של העט (איור 2).
- הכינו מלקחיים כירורגיים קטנים ופיפטה פסטר על ידי חיטוי שלהם עם 70% אלכוהול.
2. הכנת מתחם הבדיקה
- משקל והמסת 3 מ"ג LPS ב-1 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS, pH 7.2) ליצירת תמיסת LPS בריכוז של 3 מ"ג/מ"ל.
- לשקול ולהמיס 10 מ"ג של נתרן pentobarbital ב 1 מ"ל של מלוחים רגילים כדי ליצור 1% תמיסת נתרן pentobarbital. סנן-לעקר את התמיסה באמצעות מסנן מזרק 0.45 מיקרומטר.
3. החדרה לא פולשנית של הלוע
- להרדים את העכברים עם הזרקה intraperitoneal של 1% נתרן pentobarbital במינון של 50 מ"ג / ק"ג12,13. לקבוע את עומק ההרדמה על ידי חוסר תגובה לרפלקס הנכון.
- הניחו את העכבר המורדם על משטח האינטובציה. תקנו את השיניים הקדמיות העליונות עם החוט ואת שתי הרגליים הקדמיות עם הגומיות (איור 3).
- משוך את הלשון החוצה עם פינצטה, והחזק אותה ביד שמאל. דוחפים את הצינורית לאט, לאורך הפה, עם יד ימין למעלה, אל האפיגלוטיס המנדיבולרי. השתמשו באור של עט הצינורית כדי למצוא את קנה הנשימה, והכניסו אותו לאט לתוך קנה הנשימה (איור 4).
- לאחר החדרת הצינורית לקנה הנשימה, משכו את עט האינטובציה באיטיות, והשאירו את הצינורית בפנים. הכניסו את פיפטת פסטר למפרק הצינורית ולחצו על הראש (איור 5).
הערה: אם החזה של העכבר בולט, האינטובציה מצליחה (איור 6). - לאחר אינטובציה אנדוטרכאלית מוצלחת, החדרת LPS של 3 מ"ג/מ"ל לעכברים ב-3 מ"ג/ק"ג דרך הצינורית באמצעות מיקרומזרק שטוח ראש14,15 (איור 7).
- לאחר שתסיים, להסיר את הצינורית ואת microsyringe. הסר את העכבר מהפיגום, והנח אותו בכלוב בנפרד כדי להתאושש. שימו לב למצב הנשימה של העכבר עד שהוא התאושש והחזיר את העקביות.
הערה: בשעה 12 לאחר החדרת קנה הנשימה LPS, יש להרדים את העכברים בהתאם להליך שאושר על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים. בדיקות TNF-α בסרום ומדידות משקל ריאות יבשות-רטובות בוצעו באמצעות הליכים סטנדרטיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השיטה המוצעת להחדרת LPS בעכברים אומתה על ידי הערכת הביטוי של הציטוקין הדלקתי TNF-α ויחס המשקל היבש-רטוב של הריאה 12 שעות לאחר החדרת LPS. היו ארבע קבוצות בניסוי: בקרה ריקה (ללא כל טיפול), אינטובציה כירורגית 16, intranasal17,18, ואינטובציה לא פולשנית oropharyngeal (n = 6). בהשוואה לקבוצת הביקורת הריקה, רמות TNF-α בסרום בקבוצת האינטובציה הלא פולשנית של הלוע היו גבוהות באופן משמעותי (איור 8A). יחס המשקל היבש-רטוב של הריאות עלה גם הוא (איור 8B), והגיע לרמה זהה לזו שבקבוצת אינטובציית קנה הנשימה הניתוחית. מערכי הנתונים נותחו סטטיסטית באמצעות מבחני ANOVA לא מזווגים ומבחני טוקי קרמר לאחר הוק. כל הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM, ורמה של p < 0.05 נחשבה מובהקת סטטיסטית.
איור 1: אביזרי פלטפורמת אינטובציה והרכבה. הפלטפורמה מורכבת מבסיס, הגבהה, אטב נייר, שתי גומיות וכמה מיתרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ערכת אינטובציה. איור זה מציג את ערכת האינטובציה ואת הרכבתה. זה כולל מנורת עט, סיב אופטי וצינורית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: קיבוע עכבר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: איתור קנה הנשימה. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: אימות משאבת פיפטה של פסטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: תמונה לפני ואחרי של החזה שמראה אינטובציה מוצלחת. (A) חזה לפני אינטובציה. (ב) חזה לאחר אינטובציה; האזור המציג את הבליטה של החזה מסומן בעיגול אדום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: מיקרו-דוגמית עם ראש שטוח להעברת LPS. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
תרשים 8: הערכת תוקף החדרת LPS לא פולשנית . (A) ביטוי TNF-α בסרום של עכברי C57BL/6 12 שעות לאחר הזרקה אנדוטרכאלית של LPS. (B) ניתוח נתונים של יחס המשקל היבש-רטוב של רקמת הריאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בתחילה, הסתכלנו לתוך חלל הפה כדי למצוא את המיקום של קנה הנשימה19. עם זאת, במהלך תהליך זה, גילינו כי קנה הנשימה של עכברי C57/BL הוא צר, מה שמקשה על מציאת המיקום הנכון בשיטה זו ללא עזרה של ציוד כגון אנדוסקופ20. לאחר חקירה נוספת, מצאנו כי האור מנורת האינטובטור יכול לחדור לפני השטח של הגוף, מה שמאפשר למפעיל לקבוע את מיקום הצינורית21.
כדי לבדוק אם הצינור נכנס לקנה הנשימה, בתחילה, ניסינו להשתמש במראה קטנה, אשר היה מקורר על ידי הנחתו על קרח. לאחר האינטובציה השתמשנו במראה כדי להתקרב לפתח הצינורית. אם ערפל הופיע על המראה, האינטובציה נחשבה מוצלחת. עם זאת, מצאנו כי שיטת בדיקה זו לא הצליחה לקבוע במדויק אם הצינורית נכנסה לקנה הנשימה. ראשית, ראש הצינורית היה קרוב לפיו של העכבר, ולא ניתן היה לקבוע אם הערפל שהופיע על המראה נגרם על ידי גז נשוף מהפה. שנית, היה צורך לקרר את המראה. בשימוש מתמיד, הזמן הדרוש לקירור המראה הוביל גם להארכת זמן הניסוי. לאחר מכן השתמשנו בפיפטת פסטר כדי להזרים אוויר לקנה הנשימה; החזה של העכבר יתנפח אם הצינורית תוכנס לקנה הנשימה, ואם היא תוכנס לוושט, הבטן התחתונה הימנית תתנפח22. לכן, השתמשנו בשיטה זו כבסיס לשפוט אם האינטובציה הצליחה.
בהשוואה לאינטובציה כירורגית בקנה הנשימה, אינטובציה לא פולשנית של הלוע מונעת פצעים כירורגיים ומשפרת את שיעור ההישרדות של חיות הניסוי23. בהשוואה לאינטובציה תוך אפית, אינטובציה אורופרינגיאלית לא פולשנית מובילה לכניסה מדויקת יותר של הצינורית לסימפונות ולריאות24. עם זאת, שליטה טכניתמיומנויות אלה דורש תרגול רב. במקרה של עכברים עם מידות גוף קטנות, החדרת הצינורית לקנה הנשימה קשה, וניתן בקלות לגרד את קנה הנשימה במהלך הניתוח. לכן, אנו מציעים לבחור עכברים עם מידות גוף גדולות יותר לניסוי.
השיטה יכולה לשמש גם להעברת תרופות נוזליות אחרות לסימפונות ולריאה, כלומר יש לה פוטנציאל יישום רחב25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס ': 81903902), הקרן למדע פוסט-דוקטורט בסין (מס ': 2019M663457), תוכנית המדע והטכנולוגיה של סצ'ואן (מס ': 2020YJ0172), ופרויקט המחקר של Xinglin Scholar Premotion של אוניברסיטת צ'נגדו של TCM (מס ': QJRC2022053).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipopolysaccharide | MERK | L4130 | LPS |
| Microliter Syringes | SHANGHAI GAOGE INDUSTRY AND TRADE CO., LTD | 10028505008124 | To deliver LPS |
| Mouse cannula | RWD Life Science | 803-03008-00 | Mouse cannula |
| Mouse intubation kit | RWD Life Science | 903-03027-00 | Including a base, a riser, a intubator, a surgical forceps and some strings |
| Pasteur pipette | Biosharp life science | BS-XG-03 | To verify the success of intubation |
| Pentobarbital sodium | Beijing Chemical Co., China | 20220918 | To anesthetize mice |
References
- Xia, Y., et al. Protective effect of human amnion epithelial cells through endotracheal instillation against lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice. Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi. 33 (1), 7-11 (2017).
- Butt, Y., Kurdowska, A., Allen, T. C. Acute lung injury: A clinical and molecular review. Archives of Pathology and Lab Medicine. 140 (4), 345-350 (2016).
- Ware, L. B., Matthay, M. A. The acute respiratory distress syndrome. The New England Journal of Medicine. 342 (18), 1334-1349 (2000).
- Fan, E., Brodie, D., Slutsky, A. S. Acute respiratory distress syndrome: Advances in diagnosis and treatment. JAMA. 319 (7), 698-710 (2018).
- Meyer, N. J., Gattinoni, L., Calfee, C. S.
- An, N., Yang, T., Zhang, X. X., Xu, M. X. Bergamottin alleviates LPS-induced acute lung injury by inducing SIRT1 and suppressing NF-κB. Innate Immunity. 27 (7-8), 543-552 (2021).
- Liu, L., et al. Comparative study of trans-oral and trans-tracheal intratracheal instillations in a murine model of acute lung injury. The Anatomical Record. 295 (9), 1513-1519 (2012).
- Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. Journal of Visualized Experiments. (52), e2581 (2011).
- Li, J., et al. Panaxydol attenuates ferroptosis against LPS-induced acute lung injury in mice by Keap1-Nrf2/HO-1 pathway. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 96 (2021).
- Zhou, Y., et al. Soluble epoxide hydrolase inhibitor attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung injury and improves survival in mice. Shock. 47 (5), 638-645 (2017).
- Nosaka, N., et al. Optimal tube length of orotracheal intubation for mice. Laboratory Animals. 53 (1), 79-83 (2019).
- Cicero, L., Fazzotta, S., Palumbo, V. D., Cassata, G., Lo Monte, A. I. Anaesthesia protocols in laboratory animals used for scientific purposes. Acta Bio-Medica: Atenei Parmensis. 89 (3), 337-342 (2018).
- Ehrentraut, H., Weisheit, C. K., Frede, S., Hilbert, T. Inducing acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation. Journal of Visualized Experiments. (149), e59999 (2019).
- Yang, H., et al. STAT6 inhibits ferroptosis and alleviates acute lung injury by regulating P53/SLC7A11 pathway. Cell Death & Disease. 13 (6), 530 (2022).
- Aramaki, O., et al. Induction of operational tolerance and generation of regulatory cells after intratracheal delivery of alloantigen combined with nondepleting anti-CD4 monoclonal antibody. Transplantation. 76 (9), 1305-1314 (2003).
- Lan, W. Activation of mammalian target of rapamycin (mTOR) in a murine model of lipopolysaccharide (LPS) -induced acute lung injury (ALI). Peking Union Medical College. , PhD Thesis (2010).
- Lv, H., et al. Tenuigenin ameliorates acute lung injury by inhibiting NF-κB and MAPK signalling pathways. Respiratory Physiology & Neurobiology. 216, 43-51 (2015).
- Yang, H., Lv, H., Li, H., Ci, X., Peng, L. Oridonin protects LPS-induced acute lung injury by modulating Nrf2-mediated oxidative stress and Nrf2-independent NLRP3 and NF-κB pathways. Cell Communication and Signaling. 17 (1), 62 (2019).
- Im, G. H., et al. Improvement of orthotopic lung cancer mouse model via thoracotomy and orotracheal intubation enabling in vivo imaging studies. Laboratory Animals. 48 (2), 124-131 (2014).
- Hamacher, J., et al. Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: description, evaluation and comparison with transillumination. Laboratory Animals. 42 (2), 222-230 (2008).
- Nelson, A. M., Nolan, K. E., Davis, I. C.
- Zhang, S., et al. Microvesicles packaging IL-1β and TNF-α enhance lung inflammatory response to mechanical ventilation in part by induction of cofilin signaling. International Immunopharmacology. 63, 74-83 (2018).
- Feng, Z. Comparative study of different intratracheal instillation in acute lung injury model of mice. Jilin University. , Master's Thesis (2010).
- Chen, J. H., et al. Comparison of acute lung injury mice model established by intranasal and intratracheal instillation of lipopolysaccharide. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (02), 222-227 (2022).
- Luckow, B., Lehmann, M. H. A simplified method for bronchoalveolar lavage in mice by orotracheal intubation avoiding tracheotomy. BioTechniques. 71 (4), 534-537 (2021).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).
