Summary
यहां, हम नॉनइनवेसिव ऑरोफरीन्जियल एंडोट्रेकियल इंटुबैशन के माध्यम से इंट्राट्रेकियल लिपोपॉलेसेकेराइड (एलपीएस) वितरण के लिए एक प्रोटोकॉल का प्रस्ताव करते हैं। यह विधि पशु के लिए शल्य चिकित्सा प्रक्रिया के आघात को कम करती है और एलपीएस को श्वासनली और फिर फेफड़ों तक सटीक रूप से पहुंचाती है।
Abstract
लिपोपॉलेसेकेराइड (एलपीएस) या एंडोटॉक्सिन द्वारा प्रेरित तीव्र फेफड़ों की चोट (एएलआई) माउस मॉडल अभी भी तीव्र फेफड़ों की चोट या तीव्र सूजन के पशु अध्ययन में सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले मॉडल में से एक है। तीव्र फेफड़ों की चोट माउस मॉडल में वर्तमान में सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले तरीके एलपीएस के श्वासनली जलसेक के लिए एलपीएस और ट्रेकियोस्टोमी का एक इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन हैं। हालांकि, पूर्व विधि में फेफड़ों के लक्ष्यीकरण की कमी होती है और अन्य अंगों को नुकसान होता है, और बाद की विधि ऑपरेटिव आघात, संक्रमण जोखिम और कम जीवित रहने की दर को प्रेरित करती है। यहां, हम चूहों में एलपीएस इंस्टिलेशन के लिए एक नॉनइनवेसिव ऑरोफरीन्जियल एंडोट्रेकियल इंटुबैशन विधि की सिफारिश करते हैं। इस विधि में, एलपीएस को एंडोट्रेकियल इंटुबैशन के लिए एक उपकरण की मदद से फेफड़ों में डालने के लिए ऑरोफरीन्जियल गुहा के माध्यम से श्वासनली में गैर-आक्रामक रूप से पेश किया जाता है। यह विधि न केवल फेफड़ों के लक्ष्यीकरण का आश्वासन देती है, बल्कि जानवरों में क्षति और मृत्यु के जोखिम से भी बचती है। हम उम्मीद करते हैं कि यह दृष्टिकोण तीव्र फेफड़ों की चोट के क्षेत्र में व्यापक रूप से उपयोग किया जाएगा।
Introduction
तीव्र फेफड़ों की चोट (एएलआई) एक सामान्य नैदानिक सिंड्रोम है। विभिन्न रोगजनक कारकों के तहत, फेफड़ों के उपकला कोशिकाओं और संवहनी एंडोथेलियल कोशिकाओं के शारीरिक अवरोध के विघटन से वायुकोशीय पारगम्यता में वृद्धि होती है, जिससे फेफड़ों के अनुपालन, फुफ्फुसीय एडिमा और गंभीर हाइपोक्सिमिया1 में कमी आती है। तीव्र श्वसन संकट सिंड्रोम (एआरडीएस) एएलआई का सबसे गंभीर रूप है। अनियंत्रित सूजन और ऑक्सीडेटिव तनाव क्षति को एएलआई और अधिक गंभीर एआरडीएस2 का मुख्य कारण माना जाता है। जब आघात के कारण वायुकोशीय उपकला कोशिकाएं सीधे घायल हो जाती हैं, तो वायुकोशीय मैक्रोफेज की भड़काऊ प्रतिक्रिया श्रृंखला सक्रिय हो जाती है, जिससे फेफड़ों में सूजनहो जाती है। विश्व स्तर पर, प्रति वर्ष तीव्र एआरडीएस वाले 3 मिलियन से अधिक रोगी हैं, और वे गहन देखभाल इकाई प्रवेश के लगभग 10% के लिए जिम्मेदार हैं; इसके अतिरिक्त, गंभीर मामलों में मृत्यु दर 46% 4,5,6 जितनी अधिक है। इसलिए, इसके रोगजनन का अध्ययन करने के लिए एएलआई का एक उपयुक्त पशु मॉडल स्थापित करने की आवश्यकता है। एएलआई के अध्ययन में माउस सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला प्रयोगात्मक जानवर है क्योंकि इसका श्वसन पथ एएलआई अध्ययन के लिए मानव श्वसन पथ को अच्छी तरह से अनुकरण कर सकता है। इसके अलावा, एएलआई बड़े पैमाने पर भड़काऊ कोशिका घुसपैठ, फुफ्फुसीय संवहनी पारगम्यता में वृद्धि और फुफ्फुसीय एडिमा के रूप में प्रकट होता है। सीरम में भड़काऊ साइटोकिन्स में परिवर्तन और फेफड़ों के सूखे-गीले वजन अनुपात एएलआई7 की डिग्री को दर्शाते हैं।
वर्तमान में, चूहों में एलपीएस-प्रेरित एएलआई मॉडलिंग के मुख्य तरीकों में इंट्रानेसल और सर्जिकल श्वासनली इंटुबैशन 8,9 शामिल हैं। यहां, हम नॉनइनवेसिव ऑरोफरीन्जियल इंटुबैशन के माध्यम से एलपीएस को श्वासनली में पहुंचाने के लिए एक नई विधि का प्रस्ताव करते हैं। यह विधि माउस की श्वासनली को खोजने के लिए एक रोशन इंटुबेटर का उपयोग करती है और फिर एलपीएस को श्वासनली और फेफड़े में पहुंचाती है। यह विधि प्रसव की इंट्रानेसल विधि की तुलना में फेफड़ों में एलपीएस को अधिक सटीक रूप से पहुंचाती है। सर्जिकल श्वासनली इंटुबैशन की तुलना में, इस विधि को सर्जरी की आवश्यकता नहीं होती है, घाव पैदा करने से बचता है, और चूहों में दर्द को कम करताहै10. इसलिए, इस विधि का उपयोग ALI के अधिक विश्वसनीय माउस मॉडल को स्थापित करने के लिए किया जा सकता है।
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Protocol
पशु प्रयोग प्रोटोकॉल की समीक्षा की गई और चेंगदू यूनिवर्सिटी ऑफ ट्रेडिशनल चाइनीज मेडिसिन (रिकॉर्ड नंबर 2021-11) की प्रबंधन समिति द्वारा अनुमोदित किया गया। वर्तमान अध्ययन के लिए नर सी 57 / बीएल चूहों (20-25 ग्राम, 6-8 सप्ताह पुराने) का उपयोग किया गया था। चूहों को एक पशु कक्ष में रखा गया था और प्रयोग के दौरान पीने और खाने के लिए स्वतंत्र थे।
1. तैयारी
- सुनिश्चित करें कि इंटुबैशन प्लेटफॉर्म में एक बेस, एक राइजर , एक पेपर क्लिप, दो रबर बैंड और कुछ तार शामिल हैं। एक स्ट्रिंग लें, स्ट्रिंग को राइजर के शीर्ष पर दो छेदों के माध्यम से पारित करें, और स्ट्रिंग के दो सिरों को क्रमशः, राइजर के शीर्ष पर छोटे प्रोट्रूशियंस से बांधें।
नोट: माउस के सिर को स्ट्रिंग और दो छेदों के बीच से गुजरने के लिए जगह छोड़ दें। - पेपर क्लिप के प्रत्येक छोर पर दो रबर बैंड बांधें, और राइजर के पीछे रबर बैंड के साथ पेपर क्लिप को टेप करें। अंत में, राइजर को 90 ° (चित्रा 1) पर आधार पर ठीक करें।
- उपयुक्त आकार और लंबाई के प्रवेशनी का चयन करें। 20−30 ग्राम माउस के लिए, एक 22 ग्राम कैथेटर (2.5−3.8 सेमी लंबा) का उपयोग किया जा सकता है। कैनुला को एक कैनुला पेन पर इकट्ठा करें, और पेन की लाइट चालू करें (चित्रा 2)।
- उन्हें 70% अल्कोहल के साथ कीटाणुरहित करके छोटे सर्जिकल फोर्स और एक पाश्चर पिपेट तैयार करें।
2. परीक्षण यौगिक की तैयारी
- 3 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता के साथ एलपीएस समाधान बनाने के लिए फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस, पीएच 7.2) के 1 एमएल में 3 मिलीग्राम एलपीएस का वजन और भंग करें।
- 1% पेंटोबार्बिटल सोडियम घोल बनाने के लिए सामान्य खारा के 1 मिलीलीटर में 10 मिलीग्राम पेंटोबार्बिटल सोडियम का वजन और भंग करें। 0.45 μm सिरिंज फ़िल्टर का उपयोग करके समाधान को फ़िल्टर करें-निष्फल करें।
3. नॉनइनवेसिव ऑरोफरीन्जियल इंस्टिलेशन
- चूहों को 50 मिलीग्राम / किग्रा12,13 की खुराक पर 1% पेंटोबार्बिटल सोडियम के इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन के साथ एनेस्थेटाइज करें। राइटिंग रिफ्लेक्स के प्रति प्रतिक्रिया की कमी से संज्ञाहरण की गहराई निर्धारित करें।
- इंटुबैशन प्लेटफॉर्म पर एनेस्थेटाइज्ड माउस रखें। धागे के साथ शीर्ष सामने के दांतों को ठीक करें और रबर बैंड के साथ दो अग्रभाग (चित्रा 3)।
- जीभ को चिमटी से बाहर खींचें, और इसे बाएं हाथ से पकड़ें। कैनुला को धीरे-धीरे, मुंह के साथ, दाहिने हाथ से ऊपर की ओर धकेलें, मैंडिबुलर एपिग्लोटिस तक। श्वासनली को खोजने के लिए कैनुला पेन के प्रकाश का उपयोग करें, और धीरे-धीरे इसे श्वासनली में डालें (चित्रा 4)।
- श्वासनली में कैनुला डाले जाने के बाद, इंटुबैशन पेन को धीरे-धीरे वापस लें, और कैनुला को अंदर छोड़ दें। पाश्चर पिपेट को कैनुला जोड़ में डालें, और सिर दबाएं (चित्रा 5)।
नोट: यदि माउस की छाती उभार है, तो इंटुबैशन सफल है (चित्रा 6)। - सफल एंडोट्रेकियल इंटुबैशन के बाद, चूहों को फ्लैट-हेड माइक्रोसिरिंज14,15 (चित्रा 7) का उपयोग करके कैनुला के माध्यम से 3 मिलीग्राम / एमएल एलपीएस के साथ 3 मिलीग्राम / एमएल एलपीएस के साथ स्थापित करें।
- एक बार ऐसा करने के बाद, कैनुला और माइक्रोसिरिंज को हटा दें। मचान से माउस निकालें, और इसे ठीक करने के लिए अलग से पिंजरे में रखें। माउस की श्वसन स्थिति का निरीक्षण करें जब तक कि वह ठीक न हो जाए और फिर से आ जाए।
नोट: एलपीएस श्वासनली के बाद 12 घंटे में, पशु नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित प्रक्रिया का पालन करते हुए चूहों को इच्छामृत्यु दें। मानक प्रक्रियाओं का उपयोग करके सीरम टीएनएफ -α परख और सूखे-गीले फेफड़ों के वजन माप किए गए थे।
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Representative Results
चूहों में एलपीएस इंस्टिलेशन के लिए प्रस्तावित विधि को एलपीएस इंजेक्शन के 12 घंटे बाद भड़काऊ साइटोकिन टीएनएफ -α और फेफड़ों के सूखे-गीले वजन अनुपात की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करके सत्यापित किया गया था। प्रयोग में चार समूह थे: रिक्त नियंत्रण (बिना किसी उपचार के), सर्जिकल इंटुबैशन 16, इंट्रानेसल17,18, और नॉनइनवेसिव ऑरोफरीन्जियल इंटुबैशन (एन = 6)। रिक्त नियंत्रण समूह की तुलना में, नॉनइनवेसिव ऑरोफरीन्जियल इंटुबैशन समूह में सीरम टीएनएफ -α के स्तर में काफी वृद्धि हुई थी (चित्रा 8 ए)। फेफड़ों के सूखे-गीले वजन अनुपात में भी वृद्धि हुई थी (चित्रा 8 बी), सर्जिकल श्वासनली इंटुबैशन समूह के समान स्तर तक पहुंच गया। डेटासेट का सांख्यिकीय रूप से एक अप्रकाशित एनोवा और पोस्ट-हॉक मल्टीपल-तुलना टुकी क्रेमर परीक्षणों के साथ विश्लेषण किया गया था। सभी डेटा को एसईएम ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है, और पी < 0.05 के स्तर को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था।
चित्र 1: इंटुबैशन प्लेटफॉर्म फिटिंग और असेंबली। मंच में एक आधार, एक राइजर है, एक पेपर क्लिप, दो रबर बैंड और कुछ तार हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: इंटुबैशन किट। यह आंकड़ा इंटुबैशन किट और इसकी असेंबली को दर्शाता है। इसमें एक पेन लैंप, एक ऑप्टिकल फाइबर और एक कैनुला शामिल है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: माउस निर्धारण. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4: श्वासनली का पता लगाना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 5: पाश्चर पिपेट पंप सत्यापन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 6: छाती की पहले और बाद की छवि सफल इंटुबैशन दिखाती है। (ए) इंटुबैशन से पहले छाती। (बी) इंटुबैशन के बाद छाती; छाती के उभार को दिखाने वाले क्षेत्र को लाल घेरे के साथ चिह्नित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 7: एलपीएस देने के लिए फ्लैट हेड माइक्रोसैंपलर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 8: नॉनइनवेसिव एलपीएस इंस्टिलेशन की वैधता का आकलन । (ए) एलपीएस के एंडोट्रेकियल इंजेक्शन के 12 घंटे बाद सी 57बीएल /6 चूहों के सीरम में टीएनएफ -α की अभिव्यक्ति। (बी) फेफड़ों के ऊतकों के शुष्क-गीले वजन अनुपात का डेटा विश्लेषण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
प्रारंभ में, हमने श्वासनली19 के स्थान का पता लगाने के लिए मौखिक गुहा के अंदर देखा। हालांकि, इस प्रक्रिया के दौरान, हमने पाया कि सी 57 / बीएल चूहों की श्वासनली संकीर्ण है, जिससे एंडोस्कोप20 जैसे उपकरणों की मदद के बिना इस विधि द्वारा सही स्थान ढूंढना मुश्किल हो जाता है। आगे की खोज पर, हमने पाया कि इंटुबेटर लैंप से प्रकाश शरीर की सतह में प्रवेश कर सकता है, जिससे ऑपरेटर को कैनुला21 की स्थिति निर्धारित करने की अनुमति मिलती है।
यह जांचने के लिए कि ट्यूब श्वासनली में प्रवेश कर गई है या नहीं, शुरू में, हमने एक छोटे दर्पण का उपयोग करने की कोशिश की, जिसे बर्फ पर रखकर ठंडा किया गया था। इंटुबैशन के बाद, हमने कैनुला खोलने के लिए एक दर्पण का उपयोग किया। यदि दर्पण पर धुंध दिखाई देती है, तो इंटुबैशन को सफल माना जाता था। हालांकि, हमने पाया कि यह परीक्षा विधि सटीक रूप से यह निर्धारित नहीं कर सकी कि कैनुला ने श्वासनली में प्रवेश किया था या नहीं। सबसे पहले, कैनुला सिर माउस के मुंह के करीब था, और यह निर्धारित नहीं किया जा सकता था कि दर्पण पर दिखाई देने वाली धुंध मुंह से निकलने वाली गैस के कारण थी या नहीं। दूसरा, दर्पण को ठंडा करने की आवश्यकता थी। लगातार उपयोग पर, दर्पण को ठंडा करने के लिए आवश्यक समय ने प्रयोग के समय में भी वृद्धि की। फिर हमने श्वासनली में हवा पंप करने के लिए एक पाश्चर पिपेट का उपयोग किया; यदि प्रवेशनी को श्वासनली में डाला जाता है, तो माउस की छाती सूज जाएगी, और यदि इसे अन्नप्रणाली में डाला जाता है, तो दायां निचलापेट सूज जाएगा। इसलिए, हमने इस विधि का उपयोग यह तय करने के आधार के रूप में किया कि इंटुबैशन सफल था या नहीं।
सर्जिकल श्वासनली इंटुबैशन की तुलना में, नॉनइनवेसिव ऑरोफरीन्जियल इंटुबैशन सर्जिकल घावों से बचता है औरप्रयोगात्मक जानवरों की जीवित रहने की दर में सुधार करता है। इंट्रानेसल इंटुबैशन की तुलना में, नॉनइनवेसिव ऑरोफरीन्जियल इंटुबैशन ब्रोन्कस और फेफड़ों में कैनुला के अधिक सटीक प्रवेश की ओर जाताहै। हालांकि, इन तकनीकी कौशल में महारत हासिल करने के लिए बहुत अभ्यास की आवश्यकता होती है। छोटे शरीर के आकार वाले चूहों के मामले में, श्वासनली में कैनुला डालना मुश्किल है, और ऑपरेशन के दौरान श्वासनली को आसानी से खरोंच सकते हैं। इसलिए, हम सुझाव देते हैं कि प्रयोग के लिए बड़े शरीर के आकार वाले चूहों का चयन किया जाना चाहिए।
विधि का उपयोग ब्रोन्कस और फेफड़ों को अन्य तरल दवाओं को वितरित करने के लिए भी किया जा सकता है, इस प्रकार इसका अर्थ है कि इसमें व्यापक अनुप्रयोग क्षमता25,26 है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (संख्या: 81903902), चीन पोस्टडॉक्टरल साइंस फाउंडेशन (संख्या: 2019 एम 663457), सिचुआन विज्ञान और प्रौद्योगिकी कार्यक्रम (संख्या: 2020वाईजे0172), और टीसीएम के चेंगदू विश्वविद्यालय के जिंगलिन स्कॉलर रिसर्च प्रीमोशन प्रोजेक्ट (संख्या: QJRC2022053) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipopolysaccharide | MERK | L4130 | LPS |
| Microliter Syringes | SHANGHAI GAOGE INDUSTRY AND TRADE CO., LTD | 10028505008124 | To deliver LPS |
| Mouse cannula | RWD Life Science | 803-03008-00 | Mouse cannula |
| Mouse intubation kit | RWD Life Science | 903-03027-00 | Including a base, a riser, a intubator, a surgical forceps and some strings |
| Pasteur pipette | Biosharp life science | BS-XG-03 | To verify the success of intubation |
| Pentobarbital sodium | Beijing Chemical Co., China | 20220918 | To anesthetize mice |
References
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