Summary
ここでは、非侵襲的中咽頭気管内挿管 を介した 気管内リポ多糖(LPS)送達のプロトコルを提案します。この方法は、動物の外科的処置の外傷を最小限に抑え、LPSを気管、次に肺に正確に送達します。
Abstract
リポ多糖(LPS)またはエンドトキシンによって誘導される急性肺損傷(ALI)マウスモデルは、急性肺損傷または急性炎症の動物実験において依然として最も一般的に使用されているモデルの1つです。急性肺損傷マウスモデルにおいて現在最も一般的に使用されている方法は、LPSの腹腔内注射とLPSの気管注入のための気管切開である。しかし、前者の方法は肺の標的化を欠いて他の臓器に損傷を与え、後者の方法は手術外傷、感染リスク、および低い生存率を誘発します。ここでは,マウスへのLPS点滴に対する非侵襲的中咽頭気管内挿管法を推奨する.この方法では、LPSは、気管内挿管のための装置の助けを借りて肺に点滴される口腔咽頭腔を通して気管に非侵襲的に導入される。この方法は、肺の標的化を保証するだけでなく、動物の損傷や死亡のリスクを回避します。このアプローチは、急性肺障害の分野で広く使用されるようになることが期待されます。
Introduction
急性肺損傷(ALI)は一般的な臨床症候群です。さまざまな病原性因子の下で、肺上皮細胞および血管内皮細胞の生理学的障壁の破壊は、肺胞透過性の増加をもたらし、それによって肺コンプライアンスの低下、肺水腫、および重度の低酸素血症を引き起こします1。急性呼吸窮迫症候群(ARDS)は、ALIの最も重篤な形態です。制御されていない炎症と酸化ストレス損傷は、ALIとより重篤なARDSの主な原因であると考えられています2。外傷により肺胞上皮細胞が直接傷害を受けると、肺胞マクロファージの炎症反応連鎖が活性化し、肺に炎症が起こります3。世界的には、年間300万人以上の急性ARDS患者がおり、集中治療室の入院の約10%を占めています。さらに、重症例の死亡率は46%と高い4,5,6。したがって、その病因を研究するためにALIの適切な動物モデルを確立する必要がある。マウスは、その気道がALI研究のためにヒトの気道をうまくシミュレートできるため、ALIの研究で最も一般的に使用される実験動物です。さらに、ALIは、大量の炎症性細胞浸潤、肺血管透過性の増加、および肺水腫として現れます。血清中の炎症性サイトカインおよび肺乾燥湿潤重量比の変化は、ALI7の程度を反映する。
現在、マウスにおけるLPS誘発ALIをモデル化するための主な方法には、鼻腔内および外科的気管挿管が含まれます8,9。今回,非侵襲的中咽頭挿管によりLPSを気管内に送達する新しい手法を提案する.この方法は、照明付き挿管器を使用してマウスの気管を見つけ、LPSを気管と肺に送達します。この方法は、鼻腔内送達法よりも正確にLPSを肺に送達する。外科的気管挿管と比較して、この方法は手術を必要とせず、創傷を引き起こすことを回避し、マウスの痛みを軽減する10。したがって、この方法は、ALIのより説得力のあるマウスモデルを確立するために使用することができる。
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Protocol
動物実験プロトコルは、成都中医薬大学の管理委員会によってレビューおよび承認されました(記録番号2021-11)。雄のC57 / BLマウス(20〜25 g、6〜8週齢)を本研究に使用しました。マウスは動物室で飼育され、実験中は自由に飲んだり食べたりした。
1. 事前準備
- 挿管プラットフォームがベース、ライザー、ペーパークリップ、2つの輪ゴム、およびいくつかのひもで構成されていることを確認してください。ひもを取り、ライザーの上部にある2つの穴にひもを通し、ひもの両端をそれぞれライザー上部の小さな突起に結びます。
メモ: 弦と 2 つの穴の間にマウスの頭が通れる場所を空けてください。 - ペーパークリップの両端に 2 本の輪ゴムを結び、ライザーの背面にラバーバンドでペーパークリップをテープで固定します。最後に、ライザーをベースに90°固定します(図1)。
- 適切なサイズと長さのカニューレを選択します。20〜30 gのマウスの場合、22 Gのカテーテル(長さ2.5〜3.8 cm)を使用できます11。カニューレをカニューレペンに組み立て、ペンのライトをオンにします(図2)。
- 小さな外科用鉗子とパスツールピペットを70%アルコールで消毒して準備します。
2.試験化合物の調製
- 3 mgのLPSを1 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH 7.2)に重量および溶解して、濃度3 mg/mLのLPS溶液を形成します。
- 10 mgのペントバルビタールナトリウムを1 mLの生理食塩水に計量して溶解し、1%ペントバルビタールナトリウム溶液を形成します。.0.45 μmシリンジフィルターを使用して溶液をろ過滅菌します。
3.非侵襲的中咽頭点滴
- 50 mg / kg12,13の用量で1%ペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射でマウスに麻酔をかけます。.右反射に対する反応の欠如によって麻酔の深さを決定します。
- 麻酔をかけたマウスを挿管プラットフォームに置きます。上部の前歯を糸で固定し、2つの前足を輪ゴムで固定します(図3)。
- ピンセットで舌を引き抜き、左手で持ちます。カニューレを口に沿ってゆっくりと、右手を上げて下顎喉頭蓋まで押します。カニューレペンの光を使って気管を見つけ、ゆっくりと気管に挿入します(図4)。
- カニューレを気管に挿入した後、挿管ペンをゆっくりと引き出し、カニューレを中に入れたままにします。パスツールピペットをカニューレジョイントに挿入し、ヘッドを押します(図5)。
注意: マウスの胸が膨らんでいる場合、挿管は成功しています(図6)。 - 気管内挿管が成功した後、フラットヘッドマイクロシリンジ14,15を使用して、カニューレを通して3 mg / kgで3 mg / mLのLPSをマウスに注入します(図7)。
- 完了したら、カニューレとマイクロシリンジを取り外します。マウスを足場から取り外し、別々にケージに入れて回復します。マウスが回復して意識を取り戻すまで、マウスの呼吸状態を観察します。
注:LPS気管点滴注入後12時間で、動物倫理委員会によって承認された手順に従ってマウスを安楽死させます。血清TNF−αアッセイおよび乾湿肺重量測定は、標準的な手順を用いて実施した。
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Representative Results
LPS点眼後12時間における炎症性サイトカインTNF-αの発現と肺乾湿重量比を評価することにより,マウスにおけるLPS点滴の提案方法を検証した。実験には、ブランクコントロール(治療なし)、外科的挿管16、鼻腔内挿管17,18、および非侵襲的中咽頭挿管(n = 6)の4つのグループがありました。ブランク対照群と比較して、非侵襲的中咽頭挿管群における血清TNF−αレベルは有意に増加した(図8A)。肺乾湿重量比も増加し(図8B)、外科的気管挿管群と同じレベルに達した。データセットは、対応のないANOVAおよび事後多重比較Tukey Kramer検定を使用して統計的に分析されました。すべてのデータはSEM±平均値として示され、p < 0.05のレベルは統計的に有意であると考えられた。
図1:挿管プラットフォームのフィッティングとアセンブリ。 プラットフォームは、ベース、ライザー、ペーパークリップ、2つの輪ゴム、およびいくつかのストリングで構成されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:挿管キット。 この図は、挿管キットとその組み立てを示しています。これには、ペンランプ、光ファイバー、カニューレが含まれます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:マウスの固定。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:気管の位置を特定する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:パスツールピペットポンプの検証。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:挿管が成功したことを示す胸部の前後の画像 。 (A)挿管前の胸部。(B)挿管後の胸部;胸の膨らみを示す領域は赤い円でマークされています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:LPSを送達するためのフラットヘッドマイクロサンプラー。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図8:非侵襲的LPS点滴の妥当性の評価 。 (A)LPS気管内注射12時間後のC57BL/6マウスの血清中のTNF-αの発現。(B)肺組織乾湿重量比のデータ解析。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
最初に、気管19の位置を見つけるために口腔内を調べました。しかし、この過程で、C57/BLマウスの気管が狭く、内視鏡20などの機器の助けを借りずにこの方法で正しい位置を見つけることが困難であることを発見しました。さらなる調査の結果、挿管器ランプからの光が体の表面を透過し、オペレータがカニューレ21の位置を決定することを可能にすることを見出した。
チューブが気管に入ったかどうかを確認するために、最初に、氷の上に置いて冷却した小さな鏡を使用してみました。挿管後、鏡を用いてカニューレ開口部に近づいた。鏡に霧が現れた場合、挿管は成功したと見なされました。しかし、この検査方法では、カニューレが気管に入ったかどうかを正確に判断できないことがわかりました。まず、カニューレの頭部がマウスの口に近く、鏡に現れたミストが口からの呼気によるものかどうかは判断できませんでした。第二に、ミラーを冷却する必要がありました。常時使用すると、ミラーを冷却するのに必要な時間も実験時間の増加につながりました。次に、パスツールピペットを使用して気管に空気を送り込みました。カニューレを気管に挿入するとマウスの胸が腫れ、食道に挿入すると右下腹部が腫れます22。そこで,挿管が成功したかどうかの判断基準としてこの方法を用いた。
外科的気管挿管と比較して、非侵襲的中咽頭挿管は外科的創傷を回避し、実験動物の生存率を改善する23。鼻腔内挿管と比較して、非侵襲的中咽頭挿管は、気管支および肺へのカニューレのより正確な進入をもたらす24。ただし、これらの技術スキルを習得するには、多くの練習が必要です。体格の小さいマウスの場合、気管へのカニューレの挿入が難しく、手術中に気管に傷がつきやすくなります。したがって、より大きな体サイズのマウスを実験のために選択することをお勧めします。
この方法は、気管支や肺に他の液体薬物を送達するためにも使用できるため、幅広い応用の可能性を秘めています25,26。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
本研究は、中国国家自然科学基金会(第81903902号)、中国ポスドク科学基金会(第2019M663457号)、四川省科学技術プログラム(第2020年版)及び成都大学興林奨学生研究プレモーションプロジェクト(第QJRC2022053号)の支援を受けた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipopolysaccharide | MERK | L4130 | LPS |
| Microliter Syringes | SHANGHAI GAOGE INDUSTRY AND TRADE CO., LTD | 10028505008124 | To deliver LPS |
| Mouse cannula | RWD Life Science | 803-03008-00 | Mouse cannula |
| Mouse intubation kit | RWD Life Science | 903-03027-00 | Including a base, a riser, a intubator, a surgical forceps and some strings |
| Pasteur pipette | Biosharp life science | BS-XG-03 | To verify the success of intubation |
| Pentobarbital sodium | Beijing Chemical Co., China | 20220918 | To anesthetize mice |
References
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