Summary
Her foreslår vi en protokoll for intratrakeal lipopolysakkarid (LPS) levering via ikke-invasiv orofaryngeal endotrakeal intubasjon. Denne metoden minimerer traumer av den kirurgiske prosedyren for dyret og leverer nøyaktig LPS til luftrøret og deretter til lungene.
Abstract
Den akutte lungeskade (ALI) musemodellen indusert av lipopolysakkarid (LPS) eller endotoksin er fortsatt blant de mest brukte modellene i dyrestudier av akutt lungeskade eller akutt betennelse. De mest brukte metodene i musemodeller for akutt lungeskade er intraperitoneal injeksjon av LPS og trakeostomi for trakealinfusjon av LPS. Den førstnevnte metoden mangler imidlertid lungemålretting og skader andre organer, og sistnevnte metode induserer operativt traume, infeksjonsrisiko og lav overlevelse. Her anbefaler vi en ikke-invasiv orofaryngeal endotrakeal intubasjonsmetode for LPS-instillasjon hos mus. I denne metoden blir LPS ikke-invasivt introdusert i luftrøret gjennom orofaryngealhulen som skal innsettes i lungen ved hjelp av et apparat for endotrakeal intubasjon. Denne metoden sikrer ikke bare lungemålretting, men unngår også skade og risiko for død hos dyrene. Vi forventer at denne tilnærmingen vil bli mye brukt innen akutt lungeskade.
Introduction
Akutt lungeskade (ALI) er et vanlig klinisk syndrom. Under en rekke patogene faktorer fører forstyrrelsen av den fysiologiske barrieren til lungeepitelceller og vaskulære endotelceller til økt alveolær permeabilitet, og derved forårsaker nedsatt lungeoverensstemmelse, lungeødem og alvorlig hypoksemi1. Akutt lungesviktsyndrom (ARDS) er den mest alvorlige formen for ALI. Ukontrollert betennelse og oksidativ stressskade anses å være hovedårsakene til ALI og den mer alvorlige ARDS2. Når alveolære epitelceller blir direkte skadet på grunn av traumer, aktiveres den inflammatoriske responskjeden av alveolære makrofager, noe som fører til betennelse i lungen3. Globalt er det mer enn 3 millioner pasienter med akutt ARDS per år, og de står for omtrent 10% av intensivinnleggelsene; I tillegg er dødeligheten i alvorlige tilfeller så høy som 46%4,5,6. Derfor er det behov for å etablere en egnet dyremodell av ALI for å studere patogenesen. Musen er det mest brukte eksperimentelle dyret i studien av ALI, siden luftveiene kan simulere menneskets luftveier godt for ALI-studier. Videre manifesterer ALI seg som massiv inflammatorisk celleinfiltrasjon, økt pulmonal vaskulær permeabilitet og lungeødem. Endringene i inflammatoriske cytokiner i serum og forholdet mellom tørr og våt vekt i lungene gjenspeiler graden av ALI7.
For tiden inkluderer de viktigste metodene for modellering av LPS-indusert ALI hos mus intranasal og kirurgisk trakeal intubasjon 8,9. Her foreslår vi en ny metode for å levere LPS inn i luftrøret via ikke-invasiv orofaryngeal intubasjon. Denne metoden bruker en opplyst intubator for å finne luftrøret til musen og leverer deretter LPS inn i luftrøret og lungen. Denne metoden leverer LPS til lungene mer nøyaktig enn den intranasale leveringsmetoden. Sammenlignet med kirurgisk trakeal intubasjon, krever denne metoden ikke kirurgi, unngår å forårsake sår og reduserer smerte hos mus10. Derfor kan denne metoden brukes til å etablere en mer overbevisende musemodell av ALI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøksprotokollen ble gjennomgått og godkjent av styringskomiteen ved Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (Record No. 2021-11). Mannlige C57/BL-mus (20-25 g, 6-8 uker gamle) ble brukt i denne studien. Musene ble holdt i et dyrekammer og var fri til å drikke og spise under forsøket.
1. Forberedelse
- Forsikre deg om at intubasjonsplattformen består av en base, en stigerør, en binders, to gummibånd og noen strenger. Ta en streng, før strengen gjennom de to hullene på toppen av stigerøret, og bind henholdsvis de to endene av strengen til de små fremspringene på toppen av stigerøret.
MERK: La det være rom for musens hode å passere gjennom mellom strengen og de to hullene. - Bind to gummistrikker til hver ende av binders, og teip bindersen med gummistrikkene på baksiden av stigerøret. Til slutt fester du stigerøret til basen ved 90° (figur 1).
- Velg en kanyle av passende størrelse og lengde. For en 20-30 g mus kan et 22 G kateter (2,5-3,8 cm langt) brukes11. Monter kanylen på en kanylepinne, og slå på pennens lys (figur 2).
- Forbered små kirurgiske tang og en Pasteur-pipette ved å desinfisere dem med 70% alkohol.
2. Fremstilling av testforbindelsen
- Vekt og løs opp 3 mg LPS i 1 ml fosfatbufret saltvann (PBS, pH 7,2) for å danne en LPS-oppløsning med en konsentrasjon på 3 mg/ml.
- Vei og oppløs 10 mg pentobarbitalnatrium i 1 ml normal saltoppløsning for å danne en 1% pentobarbital natriumoppløsning. Filtrer steriliser løsningen ved hjelp av et 0,45 μm sprøytefilter.
3. Ikke-invasiv orofaryngeal instillasjon
- Bedøv musene med en intraperitoneal injeksjon av 1% pentobarbitalnatrium i en dose på 50 mg / kg12,13. Bestem dybden av anestesi ved mangel på respons på høyrerefleksen.
- Plasser den bedøvede musen på intubasjonsplattformen. Fest de øverste fortennene med tråden og de to forføttene med gummistrikkene (figur 3).
- Trekk tungen ut med pinsett, og hold den med venstre hånd. Skyv kanylen sakte, langs munnen, med høyre hånd opp, til mandibulær epiglottis. Bruk lyset fra kanylepennen til å finne luftrøret, og stikk det langsomt inn i luftrøret (figur 4).
- Etter at kanylen er satt inn i luftrøret, trekker du intubasjonspennen sakte ut og lar kanylen være inne. Sett Pasteur-pipetten inn i kanyleleddet, og trykk på hodet (figur 5).
MERK: Hvis brystet på musen buler, er intubasjonen vellykket (figur 6). - Etter vellykket endotrakeal intubasjon drypper musene med 3 mg/ml LPS ved 3 mg/kg gjennom kanylen ved hjelp av en mikrosprøyte med flatt hode14,15 (figur 7).
- Når du er ferdig, fjern kanylen og mikrosprøyten. Fjern musen fra stillaset, og plasser den i et bur separat for å gjenopprette. Vær oppmerksom på musens åndedrettstilstand til den har gjenopprettet og gjenvunnet bevisstheten.
MERK: Ved 12 timer etter LPS trakeal instillasjon, avlive musene etter prosedyren godkjent av dyreetikkomiteen. Serum-TNF-α-analyser og tørrvåte lungevektmålinger ble utført etter standard prosedyrer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den foreslåtte metoden for LPS-instillasjon hos mus ble verifisert ved å evaluere ekspresjonen av det inflammatoriske cytokinet TNF-α og lungetørr-våtvektforholdet 12 timer etter LPS-instillasjon. Det var fire grupper i forsøket: blank kontroll (uten behandling), kirurgisk intubasjon16, intranasal17,18 og ikke-invasiv orofaryngeal intubasjon (n = 6). Sammenliknet med den tomme kontrollgruppen var TNF-α nivåene i serum i gruppen som ikke invasiv orofaryngeal intubasjon signifikant økt (figur 8A). Forholdet mellom tørr og våt vekt i lungene var også økt (figur 8B), og kom opp på samme nivå som i gruppen som fikk kirurgisk trakeal intubasjon. Datasettene ble statistisk analysert med en uparret ANOVA og post-hoc multiple-comparisons Tukey Kramer-tester. Alle data er presentert som gjennomsnitt ± SEM, og et nivå på p < 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Figur 1: Intubasjonsplattformbeslag og montering. Plattformen består av en base, en stigerør, en binders, to gummistrikker og noen strenger. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Intubasjonssett. Denne figuren viser intubasjonssettet og dets montering. Dette inkluderer en pennelampe, en optisk fiber og en kanyle. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Musefiksering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Lokalisering av luftrøret. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Verifisering av pasteur-pipettepumpe. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Før og etter bilde av brystkassen som viser vellykket intubasjon. (A) Bryst før intubasjon. (B) Bryst etter intubasjon; Området som viser utbuling av brystet er merket med en rød sirkel. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Mikrosampler med flatt hode for levering av LPS. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Vurdering av validiteten av den ikke-invasive LPS-instillasjonen . (A) Ekspresjon av TNF-α i serum hos C57BL/6 mus 12 timer etter en endotrakeal injeksjon av LPS. (B) Dataanalyse av lungevevets tørr-våtvektforhold. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Først så vi inn i munnhulen for å finne plasseringen av luftrøret19. Under denne prosessen oppdaget vi imidlertid at luftrøret til C57/BL-mus er smalt, noe som gjør det vanskelig å finne riktig plassering ved denne metoden uten hjelp av utstyr som endoskop20. Ved nærmere undersøkelser fant vi ut at lyset fra intubatorlampen kunne trenge gjennom overflaten av kroppen, slik at operatøren kunne bestemme posisjonen til kanylen21.
For å sjekke om røret hadde kommet inn i luftrøret, prøvde vi først å bruke et lite speil, som ble avkjølt ved å legge det på is. Etter intubasjon brukte vi speil for å nærme oss kanyleåpningen. Hvis tåke dukket opp på speilet, ble intubasjonen ansett som vellykket. Vi fant imidlertid at denne undersøkelsesmetoden ikke nøyaktig kunne avgjøre om kanylen hadde kommet inn i luftrøret. For det første var kanylehodet nær musens munn, og det kunne ikke fastslås om tåken som dukket opp på speilet var forårsaket av utåndet gass fra munnen. For det andre måtte speilet avkjøles. Ved konstant bruk førte tiden som kreves for å avkjøle speilet også til en økning i eksperimenttiden. Deretter brukte vi en Pasteur-pipette til å pumpe luft inn i luftrøret. Musens bryst ville hovne opp hvis kanylen ble satt inn i luftrøret, og hvis den ble satt inn i spiserøret, ville høyre underliv hovneopp 22. Derfor brukte vi denne metoden som grunnlag for å bedømme om intubasjonen var vellykket.
Sammenlignet med kirurgisk trakeal intubasjon unngår ikke-invasiv orofaryngeal intubasjon kirurgiske sår og bedrer overlevelsen til forsøksdyrene23. Sammenlignet med intranasal intubasjon fører ikke-invasiv orofaryngeal intubasjon til mer nøyaktig innføring av kanylen i bronkus og lunger24. Men å mestre disse tekniskeferdighetene krever mye øvelse. For mus med små kroppsstørrelser er det vanskelig å sette kanylen inn i luftrøret, og man kan lett klø i luftrøret under operasjonen. Derfor foreslår vi at mus med større kroppsstørrelser bør velges for forsøket.
Metoden kan også brukes til å levere andre flytende legemidler til bronkus og lunge, noe som betyr at den har stort applikasjonspotensial25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (nr.: 81903902), China Postdoctoral Science Foundation (nr.: 2019M663457), Sichuan Science and Technology Program (nr.: 2020YJ0172), og Xinglin Scholar Research Premotion Project ved Chengdu University of TCM (nr.: QJRC2022053).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipopolysaccharide | MERK | L4130 | LPS |
| Microliter Syringes | SHANGHAI GAOGE INDUSTRY AND TRADE CO., LTD | 10028505008124 | To deliver LPS |
| Mouse cannula | RWD Life Science | 803-03008-00 | Mouse cannula |
| Mouse intubation kit | RWD Life Science | 903-03027-00 | Including a base, a riser, a intubator, a surgical forceps and some strings |
| Pasteur pipette | Biosharp life science | BS-XG-03 | To verify the success of intubation |
| Pentobarbital sodium | Beijing Chemical Co., China | 20220918 | To anesthetize mice |
References
- Xia, Y., et al. Protective effect of human amnion epithelial cells through endotracheal instillation against lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice. Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi. 33 (1), 7-11 (2017).
- Butt, Y., Kurdowska, A., Allen, T. C. Acute lung injury: A clinical and molecular review. Archives of Pathology and Lab Medicine. 140 (4), 345-350 (2016).
- Ware, L. B., Matthay, M. A. The acute respiratory distress syndrome. The New England Journal of Medicine. 342 (18), 1334-1349 (2000).
- Fan, E., Brodie, D., Slutsky, A. S. Acute respiratory distress syndrome: Advances in diagnosis and treatment. JAMA. 319 (7), 698-710 (2018).
- Meyer, N. J., Gattinoni, L., Calfee, C. S.
- An, N., Yang, T., Zhang, X. X., Xu, M. X. Bergamottin alleviates LPS-induced acute lung injury by inducing SIRT1 and suppressing NF-κB. Innate Immunity. 27 (7-8), 543-552 (2021).
- Liu, L., et al. Comparative study of trans-oral and trans-tracheal intratracheal instillations in a murine model of acute lung injury. The Anatomical Record. 295 (9), 1513-1519 (2012).
- Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. Journal of Visualized Experiments. (52), e2581 (2011).
- Li, J., et al. Panaxydol attenuates ferroptosis against LPS-induced acute lung injury in mice by Keap1-Nrf2/HO-1 pathway. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 96 (2021).
- Zhou, Y., et al. Soluble epoxide hydrolase inhibitor attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung injury and improves survival in mice. Shock. 47 (5), 638-645 (2017).
- Nosaka, N., et al. Optimal tube length of orotracheal intubation for mice. Laboratory Animals. 53 (1), 79-83 (2019).
- Cicero, L., Fazzotta, S., Palumbo, V. D., Cassata, G., Lo Monte, A. I. Anaesthesia protocols in laboratory animals used for scientific purposes. Acta Bio-Medica: Atenei Parmensis. 89 (3), 337-342 (2018).
- Ehrentraut, H., Weisheit, C. K., Frede, S., Hilbert, T. Inducing acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation. Journal of Visualized Experiments. (149), e59999 (2019).
- Yang, H., et al. STAT6 inhibits ferroptosis and alleviates acute lung injury by regulating P53/SLC7A11 pathway. Cell Death & Disease. 13 (6), 530 (2022).
- Aramaki, O., et al. Induction of operational tolerance and generation of regulatory cells after intratracheal delivery of alloantigen combined with nondepleting anti-CD4 monoclonal antibody. Transplantation. 76 (9), 1305-1314 (2003).
- Lan, W. Activation of mammalian target of rapamycin (mTOR) in a murine model of lipopolysaccharide (LPS) -induced acute lung injury (ALI). Peking Union Medical College. , PhD Thesis (2010).
- Lv, H., et al. Tenuigenin ameliorates acute lung injury by inhibiting NF-κB and MAPK signalling pathways. Respiratory Physiology & Neurobiology. 216, 43-51 (2015).
- Yang, H., Lv, H., Li, H., Ci, X., Peng, L. Oridonin protects LPS-induced acute lung injury by modulating Nrf2-mediated oxidative stress and Nrf2-independent NLRP3 and NF-κB pathways. Cell Communication and Signaling. 17 (1), 62 (2019).
- Im, G. H., et al. Improvement of orthotopic lung cancer mouse model via thoracotomy and orotracheal intubation enabling in vivo imaging studies. Laboratory Animals. 48 (2), 124-131 (2014).
- Hamacher, J., et al. Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: description, evaluation and comparison with transillumination. Laboratory Animals. 42 (2), 222-230 (2008).
- Nelson, A. M., Nolan, K. E., Davis, I. C.
- Zhang, S., et al. Microvesicles packaging IL-1β and TNF-α enhance lung inflammatory response to mechanical ventilation in part by induction of cofilin signaling. International Immunopharmacology. 63, 74-83 (2018).
- Feng, Z. Comparative study of different intratracheal instillation in acute lung injury model of mice. Jilin University. , Master's Thesis (2010).
- Chen, J. H., et al. Comparison of acute lung injury mice model established by intranasal and intratracheal instillation of lipopolysaccharide. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (02), 222-227 (2022).
- Luckow, B., Lehmann, M. H. A simplified method for bronchoalveolar lavage in mice by orotracheal intubation avoiding tracheotomy. BioTechniques. 71 (4), 534-537 (2021).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).
