Summary
Neste trabalho, propomos um protocolo para a administração intratraqueal de lipopolissacarídeo (LPS) via intubação endotraqueal orofaríngea não invasiva. Este método minimiza o trauma do procedimento cirúrgico para o animal e entrega com precisão LPS para a traqueia e, em seguida, para os pulmões.
Abstract
O modelo de lesão pulmonar aguda (LPA) em camundongos induzida por lipopolissacarídeo (LPS) ou endotoxina ainda está entre os modelos mais comumente utilizados em estudos animais de lesão pulmonar aguda ou inflamação aguda. Os métodos atualmente mais utilizados em modelos de lesão pulmonar aguda em camundongos são a injeção intraperitoneal de LPS e a traqueostomia para a infusão traqueal de LPS. No entanto, o primeiro método não tem como alvo o pulmão e danifica outros órgãos, e o segundo método induz trauma operatório, risco de infecção e baixa taxa de sobrevida. Aqui, recomendamos um método não invasivo de intubação orofaríngea endotraqueal para instilação de LPS em camundongos. Nesse método, o LPS é introduzido de forma não invasiva na traqueia através da cavidade orofaríngea para ser instilado no pulmão com o auxílio de um aparelho para intubação endotraqueal. Este método não só garante a segmentação pulmonar, mas também evita danos e o risco de morte nos animais. Esperamos que essa abordagem se torne amplamente utilizada no campo da lesão pulmonar aguda.
Introduction
A lesão pulmonar aguda (LPA) é uma síndrome clínica comum. Sob uma variedade de fatores patogênicos, a ruptura da barreira fisiológica das células epiteliais pulmonares e das células endoteliais vasculares leva ao aumento da permeabilidade alveolar, causando diminuição da complacência pulmonar, edema pulmonar e hipoxemia grave1. A síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA) é a forma mais grave de LPA. A inflamação não controlada e os danos causados pelo estresse oxidativo são considerados as principais causas de LPA e de SDRA mais grave2. Quando as células epiteliais alveolares são diretamente lesadas devido ao trauma, a cadeia de resposta inflamatória dos macrófagos alveolares é ativada, levando à inflamação nopulmão3. Globalmente, há mais de 3 milhões de pacientes com SDRA aguda por ano, e eles respondem por aproximadamente 10% das admissões em unidades de terapia intensiva; Além disso, a taxa de mortalidade nos casos graves chega a 46%4,5,6. Portanto, há necessidade de se estabelecer um modelo animal adequado de LPA para estudar sua patogênese. O camundongo é o animal experimental mais comumente usado no estudo da LPA, uma vez que seu trato respiratório pode simular bem o trato respiratório humano para estudos de LPA. Além disso, a LPA manifesta-se como infiltrado maciço de células inflamatórias, aumento da permeabilidade vascular pulmonar e edema pulmonar. As alterações nas citocinas inflamatórias no soro e na relação peso seco-úmido do pulmão refletem o grau de LPA7.
Atualmente, os principais métodos para modelagem da LPA induzida por LPS em camundongos incluem a intubação traqueal intranasal e cirúrgica 8,9. Aqui, propomos um novo método para liberar LPS na traqueia via intubação orofaríngea não invasiva. Este método usa um intubador iluminado para encontrar a traqueia do rato e, em seguida, entrega LPS na traqueia e pulmão. Este método entrega LPS aos pulmões com mais precisão do que o método intranasal de entrega. Comparado à intubação traqueal cirúrgica, esse método não requer cirurgia, evita ferimentos e reduz a dor em camundongos10. Portanto, esse método pode ser usado para estabelecer um modelo de LPA em camundongos mais convincente.
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Protocol
O protocolo de experimentação animal foi revisado e aprovado pelo Comitê de Gestão da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu (Registro No. 2021-11). Camundongos C57/BL machos (20-25 g, 6-8 semanas de idade) foram utilizados para o presente estudo. Os camundongos foram mantidos em uma câmara de animais e foram livres para beber e comer durante o experimento.
1. Preparo
- Certifique-se de que a plataforma de intubação seja composta por uma base, um riser, um clipe de papel, dois elásticos e algumas cordas. Pegue uma corda, passe a corda através dos dois orifícios no topo do riser e amarre as duas extremidades da corda, respectivamente, às pequenas saliências no topo do riser.
NOTA: Deixe espaço para a cabeça do rato passar entre a corda e os dois orifícios. - Amarre dois elásticos em cada extremidade do clipe de papel e tape o clipe de papel com os elásticos na parte de trás do riser. Por fim, fixe o riser na base a 90° (Figura 1).
- Selecione uma cânula do tamanho e comprimento apropriados. Para um camundongo de 20−30 g, pode-se utilizar um cateter de 22 G (2,5−3,8 cm de comprimento)11. Monte a cânula em uma caneta de cânula e acenda a luz da caneta (Figura 2).
- Prepare pequenas pinças cirúrgicas e uma pipeta de Pasteur desinfetando-as com álcool a 70%.
2. Preparação do composto de ensaio
- Pesar e dissolver 3 mg de LPS em 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,2) para formar uma solução de LPS com concentração de 3 mg/mL.
- Pesar e dissolver 10 mg de pentobarbital sódico em 1 ml de solução salina normal para formar uma solução de pentobarbital sódico a 1%. Filtrar-esterilizar a solução usando um filtro de seringa de 0,45 μm.
3. Instilação orofaríngea não invasiva
- Anestesiar os camundongos com injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico a 1% na dose de 50 mg/kg12,13. Determinar a profundidade da anestesia pela falta de resposta ao reflexo de retificação.
- Coloque o mouse anestesiado na plataforma de intubação. Fixar os dentes anteriores superiores com o fio e os dois antepés com os elásticos (Figura 3).
- Puxe a língua para fora com uma pinça e segure-a com a mão esquerda. Empurre a cânula lentamente, ao longo da boca, com a mão direita para cima, até a epiglote mandibular. Use a luz da caneta de cânula para encontrar a traqueia e insira-a lentamente na traqueia (Figura 4).
- Depois que a cânula tiver sido inserida na traqueia, retire a caneta de intubação lentamente e deixe a cânula dentro. Insira a pipeta de Pasteur na junta da cânula e pressione a cabeça (Figura 5).
NOTA: Se o tórax do mouse protuberância, a intubação é bem-sucedida (Figura 6). - Após intubação endotraqueal bem-sucedida, instilar os camundongos com 3 mg/mL de LPS a 3 mg/kg através da cânula usando uma microseringa de cabeça plana14,15 (Figura 7).
- Feito isso, retire a cânula e a microseringa. Retire o mouse do andaime e coloque-o em uma gaiola separadamente para recuperar. Observe o estado respiratório do camundongo até que ele tenha se recuperado e recuperado a consciência.
OBS: Após 12 h após a instilação traqueal do LPS, eutanasiar os camundongos seguindo o procedimento aprovado pelo comitê de ética animal. Dosagens séricas de TNF-α e medidas de peso pulmonar seco-úmido foram realizadas usando procedimentos padrão.
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Representative Results
O método proposto para instilação de LPS em camundongos foi verificado avaliando-se a expressão da citocina inflamatória TNF-α e a relação peso seco-úmido pulmonar 12 h após a instilação de LPS. Foram quatro grupos no experimento: controle em branco (sem tratamento), intubação cirúrgica16, intranasal17,18 e intubação orofaríngea não invasiva (n = 6). Em comparação com o grupo controle branco, os níveis séricos de TNF-α no grupo intubação orofaríngea não invasiva estavam significativamente aumentados (Figura 8A). A relação peso seco/úmido do pulmão também estava aumentada (Figura 8B), atingindo o mesmo nível do grupo intubação traqueal cirúrgica. Os conjuntos de dados foram analisados estatisticamente com ANOVA não pareada e testes post-hoc de comparações múltiplas de Tukey Kramer. Todos os dados são apresentados como média ± EPM, sendo considerado estatisticamente significante um nível de p < 0,05.
Figura 1: Montagem e encaixe da plataforma de intubação. A plataforma é composta por uma base, um riser, um clipe de papel, dois elásticos e algumas cordas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Kit de intubação. Esta figura mostra o kit de intubação e sua montagem. Isso inclui uma lâmpada de caneta, uma fibra óptica e uma cânula. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Fixação do mouse. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Localização da traqueia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Verificação da bomba de pipeta Pasteur. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Imagem antes e depois do tórax mostrando intubação bem-sucedida . (A) Tórax antes da intubação. (B) Tórax após intubação; A área que mostra o abaulamento do peito é marcada com um círculo vermelho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Microamostrador de cabeça plana para entrega de LPS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Avaliação da validade da instilação não invasiva de LPS. (A) Expressão de TNF-α no soro de camundongos C57BL/6 12 h após injeção endotraqueal de LPS. (B) Análise dos dados da relação peso seco-úmido do tecido pulmonar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Inicialmente, foi realizada uma busca no interior da cavidade oral para encontrar a localização datraqueia19. No entanto, durante esse processo, descobrimos que a traqueia de camundongos C57/BL é estreita, o que dificulta encontrar a localização correta por esse método sem o auxílio de equipamentos como um endoscópio20. Após uma exploração mais aprofundada, verificou-se que a luz da lâmpada do intubador poderia penetrar na superfície do corpo, permitindo ao operador determinar a posição da cânula21.
Para verificar se o tubo havia entrado na traqueia, inicialmente, tentou-se usar um pequeno espelho, que foi resfriado colocando-o sobre gelo. Após a intubação, utilizamos um espelho para abordagem da abertura da cânula. Se a névoa aparecesse no espelho, a intubação era considerada bem-sucedida. No entanto, descobrimos que esse método de exame não foi capaz de determinar com precisão se a cânula havia entrado na traqueia. Primeiro, a cabeça da cânula estava próxima à boca do rato, e não foi possível determinar se a névoa que apareceu no espelho foi causada pelo gás exalado da boca. Segundo, o espelho precisava ser resfriado. Após o uso constante, o tempo necessário para resfriar o espelho também levou a um aumento no tempo de experimento. Em seguida, usamos uma pipeta de Pasteur para bombear ar para a traqueia; O tórax do camundongo incharia se a cânula fosse inserida na traqueia e, se fosse inserida no esôfago, o abdome inferior direito incharia22. Portanto, usamos esse método como base para julgar se a intubação foi bem-sucedida.
Comparada à intubação traqueal cirúrgica, a intubação orofaríngea não invasiva evita feridas cirúrgicas e melhora a sobrevida dos animais experimentais23. Comparada à intubação intranasal, a intubação orofaríngea não invasiva leva a uma entrada mais precisa da cânula no brônquio e nos pulmões24. No entanto, dominar essas habilidades técnicas requer muita prática. No caso de camundongos com tamanhos corporais pequenos, inserir a cânula na traqueia é difícil, e pode-se facilmente coçar a traqueia durante a operação. Portanto, sugerimos que camundongos com tamanhos corporais maiores sejam selecionados para o experimento.
O método também pode ser utilizado para liberar outros fármacos líquidos para o brônquio e o pulmão, o que significa que tem amplo potencial de aplicação25,26.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No.: 81903902), pela China Postdoctoral Science Foundation (No.: 2019M663457), pelo Programa de Ciência e Tecnologia de Sichuan (No.: 2020YJ0172) e pelo Xinglin Scholar Research Premotion Project da Universidade de Chengdu da TCM (No.: QJRC2022053).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipopolysaccharide | MERK | L4130 | LPS |
| Microliter Syringes | SHANGHAI GAOGE INDUSTRY AND TRADE CO., LTD | 10028505008124 | To deliver LPS |
| Mouse cannula | RWD Life Science | 803-03008-00 | Mouse cannula |
| Mouse intubation kit | RWD Life Science | 903-03027-00 | Including a base, a riser, a intubator, a surgical forceps and some strings |
| Pasteur pipette | Biosharp life science | BS-XG-03 | To verify the success of intubation |
| Pentobarbital sodium | Beijing Chemical Co., China | 20220918 | To anesthetize mice |
References
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