Summary
Здесь мы предлагаем протокол интратрахеальной доставки липополисахаридов (ЛПС) с помощью неинвазивной орофарингеальной эндотрахеальной интубации. Этот метод минимизирует травматичность хирургического вмешательства для животного и точно доставляет ЛПС в трахею, а затем в легкие.
Abstract
Модель мышей с острым повреждением легких (ОПЛ), индуцированная липополисахаридом (ЛПС) или эндотоксином, по-прежнему является одной из наиболее часто используемых моделей в исследованиях на животных острого повреждения легких или острого воспаления. В настоящее время наиболее часто используемыми методами в моделях мышей с острым повреждением легких являются внутрибрюшинная инъекция ЛПС и трахеостомия для трахеальной инфузии ЛПС. Однако в первом методе отсутствует нацеливание на легкие и повреждаются другие органы, а второй метод вызывает операционную травму, риск инфекции и низкую выживаемость. Здесь мы рекомендуем неинвазивный метод орофарингеальной эндотрахеальной интубации для инстилляции ЛПС у мышей. В этом методе ЛПС неинвазивно вводится в трахею через ротоглотку для закапывания в легкое с помощью аппарата для эндотрахеальной интубации. Этот метод не только обеспечивает воздействие на легкие, но и позволяет избежать повреждений и риска смерти животных. Мы ожидаем, что этот подход получит широкое распространение в области острого поражения легких.
Introduction
Острое повреждение легких (ОПЛ) является распространенным клиническим синдромом. Под действием множества патогенных факторов нарушение физиологического барьера эпителиальных клеток легких и эндотелиальных клеток сосудов приводит к увеличению альвеолярной проницаемости, тем самым вызывая снижение податливости легких, отек легких и тяжелую гипоксемию1. Острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС) является наиболее тяжелой формой ОПЛ. Неконтролируемое воспаление и повреждение окислительным стрессом считаются основными причинами ОП и более тяжелого ОРДС2. Когда альвеолярные эпителиальные клетки непосредственно повреждаются из-за травмы, активируется цепочка воспалительного ответа альвеолярных макрофагов, что приводит к воспалению в легком3. Во всем мире ежегодно насчитывается более 3 миллионов пациентов с острым ОРДС, и на их долю приходится примерно 10% госпитализаций в отделения интенсивной терапии; Кроме того, смертность в тяжелых случаях достигает 46%4,5,6. Поэтому существует необходимость в создании подходящей животной модели ОПП для изучения его патогенеза. Мышь является наиболее часто используемым экспериментальным животным при изучении ОПЛ, поскольку ее дыхательные пути могут хорошо имитировать дыхательные пути человека для исследований ОПЛ. Кроме того, ОПГ проявляется в виде массивной воспалительной инфильтрации клеток, повышенной проницаемости легочных сосудов и отека легких. Изменения воспалительных цитокинов в сыворотке крови и соотношения массы сухого и влажного легких отражают степень ALI7.
В настоящее время к основным методам моделирования ЛПС-индуцированного ОПП у мышей относятся интраназальная и хирургическая интубация трахеи 8,9. Здесь мы предлагаем новый метод доставки ЛПС в трахею с помощью неинвазивной орофарингеальной интубации. Этот метод использует интубатор с подсветкой, чтобы найти трахею мыши, а затем доставляет ЛПС в трахею и легкие. Этот метод доставки ЛПС в легкие более точно, чем интраназальный способ доставки. По сравнению с хирургической интубацией трахеи, этот метод не требует хирургического вмешательства, позволяет избежать нанесения ран и уменьшает боль у мышей10. Таким образом, этот метод может быть использован для создания более убедительной мышиной модели ALI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол эксперимента на животных был рассмотрен и одобрен Управляющим комитетом Чэндуского университета традиционной китайской медицины (запись No 2021-11). Для настоящего исследования использовали самцов мышей C57/BL (20-25 г, возраст 6-8 недель). Мыши содержались в камере для животных и могли свободно пить и есть во время эксперимента.
1. Подготовка
- Убедитесь, что платформа для интубации состоит из основания, стояка, канцелярской скрепки, двух резинок и нескольких струн. Возьмите веревку, пропустите веревку через два отверстия в верхней части стояка и привяжите два конца веревки соответственно к небольшим выступам в верхней части стояка.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оставьте место для головы мыши, чтобы пройти между веревкой и двумя отверстиями. - Привяжите две резинки к каждому концу скрепки и прикрепите скрепку резинками к задней части стояка. Наконец, закрепите стояк к основанию под углом 90° (рис. 1).
- Выберите канюлю подходящего размера и длины. Для мыши весом 20−30 г можно использовать катетер 22 г (длиной 2,5−3,8 см)11. Установите канюлю на ручку и включите подсветку ручки (рисунок 2).
- Подготовьте небольшие хирургические щипцы и пипетку Пастера, продезинфицировав их 70% спиртом.
2. Приготовление исследуемого состава
- Взвесьте и растворите 3 мг ЛПС в 1 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS, pH 7,2) с образованием раствора ЛПС с концентрацией 3 мг/мл.
- Взвесьте и растворите 10 мг пентобарбитала натрия в 1 мл физиологического раствора, чтобы получить 1% раствор пентобарбитала натрия. Фильтруйте-стерилизуйте раствор с помощью шприцевого фильтра 0,45 мкм.
3. Неинвазивная орофарингеальная инстилляция
- Обезболивают мышей внутрибрюшинной инъекцией 1% пентобарбитала натрия в дозе 50 мг/кг12,13. Определяют глубину анестезии по отсутствию реакции на выпрямляющий рефлекс.
- Поместите анестезированную мышь на платформу для интубации. Зафиксируйте верхние передние зубы резьбой, а две передние лапы — резинками (рис. 3).
- Вытащите язык пинцетом, а левой рукой зажмите его. Медленно протолкните канюлю вдоль рта, правой рукой вверх, к нижнечелюстному надгортаннику. Используйте свет ручки-канюли, чтобы найти трахею, и медленно вставьте ее в трахею (рисунок 4).
- После того, как канюля была вставлена в трахею, медленно извлеките интубационную ручку и оставьте канюлю внутри. Вставьте пипетку Пастера в соединение канюли и нажмите на головку (Рисунок 5).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если грудная клетка мыши выпячивается, то интубация прошла успешно (рисунок 6). - После успешной эндотрахеальной интубации закапывают мышам 3 мг/мл ЛПС в дозе 3 мг/кг через канюлю с помощью микрошприца с плоской головкой14,15 (рис. 7).
- После этого извлеките канюлю и микрошприц. Снимите мышь с эшафота и поместите ее в клетку отдельно, чтобы она восстановилась. Наблюдайте за состоянием дыхания мыши до тех пор, пока она не выздоровеет и не восстановит сознание.
ПРИМЕЧАНИЕ: Через 12 часов после инстилляции трахеи ЛПС усыпьте мышей в соответствии с процедурой, одобренной комитетом по этике животных. Анализы сывороточного ФНО-α и измерения массы легких сухими и влажными проводились с использованием стандартных процедур.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Предложенный способ инстилляции ЛПС у мышей был верифицирован путем оценки экспрессии воспалительного цитокина ФНО-α и соотношения массы сухого и влажного легких через 12 ч после инстилляции ЛПС. В эксперименте было четыре группы: холостой контроль (без какого-либо лечения), хирургическая интубация16, интраназальная17,18 и неинвазивная орофарингеальная интубация (n = 6). По сравнению с холостой контрольной группой уровни ФНО-α в сыворотке крови в группе неинвазивной орофарингеальной интубации были значительно повышены (рис. 8А). Соотношение массы легких в сухом и влажном состоянии также было увеличено (рис. 8B), достигнув того же уровня, что и в группе хирургической интубации трахеи. Наборы данных были статистически проанализированы с помощью непарных тестов Тьюки Крамера ANOVA и множественных сравнений post-hoc. Все данные представлены как средние ± SEM, а уровень p < 0,05 считался статистически значимым.
Рисунок 1: Фитинги и сборка интубационной платформы. Платформа состоит из основания, стояка, канцелярской скрепки, двух резинок и нескольких струн. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Набор для интубации. На этом рисунке показан комплект для интубации и его сборка. Это включает в себя ручную лампу, оптическое волокно и канюлю. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Фиксация мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Определение местоположения трахеи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Проверка насоса для пипеток Пастера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Изображение грудной клетки до и после, показывающее успешную интубацию . (А) Грудная клетка перед интубацией. (B) грудная клетка после интубации; Область, показывающая выпячивание груди, отмечена красным кружком. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Микропробоотборник с плоской головкой для подачи LPS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: Оценка валидности неинвазивной инстилляции ЛПС . (A) Экспрессия TNF-α в сыворотке крови мышей C57BL/6 через 12 ч после эндотрахеальной инъекции ЛПС. (B) Анализ данных о соотношении веса сухой и влажной легочной ткани. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Сначала мы заглянули внутрь ротовой полости, чтобы найти расположение трахеи19. Однако во время этого процесса мы обнаружили, что трахея мышей C57/BL узкая, что затрудняет поиск правильного местоположения этим методом без помощи такого оборудования, как эндоскоп20. При дальнейшем исследовании мы обнаружили, что свет от лампы интубатора может проникать через поверхность тела, позволяя оператору определять положение канюли21.
Чтобы проверить, вошла ли трубка в трахею, сначала мы попробовали использовать маленькое зеркало, которое охлаждали, помещая его на лед. После интубации мы с помощью зеркала подошли к отверстию канюли. Если на зеркале появлялся туман, интубация считалась успешной. Однако мы обнаружили, что этот метод обследования не может точно определить, вошла ли канюля в трахею. Во-первых, головка канюли находилась близко ко рту мыши, и невозможно было определить, был ли туман, появившийся на зеркале, вызван выдыхаемым газом изо рта. Во-вторых, зеркало нужно было охладить. При постоянном использовании время, необходимое для охлаждения зеркала, также приводило к увеличению времени эксперимента. Затем мы использовали пипетку Пастера, чтобы накачать воздух в трахею; Грудная клетка мыши набухнет, если канюля будет вставлена в трахею, а если она будет вставлена в пищевод, правая нижняя часть живота набухнет22. Поэтому мы использовали этот метод в качестве основы для оценки успешности интубации.
По сравнению с хирургической интубацией трахеи, неинвазивная орофарингеальная интубация позволяет избежать хирургических ран и улучшает выживаемость экспериментальных животных23. По сравнению с интраназальной интубацией, неинвазивная орофарингеальная интубация приводит к более точному введению канюли в бронх и легкие24. Однако овладение этими техническими навыками требует большой практики. В случае мышей с маленькими размерами тела введение канюли в трахею затруднено, и можно легко поцарапать трахею во время операции. Поэтому мы предлагаем отбирать для эксперимента мышей с большими размерами тела.
Метод также может быть использован для доставки других жидких лекарств в бронх и легкие, что означает, что он имеет широкий потенциал применения25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам раскрывать нечего.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (No: 81903902), Китайским фондом постдокторантуры (No: 2019M663457), Сычуаньской научно-технической программой (No: 2020YJ0172) и Исследовательским проектом Xinglin Scholar Premotion Университета ТКМ Чэнду (No: QJRC2022053).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipopolysaccharide | MERK | L4130 | LPS |
| Microliter Syringes | SHANGHAI GAOGE INDUSTRY AND TRADE CO., LTD | 10028505008124 | To deliver LPS |
| Mouse cannula | RWD Life Science | 803-03008-00 | Mouse cannula |
| Mouse intubation kit | RWD Life Science | 903-03027-00 | Including a base, a riser, a intubator, a surgical forceps and some strings |
| Pasteur pipette | Biosharp life science | BS-XG-03 | To verify the success of intubation |
| Pentobarbital sodium | Beijing Chemical Co., China | 20220918 | To anesthetize mice |
References
- Xia, Y., et al. Protective effect of human amnion epithelial cells through endotracheal instillation against lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice. Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi. 33 (1), 7-11 (2017).
- Butt, Y., Kurdowska, A., Allen, T. C. Acute lung injury: A clinical and molecular review. Archives of Pathology and Lab Medicine. 140 (4), 345-350 (2016).
- Ware, L. B., Matthay, M. A. The acute respiratory distress syndrome. The New England Journal of Medicine. 342 (18), 1334-1349 (2000).
- Fan, E., Brodie, D., Slutsky, A. S. Acute respiratory distress syndrome: Advances in diagnosis and treatment. JAMA. 319 (7), 698-710 (2018).
- Meyer, N. J., Gattinoni, L., Calfee, C. S.
- An, N., Yang, T., Zhang, X. X., Xu, M. X. Bergamottin alleviates LPS-induced acute lung injury by inducing SIRT1 and suppressing NF-κB. Innate Immunity. 27 (7-8), 543-552 (2021).
- Liu, L., et al. Comparative study of trans-oral and trans-tracheal intratracheal instillations in a murine model of acute lung injury. The Anatomical Record. 295 (9), 1513-1519 (2012).
- Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. Journal of Visualized Experiments. (52), e2581 (2011).
- Li, J., et al. Panaxydol attenuates ferroptosis against LPS-induced acute lung injury in mice by Keap1-Nrf2/HO-1 pathway. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 96 (2021).
- Zhou, Y., et al. Soluble epoxide hydrolase inhibitor attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung injury and improves survival in mice. Shock. 47 (5), 638-645 (2017).
- Nosaka, N., et al. Optimal tube length of orotracheal intubation for mice. Laboratory Animals. 53 (1), 79-83 (2019).
- Cicero, L., Fazzotta, S., Palumbo, V. D., Cassata, G., Lo Monte, A. I. Anaesthesia protocols in laboratory animals used for scientific purposes. Acta Bio-Medica: Atenei Parmensis. 89 (3), 337-342 (2018).
- Ehrentraut, H., Weisheit, C. K., Frede, S., Hilbert, T. Inducing acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation. Journal of Visualized Experiments. (149), e59999 (2019).
- Yang, H., et al. STAT6 inhibits ferroptosis and alleviates acute lung injury by regulating P53/SLC7A11 pathway. Cell Death & Disease. 13 (6), 530 (2022).
- Aramaki, O., et al. Induction of operational tolerance and generation of regulatory cells after intratracheal delivery of alloantigen combined with nondepleting anti-CD4 monoclonal antibody. Transplantation. 76 (9), 1305-1314 (2003).
- Lan, W. Activation of mammalian target of rapamycin (mTOR) in a murine model of lipopolysaccharide (LPS) -induced acute lung injury (ALI). Peking Union Medical College. , PhD Thesis (2010).
- Lv, H., et al. Tenuigenin ameliorates acute lung injury by inhibiting NF-κB and MAPK signalling pathways. Respiratory Physiology & Neurobiology. 216, 43-51 (2015).
- Yang, H., Lv, H., Li, H., Ci, X., Peng, L. Oridonin protects LPS-induced acute lung injury by modulating Nrf2-mediated oxidative stress and Nrf2-independent NLRP3 and NF-κB pathways. Cell Communication and Signaling. 17 (1), 62 (2019).
- Im, G. H., et al. Improvement of orthotopic lung cancer mouse model via thoracotomy and orotracheal intubation enabling in vivo imaging studies. Laboratory Animals. 48 (2), 124-131 (2014).
- Hamacher, J., et al. Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: description, evaluation and comparison with transillumination. Laboratory Animals. 42 (2), 222-230 (2008).
- Nelson, A. M., Nolan, K. E., Davis, I. C.
- Zhang, S., et al. Microvesicles packaging IL-1β and TNF-α enhance lung inflammatory response to mechanical ventilation in part by induction of cofilin signaling. International Immunopharmacology. 63, 74-83 (2018).
- Feng, Z. Comparative study of different intratracheal instillation in acute lung injury model of mice. Jilin University. , Master's Thesis (2010).
- Chen, J. H., et al. Comparison of acute lung injury mice model established by intranasal and intratracheal instillation of lipopolysaccharide. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (02), 222-227 (2022).
- Luckow, B., Lehmann, M. H. A simplified method for bronchoalveolar lavage in mice by orotracheal intubation avoiding tracheotomy. BioTechniques. 71 (4), 534-537 (2021).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).
