Hele nyfødte cochlear eksplanter som en in vitro model

Summary

Den nuværende protokol opdaterer tidligere protokoller og inkorporerer relativt enkle tilgange til dyrkning af cochlea-eksplantater af høj kvalitet. Dette giver pålidelig dataindsamling og billeddannelse i høj opløsning i levende og faste celler. Denne protokol understøtter den igangværende tendens til at studere indre øreceller.

Abstract

Ubehandlet høretab medfører betydelige omkostninger for det globale sundhedssystem og forringer den enkeltes livskvalitet. Sensorineuralt høretab er kendetegnet ved det kumulative og irreversible tab af sensoriske hårceller og auditive nerver i cochlea. Hele og vitale cochlear eksplantater er et af de grundlæggende værktøjer i høreforskning til at opdage hårtab og til at karakterisere de molekylære mekanismer i de indre øreceller. For mange år siden blev der udviklet en protokol for neonatal cochlear isolation, og selvom den er blevet ændret over tid, har den stadig potentiale for forbedring.

Dette papir præsenterer en optimeret protokol til isolering og dyrkning af hele neonatale cochlear eksplanter i multi-well kulturkamre, der muliggør undersøgelse af hårceller og spiralganglion neuron celler langs hele længden af cochlea. Protokollen blev testet ved hjælp af cochlear explants fra mus og rotter. Sunde cochlear explants blev opnået for at studere interaktionen mellem hårceller, spiralganglion neuron celler og de omgivende støtteceller.

En af de største fordele ved denne metode er, at den forenkler orgelkulturtrinnene uden at gå på kompromis med kvaliteten af eksplanterne. Alle tre drejninger af Corti-organet er fastgjort til bunden af kammeret, hvilket letter in vitro-eksperimenter og den omfattende analyse af eksplanterne. Vi giver nogle eksempler på cochlear billeder fra forskellige eksperimenter med levende og faste eksplanter, der viser, at eksplanterne bevarer deres struktur på trods af eksponering for ototoksiske lægemidler. Denne optimerede protokol kan i vid udstrækning anvendes til integrativ analyse af pattedyrs cochlea.

Introduction

De fleste tilfælde af sensorineuralt høretab skyldes degeneration af sensoriske hårceller, auditive nerveceller og/eller auditive synapser¹. Denne degenerative proces i sensoriske celler er progressiv og normalt irreversibel, hvilket resulterer i høretab². Derfor er information om sensoriske cellers levedygtighed og ændringer i signalveje under stressforhold afgørende for at beskytte cellerne mod skader og dermed tab. Undersøgelsen af cochlear explants i kultur muliggør rekapitulation af vævskomplekset og vedligeholdelse af et normalt celle-cellenetværk, hvilket muliggør en bedre beskrivelse af signalprocesserne. For at etablere eksperimentelle modeller for ototoksicitet er antibiotika gentamicin og det kemoterapeutiske middel cisplatin ofte blevet brugt, fordi de vides at have ototoksiske bivirkninger³.

In vitro kultursystemer af cochlear explants er blevet udviklet og modificeret over tid; Imidlertid mangler en beskrivelse af den trinvise protokol for kulturen af hele cochlear explants ofte i flere publikationer. En af de første videoprotokoller for den primære kultur af Cortis murinorgan blev offentliggjort af Parker et al., Hvor forfatterne beskrev trinene til isolering af det sensoriske epitel, dyrkning på glasdæksler og elektroporation af eksplanter til transfektionseksperimenter⁴. En anden protokol, der bruger glasdæksedler, blev også tidligere offentliggjort, hvor organiseringen af cellulær struktur i det indre øre blev betragtet^{som 5}. En alternativ protokol med anvendelse af millicellemembran til dyrkning af museeksplanter af Corti-organet og det vestibulære organ er blevet rapporteret⁶. Disse videorapporter har bidraget til forbedringen af metoden, men der er stadig udfordringer, der skal løses. For at løse en række problemer, der opstår som følge af brugen af glasdæksler og -indsatser, sigter denne protokol mod at strømline trinnene i organkultur og dyrke organer af høj kvalitet for at opnå pålidelige data. Dette opnås ved at minimere den direkte håndtering af organet under de eksperimentelle procedurer og undgå organoverførsel, før der opnås billeder i høj opløsning af de levende og faste celler.

Denne protokol opdaterer tidligere offentliggjorte in vitro-kultursystemer og introducerer flere optimeringer i isoleringen af Corti-organet og overførsel til kulturkamrene samt integrationen af et nyt diaskammer for at forbedre dyrkningsforholdene og yderligere analyse. Denne optimerede protokol reducerer risikoen for beskadigelse af orglet, hvilket kan opstå ved brug af glasdæksler under medieskift eller under overførsel af organet fra dæksler eller membraner til yderligere analyse ^4,5,6. Glasdækslerne har et bedre reflekterende indeks end plastik; De er dog skrøbelige og kan lettere gå i stykker. De multibrøndskamre, der anvendes her, er fastgjort til et mikroskopglas, som er velegnet til orgelkultur og til billeddannelse i høj opløsning. Overførslen af de isolerede organer udføres med en spatel, som gør det muligt at bringe organet i den rigtige retning og glide ind i kammeret i stedet for at anvende kraft med en pipette som tidligere anbefalet ^4,5,6.

De poly-D-lysinbelagte multibrøndskamre, som skal indeholde tilstrækkeligt medium, letter organoverførslen og den korrekte placering af eksplanterne uden at anvende klæbetryk og samtidig undgå organoverlapning, som tidligere nævnt⁶. Derudover løses utilsigtede organoverlappende og ujævne strukturer ved hjælp af en konfokal Z-stak. Denne protokol er optimeret til forskellige applikationer, såsom muse- og rotteeksplanter, eksplanter af Corti- og cochlea-organet, kultur i serumholdigt og serumfrit medium, ototoksiske vurderinger og generelle lægemiddelresponseksperimenter. Cochlear explants monteres og inkuberes i kamre med en dækslipbund, hvilket letter vedhæftningen af cochlear explants til kamrene for optimal håndtering under in vitro-forsøgene , efterbehandling af eksplanterne og billeddannelse af levende og faste cochlear explants. Visualiseringen af hele længden af Corti-organet og kvantificeringen af hårceller strømlines. Derudover er vurderingerne af støttecellerne, spiralganglionneuronceller og neuritter nøjagtige. Derfor kan denne protokol anvendes til en omfattende analyse af pattedyrs cochleære celler.

Protocol

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne og reglerne fra dyrevelfærdsudvalget i Canton Basel City, Schweiz. Postnatal C57BL/6JR-mus, Wistar-rotter og STAT1-mangelfulde mus (blandede C57BL/6-129/SvEv)⁷ i alderen 3-5 dage og af begge køn blev brugt til forsøgene.

1. Belægning af multibrøndskamrene

1. Forbered komplet kulturmedium.
   1. For organ af Corti explants fremstilles medium indeholdende Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM), 10% føtalt bovint serum (FBS), 25 mM HEPES og 30 U / ml penicillin.
   2. For organ af Corti explants og cochlear explants fremstilles et medium, der indeholder DMEM / F12, 1x N2 supplement, 1x B27 minus antioxidanter og 30 U / ml penicillin.
2. Forbered en stamopløsning af poly-D-lysin ved at tilsætte 10 ml cellekulturvand til 5 mg poly-D-lysin i en laminær hætte. Den endelige koncentration af poly-D-lysin er 0,5 mg / ml.
   BEMÆRK: Efterlign den resterende stamopløsning, og opbevar den ved -20 °C.
   1. Forbered arbejdsopløsninger af poly-D-lysin ved at fortynde stamopløsningen 1:10 i sterilt vand.
3. Overtræk et 8-brønds kammer med 150 μL/brønd poly-D-lysin arbejdsløsning, og inkuber i 30 min ved stuetemperatur.
   BEMÆRK: Hvis der anvendes et 4-brønds kammer, skal du belægge med 300 μL / hul poly-D-lysinarbejdsløsning.
4. Opsug opløsningen ved vakuum eller pipettering.
5. 2x vaskes med 200 μL sterilt vand og én gang med 200 μL komplet dyrkningsmedium eller DMEM.
6. Der tilsættes 150 μL komplet dyrkningsmedium til hvert hul.
   BEMÆRK: Hvis der anvendes et kammer med 4 huller, tilsættes 250 μL/hul komplet dyrkningsmedium.
7. Anbring kammeret i inkubatoren ved 37 °C og 5% CO₂ i mindst 30 minutter, før du anbringer en explant.

2. Dissektion af den tidlige knogle

1. Desinficer operationsbordet med 70% ethanol, og steriliser alle instrumenterne i en glasmikrosfæresterilisator.
2. Læg en steril 60 mm petriskål på en spand med is.
3. Hæld et par milliliter 1x fosfatbufret saltvand (PBS), og hold det på is.
   BEMÆRK: Brug 30 E / ml penicillin i 1x PBS for at undgå bakteriel kontaminering.
4. Læg en steril pude på en steril bakke, og halshug hurtigt hvalpedyret med en betjeningssaks. Nedsænk hovedet i 70% ethanol i 5s, hvis forurening er en hyppig begivenhed.
   BEMÆRK: Denne protokol blev testet for mus og rotter i alderen P3-P5. Cochlear væv er vanskeligere at dissekere fra ældre mus og rotter, og overlevelsen af eksplanter i kultur er begrænset.
5. Placer dyrets hoved på en steril pude. Fjern underkæben. Løft huden og skræl den tilbage fra kraniet.
6. Hold kraniet ved at placere tangen i orbitalhulrummene.
7. Skær forsigtigt kraniet langs den sagittale sutur, og skær derefter i koronalt suturområdet med et skarpt skalpelblad uden at beskadige cochlea.
   BEMÆRK: Undgå at lægge for meget pres, og undgå fremadgående og bagudrettede bevægelser med skalpellen, da dette kan beskadige cochlear knoglen og dermed cochlear kanalen.
8. Fjern forsigtigt hjernen fra de to kraniehalvdele.
9. Kraniet overføres til en 60 mm petriskål med den iskolde PBS tilberedt i trin 2.3.

3. Isolering af cochlea

1. Lokaliser cochlea i den tidlige knogle under mikroskopet. Placer tangen i den overlegne halvcirkelformede kanal.
2. Løsn det omgivende væv mellem cochlea og tindingebenet ved hjælp af en insulinsprøjte (mus) eller tang (rotter).
3. Træk forsigtigt den tidlige knogle væk fra cochlea, og hold cochlea fastgjort til vestibulen med den tidlige knogle. Sørg for, at cochlea er fri for det omgivende væv, før du skubber den temporale knogle til side.
   BEMÆRK: Hvis der påføres for meget kraft, beskadiges cochlear-kanalen.
4. Hold cochlea i en fast position, og brug den anden hånd til forsigtigt at fjerne den bruskagtige cochleakapsel. Indsæt forsigtigt spidserne af tangen i topområdet eller mellem svingene (synlig som en hvid linje), og fjern kapslen stykke for stykke. Udsæt cochlearkanalen.
5. Placer forsigtigt tangen under cochlea, og løsn den fra det vestibulære organ og den tidlige knogle.
6. Overfør cochlea til en ny 60 mm skål indeholdende iskold PBS.
7. Juster mikroskopets forstørrelse for bedre at visualisere eksplanterne.
8. Følg de næste trin for organ af Corti explants:
   1. Hold orgelet i bunden med tang. Fjern forsigtigt cochlearkanalen ved at tage fat i den med pincet i basalkrogområdet.
   2. Rul cochlearkanalen ud af modiolusen uden at rive den i stykker.
   3. Fjern forsigtigt spiralbåndet med stria vascularis ved at holde orgelet i bunden og trække dem væk.
      BEMÆRK: Vævsseparation kan også opnås ved at holde topregionen i stedet for basisregionen. Dette kan være nyttigt, når du dissekerer rotteorganer eller ældre museunger (>P5).
   4. Fjern forsigtigt Reissners membran ved at holde orglet i bunden og trække det af stykke for stykke.
      BEMÆRK: Dette er et valgfrit trin, da Reissners membran ikke forstyrrer erhvervelsen af billeddannelsen.
9. Følg de næste trin for cochlear eksplanter:
   1. Fjern spiralganglionen fra den osseøse spirallamina ved hjælp af en insulinsprøjte (mus) eller tang (rotter).
   2. Slap forsigtigt af modiolus under frigørelsen.
      BEMÆRK: Explants kan opdeles i to stykker for bedre håndtering.
   3. Tag fat i krogområdet med tang.
   4. Fjern forsigtigt spiralbåndet med stria vascularis ved at trække det af.
   5. Fjern forsigtigt Reissners membran ved at holde orglet i bunden og trække det af stykke for stykke.
      BEMÆRK: Dette trin anbefales, fordi Reissners membran normalt folder og dækker neuronfilamenterne og derfor kan påvirke eksperimenterne.

4. Kultur af cochlear explants

1. Overfør eksplanterne fra petriskålen til multibrøndkamrene. Løft eksplanterne med hårcellerne opad ved hjælp af en laboratoriespatel. Inkluder et par mikroliter 1x PBS for at forhindre, at prøverne klæber til spatelen.
   BEMÆRK: Alvorligt beskadigede eksplanter klæber til spatelen.
2. Lad eksplanterne glide fra spatlen ind i kammeret ved forsigtigt at vifte spatlen i mediet. Anbring en explant pr. brønd i et 8-brønds kammerglas.
   BEMÆRK: Hvis eksplantatet klæber til spatelen, skal du holde spatlen i mediet og bruge tangen til at løsne eksplanterne. Placer altid tangen ved den indre kant af eksplantatet (væk fra hårcellerne).
3. Kontroller under mikroskopet, at eksplanterne er blevet overført i den rigtige retning og placeret i midten af brøndene.
   BEMÆRK: Forkert orienterede eksplanter med hårceller vendt nedad har tendens til at vise en U-form opad langs deres bredde. Korriger deres orientering ved at flytte eksplanterne til hjørnerne af kamrene (mere medium er tilgængeligt) og diriger dem til at rotere.
4. 80 μL af mediet fjernes med en 100 μL pipette, og kassér det.
5. Kontroller under mikroskopet, om hårcellerne og spiralganglionneuroncellerne er synlige. Brug om nødvendigt tang til forsigtigt at skubbe noget overlappende væv fra hinanden.
6. Fjern resten af mediet, og vent i ~ 10 s.
7. Pipet mediet tilbage. Tilsæt en eller to dråber af mediet ved siden af explant og resten af mediet i en vis afstand fra explant for at forhindre, at explant løsner sig.
   BEMÆRK: Selvom eksplanterne er fastgjort til kamrene, skal mediet altid tilsættes først ved pipettering af en til to dråber ved siden af eksplanterne. På denne måde løftes eksploderne ikke op, når de resterende komplette medier tilføjes.
8. Sæt kammeret tilbage til inkubatoren, og inkuber i 2 timer for at lade organerne fastgøre fast til bunden af kammeret.
9. Fjern mediet, og tilsæt forsigtigt 300 μL frisk forvarmet komplet substrat ved hjælp af en 100 μL eller 200 μL pipette. Brug ikke en 1 ml pipette.
   BEMÆRK: Hvis der ønskes en forbehandling, tilsættes 300 μL komplet substrat indeholdende det pågældende stof efter 2 timers fastgørelse. Hvis der anvendes et kammer med 4 huller, skal der anvendes op til 500 μL/hul.
10. Returner kamrene til inkubatoren.

5. Test af ototoksiske stoffer

1. Lad eksplanterne stå natten over for at tilpasse sig kulturforholdene og komme sig.
2. Forbered forskellige koncentrationer af ototoksiske midler for at finde den passende koncentration til at etablere en ototoksisk model med ca. 50% hårcelletab. Brug mellem 50 μM og 250 μM til gentamicin og mellem 40 μM og 320 μM til cisplatin. Forbered cisplatinopløsningerne friske, og beskyt dem mod lys.
3. Fjern mediet, og tilsæt forsigtigt 300 μL medium indeholdende det ønskede ototoksiske lægemiddel.
4. Inkuber eksplantaterne med gentamicin og cisplatin ved 37 °C i 24 timer til 48 timer for at bestemme hårcellens overlevelse.
   BEMÆRK: Lægemiddelkoncentrationer og eksponeringstid vælges afhængigt af formålet med undersøgelsen. Konserveringen af eksplanterne blev her testet op til 72 timer. Brug ikke serum, hvis du planlægger at udføre en langsigtet kultur.
5. Følg næste afsnit for at plette cochlearcellerne.

6. Fiksering og immunofluorescens

1. Kassér mediet ved afslutningen af eksperimentet, og vask straks eksplantaterne med 200 μL forvarmet 1x PBS.
2. Fastgør eksplanterne med 200 μL 4% paraformaldehyd (PFA) i 15 minutter under en kemisk damphætte.
   FORSIGTIG: PFA er et farligt kemikalie; Læs sikkerhedsdatabladet (MSDS), før du samarbejder med PFA første gang.
3. Eksplantaterne vaskes to gange med 200 μL 1x PBS. Opbevar eksplantationerne i 1x PBS ved 4 °C, hvis farvningsprocedurerne skal udsættes.
4. Forbered permeabiliseringsopløsningen bestående af 1x PBS og 1% -5% Triton-X100.
5. Kassér 1x PBS, tilsæt 200 μL permeabiliseringsopløsning, og inkuber eksplanterne i 15 min.
6. Forbered blokeringsopløsning.
   1. For organ af Corti explants fremstilles blokerende opløsning bestående af 1x PBS, 10% normalt gedeserum (NGS, for gedesekundære antistoffer eller et andet serum fra samme art som de sekundære antistoffer). Alternativt kan du bruge 1% -5% bovin serumalbumin (BSA), hvis cellerne kun farves med phalloidin.
   2. For cochlear eksplanter skal du forberede blokeringsopløsning bestående af 1x PBS, 10% NGS og Fab-fragment (Fab-fragment ged-anti-mus IgG H + L, fortynding 1: 200), hvis du bruger musens primære antistoffer (f.eks. Mus-anti-TuJ1) til at plette spiralganglioncellerne.
7. Der tilsættes 200 μL blokeringsopløsning, og eksplantaterne inkuberes i 1 time.
8. Kassér blokeringsopløsningen. Til de eksplanter, der er inkuberet med Fab-fragment, tilsættes 200 μL 4% PFA og inkuberes i 5 min.
9. Vask eksplantene med 1x PBS i 5 min.
10. Forbered en antistofopløsning bestående af 1x PBS, 5% NGS og 0,1% -0,25% Triton-X100.
11. Fortynd det primære antistof i antistofopløsning-MYO7A (ab3481 ved en fortynding på 1:500 eller MYO7A 138-1 ved 1:100) - for at mærke hårcellerne og TuJ1 (1:400) for at mærke spiralganglionneuronerne.
    BEMÆRK: Hvis hårcellerne kun er mærket med phalloidin, fortyndes phalloidin ved 1:150 i 1x PBS, inkuberes i 40 min til 1 time ved stuetemperatur og fortsæt til trin 6.22.
12. Inkluder en kontrol for den uspecifikke binding af det sekundære antistof ved at udelade det primære antistof.
13. Der tilsættes 170 μL antistofopløsning med det primære antistof til det tilsvarende hul, og der inkuberes natten over ved 4 °C under forsigtig omrystning (40-60 omdr./min.).
14. Vask eksplanterne 4x i 5 min hver med 1x PBS.
15. Fortynd det sekundære antistof i antistofopløsning (f.eks. gedeantikanin Alexa Fluor 488 eller gede-antimus Alexa Fluor 568 IgG ved en fortynding på 1:500).
16. Der tilsættes 170 μL antistofopløsning med det sekundære antistof, og der inkuberes i 1 time ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Fra dette trin skal du beskytte eksplanterne mod langvarig lyseksponering.
17. Vask eksplanterne 2x i 5 min hver med 1x PBS.
18. Fortsæt til næste trin for sekventiel dobbeltmærkning af explants. Der inkuberes med et andet primært antistof af interesse (f.eks. MYO7A for hårceller) natten over ved 4 °C under forsigtig omrystning (40-60 omdr./min.). Alternativt inkuberes med phalloidin (1:150) i 40 minutter til 1 time ved stuetemperatur og fortsæt til trin 6.22.
    BEMÆRK: Udfør sekventiel mærkning, hvis de primære antistoffer er fra samme værtsart. Udfør phalloidin mærkning i slutningen for multiplex immunofluorescens.
19. Vask eksplanterne 4x i 5 min hver med 1x PBS.
20. Fortynd det sekundære antistof i antistofopløsning (f.eks. gedeantikanin Alexa Fluor 488 eller gede-antimus Alexa Fluor 568 IgG ved en fortynding på 1:500).
21. Der tilsættes 170 μL sekundært antistof, og der inkuberes i 1 time ved stuetemperatur.
22. Vask eksplanterne 2x i 5 min hver med 1x PBS.
23. Forbered en DAPI-stamopløsning på 1 mg/ml og opbevar ved -20 °C. DAPI-stamopløsningen fortyndes 1:10 for at fremstille arbejdsopløsninger på 0,1 mg/ml, og den opbevares ved 4 °C.
    BEMÆRK: Spring trin 23 over, og gå til trin 26, hvis monteringsmediet, der indeholder DAPI, bruges.
24. Fortynd DAPI-arbejdsopløsningen 1:100 i 1x PBS, og inkuber eksplanterne med 200 μL DAPI-opløsning i 5 minutter.
25. Vask eksplanterne 2x i 5 min hver med 1x PBS.
26. Fjern 1x PBS så meget som muligt for at lade bunden af kammeret tørre. Lad ikke eksplantatet tørre.
27. Vent i 2-5 sekunder, og tilsæt en dråbe monteringsmedium direkte på eksplantatet.
    BEMÆRK: Monteringsmediet på eksplantatet forbliver på plads på grund af overfladespænding. Hærdende monteringsmedium kan bruges.
28. Opbevar kamrene ved 4 ° C indtil billeddannelse.

7. Immunofluorescens af levende celler fra eksplanter

1. Brug de isolerede eksplanter efter inkubation natten over.
2. Fjern mediet, og tilsæt forsigtigt 300 μL medium indeholdende 125 μM cisplatin.
3. Inkuber eksplanterne i 18 timer for at måle mitokondriesuperoxidet i de levende eksplanter.
4. Kassér mediet i slutningen af lægemiddeleksponeringen.
5. Der tilsættes 300 μL af en permeabel sonde for at detektere den cellulære ROS (f.eks. 250 nM mitohydroethidin) og/eller Caspase-3 (f.eks. 2 μM DEVD-peptid konjugeret til et nukleinsyrebindende farvestof).
6. Der inkuberes ved 37 °C i 30 minutter.
7. Vask eksplanterne to gange forsigtigt med 200 μL varm Hanks afbalancerede saltopløsning (HBSS) eller en passende buffer.
8. Der afbildes celler inden for 2 timer med fluorescensexcitation ved 400 nm og emissionsdetektion ved 590 nm.
9. Kassér mediet ved afslutningen af eksperimentet, og vask straks eksplantaterne med 200 μL forvarmet 1x PBS.
10. Fastgør eksplanterne, og pletter cochlearcellerne som beskrevet ovenfor.

8. Visualisering ved konfokal billeddannelse

1. Billede eksplanterne ved hjælp af et mikroskop udstyret med en roterende disk konfokal enhed eller et konfokalmikroskop udstyret med en punkt-scanning konfokal enhed.
2. Hent billederne ved hjælp af en roterende disk med et 20x luftmål (numerisk blænde: 0,75) til celletælling. Alternativt kan du hente billederne ved hjælp af et punktscanningskonfokalmikroskop med et 40x luftmål (numerisk blænde: 0,95) eller et 100x oliemål (numerisk blænde: 1,45) for at visualisere og tælle synapserne eller afbilde stereocilierne.
   BEMÆRK: Juster laserintensiteten og eksponeringstiden for hver kanal for at undgå over- og undermætning af billederne. Anvend de samme indstillinger på alle explants af det samme eksperiment.
3. Indstil mikroskopet til at tage et 3D-billede af hele cochlear-eksplantatet ved hjælp af et 20x luftmål, z-stack og automatiske syværktøjer. Brug 3 x 3 tilstødende felter med 15% overlap til museeksplanter og 4 x 4 tilstødende felter til rotteeksplanter, der skal sys sammen.
4. Juster billederne ved hjælp af mikroskopets software eller den gratis open source FIJI-software⁸.
   BEMÆRK: Deconvolution, en billedbehandlingsteknik, kan anvendes på konfokale billeder for at skærpe deres kontrast og opløsning ^9-11.

Representative Results

Denne protokol er blevet testet på cochlea hos nyfødte mus og rotter. Dette papir præsenterer billeder af explants fra forskellige eksperimenter. Explants af Corti-organet blev udsat for gentamicin eller cisplatin, og hårtab var synligt. Eksplantaterne af Corti-organet opretholdt deres struktur og samlede længde under både normale og stressforhold (figur 1 og figur 2). De overlevende hårceller langs hele længden af rotteeksplanterne, der tidligere blev udsat for cisplatin, kunne påvises individuelt (figur 1). Ud over påvisning af overlevende hårceller blev hårceller, der gennemgik apoptose, også påvist (figur 2). Denne tilgang letter visualisering og tælling af overlevende celler, som kan udføres ved hjælp af en dyb læringstilgang, som beskrevet tidligere¹². Det var også muligt at detektere de biologiske processer i levende cochlearceller ved hjælp af passende cellegennemtrængelige sonder (figur 3).

I tilfælde af cochlear explants indeholdende spiralganglionneuroner, kan explants skæres i to stykker, eller apex-regionen kan skæres væk for at give bedre kulturforhold. Her valgte vi at adskille topregionen, fordi den er mindre påvirket under stressforhold. Figur 4 viser basis- og mediale regioner af cochlear eksplanterne. Hårceller mærket med hårcellemarkøren MYO7A blev påvist. Tilsvarende blev sunde og beskadigede spiralganglioncellelegemer og neuritter mærket med neuronal markør TuJ1 identificeret. Analysen af spiralganglionregioner kan udføres manuelt eller ved hjælp af open source-software såsom FIJI med NeuronJ-pluginet til neuritsporing¹³ eller udvidelser som TrackMate og Cellpose til morfologisk segmentering^14,15. Den nærmere undersøgelse af museeksplanterne afslørede den høje opløsning af cochlearcellerne og hårcellestereocilierne (figur 5).

Figur 1: Explants af Corti-organet fra rotter udsat for gentamicin. Repræsentative billeder (maksimal intensitetsprojektion) af (A) kontrol og (B) gentamicineksponerede (200 μM i 24 timer) eksplanter. Hårcellerne er mærket med phalloidin og kan visualiseres langs hele længden af cochlea. For bedre illustration er billedet i gråtoner. Billederne blev erhvervet ved hjælp af et spindeskivekonfokalmikroskop med et 20x mål (numerisk blænde: 0,75). Skalabjælke = 500 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Eksplanter af Corti-organet fra mus udsat for cisplatin. Repræsentative billeder (maksimal intensitetsprojektion) af (A) kontrol og (B) cisplatineksponeret (160 μM i 48 timer) eksplanter. Hårcellerne er mærket med phalloidin (rød), og de apoptotiske hårceller er mærket med fluorescin. Billederne blev taget ved hjælp af et punktscanningskonfokalmikroskop og et 20x mål (numerisk blænde: 0,75). Skalabjælke = 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Explants af Corti-organet fra levende billeddannelseseksperimenter. Repræsentative billeder (maksimal intensitetsprojektion) af eksplanter fra vildtypemus, der viser (A) kontroleksplanter og (B) eksplanter med eksponering for 125 μM cisplatin i 18 timer. Hårcellerne er mærket med mito-hydroethhidin og caspase-3. Billederne blev erhvervet ved hjælp af et roterende skivekonfokalmikroskop og et 20x mål (numerisk blænde: 0,75). Skalabjælke = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Cochlear eksplanter fra STAT1 knockout mus udsat for cisplatin. Repræsentative billeder (maksimal intensitetsprojektion) af (A) kontroleksplanter og (D) eksplanter udsat for 40 μM cisplatin i 48 timer. Hårcellelegemerne er mærket med MYO7A-antistoffet (grønt) og spiralganglioncellerne med TuJ1-antistoffet (rødt) og DAPI-nuklear mærkning (blå). Billederne blev taget ved hjælp af et punktscanningskonfokalmikroskop og et 20x mål (numerisk blænde: 0,75) med yderligere 2,15 zoom (B, C, E, F). Skalabjælke = (B,C,E,F) 50 μm og (A,D) 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: Corti eksplanterer mus. (A-D) Repræsentative billeder (maksimal intensitetsprojektion) af eksplanter i fuld længde fra vildtypemus. (A,B) Explants blev mærket med MYO7A antistof, phalloidin og DAPI nuklear mærkning. (B) I den forstørrede oversigt er cellelegemerne i hårcellerne mærket med MYO7A-antistof (grøn) tydeligt synlige. (C,D) Phalloidin mærker hårcellernes stereocilia og kutikulære plade. Explants blev mærket med phalloidin. (D) I den forstørrede oversigt er dekonvoluerede billeder af individuelle indre hårcellestereocilier velidentificerede (nederste række), mens individuelle ydre hårcellestereocilier er vanskeligere at afgrænse (øverste række). Billederne i panelerne A og C blev erhvervet med et spindeskivekonfokalmikroskop med et 20x mål (numerisk blænde: 0,75). Billedet i panel B blev erhvervet med det samme mikroskop, men med et 40x luftmål (numerisk blænde: 0,95). Billedet i panel D blev erhvervet med et punktscanningskonfokalmikroskop og et 100x oliemål (numerisk blænde: 1,45) med yderligere 3,46 zoom. Scanningerne blev i gennemsnit fire gange pr. XY-sektion, og pixelstørrelsen var 0,02 μm. Skalastænger = (D) 3 μm, (B) 100 μm og (A,C) 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Formålet med at opdatere denne protokol var at strømline trinnene fra isolering af eksplantaterne til billeddannelse af de levende og faste cochlear celler. Vi forbedrede nogle trin under isoleringen og introducerede nogle innovative værktøjer med det formål at etablere en effektiv og velfungerende protokol for at opnå explants af høj kvalitet. Den beskrevne metode er en optimeret protokol fra tidligere rapporter ^4,5. Derudover mangler nogle aktuelle undersøgelser en trinvis opdateret protokol. Med forenklede trin i eksplantatkulturen giver denne protokol nem håndtering af velbevarede eksplantater, hvilket er afgørende for reproducerbare data. Indførelsen af multibrøndskamre med et polymerdæksel til ydre øreeksplanter forbedrer organfastgørelsen og bevarelsen af intakte eksplanter. Her præsenterer vi flere eksempler på eksperimenter under stressforhold for at demonstrere, at organerne i kultur opretholder deres cellulære organisation på trods af tab af hårceller og skader på neuritterne.

En af udfordringerne ved at dyrke organer i det indre øre er at undgå organernes løsrivelse og svæven, da dette påvirker eksplanternes integritet, responsen på behandlingen og de efterfølgende undersøgelser. Tidligere blev explants dyrket på glasdæksler ^4,5. Selvom kultur på glasoverflader synes at være et godt alternativ, er belægning af glasset tidskrævende, og selve dæksedlerne er skrøbelige og sarte. En alternativ protokol, der bruger Millicell-cellekulturindsatser, forsøger at løse dette problem⁶. Imidlertid synes skæring og overførsel af membranen med eksplanterne at være et delikat trin i denne protokol. Derudover kan eksplanterne blive beskadiget under montering og forsegling af dæksedlen. I vores foreslåede tilgang, når eksplanterne er overført til poly-D-lysinbelagte kamre og placeret i den korrekte position, er der ikke behov for yderligere overførsel eller dækning med dæksedler. En yderligere fordel ved denne protokol er brugen af kamre med et tyndt gasgennemtrængeligt polymerdæksel, der giver optimale dyrkningsbetingelser for organeksplanterne. Denne polymer har en optisk kvalitet svarende til glas, hvilket gør den velegnet til cellebilleddannelse i mikroskopi med høj opløsning.

Tilsætningen af serum til mediet anvendes i de fleste protokoller til celle- og vævskultur, herunder dyrkning af eksplantater i det indre øre med 1% -10% FBS 4,5,6,16. Tilstedeværelsen af serum påvirker eksperimenternes dyrkningsbetingelser; I visse situationer foretrækkes således kultur uden serum. Fraværet af serum i kulturen af cochlear explants blev erstattet enten ved tilsætning af N2 til DMEM eller ved tilsætning af N2 til Neurobasal-A medium ^5,6. I den forbindelse testede vi dyrkningsforholdene for eksplanterne med og uden serum. Under begge betingelser var cellerne i det indre øre vitale og reagerede på ototoksiske tilstande. Vi testede disse betingelser i 72 timer, men eksplanterne kan opretholdes i kultur i endnu længere tid, især når de inkuberes med serumfrit medium sammen med N2, B27 og vækstfaktorer, som foreslået i andre undersøgelser ^5,16.

Ud over de generelle kritiske trin i isoleringen af det indre øre, såsom varigheden af organisoleringen og det anvendte antibiotikum, er der også nogle kritiske trin i denne protokol, som dog er håndterbare. Et af de kritiske trin i denne metode er relateret til mængden af medium, der forbliver i kammeret, efter at organet er indsat. Dette er optimeret til at holde explants i live og fastgjort til bundoverfladen. Et andet kritisk trin er relateret til den inkubationstid, der kræves for at tillade eksplanterne at fastgøre til bunden af kammeret. Inkubationstider længere end 2 timer med et par mikroliter medium kan påvirke eksplanternes sundhed. Kortere inkubationstider, såsom 1 time, kan også bruges, så længe man passer på ikke at løsne eksplanterne. Et andet vigtigt aspekt er resterne af poly-D-lysin. Vasketrinnene af poly-D-lysin bør følges nøje, fordi rester af bromidsaltet af poly-D-lysin kan være giftige for cellerne. Efter at vasketrinnene er fulgt nøjagtigt, letter belægningen med poly-D-lysin den glatte vedhæftning af eksplanterne til kamrene, så positionen kan korrigeres, før de bliver fast fastgjort til bunden af kammeret.

En af begrænsningerne ved denne metode er billeddannelse af celler ved hjælp af opretstående mikroskopi. Dette kan være et vigtigt spørgsmål for laboratorier med inverterede mikroskoper. Glasskinner med aftagelige silikonekamre kan bruges til opretstående og omvendt mikroskopi; Vores overfladebehandlingsforhold med poly-D-lysin skal dog testes først. En yderligere begrænsning er opbevaringen af kamrene, fordi indsatserne ikke kan fjernes, og den samlede højde af et kammer med låget er næsten 11 mm sammenlignet med 1 mm højden på et standard mikroskopglas. Imidlertid bruger 8-brøndskammeret mindre plads end de 4-brøndplader, der blev foreslået før¹⁶.

Vi præsenterer her billeder erhvervet med to mikroskoper. Mens punktscanningskonfokalmikroskopet giver billeder i høj opløsning af væv på grund af dets tynde optiske sektion, giver det roterende skivekonfokale mikroskop en hurtigere billeddannelsestid med god opløsning. Stereocilierne i de indre hårceller (IHC'er) og de ydre hårceller (OHC'er) visualiseres ved hjælp af konfokal mikroskopi. Da stereocilia af IHC'er er større end OHC'ernes, blev de gentagne gange og godt visualiseret i dette arbejde. For OHC-stereocilia kan andre alternative mikroskoper forbedre visualiseringen, såsom superopløsningsmikroskopi (SRM). De eksplanterede billeder, der er erhvervet med spindeskivemikroskopet, er tilstrækkelige til nem integration af automatiseret hårcelletælling ved hjælp af en dyb læringsmetode¹². Desuden er den korte anskaffelsestid vigtig for eksperimenter med levende celler og væv. Derudover er denne protokol ikke begrænset til neonatal cochlear explants. Med nogle optimeringer kan andre eksplanter såsom vestibulære organer eller embryonale væv også dyrkes.

Kvantificeringen af cochlearceller, såsom hårceller og neuroner, in vitro er vigtig for at vurdere cellernes levedygtighed og dermed procentdelen af beskadigede eller tabte celler. Undersøgelser af signalveje og cellefunktioner hjælper med at afsløre mekanismerne for død og overlevelse. Undersøgelser af embryonale og neonatale cochlear væv er nyttige til undersøgelse af udviklingsstadierne af cochlea. Derfor vil denne protokol bidrage til at optimere in vitro-undersøgelser af eksplanter i det indre øre, for eksempel for at etablere ototoksiske modeller, undersøge udviklingsstadier, evaluere signalveje og udføre lægemiddelscreeningsundersøgelser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL High-Clarity Polypropylene Conical Tube 17 x 120 mm style	FALCON	352096
45° Angled Forceps	Fine Science Tools	11251-35
50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm style	FALCON	352070
Antifade Mounting Medium	VECTASHIELD	H-1000
Alexa Fluor 568 phalloidin	Thermofisher	2151755
Anti-beta III Tubulin antibody [TUJ-1]	Abcam	ab14545
Antifade Mounting Medium With DAPI	VECTASHIELD	H-1200
Anti-myosin VII rabbit polyclonal	Abcam	ab3481
B-27 Supplement (50x), minus antioxidants	Thermofisher	10889038
CARBON STEEL surgical blades 23	Swann Moiton	210
CellEvent™ Caspase-3/7 Green Detection Reagent	Thermofisher	C10723
DMEM/F-12/(1:1)(1x) + GlutaMAX	Thermofisher	31331028
Double spatulas, one curved end	VWR	RSGA038.150
Ethyl alcohol 70% V/V 1,000 mL	bichsel	160 0 106 00
Fetal Bovine Serum, certified	Thermofisher	16000036
Fixative Solution 4% paraformaldehyde prepared in PBS	Thermofisher	201255309/201255305
High Intensity Cold Halogen Light Source	Intralux®	5100
Huygens Professional version 21.10	Scientific Volume Imaging
ibidi µ-Slide 8 well	ibidi	80826
microscope	LEICA	M80
microscope	LEICA	MS5
MitoSOX™ Red Mitochondrial Superoxide Indicator, for live-cell imaging	Thermofisher	M36008
N2 supplement (100x)	Thermofisher	17502048
Nikon Eclipse Ti microscope with a Yokogawa CSU-W1 spinning disk confocal unit, and a Photometrics Prime 95B camera.	NIKON
Nikon Eclipse Ti microscope with an A1 point-scanning confocal unit	NIKON
Operating scissors	Fine Science Tools	14005-16
Operating scissors	Fine Science Tools	14088-10
Operating tweezers	Fine Science Tools	11008-15
PBS pH 7.2 (1x), 500mL	Thermofisher	20012-019
Penicillin	Sigma-Aldrich	P3032
POLY-D-LYSINE HYDROBROMIDE MOL WT GT 30	Sigma-Aldrich	P7405
Scalpel Handle #4	Fine Science Tools	10004-13
Steri 250 Second sterilizer	Simon Keller AG	031100
Sterilizer, desiccant pellets	Simon Keller AG	31120
Tissue Culture Dish 60 x 15 mm	FALCON	353802
Tissue Culture Dish 60 x 15 mm	FALCON	353004
Trito X-100	Sigma	T9284
Unconventional myosin-VIIa	Developmental Studies Hybridoma Bank	138-1s
WFI for Cell Culture[-]Antimicrobial, 500 mL	Thermofisher	A12873-01