Summary
הפרוטוקול הנוכחי מעדכן פרוטוקולים קודמים ומשלב גישות פשוטות יחסית לגידול צמחי שבלול באיכות גבוהה. זה מספק איסוף נתונים אמין והדמיה ברזולוציה גבוהה בתאים חיים וקבועים. פרוטוקול זה תומך במגמה המתמשכת של חקר תאי האוזן הפנימית.
Abstract
ליקוי שמיעה שאינו מטופל מטיל עלויות משמעותיות על מערכת הבריאות העולמית ופוגע באיכות החיים. ליקוי שמיעה תחושתי-עצבי מאופיין באובדן מצטבר ובלתי הפיך של תאי שיער חושיים ועצבי שמיעה בשבלול. חצילי שבלול שלמים וחיוניים הם אחד הכלים הבסיסיים בחקר השמיעה לאיתור נשירת תאי שיער ולאפיון המנגנונים המולקולריים של תאי האוזן הפנימית. לפני שנים רבות פותח פרוטוקול לבידוד שבלול בילוד, ולמרות שהוא השתנה עם הזמן, הוא עדיין טומן בחובו פוטנציאל לשיפור.
מאמר זה מציג פרוטוקול אופטימלי לבידוד וטיפוח צמחי שבלול שלמים בילודים בתאי תרבית מרובי בארות, המאפשר לחקור תאי שיער ותאי נוירון גנגליון ספירלי לכל אורך השבלול. הפרוטוקול נבדק באמצעות צמחי שבלול מעכברים וחולדות. צמחי שבלול בריאים התקבלו כדי לחקור את האינטראקציה בין תאי שיער, תאי נוירון גנגליון ספירלי והתאים התומכים שמסביב.
אחד היתרונות העיקריים של שיטה זו הוא שהיא מפשטת את שלבי תרבית האיברים מבלי להתפשר על איכות החצילים. כל שלושת הסיבובים של האיבר של קורטי מחוברים לתחתית החדר, מה שמאפשר ניסויים במבחנה וניתוח מקיף של הצמחים. אנו מספקים כמה דוגמאות של תמונות שבלול מניסויים שונים עם צמחים חיים וקבועים, המוכיחות כי הצמחים שומרים על המבנה שלהם למרות חשיפה לתרופות אוטוטוקסיות. פרוטוקול אופטימלי זה יכול להיות בשימוש נרחב לניתוח אינטגרטיבי של שבלול היונקים.
Introduction
רוב המקרים של ליקוי שמיעה תחושתי-עצבי נובעים מניוון של תאי שיער חושיים, תאי עצב שמיעתיים ו/או סינפסות שמיעתיות1. תהליך ניווני זה בתאי החישה הוא פרוגרסיבי ובדרך כלל בלתי הפיך, ולכן גורם לאובדן שמיעה2. לכן, מידע על יכולת הקיום של תאי חישה ושינויים במסלולי איתות בתנאי עקה הוא חיוני להגנה על התאים מפני נזק, ולכן אובדן. חקירת צמחי השבלול בתרבית מאפשרת שחזור של קומפלקס הרקמה ושמירה על רשת תאים תקינה, המאפשרת תיאור טוב יותר של תהליכי האיתות. כדי להקים מודלים ניסיוניים של ototoxicity, אנטיביוטיקה gentamicin ואת סוכן כימותרפי cisplatin שימשו לעתים קרובות, כי הם ידועים יש תופעות לוואי ototoxic3.
מערכות תרבית חוץ גופיות של צמחי שבלול פותחו ושונו עם הזמן; עם זאת, תיאור של פרוטוקול Stepwise לתרבית של צמחי שבלול שלמים חסר לעתים קרובות במספר פרסומים. אחד מפרוטוקולי הווידאו הראשונים לתרבות הראשונית של איבר המורין של קורטי פורסם על ידי פרקר ואחרים, שבו המחברים תיארו את השלבים לבידוד האפיתל החושי, תרבית על כיסויי זכוכית, ואלקטרופורציה של צמחים לניסויי טרנספקציה4. בעבר פורסם גם פרוטוקול נוסף באמצעות כיסויי זכוכית, שבו ארגון המבנה התאי באוזן הפנימית נחשב5. פרוטוקול חלופי המשתמש בקרום מיליסל לתרבית של צמחי עכבר של איבר קורטי ואיבר שיווי המשקל דווח6. דיווחי וידאו אלה תרמו לשיפור השיטה, אך עדיין ישנם אתגרים שיש לפתור. כדי לטפל במספר בעיות הנובעות מהשימוש בכיסויי זכוכית ותוספות, הפרוטוקול הנוכחי נועד לייעל את צעדי תרבית האיברים ולגדל איברים באיכות גבוהה לקבלת נתונים אמינים. זה מושג על ידי מזעור הטיפול הישיר של האיבר במהלך הליכי הניסוי והימנעות מהעברת איברים לפני קבלת תמונות ברזולוציה גבוהה של התאים החיים והקבועים.
הפרוטוקול הנוכחי מעדכן מערכות תרבות חוץ גופית שפורסמו בעבר ומציג מספר אופטימיזציות בבידוד האיבר של קורטי והעברתו לתאי התרבות, כמו גם שילוב תא שקופיות חדש לשיפור תנאי התרבות וניתוח נוסף. פרוטוקול אופטימלי זה מפחית את הסיכון לפגיעה באיבר, אשר יכול להתרחש בעת שימוש בכיסויי זכוכית במהלך השינוי הבינוני או במהלך העברת האיבר מכיסויים או ממברנות לניתוח נוסף 4,5,6. כיסויי הזכוכית הם בעלי אינדקס השתקפות טוב יותר מאלה הפלסטיים; עם זאת, הם שבירים ויכולים להישבר בקלות רבה יותר. התאים מרובי הקידוחים המשמשים כאן מחוברים לשקופית מיקרוסקופ, המתאימים היטב לתרבית איברים ולהדמיה ברזולוציה גבוהה. העברת האיברים המבודדים מתבצעת עם מרית, המאפשרת להביא את האיבר בכיוון הנכון ולהחליק לתוך החדר, במקום להפעיל כוח עם פיפטה כפי שהומלץ קודם לכן 4,5,6.
התאים מרובי הבאר המצופים בפולי-D-ליזין, אשר אמורים להכיל מדיום מספיק, מאפשרים את העברת האיברים ואת המיקום הנכון של הצמחים מבלי להפעיל לחץ דבק ותוך הימנעות מחפיפת איברים, כאמור6. בנוסף, איברים חופפים מקריים ומבנים לא אחידים נפתרים באמצעות מחסנית Z קונפוקלית. פרוטוקול זה הותאם ליישומים שונים, כגון צמחים של עכברים וחולדות, צמחים של איבר קורטי ושבלול, תרבית בתווך המכיל סרום וללא נסיוב, הערכות אוטוטוקסיות וניסויים כלליים בתגובה לתרופות. צמחי השבלול מורכבים ומודגרים בתאים עם תחתית כיסוי, המאפשרת היצמדות של צמחי השבלול לתאים לטיפול מיטבי במהלך ניסויי המבחנה , העיבוד שלאחר הצמחים וההדמיה של צמחי שבלול חיים וקבועים. הדמיה של כל אורך האיבר של קורטי ואת כימות של תאי שיער הם יעילים. בנוסף, ההערכות של התאים התומכים, תאי העצב של גנגליון ספירלי ותאי עצב מדויקות. לכן, פרוטוקול זה יכול לשמש לניתוח מקיף של תאי שבלול יונקים.
Protocol
כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות של הוועדה לרווחת בעלי חיים בקנטון בזל סיטי, שוויץ. עכברי C57BL/6JR לאחר הלידה, חולדות Wistar ועכברים עם מחסור ב-STAT1 (מעורב C57BL/6-129/SvEv)7 בגילאי 3-5 ימים ומשני המינים שימשו לניסויים.
1. ציפוי התאים מרובי הבארות
- הכינו מדיום תרבות שלם.
- עבור איבר של צמחי קורטי, הכינו מדיום המכיל מדיום נשר שונה (DMEM) של דולבקו, סרום בקר עוברי 10% (FBS), 25 mM HEPES ו-30 U/mL פניצילין.
- עבור איברים של צמחי קורטי וחצילי שבלול, הכינו מדיום המכיל DMEM/F12, תוסף N2 1x, B27 1x פחות נוגדי חמצון ו-30 U/mL פניצילין.
- הכינו תמיסת מלאי של פולי-D-ליזין על ידי הוספת 10 מ"ל מים מתרבית תאים ל-5 מ"ג פולי-D-ליזין במכסה מנוע למינרי. הריכוז הסופי של פולי-D-ליזין הוא 0.5 מ"ג/מ"ל.
הערה: Aliquot את פתרון המלאי הנותר, ולאחסן ב -20 ° C.- הכן פתרונות עבודה של פולי-D-ליזין על ידי דילול תמיסת המלאי 1:10 במים סטריליים.
- מצפים תא בעל 8 בארות ב-150 מיקרוליטר/באר של תמיסת עבודה פולי-D-ליזין, ודגרים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: אם משתמשים בתא 4 בארות, יש לצפות ב-300 μL/well של תמיסת עבודה פולי-D-ליזין. - שאפו את הפתרון על ידי ואקום או פיפטינג.
- יש לשטוף פעמיים עם 200 μL של מים סטריליים ופעם אחת עם 200 μL של מדיום תרבית מלאה או DMEM.
- הוסף 150 μL של מדיום תרבית שלם לכל באר.
הערה: אם משתמשים בתא 4 בארות, הוסף 250 μL / well של מדיום תרבית שלם. - הניחו את התא באינקובטור בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2 למשך 30 דקות לפחות לפני הנחת אקספלנט.
2. דיסקציה של העצם הטמפורלית
- יש לחטא את שולחן הניתוחים באתנול 70%, ולעקר את כל המכשירים במעקר מיקרוספירה מזכוכית.
- מניחים צלחת פטרי סטרילית בקוטר 60 מ"מ על דלי המכיל קרח.
- יוצקים כמה מיליליטרים של מלח חוצץ פוספט 1x (PBS), ושומרים אותו על קרח.
הערה: יש להשתמש בפניצילין 30 U/מ"ל ב-1x PBS כדי למנוע זיהום חיידקי. - הניחו פד סטרילי על מגש סטרילי וערפו במהירות את ראשו של הגור בעזרת מספריים להפעלה. לטבול את הראש באתנול 70% במשך 5 שניות, אם זיהום הוא אירוע שכיח.
הערה: פרוטוקול זה נבדק עבור עכברים וחולדות בגילאי P3-P5. קשה יותר לנתח רקמות שבלול מעכברים וחולדות מבוגרים, והישרדותם של צמחים בתרבית מוגבלת. - הניחו את ראש החיה על פד סטרילי. הסר את הלסת התחתונה. הרימו את העור וקילפו אותו בחזרה מהגולגולת.
- החזיקו את הגולגולת על ידי הנחת המלקחיים בחללי המסלול.
- חותכים בזהירות את הגולגולת לאורך התפר הסגיטלי, ולאחר מכן חותכים באזור התפר הקורונלי עם להב אזמל חד מבלי לפגוע בשבלול.
הערה: הימנע מהפעלת לחץ רב מדי, והימנע מתנועות קדימה ואחורה עם אזמל, שכן הדבר עלול לפגוע בעצם השבלול ובכך בצינור השבלול. - בזהירות להסיר את המוח משני חצאי הגולגולת.
- מעבירים את חצאי הגולגולת לצלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ עם PBS קר כקרח מוכן בשלב 2.3.
3. בידוד השבלול
- למקם את השבלול בעצם הרקתית מתחת למיקרוסקופ. מניחים את המלקחיים בתעלה החצי עגולה העליונה.
- שחררו את הרקמה שמסביב בין השבלול לעצם הרקתית באמצעות מזרק אינסולין (עכברים) או מלקחיים (חולדות).
- משכו בזהירות את העצם הטמפורלית מהשבלול, תוך שמירה על השבלול מחובר לפרוזדור עם העצם הטמפורלית. ודא שהשבלול נקי מהרקמה שמסביב לפני שתדחוף את העצם הרקתית הצידה.
הערה: הפעלת כוח רב מדי תפגע בצינור השבלול. - החזיקו את השבלול במצב קבוע, והשתמשו ביד השנייה כדי להסיר בזהירות את כמוסת השבלול הסחוסית. מכניסים בזהירות את קצות המלקחיים לאזור הקודקוד או בין הסיבובים (נראה כקו לבן), ומסירים את הקפסולה חתיכה אחר פיסה. חשוף את צינור השבלול.
- מניחים בזהירות את המלקחיים מתחת לשבלול, ומנתקים אותם מאיבר שיווי המשקל ומהעצם הרקתית.
- מעבירים את השבלול לצלחת חדשה בקוטר 60 מ"מ המכילה PBS קר כקרח.
- התאימו את ההגדלה של המיקרוסקופ כדי להמחיש טוב יותר את הצמחים.
- בצע את השלבים הבאים עבור איבר של צמחים קורטי:
- החזיקו את האיבר בבסיס בעזרת מלקחיים. הסר בעדינות את צינור השבלול על ידי תפיסתו במלקחיים באזור וו הבסיס.
- שחררו את צינור השבלול מהמודיולוס מבלי לקרוע אותו.
- בזהירות להסיר את הרצועה הספירלית עם stria vascularis על ידי החזקת האיבר בבסיס ולמשוך אותם משם.
הערה: הפרדת רקמות יכולה להיות מושגת גם על ידי החזקת אזור הקודקוד במקום אזור הבסיס. זה יכול להיות שימושי בעת ניתוח איברי חולדה או גורי עכברים מבוגרים יותר (>P5). - הסר בזהירות את קרום רייסנר על ידי החזקת האיבר בבסיס ומשיכת אותו חתיכה אחר פיסה.
הערה: זהו שלב אופציונלי מכיוון שקרום רייסנר אינו מפריע לרכישת ההדמיה.
- בצע את השלבים הבאים עבור חצילי שבלול:
- נתקו את הגנגליון הספירלי מהלמינה הספירלית באמצעות מזרק אינסולין (עכברים) או מלקחיים (חולדות).
- הרפו בעדינות את המודיולוס במהלך הניתוק.
הערה: ניתן לחלק את הצמחים לשני חלקים לטיפול טוב יותר. - אחזו באזור הקרס בעזרת מלקחיים.
- בזהירות להסיר את הרצועה הספירלית עם stria vascularis על ידי משיכתו.
- הסר בזהירות את קרום רייסנר על ידי החזקת האיבר בבסיס ומשיכת אותו חתיכה אחר פיסה.
הערה: שלב זה מומלץ, מכיוון שקרום רייסנר בדרך כלל מתקפל ומכסה את חוטי הנוירון, ולכן עשוי להשפיע על הניסויים.
4. תרבית של צמחי שבלול
- מעבירים את החצילים מצלחת הפטרי לתאים מרובי הקידוחים. הרימו את החצילים כשתאי השערה פונים כלפי מעלה בעזרת מרית מעבדה. כלול כמה מיקרוליטרים של PBS 1x כדי למנוע מהדגימות להידבק למרית.
הערה: צמחים שניזוקו קשות יידבקו למרית. - הניחו לצמחים להחליק מהמרית לתוך התא על ידי נפנוף עדין של המרית בתווך. מניחים עציץ אחד לכל באר של מגלשה קאמרית בת 8 בארות.
הערה: אם החציל נדבק למרית, החזיקו את המרית בתווך, והשתמשו במלקחיים כדי לנתק את החצילים. הניחו תמיד את המלקחיים בגבול הפנימי של החציל (הרחק מתאי השערה). - בדקו במיקרוסקופ שהצמחים הועברו בכיוון הנכון והוצבו במרכז הבארות.
הערה: עציצים בעלי כיוון שגוי עם תאי שיער הפונים כלפי מטה נוטים להראות צורת U כלפי מעלה לרוחבם. תקנו את הכיוון שלהם על ידי הזזת העציצים לפינות התאים (יש יותר מדיום) וכוונו אותם לסיבוב. - מוציאים 80 μL של המדיום באמצעות פיפטה 100 μL, ומשליכים אותו.
- בדוק תחת המיקרוסקופ אם תאי השערה ותאי העצב של גנגליון ספירלי גלויים. במידת הצורך, השתמש במלקחיים כדי לדחוף בעדינות חלק מהרקמה החופפת.
- הסר את שאר המדיום, והמתן ~ 10 שניות.
- פיפט את הגב הבינוני. הוסיפו טיפה אחת או שתיים של המדיום ליד החציל ואת שאר התווך במרחק מה מהאקספלנט כדי למנוע מהחציל להתנתק.
הערה: גם אם הצמחים מחוברים לתאים, תמיד יש להוסיף את המדיום תחילה על ידי פיפטוף טיפה אחת או שתיים ליד העציצים. בדרך זו, הצמחים לא יורמו כאשר המדיה השלמה הנותרת מתווספת. - מחזירים את התא לאינקובטור, ודגרים במשך שעתיים כדי לאפשר לאיברים להתחבר היטב לתחתית החדר.
- מוציאים את המדיום, ומוסיפים בזהירות 300 μL של מדיום שלם טרי שחומם מראש באמצעות פיפטה 100 μL או 200 μL. אין להשתמש פיפטה 1 מ"ל.
הערה: אם יש צורך בטיפול מקדים, לאחר שעתיים של התקשרות, הוסף 300 μL של מדיום שלם המכיל את החומר המעניין. אם משתמשים בתא 4 בארות, השתמש עד 500 μL / באר. - להחזיר את התאים לאינקובטור.
5. בדיקה של סוכני ototoxic
- השאירו את הצמחים למשך הלילה כדי להסתגל לתנאי התרבית ולהתאושש.
- הכינו ריכוזים שונים של חומרים אוטוטוקסיים כדי למצוא את הריכוז המתאים כדי לבסס מודל אוטוטוקסי עם כ -50% נשירת תאי שיער. יש להשתמש בין 50 מיקרומטר ל-250 מיקרומטר עבור גנטמיצין ובין 40 מיקרומטר ל-320 מיקרומטר עבור ציספלטין. הכינו את תמיסות הציספלטין טריות, והגנו עליהן מפני אור.
- הסר את המדיום, בזהירות להוסיף 300 μL של מדיום המכיל את התרופה ototoxic הרצוי.
- לדגור את explants עם gentamicin ו cisplatin ב 37 ° C במשך 24 שעות עד 48 שעות כדי לקבוע את הישרדות תאי השיער.
הערה: ריכוזי התרופות וזמן החשיפה נבחרים בהתאם למטרת המחקר. שימור הצמחים נבדק כאן עד 72 שעות. אין להשתמש בסרום אם אתם מתכננים לבצע תרבית ארוכת טווח. - עקבו אחר הסעיף הבא כדי להכתים את תאי השבלול.
6. קיבוע ו immunofluorescence
- השליכו את המדיום בסוף הניסוי, ושטפו מיד את הצמחים עם 200 מיקרוליטר של PBS 1x שחומם מראש.
- תקן את הצמחים עם 200 μL של 4% paraformaldehyde (PFA) במשך 15 דקות תחת מכסה אדים כימי.
זהירות: PFA הוא כימיקל מסוכן; קרא את גיליון נתוני בטיחות החומרים (MSDS) לפני שתעבוד עם PFA בפעם הראשונה. - לשטוף את explants פעמיים עם 200 μL של 1x PBS. אחסנו את הצמחים ב-1x PBS בטמפרטורה של 4°C למקרה שיהיה צורך לדחות את הליכי הצביעה.
- הכינו את תמיסת החדירה המורכבת מ-1x PBS ו-1%-5% Triton-X100.
- השליכו את 1x PBS, הוסיפו 200 מיקרוליטר של תמיסת חלחול ודגרו על הצמחים במשך 15 דקות.
- הכן פתרון חסימה.
- עבור איבר של צמחים קורטי, להכין פתרון חוסם המורכב 1x PBS, 10% סרום עיזים רגיל (NGS, עבור נוגדנים משניים עז, או סרום אחר מאותו מין כמו נוגדנים משניים). לחלופין, יש להשתמש באלבומין בסרום בקר (BSA) עם 1%-5% אם התאים מוכתמים רק בפלואידין.
- עבור חצילי שבלול, הכינו תמיסת חסימה המורכבת מ-1x PBS, 10% NGS ומקטע Fab (מקטע Fab עז-אנטי-עכבר IgG H+L, דילול 1:200) אם אתם משתמשים בנוגדנים ראשוניים של עכבר (למשל, עכבר אנטי-TuJ1) כדי להכתים את תאי הגנגליון הספירלי.
- מוסיפים 200 μL של תמיסת חסימה, ודגרים על הצמחים למשך שעה אחת.
- בטל את פתרון החסימה. לצמחים המודגרים עם מקטע Fab, מוסיפים 200 μL של 4% PFA, ודגרים במשך 5 דקות.
- שטפו את העציצים עם 1x PBS במשך 5 דקות.
- הכינו תמיסת נוגדנים המורכבת מ-1x PBS, 5% NGS ו-0.1%-0.25% Triton-X100.
- לדלל את הנוגדן העיקרי בתמיסת נוגדנים - MYO7A (ab3481 בדילול של 1:500 או MYO7A 138-1 בשעה 1:100) - כדי לסמן את תאי השערה ו- TuJ1 (1:400) כדי לתייג את נוירוני הגנגליון הספירליים.
הערה: אם תאי השערה מסומנים רק עם פאלואדין, לדלל את הפלואידין בשעה 1:150 ב-1x PBS, לדגור במשך 40 דקות עד שעה אחת בטמפרטורת החדר, ולהמשיך לשלב 6.22. - כלול בקרה על הקישור הלא ספציפי של הנוגדן המשני על ידי השמטת הנוגדן הראשוני.
- מוסיפים 170 μL של תמיסת הנוגדנים עם הנוגדן הראשוני לבאר המתאימה, ודגרים לילה ב 4 מעלות צלזיוס עם רעד עדין (40-60 סל"ד).
- לשטוף את explants 4x במשך 5 דקות כל אחד עם 1x PBS.
- יש לדלל את הנוגדן המשני בתמיסת נוגדנים (לדוגמה, עז נגד ארנב Alexa Fluor 488 או עז נגד עכבר Alexa Fluor 568 IgG בדילול של 1:500).
- מוסיפים 170 μL של תמיסת הנוגדנים עם הנוגדן המשני, ודגרים במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
הערה: משלב זה ואילך, הגנו על הצמחים מפני חשיפה ממושכת לאור. - לשטוף את explants 2x במשך 5 דקות כל אחד עם 1x PBS.
- המשך לשלב הבא עבור תיוג כפול רציף של explants. יש לדגור עם נוגדן עיקרי שני (למשל, MYO7A לתאי שיער) למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C עם רעידות עדינות (40-60 סל"ד). לחלופין, דגרו עם פלואדין (1:150) במשך 40 דקות עד שעה בטמפרטורת החדר, והמשיכו לשלב 6.22.
הערה: בצע תיוג רציף אם הנוגדנים העיקריים הם מאותו מין מארח. בצע תיוג phalloidin בסוף עבור immunofluorescence multiplex. - לשטוף את explants 4x במשך 5 דקות כל אחד עם 1x PBS.
- יש לדלל את הנוגדן המשני בתמיסת נוגדנים (לדוגמה, עז נגד ארנב Alexa Fluor 488 או עז נגד עכבר Alexa Fluor 568 IgG בדילול של 1:500).
- מוסיפים 170 μL של הנוגדן המשני, ודגרים במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את explants 2x במשך 5 דקות כל אחד עם 1x PBS.
- הכינו תמיסת מלאי DAPI של 1 מ"ג/מ"ל, ואחסנו בטמפרטורה של -20°C. דלל את תמיסת מלאי DAPI ביחס 1:10 להכנת תמיסות עבודה של 0.1 מ"ג/מ"ל, ואחסן בטמפרטורה של 4°C.
הערה: דלג על שלב 23 ועבור לשלב 26 אם נעשה שימוש באמצעי ההרכבה המכיל DAPI. - דללו את פתרון העבודה של DAPI ביחס של 1:100 ב-PBS אחד, ודגרו על הצמחים עם 200 מיקרוליטר של תמיסת DAPI למשך 5 דקות.
- לשטוף את explants 2x במשך 5 דקות כל אחד עם 1x PBS.
- הסר את 1x PBS ככל האפשר כדי לאפשר לתחתית התא להתייבש. אל תתנו לחציל להתייבש.
- המתן 2-5 שניות, והוסף טיפה אחת של אמצעי הרכבה ישירות על explant.
הערה: אמצעי ההרכבה על העציץ יישאר במקומו עקב מתח פני השטח. ניתן להשתמש באמצעי הרכבה הקשחה. - אחסנו את התאים בטמפרטורה של 4°C עד להדמיה.
7. Immunofluorescence של תאים חיים מ explants
- השתמשו בצמחים המבודדים לאחר דגירה של לילה.
- הסר את המדיום, ובזהירות להוסיף 300 μL של מדיום המכיל 125 μM cisplatin.
- דגרו על הצמחים במשך 18 שעות כדי למדוד את תחמוצת העל המיטוכונדריאלית בצמחים החיים.
- השליכו את המדיום בסוף החשיפה לתרופה.
- הוסף 300 μL של בדיקה חדירה כדי לזהות את ROS התא (למשל, 250 ננומטר של מיטו-הידרואתידין) ו / או קספאז-3 (למשל, 2 מיקרומטר פפטיד DEVD מצומד לצבע קושר חומצת גרעין).
- יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות.
- שטפו את החצילים פעמיים בעדינות עם 200 מיקרוליטר של תמיסת מלח מאוזנת חמה של האנק (HBSS) או חיץ אפרופיט.
- דמיינו את התאים תוך שעתיים עם עירור פלואורסצנטי ב-400 ננומטר וזיהוי פליטה ב-590 ננומטר.
- השליכו את המדיום בסוף הניסוי, ושטפו מיד את הצמחים עם 200 מיקרוליטר של PBS 1x שחומם מראש.
- תקנו את החצילים, והכתימו את תאי השבלול כמתואר לעיל.
8. הדמיה על ידי הדמיה קונפוקלית
- דמיינו את העציצים באמצעות מיקרוסקופ המצויד ביחידה קונפוקלית של דיסק מסתובב או במיקרוסקופ קונפוקלי המצויד ביחידה קונפוקלית סורקת נקודתית.
- קבל את התמונות באמצעות דיסק מסתובב עם מטרת אוויר 20x (צמצם מספרי: 0.75) לספירת תאים. לחלופין, רכשו את התמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק נקודתי עם מטרת אוויר 40x (צמצם מספרי: 0.95) או מטרת שמן 100x (צמצם מספרי: 1.45) כדי לדמיין ולספור את הסינפסות או לדמיין את הסטריאוציליה.
הערה: התאם את עוצמת הלייזר ואת זמן החשיפה לכל ערוץ כדי למנוע רוויית יתר ותת-רוויה של התמונות. החל את אותן הגדרות על כל הצמחים של אותו ניסוי. - הגדר את המיקרוסקופ כדי ללכוד תמונה תלת-ממדית של כל השבלול באמצעות אובייקט אוויר 20x, ערימת Z וכלי תפירה אוטומטיים. השתמש 3 x 3 שדות סמוכים עם חפיפה של 15% עבור צמחים עכבר ו 4 x 4 שדות סמוכים עבור explants חולדות להיות תפורים יחד.
- התאימו את התמונות באמצעות תוכנת המיקרוסקופ או תוכנת הקוד הפתוח החינמיתFIJI 8.
הערה: Deconvolution, טכניקת עיבוד תמונה, ניתנת ליישום על תמונות קונפוקליות כדי לחדד את הניגודיות והרזולוציה 9-11.
Representative Results
הפרוטוקול הנוכחי נבדק על השבלול של עכברים וחולדות בילודים. מאמר זה מציג תמונות של צמחים מניסויים שונים. הצמחים של האיבר של קורטי נחשפו לגנטמיצין או ציספלטין, ונשירת תאי שיער נראתה. הצמחים של איבר קורטי שמרו על המבנה והאורך הכולל שלהם גם בתנאי עקה נורמליים וגם בתנאי עקה (איור 1 ואיור 2). תאי השערה ששרדו לכל אורכם של צמחי החולדה שנחשפו בעבר לציספלטין היו ניתנים לזיהוי בנפרד (איור 1). בנוסף לזיהוי תאי שיער ששרדו, התגלו גם תאי שיער שעברו אפופטוזיס (איור 2). גישה זו מאפשרת הדמיה וספירה של תאים שורדים, אשר ניתן לבצע באמצעות גישת למידה עמוקה, כפי שתואר קודם לכן12. אפשר היה גם לזהות את התהליכים הביולוגיים בתאי שבלול חיים באמצעות גשושיות מתאימות שחדירות לתאים (איור 3).
במקרה של צמחי שבלול המכילים נוירונים של גנגליון ספירלי, ניתן לחתוך את הצמחים לשני חלקים, או לחתוך את אזור הקודקוד כדי לספק תנאי תרבית טובים יותר. כאן בחרנו להפריד את אזור הקודקוד, מכיוון שהוא מושפע פחות בתנאי לחץ. איור 4 מראה את אזורי הבסיס והאזורים המדיאליים של צמחי השבלול. תאי שיער המסומנים בסמן תא השערה MYO7A זוהו. באופן דומה, זוהו גופי תאי גנגליון ספירליים בריאים ופגועים ונוירוטים המסומנים בסמן העצבי TuJ1. ניתוח אזורי גנגליון ספירלי יכול להתבצע באופן ידני או באמצעות תוכנות קוד פתוח כגון FIJI עם תוסף NeuronJ עבור מעקב עצבי13 או הרחבות כגון TrackMate ו Cellpose עבור סגמנטציה מורפולוגית14,15. בחינה מדוקדקת יותר של צמחי העכבר חשפה את הרזולוציה הגבוהה של תאי השבלול והסטריאוסיליה של תאי השערה (איור 5).
איור 1: צמחים של איבר קורטי מחולדות שנחשפו לגנטמיצין. תמונות מייצגות (הקרנה בעוצמה מרבית) של (A) בקרה ו-(B) צמחים שנחשפו לגנטמיצין (200 מיקרומטר למשך 24 שעות). תאי השערה מסומנים בפלואידין וניתן לדמיין אותם לכל אורך השבלול. להמחשה טובה יותר, התמונה היא בגוונים אפורים. התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב עם מטרה של 20x (צמצם מספרי: 0.75). סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: צמחים של איבר קורטי מעכברים שנחשפו לציספלטין. תמונות מייצגות (הקרנה בעוצמה מרבית) של (A) בקרה ו-(B) צמחים שנחשפו לציספלטין (160 מיקרומטר למשך 48 שעות). תאי השערה מסומנים בפלואידין (אדום), ותאי השערה האפופטוטיים מסומנים בפלואורסצין. התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק נקודתי ומטרה פי 20 (צמצם מספרי: 0.75). סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: צמחים של האיבר של קורטי מניסויי הדמיה חיים. תמונות מייצגות (הקרנה בעוצמה מרבית) של צמחים מעכברי בר המציגות (A) צמחי ביקורת ו-(B) צמחים עם חשיפה לציספלטין של 125 מיקרומטר במשך 18 שעות. תאי השערה מסומנים במיטו-הידרואתידין ובקספאז-3. התמונות נרכשו באמצעות דיסק מסתובב מיקרוסקופ קונפוקלי ומטרה של פי 20 (צמצם מספרי: 0.75). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: צמחי שבלול מעכברי נוקאאוט מסוג STAT1 שנחשפו לציספלטין. תמונות מייצגות (הקרנה בעוצמה מרבית) של (A) צמחי בקרה ו-(D) צמחים שנחשפו לציספלטין של 40 מיקרומטר במשך 48 שעות. גופי תאי השערה מסומנים בנוגדן MYO7A (ירוק), ותאי הגנגליון הספירליים מסומנים בנוגדן TuJ1 (אדום) ותיוג גרעיני DAPI (כחול). התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק נקודתי ויעד של 20x (צמצם מספרי: 0.75) עם זום נוסף של 2.15 (B,C,E,F). סרגל קנה מידה = (B,C,E,F) 50 מיקרומטר ו- (A,D) 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: איבר עכבר של צמחי קורטי. (A-D) תמונות מייצגות (הקרנה בעוצמה מרבית) של צמחים באורך מלא מעכברי בר. (א,ב) הצמחים סומנו בנוגדן MYO7A, פאלואידין ותיוג גרעיני DAPI. (B) בסקירה המוגדלת, גופי התאים של תאי השערה המסומנים בנוגדן MYO7A (ירוק) נראים בבירור. (ג,ד) פלואדין מתייג את הסטריאוסיליה ואת הצלחת הקוטיקולרית של תאי השערה. הצמחים סומנו בפלואידין. (D) בסקירה המוגדלת, תמונות מפותלות של סטריאוסיליה של תאי שיער פנימיים בודדים מזוהים היטב (שורה תחתונה), בעוד שסטריאוסיליה של תאי שיער חיצוניים בודדים קשה יותר לתיחום (שורה עליונה). התמונות בלוחות A ו- C נרכשו במיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב עם מטרה של 20x (צמצם מספרי: 0.75). התמונה בלוח B נרכשה באותו מיקרוסקופ אך עם מטרת אוויר פי 40 (צמצם מספרי: 0.95). התמונה בלוח D נרכשה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק נקודתי ומטרת שמן 100x (צמצם מספרי: 1.45) עם זום נוסף של 3.46. הסריקות בוצעו בממוצע ארבע פעמים לכל קטע XY, וגודל הפיקסל היה 0.02 מיקרומטר. פסי קנה מידה = (D) 3 מיקרומטר, (B) 100 מיקרומטר ו- (A,C) 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
מטרת עדכון פרוטוקול זה הייתה לייעל את השלבים מבידוד הצמחים ועד להדמיית תאי השבלול החיים והקבועים. שיפרנו כמה שלבים במהלך הבידוד והצגנו כמה כלים חדשניים במטרה לבסס פרוטוקול יעיל וחלק להשגת צמחים באיכות גבוהה. השיטה המתוארת היא פרוטוקול אופטימלי מדוחות קודמים 4,5. בנוסף, בחלק מהמחקרים הנוכחיים חסר פרוטוקול מעודכן בשלבים. עם שלבי תרבית explant פשוטים, פרוטוקול זה מספק טיפול קל בצמחים שמורים היטב, החיוניים לנתונים הניתנים לשחזור. הכנסת תאים מרובי בארות עם כיסוי פולימרי עבור צמחים באוזן הפנימית משפרת את חיבור האיברים ואת השימור של צמחים שלמים. במאמר זה אנו מציגים מספר דוגמאות לניסויים בתנאי עקה כדי להדגים שהאיברים בתרבית שומרים על הארגון התאי שלהם למרות אובדן תאי השערה והנזק לנוריטים.
אחד האתגרים בטיפוח איברי האוזן הפנימית הוא הימנעות מניתוק וציפה של האיברים, שכן הדבר משפיע על שלמות העצילים, התגובה לטיפול והבדיקות שלאחר מכן. בעבר, צמחים תורבתו על כיסויי זכוכית 4,5. למרות שנראה כי תרבות על משטחי זכוכית היא חלופה טובה, ציפוי הזכוכית גוזל זמן, והכיסויים עצמם שבירים ועדינים. פרוטוקול חלופי המשתמש בתרבית תאי מיליסל מוסיף ניסיונות לפתור בעיה זו6. עם זאת, חיתוך והעברת הממברנה עם הצמחים נראה צעד עדין בפרוטוקול זה. בנוסף, העציצים עלולים להיפגע במהלך הרכבה ואיטום של הכיסוי. לפי הגישה המוצעת שלנו, ברגע שהחצילים מועברים לתאים המצופים בפולי-D-ליזין ומניחים אותם במיקום הנכון, אין צורך בהעברה או כיסוי נוספים בכיסויים. יתרון נוסף של פרוטוקול זה הוא השימוש בתאים עם כיסוי פולימרי דק חדיר לגז המספק תנאי תרבית אופטימליים לצמחי האיברים. פולימר זה הוא בעל איכות אופטית דומה לזכוכית, ולכן הוא מתאים לדימות תאי במיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה.
הוספת סרום למדיום משמשת ברוב הפרוטוקולים לתרבית תאים ורקמות, כולל תרבית של חצילים באוזן הפנימית עם 1%-10% FBS 4,5,6,16. נוכחות הסרום משפיעה על תנאי התרבית של הניסויים; לכן, במצבים מסוימים, תרבות ללא סרום עדיף. היעדר סרום בתרבית של צמחי שבלול הוחלף על ידי תוספת של N2 ל- DMEM או על ידי תוספת של N2 למדיום Neurobasal-A 5,6. בהקשר זה, בדקנו את תנאי התרבית של הצמחים עם ובלי סרום. בשני התנאים, תאי האוזן הפנימית היו חיוניים והגיבו לתנאים אוטוטוקסיים. בדקנו את התנאים האלה במשך 72 שעות, אבל הצמחים יכולים להישמר בתרבית אפילו יותר זמן, במיוחד כאשר הם מודגרים עם מדיום ללא סרום יחד עם N2, B27, וגורמי גדילה, כפי שהוצע במחקרים אחרים 5,16.
בנוסף לשלבים הקריטיים הכלליים בבידוד של חצילים באוזן הפנימית, כגון משך בידוד האיברים והאנטיביוטיקה בה משתמשים, ישנם גם כמה שלבים קריטיים בפרוטוקול זה, אשר עם זאת, ניתנים לניהול. אחד השלבים הקריטיים בשיטה זו קשור לנפח המדיום שנותר בחדר לאחר החדרת האיבר. זה עבר אופטימיזציה כדי לשמור על הצמחים בחיים ומחוברים למשטח התחתון. שלב קריטי נוסף קשור לזמן הדגירה הנדרש כדי לאפשר לצמחים להיצמד לתחתית החדר. זמני דגירה ארוכים משעתיים עם כמה מיקרוליטרים של מדיום עלולים להשפיע על בריאות הצמחים. ניתן להשתמש גם בזמני דגירה קצרים יותר, כגון שעה אחת, כל עוד מקפידים שלא לנתק את הצמחים. היבט חשוב נוסף הוא שאריות של poly-D-lysine. יש להקפיד על שלבי הכביסה של פולי-D-ליזין, מכיוון ששאריות מלח הברומיד של פולי-D-ליזין יכולות להיות רעילות לתאים. לאחר ביצוע מדויק של שלבי הכביסה, הציפוי בפולי-D-ליזין מאפשר הדבקה חלקה של הצמחים לתאים, כך שניתן לתקן את המיקום לפני שהם מחוברים היטב לתחתית החדר.
אחת המגבלות של שיטה זו היא הדמיה של תאים באמצעות מיקרוסקופ זקוף. זה יכול להיות נושא חשוב עבור אותן מעבדות עם מיקרוסקופים הפוכים. שקופיות זכוכית עם תאי סיליקון נשלפים ניתן להשתמש עבור מיקרוסקופיה זקופה הפוכה; עם זאת, תנאי הציפוי שלנו עם פולי-D-ליזין צריכים להיבדק תחילה. מגבלה נוספת היא אחסון החדרים, מכיוון שהתוספות אינן ניתנות להסרה, והגובה הכולל של תא אחד עם מכסה הוא כמעט 11 מ"מ לעומת גובה 1 מ"מ של שקופית מיקרוסקופ סטנדרטית. עם זאת, תא 8 בארות משתמש פחות מקום מאשר לוחות 4 בארות הציע לפני16.
אנו מציגים כאן תמונות שנרכשו באמצעות שני מיקרוסקופים. בעוד המיקרוסקופ הקונפוקלי הסורק נקודה מספק תמונות ברזולוציה גבוהה של רקמות בשל החלק האופטי הדק שלו, המיקרוסקופ הקונפוקלי של הדיסק המסתובב מספק זמן הדמיה מהיר יותר עם רזולוציה טובה. הסטריאוסיליה של תאי השערה הפנימיים (IHCs) ותאי השערה החיצוניים (OHCs) מומחשת באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. מכיוון שהסטריאוסיליה של IHCs גדולה יותר מזו של OHCs, הם הודגמו שוב ושוב והיטב בעבודה זו. עבור סטריאוסיליה של OHC, מיקרוסקופים חלופיים אחרים יכולים לשפר את ההדמיה, כגון מיקרוסקופ ברזולוציית על (SRM). תמונות explant שנרכשו במיקרוסקופ דיסק מסתובב מספיקות לשילוב קל של ספירת תאי שיער אוטומטית באמצעות גישת למידה עמוקה12. יתר על כן, זמן הרכישה הקצר חשוב לניסויים בתאים ורקמות חיים. בנוסף, פרוטוקול זה אינו מוגבל לחצילי שבלול בילוד. עם כמה אופטימיזציות, צמחים אחרים כגון איברים שיווי משקל או רקמות עובריות יכול גם להיות בתרבית.
כימות תאי השבלול, כגון תאי שיער ונוירונים, במבחנה חשוב להערכת כדאיות התא, ולפיכך, אחוז התאים הפגומים או האבודים. חקירות של מסלולי איתות ותפקודי תאים עוזרות לחשוף את מנגנוני המוות וההישרדות. בדיקות של רקמות שבלול עובריות ויילודים שימושיות לחקר שלבי ההתפתחות של השבלול. לכן, פרוטוקול זה יסייע לייעל מחקרי מבחנה של חצילים באוזן הפנימית, למשל, כדי לבסס מודלים אוטוטוקסיים, לחקור שלבים התפתחותיים, להעריך מסלולי איתות ולבצע מחקרי סינון תרופות.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות למתקן בעלי החיים של המחלקה לביו-רפואה של אוניברסיטת באזל על תמיכתם בטיפול בבעלי חיים, מתקני הליבה של מיקרוסקופיה וכן לשירות טכנולוגיית המידע של המחלקה לביו-רפואה על עזרתם הטכנית, והקרן הלאומית למדע שוויצרית (SNSF) לתמיכה כספית (מלגת MD-PhD ל- M.C., מענק מספר 323530_191222).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL High-Clarity Polypropylene Conical Tube 17 x 120 mm style | FALCON | 352096 | |
| 45° Angled Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm style | FALCON | 352070 | |
| Antifade Mounting Medium | VECTASHIELD | H-1000 | |
| Alexa Fluor 568 phalloidin | Thermofisher | 2151755 | |
| Anti-beta III Tubulin antibody [TUJ-1] | Abcam | ab14545 | |
| Antifade Mounting Medium With DAPI | VECTASHIELD | H-1200 | |
| Anti-myosin VII rabbit polyclonal | Abcam | ab3481 | |
| B-27 Supplement (50x), minus antioxidants | Thermofisher | 10889038 | |
| CARBON STEEL surgical blades 23 | Swann Moiton | 210 | |
| CellEvent™ Caspase-3/7 Green Detection Reagent | Thermofisher | C10723 | |
| DMEM/F-12/(1:1)(1x) + GlutaMAX | Thermofisher | 31331028 | |
| Double spatulas, one curved end | VWR | RSGA038.150 | |
| Ethyl alcohol 70% V/V 1,000 mL | bichsel | 160 0 106 00 | |
| Fetal Bovine Serum, certified | Thermofisher | 16000036 | |
| Fixative Solution 4% paraformaldehyde prepared in PBS | Thermofisher | 201255309/201255305 | |
| High Intensity Cold Halogen Light Source | Intralux® | 5100 | |
| Huygens Professional version 21.10 | Scientific Volume Imaging | ||
| ibidi µ-Slide 8 well | ibidi | 80826 | |
| microscope | LEICA | M80 | |
| microscope | LEICA | MS5 | |
| MitoSOX™ Red Mitochondrial Superoxide Indicator, for live-cell imaging | Thermofisher | M36008 | |
| N2 supplement (100x) | Thermofisher | 17502048 | |
| Nikon Eclipse Ti microscope with a Yokogawa CSU-W1 spinning disk confocal unit, and a Photometrics Prime 95B camera. | NIKON | ||
| Nikon Eclipse Ti microscope with an A1 point-scanning confocal unit | NIKON | ||
| Operating scissors | Fine Science Tools | 14005-16 | |
| Operating scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Operating tweezers | Fine Science Tools | 11008-15 | |
| PBS pH 7.2 (1x), 500mL | Thermofisher | 20012-019 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| POLY-D-LYSINE HYDROBROMIDE MOL WT GT 30 | Sigma-Aldrich | P7405 | |
| Scalpel Handle #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Steri 250 Second sterilizer | Simon Keller AG | 031100 | |
| Sterilizer, desiccant pellets | Simon Keller AG | 31120 | |
| Tissue Culture Dish 60 x 15 mm | FALCON | 353802 | |
| Tissue Culture Dish 60 x 15 mm | FALCON | 353004 | |
| Trito X-100 | Sigma | T9284 | |
| Unconventional myosin-VIIa | Developmental Studies Hybridoma Bank | 138-1s | |
| WFI for Cell Culture[-]Antimicrobial, 500 mL | Thermofisher | A12873-01 |
References
- Mukherjea, D., et al. The design and screening of drugs to prevent acquired sensorineural hearing loss. Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (5), 491-505 (2011).
- Takeda, H., Dondzillo, A., Randall, J. A., Gubbels, S. P. Challenges in cell-based therapies for the treatment of hearing loss. Trends in Neurosciences. 41 (11), 823-837 (2018).
- Schacht, J., Talaska, A. E., Rybak, L. P. Cisplatin and aminoglycoside antibiotics: Hearing loss and its prevention. The Anatomical Record. 295 (11), 1837-1850 (2012).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. Journal of Visualized Experiments. (36), e1685 (2010).
- Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research. Journal of Visualized Experiments. (124), e55704 (2017).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
- Durbin, J. E., Hackenmiller, R., Simon, M. C., Levy, D. E. Targeted disruption of the mouse Stat1 gene results in compromised innate immunity to viral disease. Cell. 84 (3), 443-450 (1996).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Etournay, R., et al. Cochlear outer hair cells undergo an apical circumference remodeling constrained by the hair bundle shape. Development. 137 (8), 1373-1383 (2010).
- MacDonald, G. H., Rubel, E. W. Three-dimensional imaging of the intact mouse cochlea by fluorescent laser scanning confocal microscopy. Hearing Research. 243 (1-2), 1-10 (2008).
- Sibarita, J. B.
- Cortada, M., Sauteur, L., Lanz, M., Levano, S., Bodmer, D. A deep learning approach to quantify auditory hair cells. Hearing Research. 409, 108317 (2021).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
- Ershov, D., et al. TrackMate 7: Integrating state-of-the-art segmentation algorithms into tracking pipelines. Nature Methods. 19 (7), 829-832 (2022).
- Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. Cellpose: A generalist algorithm for cellular segmentation. Nature Methods. 18 (1), 100-106 (2021).
- Zhang, L. W., Cang, X. H., Chen, Y., Guan, M. X. In vitro culture of mammalian inner ear hair cells. Journal of Zhejiang University of Science B. 20 (2), 170-179 (2019).
