Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

جيل سايبريد ناقل الغضروف باستخدام خطوط الخلايا السرطانية

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/65186
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3, 1, 1,2
1Department of Biochemistry, University of Zaragoza, 2Institute for Biocomputation and Physics of Complex Systems, University of Zaragoza, 3Sequencing and Functional Genomics Unit, University of Zaragoza-IACS

Summary

يصف هذا البروتوكول تقنية لتوليد السايبريد من الخلايا السرطانية المعلقة كأداة لدراسة دور الميتوكوندريا في عملية الورم.

Abstract

في السنوات الأخيرة ، ارتفع عدد الدراسات المخصصة للتأكد من العلاقة بين الميتوكوندريا والسرطان بشكل كبير. ومع ذلك ، لا تزال هناك حاجة إلى مزيد من الجهود لفهم العلاقة التي تنطوي على تغييرات في الميتوكوندريا وتكوين الأورام بشكل كامل ، وكذلك لتحديد الأنماط الظاهرية للميتوكوندريا المرتبطة بالورم. على سبيل المثال ، لتقييم مساهمة الميتوكوندريا في عمليات تكوين الأورام وورم خبيث ، من الضروري فهم تأثير الميتوكوندريا من الخلايا السرطانية في البيئات النووية المختلفة. لهذا الغرض ، يتمثل أحد الأساليب الممكنة في نقل الميتوكوندريا إلى خلفية نووية مختلفة للحصول على ما يسمى بالخلايا السايبريدية. في تقنيات cybridization التقليدية ، يتم إعادة ملء خط الخلية الذي يفتقر إلى mtDNA (ρ0 ، خلية مانحة نووية) بالميتوكوندريا المشتقة من الخلايا المنزوعة النواة أو الصفائح الدموية. ومع ذلك ، تتطلب عملية الاستئصال التصاق جيد للخلايا بلوحة المزرعة ، وهي ميزة تفقد جزئيا أو كليا في كثير من الحالات في الخلايا الغازية. بالإضافة إلى ذلك ، هناك صعوبة أخرى موجودة في الطرق التقليدية وهي تحقيق الإزالة الكاملة ل mtDNA الداخلي من خط الخلية المتلقي للميتوكوندريا للحصول على خلفيات الحمض النووي والميتوكوندريا النقية ، وتجنب وجود نوعين مختلفين من mtDNA في cybrid المتولد. في هذا العمل ، نقدم بروتوكول تبادل الميتوكوندريا المطبق على الخلايا السرطانية المعلقة النمو بناء على إعادة توطين الخلايا المعالجة مسبقا للرودامين 6G مع الميتوكوندريا المعزولة. تسمح لنا هذه المنهجية بالتغلب على قيود الأساليب التقليدية ، وبالتالي يمكن استخدامها كأداة لتوسيع فهم دور الميتوكوندريا في تطور السرطان وورم خبيث.

Introduction

إعادة برمجة استقلاب الطاقة هو السمة المميزة للسرطان1 التي لوحظت لأول مرة من قبل أوتو واربورغ في ثلاثينيات القرن العشرين2. في ظل الظروف الهوائية ، تقوم الخلايا الطبيعية بتحويل الجلوكوز إلى بيروفات ، والتي تولد بعد ذلك أسيتيل-CoA ، مما يغذي آلية الميتوكوندريا ويعزز التنفس الخلوي. ومع ذلك ، أظهر واربورغ أنه حتى في ظل الظروف المعيارية ، تقوم معظم الخلايا السرطانية بتحويل البيروفات التي تم الحصول عليها من عملية تحلل السكر إلى لاكتات ، وتحول طريقها للحصول على الطاقة. يعرف هذا التعديل الأيضي باسم "تأثير واربورغ" ويمكن بعض الخلايا السرطانية من توفير مطالبها النشطة للنمو السريع والانقسام ، على الرغم من توليد ATP بكفاءة أقل من العملية الهوائية3،4،5. في العقود الأخيرة ، دعمت العديد من الأعمال الآثار المترتبة على إعادة برمجة الأيض في تطور السرطان. وبالتالي ، تعتبر طاقة الورم هدفا مثيرا للاهتمام ضد السرطان1. كمحور مركزي في التمثيل الغذائي النشط وفي توريد السلائف الأساسية ، تلعب الميتوكوندريا دورا رئيسيا في هذه التكيفات الخلوية التي ، حتى الآن ، نفهمها جزئيا فقط.

تماشيا مع ما سبق ، تم اقتراح طفرات الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA) كأحد الأسباب المحتملة لإعادة البرمجة الأيضية هذه ، والتي يمكن أن تؤدي إلى ضعف أداء سلسلة نقل الإلكترون (ETC)6 وستفسر سبب تعزيز بعض الخلايا السرطانية لعملية التمثيل الغذائي للسكر للبقاء على قيد الحياة. في الواقع ، تم الإبلاغ عن أن mtDNA يتراكم الطفرات داخل الخلايا السرطانية ، حيث يوجد في 50٪ على الأقل من الأورام7. على سبيل المثال ، أفادت دراسة حديثة أجراها Yuan et al. بوجود جزيئات mtDNA مفرطة التحور والمقطوعة في سرطان الكلى والقولون والمستقيم والغدة الدرقية8. علاوة على ذلك ، أثبتت العديد من الأعمال أن بعض طفرات mtDNA مرتبطة بنمط ظاهري أكثر عدوانية للورم ومع زيادة في الإمكانات النقيلية للخلايا السرطانية9،10،11،12،13،14،15،16.

على الرغم من الأهمية الواضحة لجينوم الميتوكوندريا في تطور السرطان ، فإن دراسة هذه الطفرات ومساهمتها في المرض كانت صعبة بسبب القيود في النماذج والتقنيات التجريبية المتاحة حاليا17. وبالتالي ، هناك حاجة إلى تقنيات جديدة لفهم التأثير الحقيقي للحمض النووي للميتوكوندريا في تطور مرض السرطان وتطوره. في هذا العمل ، نقدم بروتوكولا لتوليد cybrid transmitochondrial من الخلايا السرطانية المعلقة النمو ، استنادا إلى إعادة توطين خلايا الرودامين 6G المعالجة مسبقا مع الميتوكوندريا المعزولة ، والتي تتغلب على التحديات الرئيسية لطرق cybridization التقليدية18,19. تسمح هذه المنهجية باستخدام أي متبرع بالنوى بغض النظر عن توفر خط الخلية ρ0 المقابل ونقل الميتوكوندريا من الخلايا التي ، باتباع التقنيات التقليدية ، سيكون من الصعب استئصالها (أي خطوط الخلايا غير الملتصقة).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: يتم تحديد جميع وسائط الاستزراع والتراكيب العازلة في الجدول 1. قبل توليد السايبريد ، يجب كتابة كل من ملفات تعريف الحمض النووي للميتوكوندريا والنووية من خلايا المتبرع والمتلقي لتأكيد وجود اختلافات وراثية في كلا الجينومين بين خطوط الخلايا. في هذه الدراسة ، تم استخدام خط خلية L929 متاح تجاريا وخط الخلية المشتق منه ، L929dt ، والذي تم إنشاؤه تلقائيا في مختبرنا (انظر13 لمزيد من المعلومات). تقدم خطوط الخلايا هذه اختلافين في تسلسل جين mt-Nd2 الخاص بها والذي يمكن استخدامه لتأكيد نقاء mtDNA بمجرد الانتهاء من عملية التجسير13. في هذه الحالة ، تم تأكيد نقاء الخلفية النووية من خلال حساسية المضادات الحيوية ، لأنه على عكس خلايا L929dt ، كان L929 مقاوما للجيناتسين.

1. استنزاف الميتوكوندريا عن طريق علاج الرودامين 6G (الخلايا المتلقية)

ملاحظة: الخطوة الأولى لتوليد cybrid الناجح هي إلغاء وظائف الميتوكوندريا في الخلايا المتلقية بشكل كامل ولا رجعة فيه. لهذا الغرض ، من الضروري أن تحدد مسبقا ، لكل خط خلية ، التركيز المناسب ومدة العلاج باستخدام الرودامين 6G. يجب أن يكون هذا التركيز الكافي أقل بقليل من موت الخلايا الناجم عن المخدرات (أعلى مستوى لا يقتل الخلايا أثناء العلاج). قم بإجراء ما يلي بمجرد تحديد الظروف المثلى.

  1. قم بزرع 10 6 خلايا في صفيحة ذات6 آبار باستخدام وسط استزراع كامل (انظر الجدول 1 للحصول على التفاصيل) ومعالجتها يوميا بالتركيز الأمثل للرودامين 6G لمدة 3-10 أيام ، اعتمادا على خط الخلية. تتراوح التركيزات التقليدية من 2 إلى 5 ميكروغرام / مل لمدة 3-10 أيام20,21. في هذه الدراسة ، بالنسبة للخلايا المشتقة من L929 ، كان 2.5 ميكروغرام / مل رودامين 6G لمدة 7 أيام هو العلاج المختار13،22.
  2. للحفاظ على الخلايا على قيد الحياة ، استكمل وسط زراعة الخلايا ب 50 ميكروغرام / مل من اليوريدين و 100 ميكروغرام / مل من البيروفات وتجديده كل 24 ساعة.
  3. بعد العلاج وقبل الانصهار ، قم بتغيير وسط الخلايا المعالجة بالرودامين 6G لإكمال وسط زراعة الخلايا بدون رودامين 6G ، واتركها في هذا الوسط لمدة 3-4 ساعات في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
    ملاحظة: التأثير السام للرودامين 6G لا رجعة فيه ، ويجب ألا تتعافى الخلايا ذات الميتوكوندريا غير الوظيفية20. وهكذا ، بعد العلاج ، يجب أن تموت الخلايا التي لا تتلقى الميتوكوندريا الوظيفية حتى في وسط الثقافة المكمل باليوريدين. ولذلك، لا ينبغي أن يكون من الضروري اختيار الأسلحة النووية. ومع ذلك ، يوصى بدمج التحكم في الخلايا المعالجة بالرودامين 6G بدون الميتوكوندريا.

2. التوسع وعزل الميتوكوندريا (الخلايا المانحة)

  1. قم بتوسيع الخلايا المانحة للميتوكوندريا خلال الفاصل الزمني لعلاج رودامين 6G للحصول على حوالي 25 × 106 خلايا.
  2. في اليوم السابع ، احصد الخلايا التي تنمو بشكل كبير في أنبوب سعة 50 مل واجمعها عن طريق الطرد المركزي عند 520 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). اغسل الخلايا 3 مرات بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات البارد (PBS) وقم بترسيبها عن طريق الطرد المركزي عند 520 × جم لمدة 5 دقائق في RT. من الآن فصاعدا ، قم بتنفيذ جميع خطوات استخراج الميتوكوندريا عند 4 درجات مئوية ، باستخدام الكواشف الباردة والحفاظ على الأنابيب مع الخلايا أو الميتوكوندريا على الجليد.
  3. بعد الطرد المركزي الثالث ، تخلص من المادة الطافية عن طريق الشفط باستخدام ماصة زجاجية مقترنة بمضخة تفريغ وأعد تعليق الخلايا المعبأة في حجم مخزن مؤقت منخفض التوتر يساوي 7 أضعاف حجم حبيبات الخلية. ثم ، انقل تعليق الخلية إلى أنبوب خالط واترك الخلايا تنتفخ عن طريق احتضانها على الجليد لمدة 2 دقيقة.
  4. كسر أغشية الخلايا عن طريق إجراء 8 إلى 10 ضربات في الخالط إلى جانب مدقة مدفوعة بمحرك تدور عند 600 دورة في الدقيقة.
    ملاحظة: يمكن أن تختلف خطوة اضطراب غشاء الخلية بين أنواع الخلايا. وبالتالي ، يجب تحسينه لكل نوع خلية.
  5. أضف نفس الحجم من المخزن المؤقت مفرط التوتر إلى تعليق الخلية (7x حجم حبيبات الخلية) لتوليد بيئة متساوية التوتر.
  6. انقل المجانس إلى أنبوب سعة 15 مل وطرده مركزيا في دوار ثابت عند 1000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. بعد ذلك ، اجمع فقط 3/4 من المادة الطافية التي تترك هامشا كبيرا من الحبيبات ، لتجنب التلوث بالنوى أو الخلايا السليمة ، ونقلها إلى أنبوب آخر. كرر نفس العملية مرتين. لاحظ أنه يجب الاحتفاظ بالمادة الطافية والتخلص من الحبيبات.
  7. احفظ جزء الميتوكوندريا (طاف). انقله إلى أنابيب 1.5 مل وأجهزة طرد مركزي بأقصى سرعة (18000 × جم) لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية.
  8. تخلص من المادة الطافية واغسل الحبيبات المخصبة بالميتوكوندريا بالمخزن المؤقت A ، مع الجمع بين محتوى الأنبوبين في أنبوب واحد والطرد المركزي في نفس الظروف الموضحة في الخطوة 2.7. كرر نفس العملية حتى تصبح جميع المواد في أنبوب واحد فقط.
  9. قم بغسل إضافي باستخدام 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت A وحدد تركيز بروتين الميتوكوندريا باستخدام اختبار برادفورد23. لكل مقايسة cybridization ، يجب تحديد الكمية المثلى من الميتوكوندريا لإجراء النقل (في حالتنا ، تركيز يتراوح بين 10-40 ميكروغرام من بروتين الميتوكوندريا لكل 106 خلايا).
  10. في الوقت نفسه ، قم بإعداد خلايا الرودامين 6G المعالجة مسبقا للاندماج عن طريق جمعها في أنبوب سعة 15 مل والطرد المركزي عند 520 × جم لمدة 5 دقائق في RT. لاحظ أن الحبيبات تكتسب لونا ورديا نيون بسبب علاج الرودامين 6G.
  11. للتأكد من أن كلا من إلغاء وظيفة الميتوكوندريا في خلايا المستقبلات وكذلك تنقية العضيات من المتبرعين قد تم إجراؤها بشكل صحيح ، قم بزرع عدد صغير من الخلايا المعالجة بالرودامين 6G وعزل الميتوكوندريا باستخدام وسط الاستزراع الكامل في لوحة 6 آبار واستزراعها لمدة شهر للتحقق من عدم بقاء أي خلايا باقية في أي من الآبار (الشكل 2).
  12. في موازاة ذلك ، قم بتقييم عدم وجود ملوثات النوى في جزء الميتوكوندريا عن طريق الكشف المناعي للبروتينات النووية (أي لامين بيتا ، هيستون H3 ، إلخ) أو عن طريق تضخيم تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (qPCR) لجين نووي (أي SDH ، 18S rRNA ، إلخ).
    ملاحظة: لتجنب التلوث ، يوصى بتنفيذ جميع الخطوات في ظروف معقمة تعمل تحت غطاء التدفق الصفحي.

3. الانصهار وتوليد cybrid

  1. للمضي قدما في الاندماج ، أضف بعناية 106 من الخلايا المعالجة بالرودامين 6G إلى حبيبات الميتوكوندريا المعزولة (10-40 ميكروغرام من بروتين الميتوكوندريا) وأجهزة الطرد المركزي عند 520 × جم لمدة 5 دقائق للسماح للخلايا بالاختلاط مع الميتوكوندريا.
  2. أضف 100 ميكرولتر من البولي إيثيلين جلايكول (PEG ، 50٪) وأعد تعليق الحبيبات برفق لمدة 30 ثانية. ثم اتركيه يرتاح دون أن يمسه أحد لمدة 30 ثانية أخرى.
  3. أخيرا ، انقل المزيج إلى طبق مكون من 6 آبار مع وسط زراعة خلايا كاملة طازجة وضعه في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. بعد بضعة أيام (عادة أسبوع واحد) ، يجب أن تبدأ cybrids transmitochondrial في النمو (الشكل 2) ، مما يؤدي إلى استنساخ يمكن اختياره بشكل فردي أو خلطه في بركة قبل تحليلها.

4. التحقق من كل من الخلفية الميتوكوندريا والنووية

ملاحظة: بمجرد إنشاء خط الخلية الجديد وتبدأ الخلايا في النمو بشكل كبير ، يجب التحقق من نقاء الحمض النووي للميتوكوندريا والنووي. وبالتالي ، يجب أن تحتوي خطوط الخلايا الأصلية على طفرات مختلفة أو تعدد أشكال داخل جينوماتها لجعلها قابلة للتمييز.

  1. عزل الحمض النووي الكلي
    1. عزل الحمض النووي الجينومي لجميع خطوط الخلايا المستخدمة لتوليد cybrid عن طريق استخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الجينومي التجارية (انظر جدول المواد) أو عن طريق تنفيذ بروتوكول قياسي باستخدام استخراج كحول الفينول - كلوروفورم - إيزو أميل وترسيبالكحول 24.
  2. تقييم mtDNA (الشكل 3)
    ملاحظة: يمكن إجراء العديد من التقنيات ، مثل التسلسل ، أو تحليل تعدد الأشكال بطول جزء التقييد (RFLP) ، أو qPCR الخاص بالأليل ، لتحليل نقاء mtDNA. للتأكد من وجود اختلافات تسلسل mtDNA بواسطة RFLP ، اتبع خطوات البروتوكول التالية.
    1. تضخيم جزء mtDNA يحتوي على تغيير النوكليوتيدات بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل.
      1. هنا ، تقدم خلايا L929dt طفرة mtDNA في الموضع 4206 ، داخل جين mt-Nd2 (m.4206C >T) الغائب في خلايا L929. لتأكيد وجود هذا الاستبدال في cybrids transmitochondrial ، قم بتضخيم جزء 397 bp بواسطة PCR باستخدام بروتوكول قياسي والبادئات التالية: 1) 5'-AAGCTATCGGG
        CCCATACCCCG-3 '(المواضع 3862-3884) و 2) 5'-TAATCAGAAGTGGAATGGGGCG -3' (المواضع 4236-4258).
    2. تحليل وجود استبدال النوكليوتيدات المطلوب بواسطة RFLP ، باستخدام نوكلياز داخلي محدد يتعرف على تغيير التسلسل ويولد نمط قطع مختلف لكلا خطي الخلية.
      ملاحظة: عند وجود متغير mtDNA L929dt (4206T) ، يحتوي amplicon الذي تم الحصول عليه في الخطوة 4.2.1 على موقعين تقييد ل SspI (انظر جدول المواد) ينتج ثلاثة أجزاء من الحمض النووي من 306 bp و 52 bp و 39 bp. يتم تعطيل موقع التقييد الذي يولد النطاقين 52 و 39 عند وجود الإصدار C4206 من النوع البري (WT) ، ويظهر نطاق جديد من 91 نقطة أساس. لذلك ، يتم تضمين الرقابة الداخلية للهضم الكامل ل SspI في التحليل. يتم إجراء تفاعل الهضم عند 37 درجة مئوية ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
    3. افصل شظايا التقييد عن طريق الرحلان الكهربائي وقارن نمط الشريط.
      1. بمجرد إجراء عملية الهضم ، قم بتحليل شظايا التقييد التي تم الحصول عليها عن طريق الرحلان الكهربائي في 10٪ من المواد الهلامية بولي أكريلاميد-تريس-بورات-EDTA (TBE) (انظر الجدول 1 لتكوين 1x TBE). قم بتشغيل الكهربائي عند 80 فولت لمدة 1 ساعة في RT. تصور شظايا الحمض النووي بعد تلطيخ الهلام في محلول بروميد الإيثيديوم في 1x TBE لمدة 15 دقيقة في RT (انظر الجدول 1 لتكوين محلول تلطيخ الهلام).
  3. التنميط الجيني للحمض النووي النووي
    ملاحظة: يجب إجراء التنميط الجيني للحمض النووي النووي باستخدام عينة استخراج الحمض النووي السابقة المستخدمة في تحليل RFLP.
    1. تضخيم 16 موقعا (D21S11 وCSF1PO وvWA و D8S1179 وTH01 وD18S51 وD5S818 و D16S539 و D3S1358 و D2S1338 و TPOX و FGA و D7S820 و D13S317 و D19S433 و AMEL) باستخدام مجموعة من قليل النيوكليوتيدات الخاصة بالتجارة (انظر جدول المواد).
    2. إجراء الكهربائي باستخدام محلل وراثي من أجل فصل الشظايا التي تم الحصول عليها مسبقا.
      ملاحظة: بمجرد تضخيمها ، يتم تحليل المواضع المختلفة عن طريق الرحلان الكهربائي باستخدام نظام شعري (انظر جدول المواد). يتم فصل الشظايا في شعري بطول 50 سم مملوء ببوليمر تجاري. تتوفر أيضا مخازن الكاثود والأنود تجاريا ، كما هو موضح في جدول المواد. يتم إجراء الرحلان الكهربائي عند 19.5 كيلو فولت لمدة 20 دقيقة عند 60 درجة مئوية.
    3. استخدم أدوات المعلوماتية الحيوية لتحديد الأليلات المقابلة لكل موضع تضخيم (انظر جدول المواد).
    4. قارن البيانات التي تم الحصول عليها في الخطوة 4.3.3 مع قاعدة بيانات ملف تعريف الحمض النووي النووي (الجدول 1) ، للتحقق مما إذا كان ملف تعريف الحمض النووي النووي يتطابق مع ملف تعريف خط خلية مستقبلات الميتوكوندريا (الشكل 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بعد اتباع البروتوكول المقدم أعلاه ، يجب الحصول على خط خلية سايبريد متجانسة ذات خلفية نووية محفوظة ولكن مع نمط وراثي جديد للميتوكوندريا ، كما هو موضح في المخططات في الشكل 1 والشكل 2. يمكن تأكيد نقاء الحمض النووي والميتوكوندريا والنووي الموجود في الجابريدات بواسطة RFLP ، كما هو موضح في الشكل 3 ، وعن طريق تحليل التنميط الجيني للحمض النووي النووي ، كما هو موضح في الشكل 4.

إذا تم نقل الميتوكوندريا بنجاح ، يجب أن تظهر النتائج التي تم الحصول عليها من خلال تحليل RFLP لخط خلية cybrid أنماط مختلفة من شريط الهضم مقارنة بخط الخلية المتلقية ومطابقة لخط الخلايا المانحة للميتوكوندريا. لهذا الغرض ، يجب اختيار إنزيم القطع بعناية ، مع التأكد من أن أنماط الشريط التي تم الحصول عليها من الهضم مختلفة في كلا خطي الخلية. ويرد أحد الأمثلة في الشكل 3 ، حيث يتم عرض شظايا التقييد التي تم الحصول عليها بعد هضم SspI في الميتوكوندريا WT والميتوكوندريا الطافرة (MUT). في حالة خطوط الخلايا المرسلة الجديدة ، كانت شظايا التقييد متطابقة مع تلك التي تم الحصول عليها في الجهات المانحة للميتوكوندريا الخاصة بها ومختلفة عن تلك التي تم إنشاؤها باستخدام مضخمات الخلايا المانحة للنوى. وبالتالي ، يؤكد هذا الفحص أن تبادل الميتوكوندريا تم إجراؤه كما هو متوقع. وتجدر الإشارة إلى أنه تم تضمين عينة من الخلايا المتلقية التي لم تخضع لعملية الهضم في هذا التحليل كعنصر تحكم سلبي.

فيما يتعلق بالتنميط الجيني النووي للحمض النووي ، يوضح الشكل 4 ملفا نموذجيا تم الحصول عليه من تحليل 16 موقعا نوويا لأحد خطوط الخلايا المستخدمة في هذا البروتوكول. على غرار RFLP ، من خلال مقارنة القمم التي تم الحصول عليها لكل موضع ، يجب أن تتطابق النتائج التي تم الحصول عليها من خط خلايا مستقبلات الميتوكوندريا (المتبرع النووي) مع cybrid المتولد.

من المهم ملاحظة أن النتائج التي تم الحصول عليها قد تختلف وفقا لعوامل مختلفة. كما نشير في البروتوكول ، ليست كل خطوط الخلايا عرضة لنفس الكمية من الرودامين 6G لإزالة مجمل الميتوكوندريا الوظيفية.

Figure 1
الشكل 1: تمثيل تخطيطي لتوليد السايبريد، يلخص الخطوات من 1 إلى 3 من البروتوكول. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: تمثيل تخطيطي يوضح تصميم صفيحة زراعة الخلايا بعد بروتوكول التجسير. يتم زرع خط خلايا سايبريد جديد وعناصر تحكم (الميتوكوندريا المعزولة والخلايا المتلقية المعالجة بالرودامين 6G) بشكل منفصل في لوحة من 6 آبار. بعد بضعة أيام من المزرعة ، تبدأ الخلايا السايبريدية في النمو ، في حين لا تبقى خلايا باقية في آبار التحكم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: التوصيف الجزيئي للسايبريدات. (أ) تحليل RFLP للطفرة m.4206C>T في خطوط الخلايا المانحة للميتوكوندريا (WT و MUT ، الممرات 3 و 4 ، على التوالي) وخطوط الخلايا المرسلة لكل منها (MUT WT → الحارة 5 ، وWT MUT → الحارة 6). MW: علامة الوزن الجزيئي (الحارة 1) ؛ غير مصقول: منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل غير المهضوم (الحارة 2). (ب) خرائط تقييد SspI لمنتج تفاعل البوليميراز المتسلسل للميتوكوندريا WT و MUT. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: النتائج التمثيلية لتحليل خلفية الحمض النووي النووي. مثال على البصمة الوراثية النووية التي تم الحصول عليها بعد تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ل 16 موقعا والفصل عن طريق الرحلان الكهربائي الشعري. يوضح الشكل نمط الذروة المميز لكل موضع تضخيم لخط خلوي. يجب أن يكون هذا النمط مختلفا بالنسبة لخطي الخلية المستخدمين في بروتوكول التجسير لتأكيد نقاء الحمض النووي النووي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

متوسط تكوين
وسط ثقافي كامل DMEM نسبة عالية من الجلوكوز مع L-Gln والبيروفات + FBS (10٪) + البنسلين الستربتومايسين (1x)
عازلة توتر مائي 10 مللي مول المماسح ، 83 ملليمتر السكروز ، درجة الحموضة 7.2
عازلة مفرطة التوتر 30 مللي متر ممسحة ، 250 مللي متر سكروز ، درجة حموضة 7.2
المخزن المؤقت أ 10 مللي متر تريس ، 1 مللي متر EDTA ، 0.32 متر سكروز ، درجة حموضة 7.4
تي بي إي (1x) 50 مللي متر تريس ، 50 مللي متر حمض البوريك ؛ 1 مللي متر EDTA
حل تلطيخ جل 0.75 ميكروغرام / مل بروميد الإيثيديوم في 1x TBE

الجدول 1: المخازن المؤقتة وتكوين الوسائط.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

منذ أن أفاد أوتو واربورغ أن الخلايا السرطانية تحول عملية التمثيل الغذائي وتحفز "تحلل السكر الهوائي"3,4 مع تقليل تنفس الميتوكوندريا ، نما الاهتمام بدور الميتوكوندريا في تحول السرطان وتطوره بشكل كبير. في السنوات الأخيرة ، تم افتراض الطفرات في mtDNA واختلال الميتوكوندريا كسمات مميزة للعديد من أنواع السرطان25. حتى الآن ، قامت العديد من الدراسات بتحليل تباين mtDNA لأورام معينة6،26،27،28،29،30،31،32 ، واعتبر العبء الإجمالي لطفرات mtDNA المكتسبة علامة حيوية للورم 30 في السرطانات مثل سرطان البروستاتا 33. تماشيا مع هذا ، في حين أن طفرات mtDNA تعتبر بادئات للورم في بعض الحالات ، كما هو الحال في سرطان الثدي 34,35 أو سرطان البنكرياس 36 ، أو الأورام الخبيثة النسائية37,38 ، أو نقائل سرطان الرئةالغدي 15,39 ، أو سرطان الدم النخاعي الحاد 40,41 ، يبدو أنها أقل أهمية في الأورام الأرومية الدبقية 42.

على الرغم من أن العديد من السرطانات تحتوي على طفرات mtDNA شديدة غير موجودة في الأنسجة السليمة43 ويمكن أن تسهم في بدء السرطان30 ، إلا أن البعض الآخر يقدم متغيرات mtDNA متعددة الأشكال شائعة في مختلف المجموعات البشرية. تعزز هذه المتغيرات التغييرات الأكثر اعتدالا التي يمكن أن تكون مهمة لتكيف الخلايا السرطانية بمجرد بدء عملية التحول30. على أي حال ، تشارك طفرات mtDNA وتغيرات استقلاب الميتوكوندريا في تطور الورم ، وتعديل جوانب مختلفة من توازن الخلية مثل إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية أو حالة الأكسدةوالاختزال 44،45،46. ومع ذلك ، فإن الآليات التي يمكن من خلالها لطفرات ومتغيرات mtDNA أن تفضل تكوين الورم ليست مفهومة تماما بعد. إلى جانب ذلك ، قد تتعايش طفرات mtDNA في الخلايا السرطانية مع التغيرات في الجينات النووية 8,33 ، مما يجعل من الصعب تحديد الطفرة الدافعة. في حالات أخرى ، يتم تحقيق متطلبات الطاقة الحيوية للخلايا السرطانية عن طريق تعديل نسخة mtDNA رقم47. من ناحية أخرى ، في بعض الحالات ، يمكن أن تجعل طفرات mtDNA الخلايا السرطانية أكثر عرضة لأدوية محددة مضادة للورم48.

لفهم دور طفرات mtDNA بشكل كامل في الفيزيولوجيا المرضية للسرطان ، من الضروري تطوير منهجيات يمكن من خلالها تحليل الميتوكوندريا المتحورة في بيئة نووية خاضعة للرقابة. يمكن أن يساعد ذلك في تجنب التأثيرات التعويضية للجينات النووية التي يمكن أن تؤدي إلى التكيف الخلوي. لهذا الغرض ، تمثل cybrids transmitochondrial نموذجا مناسبا. تتضمن الطرق التقليدية للتجسير خط خلية مستنفد mtDNA (خلايا ρ0) التي تعمل كمتبرع للنوى (وبالتالي مستقبلات الميتوكوندريا) ومتبرع للميتوكوندريا ، وعادة ما يكون خط خلية منزوعة النواة أو الصفائح الدموية19 ، تحمل متغيرات mtDNA أو الطفرات ذات الأهمية. التحدي الأول الذي يجب حله عند محاولة توليد cybrids هو توافر خلايا ρ0 التي تؤوي الخلفية النووية المفضلة. يتضمن تماسك هذه الخلايا معالجة طويلة الأمد ببروميد الإيثيديوم ، وهو مركب كيميائي يمنع تكاثر mtDNA. ومع ذلك ، يمكن أن يحفز أيضا توليد طفرات داخل الجينوم النووي يمكن أن تخفي آثار تغيرات الميتوكوندريا المراد دراستها. لذلك ، في هذا العمل ، نقترح القضاء على الميتوكوندريا الكاملة في خطوط الخلايا المانحة للنوى عن طريق العلاج باستخدام رودامين 6G ، وهو دواء يدمر الميتوكوندريا بشكل لا رجعة فيه ويقتل الخلايا ما لم يتم إدخال الميتوكوندريا الطازجة في السيتوبلازم21،22،49.

هناك تحد آخر في طرق توليد السايبريد التقليدية يتعلق بعملية استئصال الخلايا المانحة للميتوكوندريا. لهذا الغرض ، يتم طرد الخلايا الملتصقة بالطرد المركزي في وجود السيتوكلاسين B ، والذي يسمح بعزل الخلايا الخلوية المنزوعة النواة18 من خلال تعزيز عدم تنظيم الهيكل الخلوي. إذا نمت الخلايا في تعليق (مثل خطوط الدم) أو فقدت التصاق الخلية الخلوية والمصفوفة خارج الخلية (والذي قد يحدث لأولئك الذين لديهم إمكانات نقيلي أعلى50،51،52) ، اختراق بروتوكول الاستئصال هذا ، لأن البلاستيدات الخلوية ستنفصل عن اللوحة أثناء الطرد المركزي لإزالة النوى ، مما يقلل إلى حد كبير من تجمعهم لإجراء الاندماج اللاحق. للتحايل على كلا التحديين ، نقترح هنا بروتوكولا يتم فيه دمج الميتوكوندريا المعزولة مع خلايا رودامين 6G المعالجة مسبقا في وجود PEG ، والتي أثبتت أنها موفرة للوقت وفعالة21،22،49.

بمجرد إنشاء خطوط الخلايا الناقل ، من الأهمية بمكان تقييم نقاء كل من جينومات الميتوكوندريا والنووية. لذلك ، من الأهمية بمكان اختيار خطوط خلايا المتبرعين مع اختلافات التسلسل داخل الحمض النووي للميتوكوندريا وذات الخصائص المميزة ، مثل مقاومة المضادات الحيوية أو السواتل الدقيقة التفاضلية. كما هو موضح أعلاه ، تم الإبلاغ عن أن بعض أنواع السرطان تقوم بتعديل نسخة mtDNA الخاصة بها رقم47 ، مما يدل على أهمية تحليل حمل mtDNA في كل من خطوط الخلايا الأصلية و transmitochondrial ودراسة أداء OXPHOS في ظل ظروف مماثلة.

ترتبط المزالق الرئيسية المخفية في هذا الإجراء بعملية التخلص من الميتوكوندريا باستخدام الرودامين 6G. يجب أن يسبق كل تجربة cybridization مقايسات لتحديد الظروف المثلى لتركيز الدواء ووقت العلاج لخط الخلايا المانحة للنواة المختارة. إذا لم يكن تركيز الرودامين 6G أو وقت المعرض كافيا ، فسيكون لخط الخلية الجديد مساهمة اثنين من mtDNAs المختلفين ، مما سيضيف المزيد من التعقيد إلى تحليل النمط الظاهري. علاوة على ذلك ، إذا تجاوز الوقت أو الجرعة المثلى ، فلن تعيش الخلايا حتى بعد إعادة توطين الميتوكوندريا. أخيرا ، من الضروري توخي الحذر أثناء عملية عزل الميتوكوندريا لتجنب التلوث بالخلايا غير المكسورة ، والتي يمكن أن تغير توصيف النمط الظاهري.

على الرغم من الصعوبات التقنية ، فإن توليد cybrids transmitochondrial هو أداة قوية لكشف مساهمة الميتوكوندريا في عمليات السرطان والانبثاث وتوليد نماذج الخلايا حيث يمكن اختبار العلاجات المحتملة المضادة للسرطان باستخدام الميتوكوندريا كهدف علاجي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

تم تمويل هذا البحث من خلال المنحة رقم PID2019-105128RB-I00 إلى RSA و JMB و AA ، و PGC2018-095795-B-I00 إلى PFS و RML ، وكلاهما ممول من MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 وأرقام المنح B31_20R (RSA و JMA و AA) و E35_17R (PFS و RML) وبتمويل من Gobierno de Aragón. وحظي عمل الرابطة بدعم من منحة من الرابطة الإسبانية لمكافحة الكانسر PRDAR21487SOLE. ويود المؤلفان أن يعربا عن تقديرهما لاستخدام الخدمة العامة للدعم والتحقيق في الأجهزة العليا للرقابة المالية، جامعة سرقسطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3500XL Genetic Analyzer  ThermoFisher Scientific 4406016
6-well plate Corning 08-772-1B
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich A3678
AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit ThermoFisher Scientific 4427368
Anode Buffer Container 3500 Series Applied Biosystems 4393927
Boric acid PanReac 131015
Bradford assay Biorad 5000002
Cathode Buffer Container 3500 Series Applied Biosystems 4408256
Cell culture flasks TPP 90076
DMEM high glucose Gibco 11965092
EDTA PanReac 131026
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich E8751
Geneticin Gibco 10131027
Homogenizer Teflon pestle Deltalab 196102
L929 cell line ATCC CCL-1
MiniProtean Tetra4 Gel System BioRad 1658004
MOPS Sigma-Aldrich M1254
PCR primers Sigma-Aldrich Custom products
Polyacrylamide Solution 30% PanReac A3626
Polyethylene glycol Sigma-Aldrich P7181
POP-7 Applied Biosystems 4393714
Pyruvate Sigma-Aldrich P5280
QIAmp DNA Mini Kit Qiagen 51306
Rhodamine-6G Sigma-Aldrich R4127
Serum Fetal Bovine Sigma-Aldrich F7524
SspI New England Biolabs R3132
Streptomycin/penicillin PAN biotech P06-07100
Sucrose Sigma-Aldrich S3089
TEMED Sigma-Aldrich T9281
Tris PanReac P14030b
Uridine Sigma-Aldrich U3750

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hanahan, D. Hallmarks of cancer: new dimensions. Cancer Discovery. 12 (1), 31-46 (2022).
  2. Wind, F., Warburg, O. H. The Metabolism of Tumors: Investigation from the Kaiser Wilhelm Institute for Biology. , Constable. Berlin-Dahlem. (1930).
  3. Warburg, O. On respiratory impairment in cancer cells. Science. 124 (3215), 269-270 (1956).
  4. Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
  5. Weinhouse, S. On respiratory impairment in cancer cells. Science. 124 (3215), 267-269 (1956).
  6. Brandon, M., Baldi, P., Wallace, D. C. Mitochondrial mutations in cancer. Oncogene. 25 (34), 4647-4662 (2006).
  7. Ju, Y. S., et al. Origins and functional consequences of somatic mitochondrial DNA mutations in human cancer. eLife. 3, 02935 (2014).
  8. Yuan, Y., et al. Comprehensive molecular characterization of mitochondrial genomes in human cancers. Nature Genetics. 52 (3), 342-352 (2020).
  9. Arnold, R. S., et al. metastasis in prostate cancer: Recurring mitochondrial DNA mutation reveals selective pressure exerted by the bone microenvironment. Bone. 78, 81-86 (2015).
  10. Imanishi, H., et al. Mitochondrial DNA mutations regulate metastasis of human breast cancer cells. PLoS One. 6 (8), 23401 (2011).
  11. Lu, J., Sharma, L. K., Bai, Y. Implications of mitochondrial DNA mutations and mitochondrial dysfunction in tumorigenesis. Cell Research. 19 (7), 802-815 (2009).
  12. Luo, Y., Ma, J., Lu, W. The significance of mitochondrial dysfunction in cancer. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5598 (2020).
  13. Marco-Brualla, J., et al. Mutations in the ND2 subunit of mitochondrial complex I are sufficient to confer increased tumorigenic and metastatic potential to cancer cells. Cancers. 11 (7), 1027 (2019).
  14. Schopf, B., et al. OXPHOS remodeling in high-grade prostate cancer involves mtDNA mutations and increased succinate oxidation. Nature Communications. 11 (1), 1487 (2020).
  15. Yuan, Y., et al. Nonsense and missense mutation of mitochondrial ND6 gene promotes cell migration and invasion in human lung adenocarcinoma. BMC Cancer. 15, 346 (2015).
  16. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. 34;ROS-generating mitochondrial DNA mutations can regulate tumor cell metastasis"--a critical commentary. Free Radicals Biology and Medicine. 45 (9), 1217-1219 (2008).
  17. Welch, D. R., Foster, C., Rigoutsos, I. Roles of mitochondrial genetics in cancer metastasis. Trends in Cancer. 8 (12), 1002-1018 (2022).
  18. Cavaliere, A., Marchet, S., Di Meo, I., Tiranti, V. An in vitro approach to study mitochondrial dysfunction: A cybrid model. Journal of Visualized Experiments. (181), e63452 (2022).
  19. King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
  20. Bacman, S. R., Moraes, C. T. Transmitochondrial technology in animal cells. Methods in Cell Biology. 80, 503-524 (2007).
  21. Moraes, C. T., Dey, R., Barrientos, A. Transmitochondrial technology in animal cells. Methods in Cell Biology. 65, 397-412 (2001).
  22. Acin-Perez, R., et al. Respiratory complex III is required to maintain complex I in mammalian mitochondria. Molecular Cell. 13 (6), 805-815 (2004).
  23. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  24. Bayona-Bafaluy, M. P., et al. Revisiting the mouse mitochondrial DNA sequence. Nucleic Acids Research. 31 (18), 5349-5355 (2003).
  25. Srinivasan, S., Guha, M., Kashina, A., Avadhani, N. G. Mitochondrial dysfunction and mitochondrial dynamics-The cancer connection. Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1858 (8), 602-614 (2017).
  26. Bartoletti-Stella, A., et al. Mitochondrial DNA mutations in oncocytic adnexal lacrimal glands of the conjunctiva. Archives of Ophthalmology. 129 (5), 664-666 (2011).
  27. Chinnery, P. F., Samuels, D. C., Elson, J., Turnbull, D. M. Accumulation of mitochondrial DNA mutations in ageing, cancer, and mitochondrial disease: is there a common mechanism. The Lancet. 360 (9342), 1323-1325 (2002).
  28. Copeland, W. C., Wachsman, J. T., Johnson, F. M., Penta, J. S. Mitochondrial DNA alterations in cancer. Cancer Investigation. 20 (4), 557-569 (2002).
  29. Gasparre, G., et al. Clonal expansion of mutated mitochondrial DNA is associated with tumor formation and complex I deficiency in the benign renal oncocytoma. Human Molecular Genetics. 17 (7), 986-995 (2008).
  30. Kopinski, P. K., Singh, L. N., Zhang, S., Lott, M. T., Wallace, D. C. Mitochondrial DNA variation and cancer. Nature Review Cancer. 21 (7), 431-445 (2021).
  31. Pereira, L., Soares, P., Maximo, V., Samuels, D. C. Somatic mitochondrial DNA mutations in cancer escape purifying selection and high pathogenicity mutations lead to the oncocytic phenotype: pathogenicity analysis of reported somatic mtDNA mutations in tumors. BMC Cancer. 12, 53 (2012).
  32. Wallace, D. C. Mitochondria and cancer. Nature Reviews. Cancer. 12 (10), 685-698 (2012).
  33. Hopkins, J. F., et al. Mitochondrial mutations drive prostate cancer aggression. Nature Communications. 8 (1), 656 (2017).
  34. Weerts, M. J. A., Smid, M., Foekens, J. A., Sleijfer, S., Martens, J. W. M. Mitochondrial RNA expression and single nucleotide variants in association with clinical parameters in primary breast cancers. Cancers. 10 (12), 500 (2018).
  35. Jimenez-Morales, S., Perez-Amado, C. J., Langley, E., Hidalgo-Miranda, A. Overview of mitochondrial germline variants and mutations in human disease: Focus on breast cancer (Review). International Journal of Oncology. 53 (3), 923-936 (2018).
  36. Hardie, D. G. AMP-activated/SNF1 protein kinases: conserved guardians of cellular energy. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 774-785 (2007).
  37. Perrone, A. M., et al. Potential for mitochondrial DNA sequencing in the differential diagnosis of gynaecological malignancies. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2048 (2018).
  38. Musicco, C., et al. Mitochondrial dysfunctions in type I endometrial carcinoma: Exploring their role in oncogenesis and tumor progression. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2076 (2018).
  39. Li, N., et al. Dissecting the expression landscape of mitochondrial genes in lung squamous cell carcinoma and lung adenocarcinoma. Oncology Letters. 16 (3), 3992-4000 (2018).
  40. Kim, H. R., et al. Spectrum of mitochondrial genome instability and implication of mitochondrial haplogroups in Korean patients with acute myeloid leukemia. Blood Research. 53 (3), 240-249 (2018).
  41. Tyagi, A., et al. Pattern of mitochondrial D-loop variations and their relation with mitochondrial encoded genes in pediatric acute myeloid leukemia. Mutation Research. 810, 13-18 (2018).
  42. Vidone, M., et al. A comprehensive characterization of mitochondrial DNA mutations in glioblastoma multiforme. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 63, 46-54 (2015).
  43. Chatterjee, A., Mambo, E., Sidransky, D. Mitochondrial DNA mutations in human cancer. Oncogene. 25 (34), 4663-4674 (2006).
  44. Arnold, R. S., et al. An inherited heteroplasmic mutation in mitochondrial gene COI in a patient with prostate cancer alters reactive oxygen, reactive nitrogen and proliferation. BioMed Research International. 2013, 239257 (2013).
  45. Petros, J. A., et al. mtDNA mutations increase tumorigenicity in prostate cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (3), 719-724 (2005).
  46. Wallace, D. C., Fan, W., Procaccio, V. Mitochondrial energetics and therapeutics. Annual Review of Pathology. 5, 297-348 (2010).
  47. Reznik, E., et al. Mitochondrial DNA copy number variation across human cancers. eLife. 5, 10769 (2016).
  48. Soler-Agesta, R., et al. PT-112 induces mitochondrial stress and immunogenic cell death, targeting tumor cells with mitochondrial deficiencies. Cancers. 14 (16), 3851 (2022).
  49. Trounce, I., Wallace, D. C. Production of transmitochondrial mouse cell lines by cybrid rescue of rhodamine-6G pre-treated L-cells. Somatic Cell and Molecular Genetics. 22 (1), 81-85 (1996).
  50. Pastushenko, I., Blanpain, C. EMT transition states during tumor progression and metastasis. Trends in Cell Biology. 29 (3), 212-226 (2019).
  51. Pastushenko, I., et al. Identification of the tumour transition states occurring during EMT. Nature. 556 (7702), 463-468 (2018).
  52. Thiery, J. P., Sleeman, J. P. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 131-142 (2006).

Tags

أبحاث السرطان ، العدد 193 ،
جيل سايبريد ناقل الغضروف باستخدام خطوط الخلايا السرطانية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Soler-Agesta, R., Marco-Brualla, J., … More

Soler-Agesta, R., Marco-Brualla, J., Fernández-Silva, P., Mozas, P., Anel, A., Moreno Loshuertos, R. Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines. J. Vis. Exp. (193), e65186, doi:10.3791/65186 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter