Summary
该协议描述了一种从悬浮生长的癌细胞生成cybrid的技术，作为研究线粒体在致瘤过程中作用的工具。
Abstract
近年来，致力于确定线粒体与癌症之间联系的研究数量显着增加。然而，仍然需要做出更多的努力来充分了解涉及线粒体改变和肿瘤发生的联系，以及识别与肿瘤相关的线粒体表型。例如，为了评估线粒体在肿瘤发生和转移过程中的贡献，必须了解线粒体在不同核环境中肿瘤细胞的影响。为此，一种可能的方法是将线粒体转移到不同的核背景中以获得所谓的cybrid细胞。在传统的细胞化技术中，缺乏mtDNA（ρ0，核供体细胞）的细胞系被来自去核细胞或血小板的线粒体重新填充。然而，剜除过程需要良好的细胞粘附在培养板上，在许多情况下，侵袭性细胞会部分或完全失去这一特征。此外，传统方法中发现的另一个困难是从线粒体受体细胞系中完全去除内源性mtDNA，以获得纯核和线粒体DNA背景，避免在生成的cybrid中存在两种不同的mtDNA物种。在这项工作中，我们提出了一种应用于悬浮生长癌细胞的线粒体交换协议，该方案基于罗丹明6G预处理细胞与分离线粒体的重新繁殖。这种方法使我们能够克服传统方法的局限性，因此可以用作扩展对线粒体在癌症进展和转移中的作用的理解的工具。
Introduction
重编程能量代谢是癌症1的标志，这是奥托·沃伯格（Otto Warburg）在1930年代首次观察到的2。在有氧条件下，正常细胞将葡萄糖转化为丙酮酸，然后产生乙酰辅酶A，为线粒体机器提供燃料并促进细胞呼吸。然而，Warburg证明，即使在常氧条件下，大多数癌细胞将从糖酵解过程中获得的丙酮酸转化为乳酸，从而改变其获取能量的方式。这种代谢调节被称为“Warburg效应”，使一些癌细胞能够提供其快速生长和分裂的能量需求，尽管产生ATP的效率低于有氧过程3，4，5。近几十年来，许多工作支持代谢重编程在癌症进展中的含义。因此，肿瘤能量学被认为是对抗癌症的有趣靶标1。作为能量代谢和必需前体供应的中心枢纽，线粒体在这些细胞适应中起着关键作用，迄今为止，我们只部分了解这些细胞。
根据上述情况，线粒体DNA（mtDNA）突变已被提出为这种代谢重编程的可能原因之一，这可能导致电子传递链（ETC）性能受损6，并解释为什么一些癌细胞增强其糖酵解代谢以存活。事实上，据报道mtDNA在癌细胞内积累突变，至少存在于50%的肿瘤中7。例如，Yuan等人最近进行的一项研究报告称，肾脏癌，结直肠癌和甲状腺癌中存在超突变和截短的mtDNA分子8。此外，许多研究表明，某些mtDNA突变与更具侵袭性的肿瘤表型和癌细胞转移潜力的增加有关9，10，11，12，13，14，15，16。
尽管线粒体基因组与癌症进展有明显的相关性，但由于目前可用的实验模型和技术的局限性，对这些突变及其对疾病的贡献的研究一直具有挑战性17。因此，需要新技术来了解线粒体DNA对癌症疾病发展和进展的真正影响。在这项工作中，我们介绍了一种从悬浮生长的癌细胞中传输软骨细胞生成的协议，该协议基于罗丹明6G预处理细胞与分离线粒体的重新繁殖，克服了传统胞化方法的主要挑战18，19。该方法允许使用任何细胞核供体，无论其相应的ρ0 细胞系的可用性如何，以及线粒体从遵循传统技术难以去核的细胞（即非贴壁细胞系）转移。
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Protocol
注意： 表1中指定了所有培养基和缓冲液组合物。在cybrid生成之前，必须对来自供体和受体细胞的线粒体和核DNA图谱进行分型，以确认细胞系之间两个基因组中存在遗传差异。在这项研究中，使用了市售的L929细胞系及其衍生的细胞系L929dt，该细胞系是我们实验室自发产生的（更多信息见13 ）。这些细胞系在其 mt-Nd2 基因序列中存在两种差异，一旦细胞化过程完成，可用于确认mtDNA的纯度13。在这种情况下，核背景的纯度通过抗生素敏感性得到证实，因为与L929dt细胞相反，L929对遗传素具有抗性。
1.罗丹明6G处理（受体细胞）耗竭线粒体
注意：成功生成cybrid的第一步是完全和不可逆地消除受体细胞中的线粒体功能。为此，有必要事先确定每个细胞系的适当浓度和罗丹明6G的处理持续时间。这个足够的浓度应该略低于药物诱导的细胞死亡（在治疗过程中不会杀死细胞的最高浓度）。定义最佳条件后，执行以下操作。
- 使用完整的培养基在6孔板中接种106 个细胞（详见 表1 ），并根据细胞系每天用最佳浓度的罗丹明6G处理3-10天。传统浓度范围为2至5μg/mL，持续3-10天20，21。在这项研究中，对于L929来源的细胞，选择2.5μg/mL罗丹明6G7天治疗13，22。
- 为了保持细胞存活，用50μg/ mL尿苷和100μg/ mL丙酮酸补充细胞培养基，并每24小时更新一次。
- 处理后和融合前，将罗丹明6G处理的细胞的培养基更换为不含罗丹明6G的完全细胞培养基，并将它们在该培养基中在37°C的培养箱中放置3-4小时，CO2。
注意：罗丹明6G毒性作用是不可逆的，具有无功能线粒体的细胞不应恢复20。因此，处理后，即使在补充尿苷的培养基中，不接受功能性线粒体的细胞也应死亡。因此，没有必要进行核选择。然而，建议使用不含线粒体的罗丹明6G处理细胞的对照融合。
2. 扩增和线粒体分离（供体细胞）
- 在罗丹明6G治疗的时间间隔内扩增线粒体供体细胞，以获得约25 x 106 细胞。
- 在第 7 天，收获 50 mL 管中指数生长的细胞，并在室温 （RT） 下以 520 x g 离心 5 分钟收集它们。用冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞3倍，并在室温下以520× g 离心5分钟沉淀。从现在开始，使用冷试剂在4°C下执行线粒体提取的所有步骤，并将带有细胞或线粒体的管保持在冰上。
- 第三次离心后，使用与真空泵耦合的玻璃移液管抽吸丢弃上清液，并将填充的细胞重悬于等于细胞沉淀体积7倍的低渗缓冲液中。然后，将细胞悬液转移到均质管中，并通过在冰上孵育2分钟让细胞膨胀。
- 通过在均质器中执行8至10次冲程来破坏细胞膜，该均质器与以600rpm旋转的电机驱动的杵耦合。
注意：细胞膜破碎的步骤可能因细胞类型而异;因此，必须针对每种细胞类型进行优化。 - 向细胞悬液中加入相同体积的高渗缓冲液（细胞沉淀体积的 7 倍）以产生等渗环境。
- 将匀浆转移到15mL管中，并在固定转子中以1，000× g 在4°C下离心5分钟。 然后，仅收集3/4的上清液，从沉淀中留下大量边缘，以避免被细胞核或完整细胞污染，并将其转移到另一个管中。重复相同的过程两次。请注意，必须保留上清液并丢弃沉淀。
- 保存线粒体部分（上清液）。将其转移到1.5mL管中，并在4°C下以最大速度（18，000× g）离心2分钟。
- 弃去上清液并用缓冲液A洗涤富含线粒体的沉淀，将两个管的内容物合并为一个，并在与步骤2.7中所述的相同条件下离心。重复相同的过程，直到所有材料都在一个管子中。
- 用 300 μL 缓冲液 A 进行额外洗涤，并使用Bradford 测定法 23 定量线粒体蛋白浓度。对于每个细胞化测定，必须确定转移过程的最佳线粒体量（在我们的例子中，每106 个细胞的线粒体蛋白浓度在10-40μg之间）。
- 同时，通过将罗丹明 6G 预处理的细胞收集在 15 mL 管中并在室温下以 520 x g 离心 5 分钟来制备用于融合的罗丹明 6G 预处理细胞。 请注意，由于罗丹明 6G 处理，颗粒获得霓虹粉色。
- 为了确保正确执行受体细胞中的线粒体功能消除以及来自供体的细胞器纯化，使用完整的培养基在 6 孔板中接种少量罗丹明 6G 处理的细胞和分离的线粒体并培养一个月以检查任何孔中没有存活细胞残留（图 2）。
- 同时，通过免疫检测核蛋白（即层粘连蛋白 β、组蛋白 H3 等）或通过核基因（即 SDH、18S rRNA 等）的定量聚合酶链反应 （qPCR） 扩增来评估线粒体部分中是否存在细胞核污染物。
注意：为避免污染，建议在无菌条件下在层流罩下执行所有步骤。
3. 聚变和赛布里德生成
- 为了进行融合，小心地将106个罗丹明6G处理的细胞添加到分离的线粒体沉淀（10-40μg线粒体蛋白）中，并以520× g 离心5分钟，以使细胞与线粒体混合。
- 加入 100 μL 聚乙二醇 （PEG， 50%），轻轻重悬沉淀 30 秒。然后，让原封不动地再静置 30 秒。
- 最后，将混合物转移到带有新鲜完全细胞培养基的6孔板中，并置于37°C的培养箱中，并用5%CO2。几天后（通常为1周），透射软骨体cybris应该开始生长（图2），从而产生可以在分析之前单独选择或在池中混合的克隆。
4. 线粒体和核背景的验证
注意：一旦建立了新的细胞系并且细胞开始呈指数级增长，就必须验证其线粒体和核DNA的纯度。因此，原始细胞系应该在其基因组中具有不同的突变或多态性，以使它们可识别。
- 总脱氧核糖核酸分离
- 通过使用商业基因组DNA提取试剂盒（参见材料表）或使用苯酚-氯仿-异戊醇提取和醇沉淀执行标准方案，分离用于cybrid生成的所有细胞系的基因组DNA。
- mtDNA评估（图3）
注意：可以执行多种技术，例如测序，限制性片段长度多态性（RFLP）分析或等位基因特异性qPCR，以分析mtDNA的纯度。要通过RFLP确认mtDNA序列变异的存在，请遵循后续协议步骤。- 通过 PCR 扩增含有核苷酸变化的 mtDNA 片段。
- 在这里，L929dt细胞在L929细胞中不存在的 mt-Nd2 基因（m.4206C>T）内在4206位置呈现mtDNA突变。为了确认透射软骨蠹骨中存在这种取代，请使用标准方案和以下引物通过PCR扩增397 bp片段：1）5'-AAGCTATCGGG
CCCATACCCCG-3'（位置3862-3884）和2）5'-TAATCAGAAGTGGAATGGGGGG-3'（位置4236-4258）。
- 在这里，L929dt细胞在L929细胞中不存在的 mt-Nd2 基因（m.4206C>T）内在4206位置呈现mtDNA突变。为了确认透射软骨蠹骨中存在这种取代，请使用标准方案和以下引物通过PCR扩增397 bp片段：1）5'-AAGCTATCGGG
- 使用识别序列变化并为两种细胞系生成不同切割模式的特定核酸内切酶，分析RFLP所需核苷酸取代的存在。
注意：当存在L929dt mtDNA变体（4206T）时，在步骤4.2.1中获得的扩增子包含两个SspI限制性位点（参见 材料表），可产生306 bp，52 bp和39 bp的三个DNA片段。当存在野生型 （WT） 版本 C4206 时，生成 52 和 39 波段的限制性位点被破坏，并且出现 91 bp 的新波段。因此，分析中包括用于完全消化SspI的内部对照。按照制造商的说明在37°C下进行消化反应。 - 通过电泳分离限制性内切酶片段并比较条带模式。
- 进行酶解后，在10%聚丙烯酰胺-三硼酸盐-EDTA（TBE）凝胶中通过电泳分析获得的限制性内切性片段（参见 表1 的1x TBE组成）。在室温下以80V运行电泳1小时。 在室温下在1x TBE的溴化乙锭溶液中凝胶染色15分钟后可视化DNA片段（凝胶染色溶液组成参见 表1 ）。
- 通过 PCR 扩增含有核苷酸变化的 mtDNA 片段。
- 核DNA基因分型
注意：核DNA基因分型必须使用先前用于RFLP分析的DNA提取样品进行。- 通过使用商业特异性寡核苷酸池扩增16个位点（D21S11，CSF1PO，vWA，D8S1179，TH01，D18S51，D5S818，D16S539，D3S1358，D2S1338，TPOX，FGA，D7S820，D13S317，D19S433和AMEL）（参见 材料表）。
- 使用基因分析仪进行电泳，以分离先前获得的片段。
注意：扩增后，使用capilar系统通过电泳分析不同的位点（参见 材料表）。碎片在填充有商业聚合物的50厘米长的帽状物中分离。阴极和阳极缓冲液也可市售，如 材料表所示。在60°C下在19.5kV下进行电泳20分钟。 - 使用生物信息学工具确定对应于每个扩增位点的等位基因（参见 材料表）。
- 将步骤4.3.3中获得的数据与核DNA谱数据库（表1）进行比较，以检查核DNA图谱是否与线粒体受体细胞系谱匹配（图4）。
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Representative Results
遵循上述方案后，应获得具有保守核背景但具有新线粒体基因型的同质cybrid细胞系，如图1和图2中的示意图所示。存在于cybrid中的线粒体和核DNA的纯度可以通过RFLP和核DNA基因分型分析（如图4所示）来确认。
如果线粒体转移成功完成，则通过RFLP分析获得的cybrid细胞系的结果必须显示与受体细胞系不同的消化带模式，并且与线粒体供体供体细胞系相同。为此，必须仔细选择限制性内切酶，确保从消化中获得的条带模式在两种细胞系中不同。 图3给出了一个例子，其中显示了WT线粒体和突变线粒体（MUT）中SspI消化后获得的限制性切合片段。在新的传输软骨细胞系的情况下，限制性片段与在其各自的线粒体供体中获得的片段相同，与细胞核供体细胞扩增子产生的片段不同。因此，该测定证实线粒体交换按预期进行。值得注意的是，未经过消化程序的受体细胞样品作为阴性对照被纳入该分析。
关于DNA核基因分型，通过分析该协议中使用的细胞系之一的16个核位点获得的典型图谱如图 4所示。与RFLP类似，通过比较每个位点获得的峰，从线粒体受体细胞系（核供体）获得的结果应与生成的cybrid相匹配。
重要的是要注意，获得的结果可能会根据不同的因素而有所不同。正如我们在协议中指出的那样，并非所有细胞系都对相同数量的罗丹明6G敏感，以去除全部功能性线粒体。
图 1：cybrid 生成的示意图表示，总结了协议的步骤 1 到 3。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：示意图表示，显示了 cybridized 方案后细胞培养板的设计。 将新的cybrid细胞系和对照（分离的线粒体和罗丹明6G处理的受体细胞）分别接种在6孔板中。培养几天后，cybrid细胞开始生长，而对照孔中没有存活的细胞。 请点击此处查看此图的大图。
图3：cybrid的分子表征 。 （A）线粒体供体细胞系（WT和MUT，分别为泳道3和4）及其各自的传输软骨细胞系（MUTWT →泳道5和WTMUT →泳道6）中m.4206C>T突变的RFLP分析。分子量：分子量标记（泳道 1）;未切割：未消化的 PCR 产物（泳道 2）。（B）WT和MUT线粒体PCR产物的SspI限制图。 请点击此处查看此图的大图。
图4：核DNA背景分析的代表性结果。 在PCR扩增16个位点并通过卡皮拉尔电泳分离后获得的核DNA指纹图谱的示例。该图显示了细胞系中每个扩增位点的特征峰模式。对于用于氯化方案的两个细胞系，这种模式必须不同，以确认核DNA纯度。 请点击此处查看此图的大图。
| 中等 | 组成 | ||
| 完整的培养基 | DMEM 高血糖与 L-Gln 和丙酮酸 + FBS （10%） + 青霉素-链霉素 （1x） | ||
| 低渗缓冲液 | 10 毫米拖把，83 毫米蔗糖，pH 7.2 | ||
| 高渗缓冲液 | 30 毫米拖把，250 毫米蔗糖，pH 7.2 | ||
| 缓冲液 A | 10 mM Tris， 1 mM EDTA， 0.32 M 蔗糖， pH 7.4 | ||
| 待定 （1x） | 50 mM Tris，50 mM 硼酸;1 毫米乙二胺四乙酸 | ||
| 凝胶染色液 | 0.75 μg/mL 溴化乙锭 1x TBE 溶液 | ||
表 1：缓冲液和培养基组成。
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Discussion
自从Otto Warburg报道癌细胞改变其新陈代谢并增强“有氧糖酵解”3，4，同时减少线粒体呼吸以来，对线粒体在癌症转化和进展中的作用的兴趣呈指数级增长。近年来，mtDNA突变和线粒体功能障碍已被假定为许多癌症类型的标志25。迄今为止，许多研究已经分析了特定肿瘤6，26，27，28，29，30，31，32的mtDNA变异，并且获得性mtDNA突变的总负担被认为是前列腺癌等癌症中致瘤性的生物标志物3033.与此一致，虽然mtDNA突变在某些情况下被认为是肿瘤起始因子，例如乳腺癌34，35或胰腺36癌症，妇科恶性肿瘤37，38，肺腺癌转移15，39或急性髓性白血病40，41，但它们似乎与胶质母细胞瘤42的相关性较低。
尽管许多癌症具有严重的mtDNA突变，这些突变在健康组织中没有发现43，并且可能导致癌症的发生30，但其他癌症则呈现出在各种人群中常见的多态性mtDNA变异。这些变异促进更温和的变化，一旦转化过程开始，这些变化对癌细胞适应很重要30。在任何情况下，mtDNA突变和线粒体代谢改变都参与肿瘤进展，改变细胞稳态的不同方面，如活性氧产生或氧化还原状态44，45，46。然而，mtDNA突变和变异有利于肿瘤发生的机制尚未完全了解。此外，癌细胞中的mtDNA突变可能与核基因8，33的改变共存，因此很难确定哪个是驱动突变。在其他情况下，肿瘤细胞的生物能量需求是通过调节mtDNA拷贝数47来实现的。另一方面，在某些情况下，mtDNA突变可能使肿瘤细胞更容易受到特定的抗肿瘤药物的影响48。
为了充分了解mtDNA突变在癌症病理生理学中的作用，有必要开发可以在受控核环境中分析突变线粒体的方法。这有助于避免可能触发细胞适应的核基因的补偿作用。为此，透射软骨体鲤代表一个合适的模型。传统的细胞化方法涉及作为细胞核供体（因此线粒体受体）的mtDNA耗尽细胞系（ρ0细胞）和线粒体供体供体，通常是去核细胞系或血小板19，携带感兴趣的mtDNA变体或突变。在尝试生成cybrid时要解决的第一个挑战是具有所选核背景的ρ0细胞的可用性。这些细胞的获得涉及用溴化乙锭长期处理，溴化乙锭是一种抑制mtDNA复制的化合物。然而，它也可以诱导核基因组内突变的产生，这些突变可以掩盖要研究的线粒体改变的影响。因此，在这项工作中，我们建议通过用罗丹明6G处理来消除细胞核供体细胞系中的整个线粒体，罗丹明6G是一种不可逆转地损害线粒体的药物，除非新鲜线粒体引入其细胞质21，22，49，否则会杀死细胞。
传统cybrid生成方法的另一个挑战与线粒体供体供体细胞的剜除过程有关。为此，贴壁细胞在细胞松弛素B存在下离心，其允许通过促进细胞骨架的紊乱来分离去核细胞质体18。如果细胞在悬浮液中生长（例如血液学系）或失去细胞-细胞和细胞-细胞外基质粘附（这可能发生在转移电位较高的50，51，52的细胞上），则该剜除方案将受到损害，因为细胞质体会在离心过程中从板上分离以去除细胞核，从而大大减少了随后融合程序的池。为了规避这两个挑战，我们在这里提出了一种协议，其中分离的线粒体在PEG存在下与罗丹明6G预处理细胞融合，已被证明是省时且高效的21，22，49。
一旦产生传输粒体细胞系，评估线粒体和核基因组的纯度至关重要。因此，选择线粒体DNA内具有序列差异且具有可区分特征（例如抗生素耐药性或差异微卫星）的供体细胞系至关重要。如上所述，据报道，一些癌症调节其mtDNA拷贝数47，证明了分析原始和传输软骨细胞系中的mtDNA负荷以及研究其在类似条件下的OXPHOS性能的重要性。
此程序中隐藏的主要陷阱与罗丹明6G消除线粒体的过程有关。每个细胞化实验之前应进行测定，以确定所选细胞核供体细胞系的药物浓度和治疗时间的最佳条件。如果罗丹明6G浓度或暴露时间不够，新的细胞系将具有两种不同mtDNA的贡献，这将增加表型分析的复杂性。此外，如果时间或剂量超过最佳剂量，即使线粒体重新繁殖，细胞也无法存活。最后，在线粒体分离过程中必须小心，以避免被未破碎的细胞污染，这可能会改变表型特征。
尽管存在技术困难，但透射软骨体的产生是揭示线粒体对癌症和转移过程的贡献并生成细胞模型的有力工具，其中可以使用线粒体作为治疗靶点测试潜在的抗癌治疗。
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
这项研究由RSA，JMB和AA的授权号PID2019-105128RB-I00以及PFS和RML的PGC2018-095795-B-I00资助，均由MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033和授权号B31_20R（RSA，JMA和AA）和E35_17R（PFS和RML）资助，并由Gobierno de Aragón资助。RSA的工作得到了西班牙反对协会PRDAR21487SOLE的赠款支持。作者要感谢萨拉戈萨大学使用高级调查总局。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3500XL Genetic Analyzer | ThermoFisher Scientific | 4406016 | |
| 6-well plate | Corning | 08-772-1B | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit | ThermoFisher Scientific | 4427368 | |
| Anode Buffer Container 3500 Series | Applied Biosystems | 4393927 | |
| Boric acid | PanReac | 131015 | |
| Bradford assay | Biorad | 5000002 | |
| Cathode Buffer Container 3500 Series | Applied Biosystems | 4408256 | |
| Cell culture flasks | TPP | 90076 | |
| DMEM high glucose | Gibco | 11965092 | |
| EDTA | PanReac | 131026 | |
| Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E8751 | |
| Geneticin | Gibco | 10131027 | |
| Homogenizer Teflon pestle | Deltalab | 196102 | |
| L929 cell line | ATCC | CCL-1 | |
| MiniProtean Tetra4 Gel System | BioRad | 1658004 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| PCR primers | Sigma-Aldrich | Custom products | |
| Polyacrylamide Solution 30% | PanReac | A3626 | |
| Polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | P7181 | |
| POP-7 | Applied Biosystems | 4393714 | |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| QIAmp DNA Mini Kit | Qiagen | 51306 | |
| Rhodamine-6G | Sigma-Aldrich | R4127 | |
| Serum Fetal Bovine | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| SspI | New England Biolabs | R3132 | |
| Streptomycin/penicillin | PAN biotech | P06-07100 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S3089 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris | PanReac | P14030b | |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 |
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