Summary
Detta protokoll beskriver en teknik för cybridgenerering från suspensionsväxande cancerceller som ett verktyg för att studera mitokondriernas roll i den tumörframkallande processen.
Abstract
Under de senaste åren har antalet studier som syftar till att fastställa sambandet mellan mitokondrier och cancer ökat avsevärt. Men mer ansträngningar behövs fortfarande för att fullt ut förstå kopplingen som involverar förändringar i mitokondrier och tumörgenes, samt att identifiera tumörassocierade mitokondriella fenotyper. Till exempel, för att utvärdera mitokondriernas bidrag till tumörgenes och metastaseringsprocesser, är det viktigt att förstå påverkan av mitokondrier från tumörceller i olika kärnmiljöer. För detta ändamål består ett möjligt tillvägagångssätt av att överföra mitokondrier till en annan kärnbakgrund för att erhålla de så kallade cybridcellerna. I de traditionella cybridiseringsteknikerna återbefolkas en cellinje som saknar mtDNA (ρ0, kärndonatorcell) med mitokondrier härrörande från antingen enukleerade celler eller blodplättar. Enukleationsprocessen kräver dock god celladhesion till odlingsplattan, en egenskap som delvis eller helt förloras i många fall i invasiva celler. Dessutom är en annan svårighet som finns i de traditionella metoderna att uppnå fullständigt avlägsnande av det endogena mtDNA från mitokondriell mottagarcellinje för att erhålla ren kärn- och mitokondriell DNA-bakgrund, vilket undviker närvaron av två olika mtDNA-arter i den genererade cybriden. I detta arbete presenterar vi ett mitokondriellt utbytesprotokoll applicerat på suspensionsväxande cancerceller baserat på återinsättning av rhodamin 6G-förbehandlade celler med isolerade mitokondrier. Denna metod gör det möjligt för oss att övervinna begränsningarna i de traditionella tillvägagångssätten och kan därmed användas som ett verktyg för att utöka förståelsen av mitokondriell roll i cancerprogression och metastasering.
Introduction
Omprogrammering av energimetabolism är ett kännetecken för cancer1 som observerades för första gången av Otto Warburg på 1930-talet2. Under aeroba förhållanden omvandlar normala celler glukos till pyruvat, som sedan genererar acetyl-coA, driver mitokondriella maskineriet och främjar cellulär andning. Ändå visade Warburg att även under normoxiska förhållanden omvandlar de flesta cancerceller pyruvat erhållet från glykolysprocessen till laktat och flyttar sig för att erhålla energi. Denna metaboliska justering är känd som "Warburg-effekten" och gör det möjligt för vissa cancerceller att tillgodose sina energiska krav på snabb tillväxt och delning, trots att de genererar ATP mindre effektivt än den aeroba processen 3,4,5. Under de senaste decennierna har många verk stött implikationen av metabolism omprogrammering i cancerprogression. Därför anses tumörenergetik vara ett intressant mål mot cancer1. Som ett centralt nav i energisk metabolism och i tillförseln av väsentliga prekursorer spelar mitokondrier en nyckelroll i dessa cellanpassningar som vi hittills bara delvis förstår.
I linje med ovanstående har mitokondriella DNA-mutationer (mtDNA) föreslagits som en av de möjliga orsakerna till denna metaboliska omprogrammering, vilket kan leda till en försämrad elektrontransportkedja (ETC) prestanda6 och skulle förklara varför vissa cancerceller förbättrar sin glykolytiska metabolism för att överleva. Det har faktiskt rapporterats att mtDNA ackumulerar mutationer i cancerceller, som finns i minst 50% av tumörerna7. Till exempel rapporterade en nyligen genomförd studie utförd av Yuan et al. närvaron av hypermuterade och trunkerade mtDNA-molekyler i njur-, kolorektal- och sköldkörtelcancer8. Dessutom har många arbeten visat att vissa mtDNA-mutationer är associerade med en mer aggressiv tumörfenotyp och med en ökning av den metastatiska potentialen hos cancerceller 9,10,11,12,13,14,15,16.
Trots den uppenbara relevansen av mitokondriellt genom i cancerprogression har studien av dessa mutationer och deras bidrag till sjukdomen varit utmanande på grund av begränsningar i de experimentella modeller och tekniker som för närvarande finns tillgängliga17. Således behövs nya tekniker för att förstå den verkliga effekten av mitokondri-DNA i utveckling och progression av cancersjukdomar. I detta arbete introducerar vi ett protokoll för transmitokondriell cybridgenerering från suspensionsväxande cancerceller, baserat på återinsättning av rhodamin 6G-förbehandlade celler med isolerade mitokondrier, som övervinner de viktigaste utmaningarna med traditionella cybridiseringsmetoder18,19. Denna metod tillåter användning av alla kärndonatorer oavsett tillgängligheten av deras motsvarande ρ 0-cellinje och överföring av mitokondrier från celler som, enligt de traditionella teknikerna, skulle vara svåra att enukleera (dvs icke-vidhäftande cellinjer).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Anmärkning: Alla odlingssubstrat och buffertsammansättningar specificeras i tabell 1. Före cybridgenerering måste både mitokondriella och nukleära DNA-profiler från givar- och mottagarcellerna skrivas för att bekräfta förekomsten av genetiska skillnader i båda genomerna mellan cellinjerna. I denna studie användes en kommersiellt tillgänglig L929-cellinje och dess härledda cellinje, L929dt, som genererades spontant i vårt laboratorium (se13 för mer information). Dessa cellinjer presenterar två skillnader i sekvensen av deras mt-Nd2-gen , som kan användas för att bekräfta renheten hos mtDNA när cybridiseringsprocessen har avslutats13. I detta fall bekräftades renheten hos kärnbakgrunden av antibiotikakänslighet, eftersom L929, i motsats till L929dt-celler, var resistenta mot geneticin.
1. Mitokondriell utarmning genom rhodamin 6G-behandling (mottagarceller)
OBS: Det första steget för framgångsrik cybridgenerering är att helt och irreversibelt avskaffa mitokondriella funktioner i mottagarcellerna. För detta ändamål är det nödvändigt att tidigare bestämma, för varje cellinje, lämplig koncentration och behandlingstid med rhodamin 6G. Denna adekvata koncentration bör ligga strax under läkemedelsinducerad celldöd (den högsta som inte dödar cellerna under behandlingen). Utför följande när de optimala förhållandena har definierats.
- Frö 106 celler i en 6-brunnsplatta med komplett odlingsmedium (se tabell 1 för detaljer) och behandla dem dagligen med optimal koncentration av rhodamin 6G i 3-10 dagar, beroende på cellinjen. Traditionella koncentrationer varierar från 2 till 5 μg / ml i 3-10 dagar20,21. I denna studie, för L929-härledda celler, var 2,5 μg/ml rhodamin 6G under 7 dagar den valda behandlingen13,22.
- För att hålla cellerna vid liv, komplettera cellodlingsmediet med 50 μg/ml uridin och 100 μg/ml pyruvat och förnya det var 24:e timme.
- Efter behandling och före fusion, byt medium av rhodamin 6G-behandlade celler till komplett cellodlingsmedium utan rhodamin 6G och lämna dem i detta medium i 3-4 timmar i en inkubator vid 37 ° C med 5% CO2.
OBS: Den toxiska effekten av rhodamin 6G är irreversibel och celler med icke-funktionella mitokondrier bör inte återhämta sig20. Således, efter behandling, bör celler som inte får funktionella mitokondrier dö även i uridinkompletterat odlingsmedium. Därför bör inget urval av kärnkraft vara nödvändigt. En kontrollfusion av rhodamin 6G-behandlade celler utan mitokondrier rekommenderas dock.
2. Expansion och mitokondriell isolering (donatorceller)
- Expandera mitokondriernas donatorceller under tidsfördröjningen av rhodamin 6G-behandling för att erhålla cirka 25 x 106 celler.
- På dag 7, skörda exponentiellt växande celler i ett 50 ml rör och samla dem genom centrifugering vid 520 x g i 5 minuter vid rumstemperatur (RT). Tvätta cellerna 3x med kall fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och sedimentera dem genom centrifugering vid 520 x g i 5 minuter vid RT. Från och med nu ska du utföra alla steg för mitokondriell extraktion vid 4 ° C, använda kalla reagens och hålla rören med celler eller mitokondrier på is.
- Efter den tredje centrifugeringen, kassera supernatanten genom aspiration med en glaspipett kopplad till en vakuumpump och återsuspendera de packade cellerna i en volym hypotonisk buffert lika med 7x cellpelletsvolymen. Överför sedan cellsuspensionen till ett homogenisatorrör och låt cellerna svälla genom att inkubera dem på is i 2 minuter.
- Bryt cellmembranen genom att utföra 8 till 10 slag i homogenisatorn kopplad till en motordriven stöt som roterar vid 600 rpm.
OBS: Steget för cellmembranstörning kan variera mellan celltyper; Således måste den optimeras för varje celltyp. - Tillsätt samma volym hypertonisk buffert till cellsuspensionen (7x cellpelletsvolymen) för att generera en isoton miljö.
- Överför homogenatet till ett 15 ml rör och centrifugera det i en fast rotor vid 1 000 x g i 5 minuter vid 4 °C. Samla sedan endast 3/4 av supernatanten som lämnar en stor marginal från pelleten för att undvika kontaminering med kärnor eller intakta celler och överför den till ett annat rör. Upprepa samma process två gånger. Observera att supernatanten måste behållas och pelleten kasseras.
- Spara mitokondriell fraktion (supernatant). Överför den till 1,5 ml rör och centrifugera med maximal hastighet (18 000 x g) i 2 minuter vid 4 °C.
- Kassera supernatanten och tvätta den mitokondrier anrikade pelleten med buffert A, kombinera innehållet i de två rören till ett och centrifugera under samma betingelser som beskrivs i steg 2.7. Upprepa samma process tills allt material är i endast ett rör.
- Gör ytterligare en tvätt med 300 μl buffert A och kvantifiera mitokondriell proteinkoncentration med Bradford assay23. För varje cybridiseringsanalys måste den optimala mängden mitokondrier för överföringsproceduren bestämmas (i vårt fall en koncentration mellan 10-40 μg mitokondriellt protein per 106 celler).
- Förbered samtidigt de förbehandlade rhodamin-6G-cellerna för fusion genom att samla dem i ett 15 ml rör och centrifugera vid 520 x g i 5 minuter vid RT. Observera att pelleten får en neonrosa färg på grund av rhodamin 6G-behandling.
- För att säkerställa att både mitokondriell funktionsavskaffande i receptorceller samt organellrening från givare har utförts korrekt, frö ett litet antal rhodamin 6G-behandlade celler och isolerade mitokondrier med hjälp av hela odlingsmediet i en 6-brunnsplatta och odla dem i en månad för att kontrollera att inga överlevande celler finns kvar i någon av brunnarna (figur 2).
- Parallellt utvärdera frånvaron av nukleiföroreningar i mitokondriell fraktion genom immundetektion av kärnproteiner (dvs lamin beta, histon H3, etc.) eller genom kvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR) amplifiering av en kärngen (dvs SDH, 18S rRNA, etc.).
OBS: För att undvika kontaminering rekommenderas att alla steg utförs under aseptiska förhållanden under laminär flödeshuv.
3. Fusion och cybridgenerering
- För att fortsätta med fusionen, tillsätt försiktigt 106 av de rhodamin 6G-behandlade cellerna till den isolerade mitokondrierpelleten (10-40 μg mitokondriellt protein) och centrifugera vid 520 x g i 5 minuter så att cellerna kan blandas med mitokondrierna.
- Tillsätt 100 μL polyetylenglykol (PEG, 50%) och suspendera försiktigt pelleten i 30 sekunder. Låt sedan vila orörd i ytterligare 30 sekunder.
- Slutligen överför blandningen till en platta med 6 brunnar med färskt komplett cellodlingsmedium och placera i inkubatorn vid 37 °C med 5 % CO2. Efter några dagar (vanligtvis 1 vecka) bör transmitokondriella cybrider börja växa (figur 2), vilket ger upphov till kloner som kan väljas individuellt eller blandas i en pool före analysen.
4. Verifiering av både mitokondriell och nukleär bakgrund
OBS: När den nya cellinjen har etablerats och celler börjar växa exponentiellt måste renheten hos deras mitokondriella och nukleära DNA verifieras. Således bör de ursprungliga cellinjerna ha olika mutationer eller polymorfismer inom deras genom för att göra dem igenkännliga.
- Total DNA-isolering
- Isolera det genomiska DNA:t i alla cellinjer som används för cybridgenerering genom att använda ett kommersiellt genomiskt DNA-extraktionskit (se materialförteckning) eller genom att utföra ett standardprotokoll med fenol-kloroform-isoamylalkoholextraktion och alkoholutfällning24.
- mtDNA-utvärdering (figur 3)
OBS: Flera tekniker, såsom sekvensering, RFLP-analys (restriction fragment length polymorphism) eller allelspecifik qPCR, kan utföras för att analysera renheten hos mtDNA. För att bekräfta förekomsten av mtDNA-sekvensvariationer med RFLP, följ nästa protokollsteg.- Förstärk ett mtDNA-fragment innehållande nukleotidförändringen med PCR.
- Här presenterar L929dt-celler en mtDNA-mutation vid position 4206, inom en mt-Nd2-gen (m.4206C>T) som saknas i L929-celler. För att bekräfta närvaron av denna substitution i de transmitokondriella cybriderna, förstärk ett 397 bp-fragment med PCR med hjälp av ett standardprotokoll och följande primers: 1) 5'-AAGCTATCGGG
CCCATACCCCG-3' (positionerna 3862-3884) och 2) 5'-TAATCAGAAGTGGAATGGGGGGCG -3' (positionerna 4236-4258).
- Här presenterar L929dt-celler en mtDNA-mutation vid position 4206, inom en mt-Nd2-gen (m.4206C>T) som saknas i L929-celler. För att bekräfta närvaron av denna substitution i de transmitokondriella cybriderna, förstärk ett 397 bp-fragment med PCR med hjälp av ett standardprotokoll och följande primers: 1) 5'-AAGCTATCGGG
- Analysera närvaron av den önskade nukleotidsubstitutionen med RFLP, med hjälp av ett specifikt endonukleas som känner igen sekvensförändringen och genererar ett annat snittmönster för båda cellinjerna.
OBS: När L929dt mtDNA-varianten är närvarande (4206T) innehåller amplikonen erhållen i steg 4.2.1 två restriktionsställen för SspI (se materialförteckning) som producerar tre DNA-fragment av 306 bp, 52 bp och 39 bp. Begränsningsplatsen som genererar 52- och 39-banden störs när wild-type (WT) version C4206 finns och ett nytt band med 91 bp visas. Därför ingår en intern kontroll för full uppslutning för SspI i analysen. Uppslutningsreaktionen utförs vid 37 °C enligt tillverkarens anvisningar. - Separera restriktionsfragmenten genom elektrofores och jämför bandmönstret.
- När uppslutningen har utförts, analysera de erhållna restriktionsfragmenten genom elektrofores i 10% polyakrylamid-Tris-borat-EDTA (TBE) geler (se tabell 1 för 1x TBE-sammansättning). Kör elektroforesen vid 80 V i 1 h vid RT. Visualisera DNA-fragmenten efter gelfärgning i en lösning av etidiumbromid i 1x TBE i 15 minuter vid RT (se tabell 1 för gelfärgningslösningens sammansättning).
- Förstärk ett mtDNA-fragment innehållande nukleotidförändringen med PCR.
- Genotypning av nukleärt DNA
OBS: Genotypning av nukleärt DNA måste utföras med hjälp av det tidigare DNA-extraktionsprovet som användes för RFLP-analys.- Förstärk 16 loci (D21S11, CSF1PO, vWA, D8S1179, TH01, D18S51, D5S818, D16S539, D3S1358, D2S1338, TPOX, FGA, D7S820, D13S317, D19S433 och AMEL) genom att använda en pool av kommersiella-specifika oligonukleotider (se materialtabell).
- Utför elektrofores med hjälp av en genetisk analysator för att separera de fragment som tidigare erhållits.
OBS: När de har förstärkts analyseras de olika loci genom elektrofores med hjälp av ett kapilarsystem (se materialförteckning). Fragmenten separeras i en 50 cm lång kapilar fylld med en kommersiell polymer. Katod- och anodbuffertar är också kommersiellt tillgängliga, vilket visas i materialtabellen. Elektrofores utförs vid 19,5 kV i 20 min vid 60 °C. - Använda bioinformatiska verktyg för att bestämma allelerna som motsvarar varje förstärkt plats (se Materialförteckning).
- Jämför de data som erhållits i steg 4.3.3 med kärn-DNA-profildatabasen (tabell 1) för att kontrollera om kärn-DNA-profilen matchar mitokondrireceptorns cellinjeprofil (figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter att ha följt det ovan presenterade protokollet bör en homoplasmatisk cybridcellinje med bevarad kärnbakgrund men med en ny mitokondriernas genotyp erhållas, såsom representeras i schemat i figur 1 och figur 2. Renheten hos mitokondriellt och nukleärt DNA i cybriderna kan bekräftas med RFLP, som visas i figur 3, och genom nukleär DNA-genotypanalys, som visas i figur 4.
Om mitokondriell överföring gjordes framgångsrikt måste resultaten erhållna med RFLP-analysen för cybridcellinjen visa olika matsmältningsbandmönster jämfört med mottagarcellinjen och identiska med mitokondriernas donatorcellinje. För detta ändamål måste restriktionsenzymet väljas noggrant, se till att bandmönstren som erhålls från matsmältningen är olika i båda cellinjerna. Ett exempel ges i figur 3, där restriktionsfragmenten erhållna efter SspI-uppslutning i WT-mitokondrier och mutanta mitokondrier (MUT) visas. När det gäller de nya transmitokondriella cellinjerna var restriktionsfragment identiska med dem som erhölls i deras respektive mitokondriella donatorer och annorlunda än de som genererades med kärndonatorcellamplikonerna. Således bekräftar denna analys att mitokondriellt utbyte utfördes som förväntat. Observera att ett prov från mottagarceller som inte utsattes för matsmältningsproceduren inkluderades i denna analys som en negativ kontroll.
När det gäller DNA-nukleär genotypning visas i figur 4 en typisk profil som erhålls från analysen av 16 kärnlokus för en av de cellinjer som används i detta protokoll. I likhet med RFLP, genom att jämföra topparna erhållna för varje lokus, bör resultaten erhållna från mitokondriernas receptorcellinje (kärndonator) matcha med den genererade cybriden.
Det är viktigt att notera att de erhållna resultaten kan variera beroende på olika faktorer. Som vi anger i protokollet är inte alla cellinjer mottagliga för samma mängd rhodamin 6G för att avlägsna totaliteten av funktionella mitokondrier.
Figur 1: Schematisk representation av cybridgenerering, sammanfattning av steg 1 till 3 i protokollet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Schematisk representation som visar utformningen av cellodlingsplattan efter cybridiseringsprotokollet. En ny cybridcellinje och kontroller (isolerade mitokondrier och rhodamin 6G-behandlade mottagarceller) sås separat i en 6-brunnsplatta. Efter några dagars odling börjar cybridceller växa, medan inga överlevande celler finns kvar i kontrollbrunnarna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Molekylär karakterisering av cybrider. (A) RFLP-analys av m.4206C>T-mutationen i mitokondriella donatorcellinjer (WT och MUT, banorna 3 respektive 4) och deras respektive transmitokondriella cellinjer (MUT WT → bana 5 ochWT MUT → bana 6). MW: molekylviktsmarkör (bana 1). oklippt: icke-smält PCR-produkt (bana 2). (B) SspI-restriktionskartor för PCR-produkten för WT- och MUT-mitokondrier. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Representativa resultat av bakgrundsanalys av nukleärt DNA. Exempel på nukleärt DNA-fingeravtryck erhållet efter PCR-amplifiering av 16 loci och separation med kapilär elektrofores. Figuren visar det karakteristiska toppmönstret för varje förstärkt loci i en cellinje. Detta mönster måste vara annorlunda för de två cellinjer som används i cybridiseringsprotokollet för att bekräfta nukleär DNA-renhet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Medium | Sammansättning | ||
| Komplett odlingsmedium | DMEM hög glukos med L-Gln och pyruvat + FBS (10%) + Penicillin-streptomycin (1x) | ||
| Hypotonisk buffert | 10 mM MOPS, 83 mM sackaros, pH 7,2 | ||
| Hyperton buffert | 30 mM MOPS, 250 mM sackaros, pH 7,2 | ||
| Buffert A | 10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,32 M sackaros, pH 7,4 | ||
| TBE (1x) | 50 mM Tris, 50 mM Borsyra; 1 mM EDTA | ||
| Gel färgning lösning | 0,75 μg/ml etidiumbromid i 1x TBE | ||
Tabell 1: Buffertar och mediesammansättning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sedan Otto Warburg rapporterade att cancerceller skiftar sin ämnesomsättning och förstärker "aerob glykolys"3,4 samtidigt som mitokondriell andning minskar, har intresset för mitokondriernas roll i cancertransformation och progression ökat exponentiellt. Under de senaste åren har mutationer i mtDNA och mitokondriell dysfunktion postulerats som kännetecken för många cancertyper25. Hittills har många studier analyserat mtDNA-variationen av specifika tumörer 6,26,27,28,29,30,31,32, och den totala bördan av förvärvade mtDNA-mutationer har ansetts vara en biomarkör för tumorigenicitet 30 i cancer som prostatacancer 33. I linje med detta, medan mtDNA-mutationer i vissa fall betraktas som tumörinitiatorer, såsom i bröst 34,35 eller bukspottskörtel36 cancer, gynekologiska maligniteter 37,38, lungadenokarcinom metastaser 15,39 eller akut myeloisk leukemi 40,41, verkar de vara mindre relevanta i glioblastom 42.
Även om många cancerformer har allvarliga mtDNA-mutationer som inte finns i friska vävnader43 och kan bidra till cancerinitiering30, presenterar andra polymorfa mtDNA-varianter som är vanliga i olika mänskliga populationer. Dessa varianter främjar mildare förändringar som kan vara viktiga för cancercellsanpassning när transformationsprocessen har initierats30. I vilket fall som helst är mtDNA-mutationer och mitokondriella metabolismförändringar involverade i tumörprogression, vilket modifierar olika aspekter av cellhomeostas, såsom reaktiv syreartsproduktion eller redoxstatus44,45,46. Men mekanismerna genom vilka mtDNA-mutationer och varianter kan gynna tumörgenes är inte helt förstådda ännu. Dessutom kan mtDNA-mutationer i cancerceller samexistera med förändringar i kärngener 8,33, vilket gör det svårt att avgöra vilken som är drivarmutationen. I andra fall uppnås de bioenergetiska kraven på tumörceller genom att modulera mtDNA-kopieringsnumret47. Å andra sidan kan mtDNA-mutationer i vissa fall göra tumörceller mer mottagliga för specifika antitumörläkemedel48.
För att fullt ut förstå mtDNA-mutationernas roll i patofysiologin av cancer är det nödvändigt att utveckla metoder där muterade mitokondrier kan analyseras i en kontrollerad kärnmiljö. Detta kan bidra till att undvika kompenserande effekter av kärngener som kan utlösa cellulär anpassning. För detta ändamål representerar transmitokondriella cybrider en lämplig modell. Traditionella metoder för cybridisering involverar en mtDNA-utarmad cellinje (ρ0-celler) som fungerar som en kärndonator (och därför mitokondrireceptor) och en givare av mitokondrier, vanligtvis en enukleerad cellinje eller blodplättar19, som bär mtDNA-varianterna eller mutationerna av intresse. Den första utmaningen som ska lösas när man försöker generera cybrider är tillgången på ρ0-celler som har den nukleära bakgrunden som valts. Obtentionen av dessa celler innebär långvarig behandling med etidiumbromid, en kemisk förening som hämmar mtDNA-replikation. Det kan emellertid också inducera generering av mutationer inom kärngenomet som kan maskera effekterna av de mitokondriella förändringar som ska studeras. Därför föreslår vi i detta arbete eliminering av hela mitokondrier i kärndonatorcellinjer genom behandling med rhodamin 6G, ett läkemedel som irreversibelt skadar mitokondrier och skulle döda cellerna om inte färska mitokondrier införs i deras cytoplasma21,22,49.
En annan utmaning i traditionella cybridgenereringsmetoder är relaterad till enukleationsprocessen hos mitokondriella donatorceller. För detta ändamål centrifugeras vidhäftande celler i närvaro av cytochalasin B, vilket möjliggör isolering av enukleerade cytoplaster18 genom att främja disorganiseringen av cytoskeletten. Om celler växer i suspension (såsom hematologiska linjer) eller har förlorat cell-cell och cell-extracellulär matrisadhesion (vilket kan hända med dem med en högre metastatisk potential50,51,52), skulle detta enukleationsprotokoll äventyras, eftersom cytoplaster skulle lossna från plattan under centrifugeringen för att avlägsna kärnorna, vilket i stor utsträckning minskar deras pool för den efterföljande fusionsproceduren. För att kringgå båda utmaningarna föreslår vi här ett protokoll där isolerade mitokondrier smälts samman med rhodamin 6G-förbehandlade celler i närvaro av PEG, som har visat sig vara tidsbesparande och effektiv21,22,49.
När de transmitokondriella cellinjerna har genererats är det avgörande att bedöma renheten hos både mitokondriella och nukleära genomer. Därför är det viktigt att välja donatorcellinjer med sekvensskillnader inom deras mitokondriella DNA och med urskiljbara egenskaper, såsom antibiotikaresistens eller differentiella mikrosatelliter. Som beskrivits ovan har vissa cancerformer rapporterats modulera deras mtDNA-kopia nummer47, vilket visar vikten av att analysera mtDNA-belastningen i både ursprungliga och transmitokondriella cellinjer och studera deras OXFOS-prestanda under liknande förhållanden.
De viktigaste fallgroparna dolda i denna procedur är kopplade till processen för mitokondrier eliminering med rhodamin 6G. Varje cybridiseringsexperiment bör föregås av analyser för att fastställa optimala förhållanden för läkemedelskoncentration och behandlingstid för den valda kärndonatorcellinjen. Om rhodamin 6G-koncentrationen eller exponeringstiden inte är tillräcklig kommer den nya cellinjen att bidra med två olika mtDNA, vilket kommer att ge mer komplexitet till den fenotypiska analysen. Dessutom, om tiden eller dosen överstiger de optimala, kommer cellerna inte att överleva även efter mitokondrier återbefolkning. Slutligen är det viktigt att vara försiktig under mitokondriernas isoleringsprocess för att undvika kontaminering med obrutna celler, vilket kan förändra den fenotypiska karakteriseringen.
Trots de tekniska svårigheterna är genereringen av transmitokondriella cybrider ett kraftfullt verktyg för att avslöja mitokondriernas bidrag till cancer- och metastaseringsprocesser och generera cellmodeller där potentiella cancerbehandlingar med mitokondrier som terapeutiskt mål kan testas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Denna forskning finansierades av bidragsnummer PID2019-105128RB-I00 till RSA, JMB och AA, och PGC2018-095795-B-I00 till PFS och RML, båda finansierade av MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 och bidragsnummer B31_20R (RSA, JMA och AA) och E35_17R (PFS och RML) och finansierades av Gobierno de Aragón. RSA:s arbete stöddes av ett bidrag från Asociación Española Contra el Cáncer (AECC) PRDAR21487SOLE. Författarna vill erkänna användningen av Servicio General de Apoyo a la Investigación-SAI, Universidad de Zaragoza.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3500XL Genetic Analyzer | ThermoFisher Scientific | 4406016 | |
| 6-well plate | Corning | 08-772-1B | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit | ThermoFisher Scientific | 4427368 | |
| Anode Buffer Container 3500 Series | Applied Biosystems | 4393927 | |
| Boric acid | PanReac | 131015 | |
| Bradford assay | Biorad | 5000002 | |
| Cathode Buffer Container 3500 Series | Applied Biosystems | 4408256 | |
| Cell culture flasks | TPP | 90076 | |
| DMEM high glucose | Gibco | 11965092 | |
| EDTA | PanReac | 131026 | |
| Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E8751 | |
| Geneticin | Gibco | 10131027 | |
| Homogenizer Teflon pestle | Deltalab | 196102 | |
| L929 cell line | ATCC | CCL-1 | |
| MiniProtean Tetra4 Gel System | BioRad | 1658004 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| PCR primers | Sigma-Aldrich | Custom products | |
| Polyacrylamide Solution 30% | PanReac | A3626 | |
| Polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | P7181 | |
| POP-7 | Applied Biosystems | 4393714 | |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| QIAmp DNA Mini Kit | Qiagen | 51306 | |
| Rhodamine-6G | Sigma-Aldrich | R4127 | |
| Serum Fetal Bovine | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| SspI | New England Biolabs | R3132 | |
| Streptomycin/penicillin | PAN biotech | P06-07100 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S3089 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris | PanReac | P14030b | |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 |
References
- Hanahan, D.
- Wind, F., Warburg, O. H. The Metabolism of Tumors: Investigation from the Kaiser Wilhelm Institute for Biology. , Constable. Berlin-Dahlem. (1930).
- Warburg, O. On respiratory impairment in cancer cells. Science. 124 (3215), 269-270 (1956).
- Warburg, O.
- Weinhouse, S. On respiratory impairment in cancer cells. Science. 124 (3215), 267-269 (1956).
- Brandon, M., Baldi, P., Wallace, D. C.
- Ju, Y. S., et al. Origins and functional consequences of somatic mitochondrial DNA mutations in human cancer. eLife. 3, 02935 (2014).
- Yuan, Y., et al. Comprehensive molecular characterization of mitochondrial genomes in human cancers. Nature Genetics. 52 (3), 342-352 (2020).
- Arnold, R. S., et al. metastasis in prostate cancer: Recurring mitochondrial DNA mutation reveals selective pressure exerted by the bone microenvironment. Bone. 78, 81-86 (2015).
- Imanishi, H., et al. Mitochondrial DNA mutations regulate metastasis of human breast cancer cells. PLoS One. 6 (8), 23401 (2011).
- Lu, J., Sharma, L. K., Bai, Y. Implications of mitochondrial DNA mutations and mitochondrial dysfunction in tumorigenesis. Cell Research. 19 (7), 802-815 (2009).
- Luo, Y., Ma, J., Lu, W. The significance of mitochondrial dysfunction in cancer. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5598 (2020).
- Marco-Brualla, J., et al. Mutations in the ND2 subunit of mitochondrial complex I are sufficient to confer increased tumorigenic and metastatic potential to cancer cells. Cancers. 11 (7), 1027 (2019).
- Schopf, B., et al. OXPHOS remodeling in high-grade prostate cancer involves mtDNA mutations and increased succinate oxidation. Nature Communications. 11 (1), 1487 (2020).
- Yuan, Y., et al. Nonsense and missense mutation of mitochondrial ND6 gene promotes cell migration and invasion in human lung adenocarcinoma. BMC Cancer. 15, 346 (2015).
- Zielonka, J., Kalyanaraman, B. 34;ROS-generating mitochondrial DNA mutations can regulate tumor cell metastasis"--a critical commentary. Free Radicals Biology and Medicine. 45 (9), 1217-1219 (2008).
- Welch, D. R., Foster, C., Rigoutsos, I. Roles of mitochondrial genetics in cancer metastasis. Trends in Cancer. 8 (12), 1002-1018 (2022).
- Cavaliere, A., Marchet, S., Di Meo, I., Tiranti, V. An in vitro approach to study mitochondrial dysfunction: A cybrid model. Journal of Visualized Experiments. (181), e63452 (2022).
- King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
- Bacman, S. R., Moraes, C. T.
- Moraes, C. T., Dey, R., Barrientos, A.
- Acin-Perez, R., et al. Respiratory complex III is required to maintain complex I in mammalian mitochondria. Molecular Cell. 13 (6), 805-815 (2004).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Bayona-Bafaluy, M. P., et al. Revisiting the mouse mitochondrial DNA sequence. Nucleic Acids Research. 31 (18), 5349-5355 (2003).
- Srinivasan, S., Guha, M., Kashina, A., Avadhani, N. G. Mitochondrial dysfunction and mitochondrial dynamics-The cancer connection. Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1858 (8), 602-614 (2017).
- Bartoletti-Stella, A., et al. Mitochondrial DNA mutations in oncocytic adnexal lacrimal glands of the conjunctiva. Archives of Ophthalmology. 129 (5), 664-666 (2011).
- Chinnery, P. F., Samuels, D. C., Elson, J., Turnbull, D. M. Accumulation of mitochondrial DNA mutations in ageing, cancer, and mitochondrial disease: is there a common mechanism. The Lancet. 360 (9342), 1323-1325 (2002).
- Copeland, W. C., Wachsman, J. T., Johnson, F. M., Penta, J. S.
- Gasparre, G., et al. Clonal expansion of mutated mitochondrial DNA is associated with tumor formation and complex I deficiency in the benign renal oncocytoma. Human Molecular Genetics. 17 (7), 986-995 (2008).
- Kopinski, P. K., Singh, L. N., Zhang, S., Lott, M. T., Wallace, D. C. Mitochondrial DNA variation and cancer. Nature Review Cancer. 21 (7), 431-445 (2021).
- Pereira, L., Soares, P., Maximo, V., Samuels, D. C. Somatic mitochondrial DNA mutations in cancer escape purifying selection and high pathogenicity mutations lead to the oncocytic phenotype: pathogenicity analysis of reported somatic mtDNA mutations in tumors. BMC Cancer. 12, 53 (2012).
- Wallace, D. C.
- Hopkins, J. F., et al. Mitochondrial mutations drive prostate cancer aggression. Nature Communications. 8 (1), 656 (2017).
- Weerts, M. J. A., Smid, M., Foekens, J. A., Sleijfer, S., Martens, J. W. M. Mitochondrial RNA expression and single nucleotide variants in association with clinical parameters in primary breast cancers. Cancers. 10 (12), 500 (2018).
- Jimenez-Morales, S., Perez-Amado, C. J., Langley, E., Hidalgo-Miranda, A. Overview of mitochondrial germline variants and mutations in human disease: Focus on breast cancer (Review). International Journal of Oncology. 53 (3), 923-936 (2018).
- Hardie, D. G. AMP-activated/SNF1 protein kinases: conserved guardians of cellular energy. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 774-785 (2007).
- Perrone, A. M., et al. Potential for mitochondrial DNA sequencing in the differential diagnosis of gynaecological malignancies. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2048 (2018).
- Musicco, C., et al. Mitochondrial dysfunctions in type I endometrial carcinoma: Exploring their role in oncogenesis and tumor progression. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2076 (2018).
- Li, N., et al. Dissecting the expression landscape of mitochondrial genes in lung squamous cell carcinoma and lung adenocarcinoma. Oncology Letters. 16 (3), 3992-4000 (2018).
- Kim, H. R., et al. Spectrum of mitochondrial genome instability and implication of mitochondrial haplogroups in Korean patients with acute myeloid leukemia. Blood Research. 53 (3), 240-249 (2018).
- Tyagi, A., et al. Pattern of mitochondrial D-loop variations and their relation with mitochondrial encoded genes in pediatric acute myeloid leukemia. Mutation Research. 810, 13-18 (2018).
- Vidone, M., et al. A comprehensive characterization of mitochondrial DNA mutations in glioblastoma multiforme. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 63, 46-54 (2015).
- Chatterjee, A., Mambo, E., Sidransky, D. Mitochondrial DNA mutations in human cancer. Oncogene. 25 (34), 4663-4674 (2006).
- Arnold, R. S., et al. An inherited heteroplasmic mutation in mitochondrial gene COI in a patient with prostate cancer alters reactive oxygen, reactive nitrogen and proliferation. BioMed Research International. 2013, 239257 (2013).
- Petros, J. A., et al. mtDNA mutations increase tumorigenicity in prostate cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (3), 719-724 (2005).
- Wallace, D. C., Fan, W., Procaccio, V.
- Reznik, E., et al. Mitochondrial DNA copy number variation across human cancers. eLife. 5, 10769 (2016).
- Soler-Agesta, R., et al. PT-112 induces mitochondrial stress and immunogenic cell death, targeting tumor cells with mitochondrial deficiencies. Cancers. 14 (16), 3851 (2022).
- Trounce, I., Wallace, D. C. Production of transmitochondrial mouse cell lines by cybrid rescue of rhodamine-6G pre-treated L-cells. Somatic Cell and Molecular Genetics. 22 (1), 81-85 (1996).
- Pastushenko, I., Blanpain, C. EMT transition states during tumor progression and metastasis. Trends in Cell Biology. 29 (3), 212-226 (2019).
- Pastushenko, I., et al. Identification of the tumour transition states occurring during EMT. Nature. 556 (7702), 463-468 (2018).
- Thiery, J. P., Sleeman, J. P. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 131-142 (2006).
