Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

בדיקת כדאיות של Trichoderma stromaticum conidia בתוך מקרופאגים חד-גרעיניים בדם היקפי אנושי

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65231
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Laboratory of Immunobiology - Department of Biological Sciences, State University of Santa Cruz - UESC, 2Università Degli Studi di Genova
* These authors contributed equally

Summary

הטכניקה המערבת פאגוציטוזה של קונידיה פטרייתית על ידי מקרופאגים נמצאת בשימוש נרחב למחקרים המעריכים את אפנון התגובה החיסונית נגד פטריות. מטרת כתב היד היא להציג שיטה להערכת יכולות הפאגוציטוזה והפינוי של מקרופאגים חד-גרעיניים מדם היקפי אנושי המגורות באמצעות Trichoderma stromaticum conidia.

Abstract

מקרופאגים מהווים קו הגנה חיוני ואחראים למניעת גדילה והתיישבות של פתוגנים ברקמות שונות. פגוציטוזה קונידיאלית היא תהליך מפתח המאפשר לחקור את האירועים הציטופלזמיים והמולקולריים המעורבים באינטראקציות מקרופאגים-פתוגנים, כמו גם לקביעת זמן המוות של קונידיה מופנמת. הטכניקה המערבת פאגוציטוזה של קונידיה פטרייתית על ידי מקרופאגים נמצאת בשימוש נרחב למחקרים המעריכים את אפנון התגובה החיסונית נגד פטריות. התחמקות מפאגוציטוזה ובריחה של פגוזומים הם מנגנונים של אלימות פטרייתית. כאן, אנו מדווחים על השיטות שניתן להשתמש בהן לניתוח של phagocytosis, סליקה, ואת הכדאיות של T. stromaticum conidia, פטרייה אשר משמש biocontrol ו biofertilizer סוכן והוא מסוגל לגרום זיהומים אנושיים. הפרוטוקול מורכב מ-1) תרבית טריכודרמה (Trichoderma ), 2) שטיפה להשגת קונידיה (conidia), 3) בידוד תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) בשיטת תמיסת רב-סוכרוז והתמיינות ה-PBMCs למקרופאגים, 4) שיטת פאגוציטוזה חוץ-גופית באמצעות כיסויי זכוכית עגולים וצבע, ו-5) בדיקת פינוי להערכת הכדאיות של הקונידיה לאחר פגוציטוזה של קונידיה. לסיכום, ניתן להשתמש בטכניקות אלה כדי למדוד את יעילות פינוי הפטריות של מקרופאגים.

Introduction

סוג טריכודרמה (סדר: Hypocreales, משפחה: Hypocreaceae) מורכב מפטריות ספרופיטיות הנמצאות בכל מקום, שהן טפילים של מיני פטריות אחרים ומסוגלות לייצר מגוון אנזימים שימושיים מסחרית1. מיני פטריות אלה משמשים לייצור חלבונים הטרולוגיים2, לייצור תאית3, אתנול, בירה, יין ונייר4, בתעשיית הטקסטיל5, בתעשיית המזון6, ובחקלאות כסוכני הדברה ביולוגית 7,8. בנוסף להתעניינות התעשייתית במינים פטרייתיים אלה, המספר ההולך וגדל של זיהומים בבני אדם העניק לחלק ממיני הטריכודרמה מעמד של פתוגנים אופורטוניסטיים9.

Trichoderma spp. גדלים במהירות בתרבות, עם מושבות לבנות וכותנות בתחילה שהופכות צהוב ירקרק לירוק כהה10. הם מותאמים לחיות במגוון רחב של תנאי pH וטמפרטורה, והמינים האופורטוניסטיים מסוגלים לשרוד ב- pH פיזיולוגי ובטמפרטורות ובכך ליישב רקמות אנושיות שונות 11,12,13. חשוב לציין, העלייה בשיעור הזיהום של Trichoderma spp. עשויה להיות קשורה לגורמי אלימות, ואלה אינם נחקרים היטב. בנוסף, מחקרים המתמקדים בהבנת התגובה החיסונית נגד מיני טריכודרמה אופורטוניסטיים הם עדיין נדירים.

במהלך זיהום, יחד עם נויטרופילים, מקרופאגים מייצגים את קו ההגנה האחראי לפאגוציטוזה, ובכך מונעים צמיחה והתיישבות של פתוגנים ברקמות שונות. באמצעות שימוש בקולטנים לזיהוי דפוסים, כגון קולטנים דמויי טול וקולטני לקטין מסוג C, פטריות פאגוציטוזה של מקרופאגים ועיבודן לפגוליזוזומים, ובכך קידום התפרצות נשימתית, שחרור ציטוקינים מעודדי דלקת והרס מיקרואורגניזמים פגוציטוזים14. מנגנון הפאגוציטוזה, לעומת זאת, יכול להיות מושפע ולהתחמק על ידי אסטרטגיות מיקרוביאליות שונות, כגון גודל וצורה של תאים פטרייתיים; נוכחות של כמוסות המעכבות phagocytosis; הפחתת מספר הקולטנים הגורמים לפאגוציטוזה; שיפוץ המבנה של סיבי אקטין בציטופלסמה; מעכב את היווצרות pseudopodia; ופאגוזום או פאגוליזוזום בורחים לאחר תהליך הפאגוציטוזה14.

פתוגנים רבים, כולל Cryptococcus neoformans, משתמשים במקרופאגים כנישה לשרוד בפונדקאי, להפיץ ולגרום לזיהום15. בדיקת הפאגוציטוזה והפינוי משמשת להערכת התגובה החיסונית נגד פתוגנים ולזיהוי האסטרטגיות המיקרוביאליות המשמשות להתחמקות ממערכת החיסון המולדת 15,16,17. סוג זה של טכניקה יכול לשמש גם כדי לבחון את הקינטיקה הדיפרנציאלית של phagocytosis, החמצה מאוחרת phagosome, פרץ חמצוני שתוצאתם הרג פטרייתי מופחת18.

ניתן להשתמש בשיטות שונות כדי להעריך פגוציטוזה, הישרדות פטרייתית והתחמקות מתהליך ההבשלה של הפאגוזומים. אלה כוללים מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, המשמשת לצפייה בפאגוציטוזה, במיקום התא ובמולקולות המיוצרות במהלך פגוציטוזה19; ציטומטריית זרימה, המספקת נתונים כמותיים על פגוציטוזה ומשמשת להערכת הסמנים השונים המעורבים בתהליך20,21; מיקרוסקופיה תוך חיונית, המשמשת להערכת לכידת חיידקים והבשלת פגוזום22; פגוציטוזה בתיווך נוגדנים, המשמשת להערכת הספציפיות של תהליך הפאגוציטוזה עבור פתוגן23; ואחרים 24,25,26,27.

הפרוטוקול המוצג כאן משתמש בשיטה נפוצה, זולה וישירה באמצעות מיקרוסקופ אופטי ובדיקת צמיחת לוחות כדי להעריך את הפאגוציטוזה וההרג של קונידיה פטרייתית. פרוטוקול זה יספק לקוראים הוראות שלב אחר שלב לביצוע בדיקת פאגוציטוזה וסילוק באמצעות מקרופאגים חד-גרעיניים מדם היקפי אנושי שנחשפו ל- T. stromaticum. PBMCs שימשו מכיוון ש - Trichoderma conidia מיושמים כהדברה ביולוגית נגד פיטופתוגנים ודשן ביולוגי לגידולי צמחים ברחבי העולם וגרמו למספר זיהומים בבני אדם, הנקראים Trichodermosis. מלבד זאת, יש רק שתי עבודות קודמות המתמקדות באינטראקציה בין Trichoderma conidia לבין מערכת החיסון האנושית, שבהן בחנו נויטרופילים28 ואוטופגיה במקרופאגים29. מאמר זה מראה תחילה כיצד ניתן לחקור את הפאגוציטוזה של הקונידיה של T. stromaticum על ידי מקרופאגים שמקורם ב-PBMC, ולאחר מכן כיצד ניתן להעריך את הכדאיות של הקונידיה הנבלעת באמצעות טכניקות פשוטות המבוססות על מיקרוסקופיה. פרוטוקול זה עשוי להקל עוד יותר על חקירות של תגובה חיסונית הקשורה למקרופאגים או מנגנונים הקשורים לאפנון מערכת החיסון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

שיקולים אתיים ונושאים אנושיים
כל הניסויים בבני אדם המתוארים במחקר זה נערכו על פי הצהרת הלסינקי והחוקים הפדרליים של ברזיל ואושרו על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת המדינה של סנטה קרוז (קוד זיהוי הפרויקט: 550.382/ 2014).

דם היקפי אנושי נאסף ממתנדבים בריאים מהעיר איליאוס בבאהיה, ברזיל, שלא נחשפו לפעילות תעסוקתית הקשורה לפטרייה הנחקרת. אנשים עם מצב בריאותי רפואי מדווח או שימוש בתרופות לא נכללו. כל הנבדקים הסכימו מרצונם להשתתף וחתמו על טופס הסכמה מדעת לפני הכללתם במחקר זה.

1. הכנת ריאגנטים ופתרונות

הערה: הכן את הריאגנטים והפתרונות הבאים לפני שתמשיך. עיין בטבלת החומרים (TOM) לקבלת מידע על מגיב וספק חומרים.

  1. הכינו תמיסת מלח סטרילית מאוזן חוצצת פוספט 1x (PBS).
    הערה: בפרוטוקול זה, PBS ללא אנדוטוקסין לא היה בשימוש.
  2. הכינו אגר דקסטרוז תפוחי אדמה (PDA) בינוני, ומזגו 20 מ"ל לכל צלחת פטרי לתרבית T. stromaticum . הכינו שש צלחות עם מחשב כף יד לכל תורם, והשתמשו בצלחת אחת לכל מצב: 3 שעות, 24 שעות, 48 שעות, 72 שעות, 96 שעות ו-120 שעות. בנוסף, השתמש בשלושה לוחות עבור כל בקרה: שלושה עבור בקרת Trichoderma ושלושה עבור הבקרה הבינונית R10. השתמש בצלחות פטרי של 60 מ"מ x 15 מ"מ או 100 מ"מ x 15 מ"מ להתאוששות קונידיה אופטימלית.
  3. לעקר 100% גליצרול.
  4. הכינו מדיום R10 לתרבית התא: מדיום RPMI בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי ו-1% אנטיביוטיקה (פניצילין/סטרפטומיצין).
  5. לעקר מים מזוקקים עבור ליזה התא.
  6. הכינו מים ב-pH 7.0 לתהליך הצביעה.
    הערה: במידת הצורך, כוונן את ה- pH באמצעות מד pH ותמיסות של 0.1 M/L NaOH ו- 0.1 M/L HCl.
  7. יש לעקר כיסויי זכוכית עגולים (13 מ"מ) ופינצטה.

2. תרבית ועיבוד Trichoderma stromaticum

  1. הכנת ציר אם (M1) של T. stromaticum:
    הערה: מלאי אם (M1) נדרש כדי להבטיח שכל הניסויים נעשים מהתרבות של אותו דור טרי (F1).
    1. גידלו T . stromaticum inoculum בצלחות פטרי עם מחשב כף יד בטמפרטורה של 28°C בחושך במשך 7-10 ימים עד שהקונידיה נצפית והתרבית הופכת לירוקה.
    2. לשטוף את התרבות של T. stromaticum. הוסף 3-5 מ"ל של PBS למשטח התרבית באמצעות פיפטה. אספו את PBS מהצלחת, ושוב הניחו אותו על התרבית כדי להסיר בהדרגה את הקונידיה באמצעות הפיפטה. חזור על תהליך זה ככל שיידרש עד שהמתלה הופך לירוק כהה.
      הערה: לחלופין, מומלץ לשטוף בעדינות את התרבית על ידי הוספת 3-5 מ"ל PBS לצלחת ולאחר מכן לבצע תנועה מעגלית עד שהמתלה הופך לירוק כדי לשחזר את הקונידיה. עם פיפטינג חוזר, ניתן לאסוף יותר קונידיה.
    3. מעבירים את המתלה המשוחזר מהצלחת לצינור סטרילי של 15 מ"ל עם פיפטה. חזור על שלבים 2.1.2-2.1.3 כמה פעמים שצריך כדי להשיג יותר conidia.
    4. צנטריפוגו את המתלים ב 1,160 x גרם למשך 5 דקות ב 12 ° C, והשהה מחדש את הגלולה ב 5 מ"ל של PBS. חזור על שלב זה (2.1.4) שלוש פעמים כדי לקבל השעיה ללא קורים.
      הערה: כדי להשהות מחדש את הגלולה כראוי, לאחר צנטריפוגה, מומלץ מערבולות קצרות.
    5. יש להשהות מחדש את הגלולה האחרונה ב-2-3 מ"ל של PBS, ולספור את הקונידיה בתא נויבאואר באמצעות דילול של 1:100 או 1:1,000.
      הערה: בתנאים אופטימליים, ניתן לשחזר ריכוז סופי של 2 x 108 conidia/mL מהתרבית. הערכת הכדאיות של הקונידיה באמצעות שיטת ההדרה הכחולה של טריפאן היא אופציונלית.
    6. Aliquot את המתלה לתוך צינורות סטריליים 1.5 מ"ל על ידי הוספת 0.5 מ"ל של מתלה conidia (משלב 2.1.5) לכל צינור. לאחר מכן, הוסף 0.5 מ"ל של גליצרול סטרילי 100% כדי להשיג מניות M1. מערבולות קצרות, לזהות את הצינורות, ולאחסן ב -20 ° C או -80 ° C.
  2. תרבית של T. stromaticum והשגת conidia עבור הניסוי
    1. צלחת 10 μL של מתלה M1 (מוכן בשלב 2.1) ב- PDA ב 28 ° C בחושך במשך 7-10 ימים עד שהקונידיה נצפית והתרבות הופכת לירוקה כדי לקבל את דור F1 הטרי.
      הערה: כדי להבטיח תרבית T . stromaticum טרייה לניסוי, הערך את הזמן הדרוש לצמיחת פטרייה ואת הזמן הדרוש להתמיינות מקרופאגים.
    2. אסוף את הקונידיה, חזור על שלבים 2.1.2-2.1.4.
    3. השהה מחדש את הגלולה הסופית ב 2-3 מ"ל של PBS. הערך את כדאיות הקונידיה באמצעות שיטת ההדרה הכחולה של טריפאן, או ספור את הקונידיה כפי שהוזכר בשלב 2.1.5.

3. בידוד תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMC)

הערה: PBMCs מתקבלים בשיטת מחסום צפיפות באמצעות תמיסה polysucrose של צפיפות 1.077 גרם / מ"ל30.

  1. Aliquot 15 מ"ל של תמיסת פוליסוקרוז לצינור אחד של 50 מ"ל עבור כל דגימת תורם שתיאסף.
  2. לאסוף 20 מ"ל של דם מכל תורם באמצעות שלושה עד ארבעה צינורות EDTA. גייסו לפחות ארבעה תורמים בכל ניסוי. אין לצרף את דמם של התורמים; במקום זאת, השתמשו בכל דגימה בנפרד כשכפול ביולוגי. עבור כל תורם, להעביר את הדם לצינור אחד 50 מ"ל, ולהוסיף PBS כדי לקבל נפח סופי של 35 מ"ל.
  3. העבירו את תרחיף הדם (שלב 3.2) באיטיות לאורך דופן הצינור המכיל את תמיסת הרב-סוכרוז (שלב 3.1) ליצירת תרחיף דו-פאזי.
    הערה: כדי למנוע ערבוב של הדם עם תמיסת רב-סוכרוז, הוסף את הדם לאט. מומלץ להשתמש במינימום של 7 מ"ל דם מכל תורם לבידוד PBMC.
  4. מיד צנטריפוגה את הצינור המכיל את המתלה biphasic ב 1,600 x גרם במשך 30 דקות ב 24 ° C. תכנת את הצנטריפוגה של PBMCs: השתמש בתאוצה 1 והאטה 0 כדי למנוע עצירה פתאומית של הצנטריפוגה.
  5. שימו לב להיווצרות טבעת לבנה המכילה את PBMCs לאחר צנטריפוגה. תאי הדם האדומים והגרנולוציטים שוכנים בשכבה התחתונה, השכבה הבאה מכילה את תמיסת הרב-סוכרוז, וה-PBMCs שוכנים בטבעת הלבנה שבין תמיסת הרב-סוכרוז לפלזמה (השכבה העליונה). אספו את הטבעת הלבנה על ידי שאיפה עדינה באמצעות פיפטה או פיפטה סטרילית של פסטר כדי לא לתפוס תאי דם אדומים, פלזמה או תמיסת רב-סוכרוז, והעבירו לצינורית אחת של 15 מ"ל.
  6. הוסף PBS לצינור 15 מ"ל המכיל את PBMCs כדי לקבל נפח סופי של 10 מ"ל. הומוגניזציה של המתלים, וצנטריפוגה את הצינור ב 1,600 x גרם למשך 30 דקות ב 24 ° C.
  7. שטפו את התאים שלוש פעמים במהירות של 1,600 x גרם במשך 5 דקות ב-24°C עם 10 מ"ל PBS. לאחר מכן, להשעות מחדש את הגלולה הסופית ב 2 מ"ל של R10 בינוני.
  8. להעריך את כדאיות התא באמצעות שיטת ההרחקה הכחולה טריפאן, ולספור את התאים בתא נויבאואר.

4. קינטיקה פגוציטוזה

הערה: המקרופאגים החד-גרעיניים בדם היקפי אנושיים מטופלים ב-T. stromaticum conidia בריבוי זיהומים (MOI) של 1:10 או רק R10 בינוני כבקרה. ריבוי ההדבקה (MOI) מייצג את היחס בין גורמי ההדבקה המתווספים ליעדי ההדבקה ומוצג כמספרים מוחלטים: MOI = סוכנים:יעדים31. כאן, אנו משתמשים 1 T. stromaticum conidia (סוכן) עבור 10 מקרופאגים (מטרות). לאחר מכן, התאים מודגרים ב 37 ° C ו 5% CO2 לפרקי זמן שונים (3 שעות, 24 שעות, 48 שעות, 72 שעות, 96 שעות, ו 120 שעות). לאחר מכן, כיסוי זכוכית עגול משמש כדי לדמיין את המקרופאגים הדבקים המעורבים בתהליך phagocytosis תחת מיקרוסקופ. מוצגת דמות של תכנון ניסויי (איור 1).

הערה: מומלץ להשתמש בצלחות 24 בארות.

  1. טיפול במקרופאגים שמקורם בבני אדם עם T. stromaticum conidia
    1. הוסיפו לכל באר כיסוי זכוכית עגול סטרילי (13 מ"מ) באמצעות פינצטה סטרילית.
    2. התאם את נפח תרחיף התא המתקבל בשלבים 3.7-3.8 לצלחת 8 x 105 תאים לכל באר לנפח סופי של 1 מ"ל עם מדיום R10. השתמש במיקרוסקופ הפוך כדי להעריך את המורפולוגיה של התא.
      הערה: התאים חייבים להיות תלויים בתווך ולהיות בעלי מורפולוגיה מעוגלת.
    3. לדגור על התאים בטמפרטורה של 37°C תחת אטמוספירה של 5% CO2 למשך 7 ימים, ולהחליף את התווך בתווך R10 טרי כל יומיים לצורך התמיינות המונוציטים למקרופאגים32. התבוננו במורפולוגיית התא באמצעות מיקרוסקופ הפוך. המקרופאגים יציגו מורפולוגיה צירית, עם צורות שטוחות ומורחבות; ניתן לראות גם יחס ציטופלסמטי מוגבר ונוכחות של פסאודופודיה. חפשו מקרופאגים חד-גרעיניים דבקים.
      הערה: חלק קטן מאוד של מונוציטים לא מובחנים עשוי להישאר תלוי בתווך.
    4. הסר את המדיום של כל באר באמצעות פיפטה, ולשטוף את התאים עם 1 מ"ל של PBS כדי להסיר פסולת ותאים שאינם דבקים.
    5. השתמש בתרחיף שהוכן בשלב 2.2 כדי להכין תרחיף חדש של T. stromaticum conidia בריכוז סופי של 8 x 104 conidia/mL בתווך R10.
    6. הוסף 1 מ"ל של מתלה הקונידיה שהוכן בשלב 4.1.5 לכל באר טיפול (3 שעות, 24 שעות, 48 שעות, 72 שעות, 96 שעות ו-120 שעות) לקבלת MOI של 1:10. לבקרות, הוסף רק 1 מ"ל של מדיום R10 לבאר.
    7. אתגרו את המקרופאגים במשך 3 שעות עם T. stromaticum conidia בטמפרטורה של 37°C תחת אטמוספירה של 5% CO2 . לאחר 3 שעות, להסיר את המדיום, ולשטוף את התאים כדי להסיר את conidia non-phagocytosed.
    8. הוסיפו 1 מ"ל של מדיום R10 לכל באר, ודגרו על הצלחת לזמנים שונים (3 שעות, 24 שעות, 48 שעות, 72 שעות, 96 שעות ו-120 שעות) בטמפרטורה של 37°C תחת אטמוספירה של 5% CO2 .
  2. צביעה וניתוח
    1. הסר את המדיום מכל באר לאחר השלמת הדגירה המתאימה (שלב 4.1.8), והוסף 1 מ"ל PBS לבאר זו.
    2. הסירו את כיסויי הזכוכית העגולים מהבארות באמצעות פינצטה סטרילית ומחט לצביעה בעזרת ערכת צביעה.
      הערה: לחילופין, ניתן לבצע צביעה באמצעות כתם מאי גרינוולד-גימסה33.
    3. לכל אחת מכיסויי הזכוכית העגולים יש להוסיף מקבע כתמים (5 שניות), צבע 1 (5 שניות), צבע 2 (2 שניות) ומים חוצצים pH 7.0 (5 שניות), שהם רכיבי ערכת הצביעה. המתינו עד שהם יבשים, וקבעו את הכיסויים על מגלשת זכוכית באמצעות חומר הרכבה.
    4. כמת את התוצאה: ספירה כוללת של 100 מקרופאגים (Mø) עבור כל תנאי זמן. באמצעות מיקרוסקופ אופטי, ספרו את מספר המקרופאגים עם קונידיה פגוציטוזית באמצעות שמן מטרה וטבילה פי 100 (משוואה [1]).
      Equation 1 (1)
    5. קבל את מספר הקונידיה פאגוציטוזה לכל מקרופאג: קשר את הקונידיה הקיימת ב-100 מקרופאגים חלקי מספר המקרופאגים עם לפחות קונידיום פאגוציטוזי אחד (משוואה [2])34.
      Equation 2 (2)
      הערה: כדי להעריך ולספור את הקונידיה, ניתן להשתמש בתוכנת ImageJ35.
    6. צלם את הפאגוציטוזה מכל דגימה ומצב זמן באמצעות מטרות 40x ו- 100x כדי להציג את התוצאות.

Figure 1
איור 1: ייצוג סכמטי של בדיקת פאגוציטוזה ובדיקת כדאיות קונידיאלית באמצעות מקרופאגים חד-גרעיניים מדם היקפי אנושי. (1-10) בדיקת פגוציטוזיס: יש לגדל את T. stromaticum ב- PDA, ואת conidia הם התאוששו על ידי שטיפת הצלחת עם PBS. יש לבודד את ה-PBMCs בשיטת מחסום הצפיפות באמצעות הפרוטוקול המתואר, לגדל בתרבית בלוחות 24 בארות עם כיסויי זכוכית עגולים סטריליים למשך 7 ימים לצורך התמיינות למקרופאגים, ולאחר מכן לטפל ב-MOI של 1:10 עם מרווחי זמן שונים. כיסויי הזכוכית העגולים מוסרים ומוכתמים באמצעות ערכת הצביעה, והתוצאות מנותחות באמצעות מיקרוסקופ אור. (1-8,11-13) בדיקת כדאיות קונידיה: לאחר בידוד, ה-PBMCs מתורבתים בצלחות של 24 בארות ללא כיסויי זכוכית עגולים למשך 7 ימים לצורך התמיינות למקרופאגים ולאחר מכן מטופלים ב-MOI של 1:10 לפרקי זמן שונים. התאים חייבים להיות lysed על ידי דגירה עם מים מזוקקים; לאחר מכן מתלה הוא צנטריפוגה, ולאחר מכן גלולה resuspended מצופה PDA כדי לנתח את קינטיקה הצמיחה של Trichoderma. דמות זו עוצבה באמצעות מסד נתונים של תמונות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

5. בדיקת כדאיות קונידיאלית לאחר פגוציטוזה

הערה: מוצגת דמות של תכנון ניסויי (איור 1).

הערה: יש להשתמש בצלחות של 24 בארות.

  1. אתגר את המקרופאגים שמקורם בבני אדם עם T. stromaticum conidia.
    1. חזור על שלבים 4.1.2-4.1.8 כדי להבדיל בין המונוציטים, ולטפל במקרופאגים עם T. stromaticum conidia.
      הערה: אין להשתמש בכיסויי זכוכית עגולים בבארות. השתמש באותם מרווחי זמן המשמשים להערכת קינטיקה phagocytosis כך phagocytosis יכול להיות בקורלציה עם הכדאיות conidial.
    2. להעריך את ההשפעה של תווך R10 על צמיחת T. stromaticum באמצעות בארות עם המתלה מוכן בשלב 4.1.5 (R10 בינוני + conidia) כבקרה.
  2. בדיקת כדאיות קונידיאלית
    1. הסר את המדיום לאחר כל תקופת דגירה (3 שעות, 24 שעות, 48 שעות, 72 שעות, 96 שעות ו -120 שעות), ושטוף את התאים פעמיים עם PBS כדי להסיר את הקונידיה שלא עברה פגוציטוזה.
      הערה: אין לשטוף את הפקד המכיל R10 medium + conidia.
    2. הוסיפו 0.5 מ"ל מים מזוקקים סטריליים לכל באר, ודגרו על הצלחת בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2 למשך 30 דקות. לאחר זמן זה, התבונן במורפולוגיית התא תחת מיקרוסקופ הפוך כדי לוודא שהתאים עברו ליזה.
    3. לאסוף את ההשעיה, ולהעביר אותו 1.5 מ"ל צינורות. צנטריפוגה את המתלה באמצעות מיני צנטריפוגה ב 6,000 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. יש להשליך את הסופרנאטנט בזהירות, להשהות מחדש את הגלולה ב-10 מיקרוליטר מים מזוקקים סטריליים, ולחסן 10 מיקרוליטר של התרחיף לתוך הצלחת המכילה מחשב כף יד ב-28°C בחושך.
    5. הכן בקרה חיובית לצמיחת T. stromaticum : השתמש בתרחיף של T. stromaticum conidia (שלב 2.2) כדי להכין תרחיף חדש עם ריכוז סופי של 8 x 106 conidia / mL. צלחת 10 μL של מתלה זה ב- PDA ב- 28 ° C בחושך.
      הערה: 10 μL של תרחיף זה יכיל את אותו מספר של קונידיה (8 x 104) ששימש להדבקת המקרופאגים שמקורם בדם מונו-גרעיני. ההבדל בין בקרה חיובית זו לבין זו שהוזכרה בשלב 5.1.2 הוא שהבקרה שהוזכרה לעיל בשלב 5.1.2 משמשת להערכת ההשפעה האפשרית של מדיום R10 על צמיחת טריכודרמה בזמן פגוציטוזה. בקרה חיובית זו בשלב 5.2.5 באמצעות ההשעיה של T. stromaticum conidia שנאסף ב- PBS מייצגת בקרה לצמיחת טריכודרמה ללא השפעה של מדיום R10 כדי לשקף כיצד הפטרייה גדלה באופן טבעי. באמצעות בקרה זו, ניתן להעריך אם מדיום R10 משפיע על צמיחת Trichoderma .
    6. צפו בקינטיקה הגדילה של T. stromaticum במחשבי כף יד מדי יום, וצלמו את התרבית.
    7. ניתוח: ניתן להשתמש בשתי נקודות כדי להעריך את התוצאות: 1) הזמן (בימים) הדרוש לתרבות לתפוס את כל צלחת התרבית, 2) הזמן (בימים) עד הופעת הפיגמנטציה הירוקה האופיינית של T. stromaticum conidia בתרבית.

6. ניתוח סטטיסטי

  1. השתמש בבדיקת קרוסקל-וואליס כדי לקבוע הבדלים מובהקים סטטיסטית בין 8 הקבוצות/טיפולים. ניקח בחשבון את p < 0.05 כמובהק סטטיסטית. כל הנתונים מוצגים כאמצעי ± סטיית תקן (SD). באיורים, # מציין מובהקות סטטיסטית ב p < 0.05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הטכניקה המערבת פאגוציטוזה של קונידיה פטרייתית על ידי מקרופאגים נמצאת בשימוש נרחב למחקרים המעריכים את אפנון התגובה החיסונית נגד פטריות. השתמשנו בפאגוציטוזה של T. stromaticum conidia כדי להעריך את הכדאיות של הקונידיה לאחר פגוציטוזה, שכן התחמקות מפאגוציטוזה ובריחת פגוזומים הם מנגנונים של אלימות פטרייתית. חוקרים צריכים לבצע טכניקות אלה כאחד הבדיקות הראשונות בעת חקירת מין של עניין קליני.

Figure 2
איור 2: פגוציטוזה של T. stromaticum conidia על-ידי מקרופאגים חד-גרעיניים מדם היקפי אנושי. תוצאות מייצגות של קינטיקה של פאגוציטוזיס (A) מתחת למטרות 40x ו-(B) 100x המראות מקרופאגים שמקורם ב-PBMC המכילים T. stromaticum conidia. (C) T. stromaticum conidia חופשי ומחובר לקרום החיצוני; (D) T. stromaticum conidia מופנם לחלוטין על ידי מקרופאגים; (E) T. stromaticum conidia במישור עליון; (F) פגוציטוזה מרובה; ו-(G) נביטת קונידיה בתוך (H) ומחוץ למקרופאגים. חצים: צהוב, קונידיה חופשית; לבן, קונידיה המחוברת לקרום החיצוני; קונידיה שחורה, מופנמת לחלוטין; נביטה אדומה, קונידיה בתוך המקרופאגים. חצים מקווקוים: שחור, פאגוציטוזה מרובה; אדום, קונידיה נובטת בתווך R10 מחוץ למקרופאגים; לבן, קונידיה במישור העליון. סרגל קנה המידה מציין 20 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2 מראה את התוצאות המייצגות של קינטיקה של פאגוציטוזיס. בתחילת תהליך הפאגוציטוזה ניתן להבחין ב-T. stromaticum conidia חופשי, כמו גם בקונידיה המחוברת לקרום החיצוני של המקרופאגים או מופנמת לחלוטין על-ידם (איור 2A-C). פחות קונידיה ניתן לראות חופשי או מחובר לקרום החיצוני של המקרופאגים עם הגדלת זמן phagocytosis.

יש לציין שבעבודה זו ניתן היה למצוא קונידיה חופשית ומחוברת לקרום החיצוני (איור 2C) בתחילת תהליך הפאגוציטוזה, כשהיא מופנמת לחלוטין על-ידי המקרופאגים (איור 2D), או במישור עליון בהשוואה למקרופאגים (איור 2E), אך לא בפאגוציטוזה, וניתן היה למצוא יותר מקונידיום אחד באותו מקרופאג (איור 2F). לאחר פרקי זמן ארוכים (96 שעות), קונידיה פגוציטוזית יכולה לנבוט בתוך המקרופאגים (איור 2G), וקונידיה חופשית יכולה לנבוט בתווך R10 וליצור קורים ב-37°C (איור 2H).

לאחר phagocytosis, ניתן היה לראות כי T. stromaticum conidia נשאר קיימא גם לאחר 120 שעות של אינטראקציה עם מקרופאגים שמקורם PBMC האנושי. התוצאות המייצגות מראות את התרבית של קונידיה משוחזרת (איור 3A) ומייצגות את הזמן (בימים) הדרוש לתרבית לתפוס את כל לוח התרבות (איור 3B) וליצור קונידיה בצבע ירוק (איור 3C). רק T. stromaticum conidia בדידים הצליחו לחמוק מהפאגוזום ולהימצא חופשיים בציטופלסמה של המקרופאגים החד-גרעיניים בדם ההיקפי האנושי29. היכולת של טריכודרמה להפחית את הייצור של מיני חמצן וחנקן תגובתיים עשויה גם לתרום להישרדות של קונידיה בתוך הפאגוזום ולהסביר את הכדאיות לאחר פגוציטוזה 28,29,36. עד כה, הראינו כי קונידיה phagocytosed להישאר קיימא והם מסוגלים לגדול בתווך PDA גם לאחר 120h. מיקרואורגניזמים אחרים דווחו גם לשרוד לאחר בליעה על ידי מקרופאגים, כגון Aspergillus27,37 ו Cryptococcus38.

Figure 3
איור 3: יכולת פינוי של מקרופאגים חד-גרעיניים מדם היקפי אנושיים שמקורם ב-T. stromaticum conidia. לאחר אתגר עם T. stromaticum conidia (3 שעות, 24 שעות, 48 שעות, 72 שעות, 96 שעות או 120 שעות) המקרופאגים שמקורם ב-PBMC עברו ליזה, והתרחיף היה מצופה ב-PDA כדי להעריך את הכדאיות של הקונידיה. (A) מוצגות תוצאות מייצגות של צמיחת T. stromaticum לאחר פגוציטוזה על ידי מקרופאגים שמקורם ב-PBMC. ניטור (B) צמיחת T. stromaticum ו-(C) קונידיציה בימים שונים עבור הבקרה החיובית עם T. stromaticum ב-PBS (ראה שלב 5.2.5), הבקרה עבור תווך R10 (ראה שלב 5.1.2), ו-conidia phagocytosed על ידי מקרופאגים לפרקי זמן שונים (3 שעות, 24 שעות, 48 שעות, 72 שעות, 96 שעות, 120 שעות). תוצאות מייצגות מארבעה תורמים בריאים. ממוצע ± סטיית תקן (SD). מבחן קרוסקל-ואליס. הסמל # מציין מובהקות ב - p < 0.05, n = 4. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

עבור מספר פתוגנים פטרייתיים, כולל Aspergillus fumigatus, Cryptococcus, Candida albicans, ואחרים, phagocytosis conidial או שמרים הוא תהליך מפתח המאפשר לחקור את האירועים cytoplasmic ומולקולרי באינטראקציות מקרופאג פתוגן, כמו גם לקביעת זמן המוות של conidiaמופנם 14,39,40. פגוציטוזה היא תהליך המפתח באינטראקציה טריכודרמה מארח. סוג טריכודרמה מווסת מספר מסלולי פאגוציטוזה, כולל Dectin-1 ו-Dectin-2, קולטן דמוי אגרה 2 וקולטן דמוי אגרה 4, MHC ו-NF-κB 25,28,41,42,43. Trichoderma לגרום trichodermosis אצל אנשים מדוכאי חיסון ולא מדוכאי חיסון9. חשוב לציין, מספר מינים של סוג זה משמשים בחקלאות והם המקור הפוטנציאלי של Trichodermosis. הבנת גורמי האלימות של T. stromaticum ומנגנון התגובה החיסונית בגוף האדם נגד פטריות אלה נחוצה בדחיפות, שכן סיכונים תעסוקתיים הנגרמים על ידי מיני Trichoderma, כולל T.stromaticum, עולים באופן מדאיג. השיטה המוצגת כאן מספקת פרטים לביצוע בדיקת פאגוציטוזה והריגה לחקר האינטראקציה טריכודרמה מקרופאגים במקרופאגים היקפיים אנושיים שמקורם בדם; עם זאת, שיטה זו יכולה לשמש גם לחקר מקרופאגים מרקמות שונות, כולל מקרופאגים מכתשית, פריטוניאלית או שושלת.

השלב הראשון בפרוטוקול זה מתחיל בהשעיית ציר אם (M1) כדי לקבל תרביות טריות של הפטרייה. תרביות טריכודרמה גדלות מהר, מכיוון שהן בדרך כלל משתלטות על הצלחת כולה ומתחילות להראות קונידיה בצבע ירוק תוך 5 ימים. הטמפרטורה והאור הם גורמים מכריעים לצמיחת טריכודרמה ושינויים בגורמים אלה יכולים להשפיע על הקינטיקה של טריכודרמה ולפגוע בניסוי44.

לאחר שטיפת תרבית T. stromaticum, נפח סופי בין 5-8 מ"ל צריך להיות התאושש. עוצמת הצבע של המתלה פרופורציונלית לריכוז הקונידיאה. תרחיף הקונידיה המתקבל יכול לשמש לבדיקות in vitro ו- in vivo, כגון להערכת פגוציטוזה26, מלכודות חוץ-תאיות נויטרופילים28, חשיפה תוך אפית36,41, חשיפה תוך צפקית26, זיהום תוך עורי45 וזיהום תוך ורידי46. מחקרים קודמים שנערכו עם מקרופאגים אנושיים העריכו את האוטופגיה הנגרמת על ידי טריכודרמה29 ואת יכולתו של הסוג לעכב היווצרות מלכודות חוץ-תאיות בנויטרופילים28, שהוא מנגנון המשמש לסילוק פתוגנים פטרייתיים ומיקרואורגניזמים אחרים.

חשוב לציין שאמצעי התרבית המשמש לתחזוקת התאים יכול להשפיע על נביטה קונידיאלית (איור 3G,H). אם הנביטה אינה רצויה עבור ניסוי מסוים, אנו ממליצים לבצע בדיקת סינון ראשונית עם מדיום תרבית התא כדי לקבוע את קינטיקה הצמיחה של Trichoderma באותו מדיום מסוים. בדיקה זו צריכה להתבצע לפני תחילת הניסויים במבחנה עם שושלת התאים הרצויה, ואת הניסוי יש להפסיק לאחר 72 שעות אם המדיום נמצא לא תואם. ניתן לצפות בנביטה של Trichoderma conidia (איור 3G,H) מ-96 שעות בתוך המקרופאגים ומחוצה להם.

מכיוון שמינים של טריכודרמה מציגים הבדלים במורפולוגיה ובטמפרטורה וב-pH האופטימליים לגידולם, ייתכן שהתוצאות המוצגות כאן לא יהיו ניתנות לשחזור עבור כל המינים בסוג, ופרוטוקול זה עשוי להזדקק להתאמות כאשר הוא מבוצע עם מינים אחרים. לדוגמה, Trichoderma asperelloides conidia לנבוט מהר יותר בתרבות מאשר אלה של T. stromaticum.

פרוטוקולים מתועדים קודמים להערכת פגוציטוזה והריגת הפתוגן באמצעות ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופ פלואורסצנטי דורשים ריאגנטים יקרים, אך הם מספקים מידע ספציפי על תהליך הפאגוציטוזה19. הפרוטוקול המוצג במאמר זה דורש רק מיקרוסקופ אופטי וצמיחת לוחות כדי להעריך פגוציטוזה ומספק תמונות מקיפות של תהליך הפאגוציטוזה. ניתן להשתמש בפרוטוקולים שונים כדי להשיג מקרופאגים מובחנים ולגרום לליזה של מקרופאגים. פרוטוקולים אלה כוללים שימוש בזמנים שונים להתמיינות מקרופאגים במקום 7 הימים הנהוגים כאן26 או שימוש ב-2.5% דאוקסיכולאט47 כדי ליזה את המקרופאגים במקום מים מזוקקים ב-37°C ו-5%CO2 למשך 30 דקות, כפי שנעשה בו שימוש כאן בפרוטוקול זה. שיטות אלה שימשו ביעילות עבור מינים פטרייתיים שונים כגון A. fumigatus27, A. nidulans18, ו - Cryptococcus neoformans15.

חלק מהמגבלות של פרוטוקול זה קשורות לשימוש ב-PBS שאינו נטול אנדוטוקסין, לשימוש בכיסויי זכוכית עגולים ולשימוש בדם אנושי. אנו ממליצים לבדוק PBS (לא נטול אנדוטוקסין) על תאים כדי לוודא שהוא לא יכול להפעיל את המונוציטים ולהטות את הניסוי. השימוש בכיסויי זכוכית עגולים שימושי מאוד להכתמה ולספירה של התאים, אך התאים עשויים שלא להתפשט באופן שווה מתחת לשקופית, מכיוון שחלק מהתאים נודדים היטב לקצה הצלחת, והבדל זה עשוי להשפיע על מספר התאים הכולל המשוער בכיסויי הזכוכית העגולים. מכיוון שאיננו משתמשים באימונופלואורסצנטיות או בטכניקות דומות בפרוטוקול זה, נוכחות של קונידיה לא פגוציטוזה במישור העליון בהשוואה למקרופאגים עלולה להוביל לפרשנות שגויה של תוצאות הפאגוציטוזה. כאשר אנו משתמשים בדם מתורמים אנושיים, ספירת PBMC הסופית משתנה בין תורמים, וספירת תאי תורם נמוכה עשויה שלא להספיק לכל הניסויים.

לסיכום, ניתן להשתמש בטכניקות אלה כדי למדוד את תפקודם של מקרופאגים ואת פינוי הפטריות, במיוחד עבור פטריות נימה כגון טריכודרמה ומיקרובים אחרים, כגון שמרים וחיידקים. יתר על כן, פרוטוקול זה מספק כיוונים עתידיים לחקר שונות אמיתית בתגובה החיסונית נגד פטריות יוצרות קונידיה באוכלוסיות אנושיות, שלא ניתן לצפות בהן באמצעות מודלים איזוגניים של בעלי חיים או קווי תאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

כל המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מוסדות המימון הברזילאים הבאים: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) עם מענקים RED0011/2012 ו- RED008/2014. U.R.S., J.O.C. ו- M.E.S.M. מכירים במלגה המוענקת על ידי Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) ו- FAPESB, בהתאמה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL centrifuge tubes Corning CLS431470 15 mL centrifuge tubes, polypropylene, conical bottom with lid, individually sterile
24-Well Flat Bottom Cell Culture Plate Kasvi K12-024 Made of polystyrene with alphanumeric identification; The Cell Culture Plate is DNase, RNase and pyrogen-free and free of cytotoxic substances; Sterilized by gamma radiation;
Cell culture CO2 incubator Sanyo 303082 A CO2 incubator serves to create and control conditions similar to a human body, thus allowing the in vitro growth and proliferation of different cell types.
Centrifuge Microtube (eppendorf type) 1.5 mL Capp 5101500 Made from polypropylene, with a cap attached to the tube for opening and closing with just one hand. It has a polished interior against protein adhesion and for sample visibility, being free of DNase, RNase and Pyrogens
Circular coverslip 15 mm Olen K5-0015 Circular coverslips are used for microscopy techniques in cell culture. Made of super transparent translucent glass; with thickness of 0.13 mm
Class II Type B2 (Total Exhaust) Biosafety Cabinets Esco Lifesciences group 2010274 Airstream Class II Type B2 Biosafety Cabinets (AB2) provide product, operator and environmental protection and are suitable for work with trace amounts of toxic chemicals and agents assigned to biological safety levels I, II or III. In a Class II Type B2 cabinet, all inflow and downflow air is exhausted after HEPA/ULPA filtration to the external environment without recirculation across the work surface.
Dextrose Potato Agar medium Merck 145 Potato Dextrose Agar is used in the cultivation and enumeration of yeasts and fungi
EDTA vacuum blood collection tube FirstLab FL5-1109L EDTA is the recommended anticoagulant for hematology routines as it is the best anticoagulant for preserving cell morphology.
Entellan Merck 1.07961  Fixative agent; Entellan is a waterless mounting medium for permanent mounting for microscopy.
Fetal Bovine Serum Gibco A2720801 Fetal bovine serum (FBS) is a universal growth supplement of cell and tissue culture media. FBS is a natural cocktail of most of the factors required for cell attachment, growth, and proliferation, effective for most types of human and animal (including insect) cells.
Flaticon  database of images
Glycerol Merck 24900988 The cryoprotectant agent glycerol is used for freezing cells and spores
Histopaque-1077 polysucrose solution
Image J  Image analysis software
Microscopy slides Precision 7105 Slide for Microscopy 26 x 76 mm Matte Lapped Thickness 1.0 to 1.2 mm. Made of special optical glass and packaged with silk paper divider with high quality transparency free of imperfections
Mini centrifuge Prism C1801 The Prism Mini Centrifuge was designed to be extremely compact with an exceptionally small footprint. Includes 2 interchangeable quick-release rotors that spin up to 6000 rpm. An electronic brake provides quick deceleration and the self-opening lid allows easy access to the sample, reducing handling time.
Neubauer chamber Kasvi K5-0011 The Neubauer Counting Chamber is used for counting cells or other suspended particles.
Panoptic fast  Laborclin 620529 Laborclin's  panoptic fast c is a kit for quick staining in hematology
Penicillin/Streptomycin Solution - 10,000U LGC- Biotechnology  BR3011001 antibiotic is used in order to avoid possible contamination by manipulation external to the laminar flow.
Petri dish 90 x 15 mm Smooth Cralplast 18248 Disposable Petri dish; Made of highly transparent polystyrene (PS); flat bottom; Smooth;Size: 90 x 15 mm.
Phosphate buffered saline (PBS) thermo fisher Scientific 10010001 PBS is a water-based saline solution with a simple formulation. It is isotonic and non-toxic to most cells. It includes sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock while maintaining the water balance of living cells.
Pipette Pasteur 3 mL Sterile Accumax AP-3-B-S STERILE ACCUMAX PASTEUR 3 ML PIPETTE with 3 mL capacity, made of transparent low-density polyethylene (LDPE) and individually sterile
Refrigerated Centrifuge Thermo Scientific TS-HM16R The Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R Refrigerated Centrifuge is a refrigerated centrifuge with the user-friendly control panel makes it easy to pre-set the speed, RCF value, running time, temperature, and running profile. The Megafuge 16R can reach maximum speeds of 15,200 RPM and maximum RCF of 25,830 x g.
RPMI-1640 Medium Merck MFCD00217820 HEPES Modification, with L-glutamine and 25 mM HEPES, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture
The single channel micropipettes Eppendorf Z683809 Single-channel micropipettes are used to accurately transfer and measure very small amounts of liquids.
Tip for Micropipettor Corning 4894 Capacity of 10 µL and 1,000 µL Autoclavable
Triocular inverted microscope LABOMED VU-7125500 It allows you to observe cells inside tubes and bottles, without having to open them, thus avoiding contamination problems.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Samuels, G. J. Trichoderma: A review of biology and systematics of the genus. Mycological Research. 100 (8), 923-935 (1996).
  2. Nevalainen, H., Peterson, R. Chapter 7 - Heterologous expression of proteins in Trichoderma. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  3. Do Vale, L. H. F., Filho, E. X. F., Miller, R. N. G., Ricart, C. A. O., de Sousa, M. V. Chapter 16 - Cellulase systems in Trichoderma: An overview. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  4. Ferreira, N. L., Margeot, A., Blanquet, S., Berrin, J. G. Chapter 17 - Use of cellulases from Trichoderma reesei in the twenty-first century part I: Current industrial uses and future applications in the production of second ethanol generation. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  5. Puranen, T., Alapuranen, M., Vehmaanperä, J. Chapter 26 - Trichoderma enzymes for textile industries. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  6. Kunamneni, A., Plou, F. J., Alcalde, M., Ballesteros, A. Chapter 24 - Trichoderma enzymes for food industries. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  7. Mukherjee, P. K., Horwitz, B. A., Herrera-Estrella, A., Schmoll, M., Kenerley, C. M. Trichoderma research in the genome era. Annual Review of Phytopathology. 51 (1), 105-129 (2013).
  8. Mukherjee, M., et al. Trichoderma-plant-pathogen interactions: Advances in genetics of biological control. Indian Journal of Microbiology. 52 (4), 522-529 (2012).
  9. dos Santos, U. R., dos Santos, J. L. Trichoderma after crossing kingdoms: Infections in human populations. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B. 26 (2), 97-126 (2023).
  10. Asis, A., et al. Identification patterns of Trichoderma strains using morphological characteristics, phylogenetic analyses and lignocellulolytic activities. Molecular Biology Reports. 48 (4), 3285-3301 (2021).
  11. Antal, Z., et al. Comparative study of potential virulence factors in human pathogenic and saprophytic Trichoderma longibrachiatum strains. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. 52 (3-4), 341-350 (2005).
  12. Hatvani, L., Manczinger, L., Vágvölgyi, C., Kredics, L. Trichoderma as a human pathogen. Trichoderma: Biology and Applications. Mukherjee, P. K., Horwitz, B. A., Singh, U. S., Mukherjee, M., Schmoll, M. , Wallingford, UK. (2013).
  13. Kredics, L., et al. Clinical importance of the genus Trichoderma: A review. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. 50 (2-3), 105-117 (2003).
  14. Erwig, L. P., Gow, N. A. R. Interactions of fungal pathogens with phagocytes. Nature Reviews Microbiology. 14 (3), 163-176 (2016).
  15. Nicola, A. M., Casadevall, A. In vitro measurement of phagocytosis and killing of Cryptococcus neoformans by macrophages. Methods in Molecular Biology. 844, 189-197 (2012).
  16. Medina, E., Goldmann, O. In vivo and ex vivo protocols for measuring the killing of extracellular pathogens by macrophages. Current Protocols in Immunology. , Chapter 14, Unit 14 1-17 (2011).
  17. Drevets, D. A., Canono, B. P., Campbell, P. A. Measurement of bacterial ingestion and killing by macrophages. Current Protocols in Immunology. 109, 1-17 (2015).
  18. Gresnigt, M. S., et al. Differential kinetics of Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus phagocytosis. Journal of Innate Immunity. 10 (2), 145-160 (2018).
  19. Steinberg, B. E., Grinstein, S. Analysis of macrophage phagocytosis: Quantitative assays of phagosome formation and maturation using high-throughput fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 531, 45-56 (2009).
  20. Yan, Q., Ahn, S. H., Fowler, V. G. Macrophage phagocytosis assay of Staphylococcus aureus by flow cytometry. Bio-Protocol. 5 (4), 1406 (2015).
  21. Marr, K. A., Koudadoust, M., Black, M. Early events in macrophage killing of Aspergillus fumigatus conidia New flow cytometric viability assay. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1240-1247 (2001).
  22. Surewaard, B. G. J., Kubes, P. Measurement of bacterial capture and phagosome maturation of Kupffer cells by intravital microscopy. Methods. 128, 12-19 (2017).
  23. Siggins, M. K., et al. Differential timing of antibody-mediated phagocytosis and cell-free killing of invasive African Salmonella allows immune evasion. European Journal of Immunology. 44 (4), 1093-1098 (2014).
  24. Cannon, G. J., Swanson, J. A. The macrophage capacity for phagocytosis. Journal of Cell Science. 101 (4), 907-913 (1992).
  25. Harvath, L., Terle, D. A. Assay for phagocytosis. Methods in Molecular Biology. 115, 281-290 (1999).
  26. dos Santos, A. G., et al. Trichoderma asperelloides spores downregulate dectin1/2 and TLR2 receptors of mice macrophages and decrease Candida parapsilosis phagocytosis independent of the M1/M2 polarization. Frontiers in Microbiology. 8, 1681 (2017).
  27. Souza, J. A. M., et al. Characterization of Aspergillus fumigatus extracellular vesicles and their effects on macrophages and neutrophils functions. Frontiers in Microbiology. 10, 2008 (2019).
  28. Oliveira-Mendonça, L. S., et al. Inhibition of extracellular traps by spores of Trichoderma stromaticum on neutrophils obtained from human peripheral blood. Molecular Immunology. 141, 43-52 (2022).
  29. Oliveira-Mendonça, L. S., et al. Trichoderma stromaticum spores induce autophagy and downregulate inflammatory mediators in human peripheral blood-derived macrophages. Current Research in Microbial Sciences. 3, 100145 (2022).
  30. Johnston, L., Harding, S. A., La Flamme, A. C. Comparing methods for ex vivo characterization of human monocyte phenotypes and in vitro responses. Immunobiology. 220 (12), 1305-1310 (2015).
  31. Abedon, S. T., Bartom, E. Multiplicity of infection. Brenner's Encyclopedia of Genetics. Second Edition. Maloy, S., Hughes, K. , Academic Press. Cambridge, MA. (2013).
  32. Rios, F. J., Touyz, R. M., Montezano, A. C. Isolation and differentiation of human macrophages. Methods in Molecular Biology. 1527, 311-320 (2017).
  33. Lombard, Y., Giaimis, J., Makaya-Kumba, M., Fonteneau, P., Poindron, P. A new method for studying the binding and ingestion of zymosan particles by macrophages. Journal of Immunological Methods. 174 (1-2), 155-165 (1994).
  34. Ghoneum, M., Gollapudi, S. Phagocytosis of Candida albicans by metastatic and non metastatic human breast cancer cell lines in vitro. Cancer Detection and Prevention. 28 (1), 17-26 (2004).
  35. Nunes, J. P. S., Dias, A. A. M. ImageJ macros for the user-friendly analysis of soft-agar and wound-healing assays. BioTechniques. 62 (4), 175-179 (2017).
  36. Alves-Filho, E. R., et al. The biocontrol fungus Trichoderma stromaticum downregulates respiratory burst and nitric oxide in phagocytes and IFN-gamma and IL-10. Journal of Toxicology and Environmental Health - Part A: Current Issues. 74 (14), 943-958 (2011).
  37. Slesiona, S., et al. Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages. PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).
  38. Johnston, S. A., May, R. C. Cryptococcus interactions with macrophages: Evasion and manipulation of the phagosome by a fungal pathogen. Cellular Microbiology. 15 (3), 403-411 (2013).
  39. Alonso, M. F., et al. The nature of the fungal cargo induces significantly different temporal programmes of macrophage phagocytosis. The Cell Surface. 8, 100082 (2022).
  40. Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. Interaction of phagocytes with filamentous fungi. Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).
  41. Dos Santos, U. R., et al. Exposition to biological control agent Trichoderma stromaticum increases the development of cancer in mice injected with murine melanoma. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 252 (2020).
  42. Wang, G., et al. Exopolysaccharide from Trichoderma pseudokoningii induces macrophage activation. Carbohydrate Polymers. 149, 112-120 (2016).
  43. Xu, Y., et al. Exopolysaccharide from Trichoderma pseudokoningii promotes maturation of murine dendritic cells. International Journal of Biological Macromolecules. 92, 1155-1161 (2016).
  44. Schmoll, M., Esquivel-Naranjo, E. U., Herrera-Estrella, A. Trichoderma in the light of day - Physiology and development. Fungal Genetics and Biology. 47 (11), 909-916 (2010).
  45. Zhang, G., Li, D. Trichoderma longibrachiatum-associated skin inflammation and atypical hyperplasia in mouse. Frontiers in Medicine. 9, 865722 (2022).
  46. Paredes, K., Capilla, J., Mayayo, E., Guarro, J. Virulence and experimental treatment of Trichoderma longibrachiatum, a fungus refractory to treatment. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (8), 5029-5032 (2016).
  47. Perkhofer, S., Speth, C., Dierich, M. P., Lass-Flörl, C. In vitro determination of phagocytosis and intracellular killing of Aspergillus species by mononuclear phagocytes. Mycopathologia. 163 (6), 303-307 (2007).

Tags

בדיקת כדאיות Trichoderma stromaticum Conidia מקרופאגים חד-גרעיניים בדם היקפי אנושי פגוציטוזה אינטראקציות מקרופאגים-פתוגנים תגובות חיסוניות נגד פטריות בריחת פגוזום אלימות פטרייתית סוכן הדברה ביולוגית סוכן דשן ביולוגי זיהומים אנושיים תרבית טריכודרמה (Trichoderma) קונידיה שוטפת תאים חד-גרעיניים היקפיים בדם (PBMCs) התמיינות מקרופאגים שיטת פגוציטוזה חוץ גופית בדיקת סילוק יעילות פינוי פטריות
בדיקת כדאיות של <em>Trichoderma stromaticum</em> conidia בתוך מקרופאגים חד-גרעיניים בדם היקפי אנושי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

dos Santos, U. R., de Castro, J. O., … More

dos Santos, U. R., de Castro, J. O., Santos Matos, M. E., De Bonis, G., dos Santos, J. L. Viability Assay of Trichoderma stromaticum Conidia Inside Human Peripheral Blood Mononuclear-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (200), e65231, doi:10.3791/65231 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter