Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Анализ жизнеспособности конидий Trichoderma stromaticum в мононуклеарных макрофагах периферической крови человека

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65231
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Laboratory of Immunobiology - Department of Biological Sciences, State University of Santa Cruz - UESC, 2Università Degli Studi di Genova
* These authors contributed equally

Summary

Методика фагоцитоза грибковых конидий макрофагами широко используется для исследований, оценивающих модуляцию иммунных реакций против грибов. Целью данной статьи является представление метода оценки фагоцитоза и клиренсных способностей мононуклеарных макрофагов периферической крови человека, стимулированных конидиями Trichoderma stromaticum .

Abstract

Макрофаги представляют собой важнейшую линию защиты и отвечают за предотвращение роста и колонизации патогенов в различных тканях. Конидиальный фагоцитоз является ключевым процессом, позволяющим исследовать цитоплазматические и молекулярные события, участвующие в макрофагально-патогенных взаимодействиях, а также определять время гибели интернализованных конидий. Методика фагоцитоза грибковых конидий макрофагами широко используется для исследований, оценивающих модуляцию иммунных реакций против грибов. Уклонение от фагоцитоза и ускользание фагосом являются механизмами вирулентности грибов. Здесь мы сообщаем о методах, которые могут быть использованы для анализа фагоцитоза, клиренса и жизнеспособности T. stromaticum conidia, гриба, который используется в качестве агента биоконтроля и биоудобрения и способен вызывать инфекции человека. Протокол состоит из: 1) культивирования триходермы , 2) промывки для получения конидий, 3) выделения мононуклеарных клеток периферической крови (МПКМ) методом раствора полисахарозы и дифференцировки МПМК в макрофаги, 4) метода фагоцитоза in vitro с использованием круглых стеклянных покровных стекол и окраски, и 5) анализа клиренса для оценки жизнеспособности конидий после фагоцитоза конидий. Таким образом, эти методы могут быть использованы для измерения эффективности выведения макрофагов из грибков.

Introduction

Род Trichoderma (Отряд: Hypocreales, Семейство: Hypocreaceae) состоит из вездесущих сапрофитных грибов, которые являются паразитами других видов грибов и способны продуцировать ряд коммерчески полезных ферментов1. Эти виды грибов используются для производства гетерологичных белков2, производства целлюлозы3, этанола, пива, вина и бумаги4, в текстильной промышленности5, пищевой промышленности6 и в сельском хозяйстве в качестве агентов биологического контроля 7,8. В дополнение к промышленному интересу к этим грибковым видам, растущее число инфекций у людей придало некоторым видам Trichoderma статус условно-патогенных микроорганизмов.

Trichoderma spp. быстро растет в культуре, с первоначально белыми и хлопковыми колониями, которые становятся зеленовато-желтыми или темно-зелеными10. Они приспособлены к жизни в широком диапазоне рН и температурных условий, а условно-патогенные виды способны выживать при физиологических рН и температурах и, таким образом, колонизировать различные ткани человека 11,12,13. Важно отметить, что рост заболеваемости Trichoderma spp. может быть связан с факторами вирулентности, а они недостаточно изучены. Кроме того, исследования, направленные на понимание иммунного ответа против условно-патогенных видов Trichoderma, все еще редки.

Во время инфекции, наряду с нейтрофилами, макрофаги представляют собой линию защиты, отвечающую за фагоцитоз, и, таким образом, препятствуют росту и колонизации возбудителей в различных тканях. Используя рецепторы распознавания образов, такие как Toll-подобные рецепторы и лектиновые рецепторы C-типа, макрофаги фагоцитозируют грибы и перерабатывают их в фаголизосомы, тем самым способствуя дыхательному взрыву, высвобождению провоспалительных цитокинов и уничтожению фагоцитозированных микроорганизмов14. Механизм фагоцитоза, однако, может быть затронут и уклонен от различных микробных стратегий, таких как размер и форма грибковых клеток; наличие капсул, препятствующих фагоцитозу; уменьшение количества рецепторов, индуцирующих фагоцитоз; ремоделирование структуры актиновых волокон в цитоплазме; препятствующие образованию псевдоподий; и фагосома или фаголизосома ускользают после процесса фагоцитоза14.

Многие патогены, в том числе Cryptococcus neoformans, используют макрофаги в качестве ниши для выживания в организме хозяина, распространения и индуцирования инфекции15. Анализ фагоцитоза и клиренса используется для оценки иммунного ответа против патогенов и определения микробных стратегий, используемых для уклонения от врожденной иммунной системы 15,16,17. Этот тип метода также может быть использован для изучения дифференциальной кинетики фагоцитоза, замедленного закисления фагосом и окислительного взрыва, которые приводят к уменьшению гибели грибков18.

Различные методы могут быть использованы для оценки фагоцитоза, выживаемости грибов и уклонения от процесса созревания фагосом. К ним относятся флуоресцентная микроскопия, которая используется для наблюдения за фагоцитозом, расположением клеток и молекулами, образующимися во время фагоцитоза19; проточная цитометрия, которая дает количественные данные о фагоцитозе и используется для оценки различных маркеров, участвующих в процессе20,21; прижизненная микроскопия, которая используется для оценки микробного захвата и созревания фагосом22; антитело-опосредованный фагоцитоз, который используется для оценки специфичности процесса фагоцитоза для возбудителя23; и другие 24,25,26,27.

Протокол, представленный здесь, использует обычный, недорогой и прямой метод с использованием оптического микроскопа и анализа роста пластин для оценки фагоцитоза и гибели грибковых конидий. Этот протокол предоставит читателям пошаговую инструкцию по проведению анализа фагоцитоза и клиренса с использованием мононуклеарных макрофагов периферической крови человека, подвергшихся воздействию T. stromaticum. ПБМК были использованы в связи с тем, что конидии Trichoderma применяются в качестве биоконтроля против фитопатогенов и биоудобрения для растительных культур во всем мире и вызывают несколько инфекций человека, называемых триходермозами. Кроме того, существует только две предыдущие работы, посвященные взаимодействию между конидиями Trichoderma и иммунной системой человека, в которых мы изучали нейтрофилы28 и аутофагию у макрофагов29. В данной статье сначала показано, как можно изучать фагоцитоз конидий T. stromaticum макрофагами, полученными из PBMC, а затем как можно оценить жизнеспособность поглощенных конидий с помощью простых методов, основанных на микроскопии. Этот протокол может способствовать дальнейшему изучению макрофаг-ассоциированного иммунного ответа или механизмов, связанных с модуляцией иммунной системы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Этические соображения и люди-субъекты
Все эксперименты на людях, описанные в этом исследовании, были проведены в соответствии с Хельсинкской декларацией и федеральными законами Бразилии и одобрены Комитетом по этике Государственного университета Санта-Крус (идентификационный код проекта: 550.382/2014).

Периферическая кровь человека была собрана у здоровых добровольцев из города Ильеус, штат Баия, Бразилия, не подвергавшихся профессиональной деятельности, связанной с изучаемым грибком. Лица, у которых сообщалось о заболеваниях или принимающих лекарства, были исключены. Все испытуемые добровольно согласились принять участие и подписали форму информированного согласия перед включением в это исследование.

1. Приготовление реагентов и растворов

ПРИМЕЧАНИЕ: Прежде чем продолжить, подготовьте следующие реагенты и растворы. Информацию о поставщиках реагентов и материалов см. в Таблице материалов (TOM).

  1. Приготовьте сбалансированный стерильный фосфатно-буферный солевой раствор 1x (PBS).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе ПБС, не содержащая эндотоксинов, не использовалась.
  2. Приготовьте среду из картофельного декстрозного агара (КПК) и влейте по 20 мл в каждую чашку Петри для культуры T. stromaticum . Подготовьте шесть планшетов с КПК для каждого донора и используйте по одной пластине для каждого состояния: 3 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч, 96 ч и 120 ч. Кроме того, используйте три пластины для каждого контроля: три для контроля триходермы и три для контроля среды R10. Используйте чашки Петри размером 60 мм x 15 мм или 100 мм x 15 мм для оптимального извлечения конидий.
  3. Стерилизовать 100% глицерин.
  4. Приготовьте среду R10 для клеточной культуры: среду RPMI с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% антибиотика (пенициллин/стрептомицин).
  5. Стерилизуйте дистиллированную воду для лизиса клеток.
  6. Подготовьте воду с рН 7,0 для процесса окрашивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости отрегулируйте рН с помощью рН-метра и растворов 0,1 М/л NaOH и 0,1 М/л HCl.
  7. Простерилизуйте круглый стеклянный покровный стекло (13 мм) и пинцетом.

2. Культивирование и обработка Trichoderma stromaticum

  1. Подготовка маточного подвоя (М1) T. stromaticum:
    ПРИМЕЧАНИЕ: Маточное поддвое (M1) необходимо для того, чтобы убедиться, что все эксперименты проводятся на культуре одного и того же свежего поколения (F1).
    1. Выращивают посевной материал T. stromaticum в чашках Петри с КПК при температуре 28 °С в темноте в течение 7-10 дней, пока не будут наблюдаться конидии и культура не позеленеет.
    2. Промойте культуру T. stromaticum. Добавьте 3-5 мл PBS на поверхность культуры с помощью пипетки. Соберите PBS с планшета и снова распределите его по культуре, чтобы постепенно удалить конидии с помощью пипетки. Повторяйте этот процесс столько, сколько необходимо, пока суспензия не станет темно-зеленой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы рекомендуется осторожное промывание культуры путем добавления 3-5 мл PBS в планшет с последующим выполнением круговых движений до тех пор, пока суспензия не станет зеленой, чтобы восстановить конидии. При повторном пипетировании можно собрать больше конидий.
    3. Переложите восстановленную суспензию с планшета в стерильную пробирку объемом 15 мл с помощью пипетки. Повторите шаги 2.1.2-2.1.3 столько раз, сколько необходимо, чтобы получить больше конидий.
    4. Центрифугируют суспензию при 1,160 x g в течение 5 мин при 12 °C и повторно суспендируют гранулы в 5 мл PBS. Повторите этот шаг (2.1.4) три раза, чтобы получить суспензию без гиф.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для правильного ресуспендирования гранулы после центрифугирования рекомендуется кратковременное вихрь.
    5. Ресуспендант готовой гранулы в 2-3 мл PBS и подсчитайте конидии в камере Нойбауэра, используя разведение 1:100 или 1:1000.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В оптимальных условиях окончательная концентрация 2 x 108 конидий/мл может быть извлечена из культуры. Оценка жизнеспособности конидий с помощью метода исключения трипанового синего не является обязательной.
    6. Распределите суспензию по 1,5 мл в стерильные пробирки, добавив в каждую пробирку 0,5 мл суспензии конидий (с шага 2.1.5). Затем добавьте 0,5 мл стерильного 100% глицерина, чтобы получить запасы М1. Кратковременно встряхните, определите трубки и храните при температуре −20 °C или −80 °C.
  2. Культивирование T. stromaticum и получение конидий для эксперимента
    1. Планшет 10 мкл суспензии М1 (приготовленной на этапе 2.1) помещают в КПК при 28 °С в темноте в течение 7-10 дней до появления конидий и зеленеющей культуры для получения свежего поколения F1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить свежую культуру T. stromaticum для эксперимента, оцените время, необходимое для роста гриба, и время, необходимое для дифференцировки макрофагов.
    2. Соберите конидии, повторив шаги 2.1.2-2.1.4.
    3. Ресуспендируйте конечную гранулу в 2-3 мл PBS. Оцените жизнеспособность конидий с помощью метода исключения трипанового синего или подсчитайте конидии, как указано в шаге 2.1.5.

3. Выделение мононуклеарных клеток периферической крови (МПКМ)

ПРИМЕЧАНИЕ: PBMC получают методом барьера плотности с использованием раствора полисахарозы плотностью 1,077 г/мл30.

  1. Аликвота 15 мл раствора полисахарозы на одну пробирку объемом 50 мл для каждого донорского образца, который будет взят.
  2. Возьмите 20 мл крови у каждого донора, используя три-четыре пробирки с ЭДТА. Привлекайте не менее четырех доноров для каждого эксперимента. Не объединяйте кровь доноров; Вместо этого используйте каждый образец отдельно в качестве биологической реплики. Для каждого донора переведите кровь в одну пробирку объемом 50 мл и добавьте PBS, чтобы получить окончательный объем 35 мл.
  3. Медленно перенесите кровяную суспензию (шаг 3.2) вдоль стенки пробирки, содержащей раствор полисахарозы (шаг 3.1), чтобы образовалась двухфазная суспензия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить смешивание крови с раствором полисахарозы, добавляйте кровь медленно. Рекомендуется использовать не менее 7 мл крови от каждого донора для выделения PBMC.
  4. Немедленно центрифугируйте пробирку, содержащую двухфазную суспензию, при 1 600 x g в течение 30 мин при 24 °C. Запрограммируйте центрифугирование PBMC: используйте ускорение 1 и замедление 0, чтобы избежать резкой остановки центрифугирования.
  5. Наблюдайте за образованием белого кольца, содержащего МПМК после центрифугирования. Эритроциты и гранулоциты находятся в нижнем слое, следующий слой содержит раствор полисахарозы, а МПМК находятся в белом кольце между раствором полисахарозы и плазмой (верхний слой). Соберите белое кольцо, осторожно аспирируя с помощью пипетки или стерильной пипетки Пастера, чтобы не поймать эритроциты, плазму или раствор полисахарозы, и переложите в одну пробирку объемом 15 мл.
  6. Добавьте PBS в пробирку объемом 15 мл, содержащую PBMC, чтобы получить окончательный объем 10 мл. Гомогенизируйте суспензию и центрифугируйте пробирку при 1 600 x g в течение 30 мин при 24 °C.
  7. Промойте клетки три раза при концентрации 1 600 x g в течение 5 минут при 24 °C с 10 мл PBS. Затем повторно суспендируйте конечную гранулу в 2 мл среды R10.
  8. Оцените жизнеспособность клеток с помощью метода исключения трипанового синего и подсчитайте количество клеток в камере Нойбауэра.

4. Кинетика фагоцитоза

ПРИМЕЧАНИЕ: Мононуклеарные макрофаги периферической крови человека обрабатывают конидиями T. stromaticum при кратности инфекции (MOI) 1:10 или только средой R10 в качестве контроля. Кратность инфекции (MOI) представляет собой отношение инфекционных агентов, добавленных к целям заражения, и представлена в виде абсолютных чисел: MOI = агенты:мишени31. Здесь мы используем 1 T. stromaticum conidia (агент) для 10 макрофагов (мишеней). Затем клетки инкубируют при 37 °C и 5%CO2 в течение различных периодов времени (3 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч, 96 ч и 120 ч). Далее с помощью круглого стеклянного покровного стекла визуализируют под микроскопом адгезивные макрофаги, участвующие в процессе фагоцитоза. Приведена экспериментальная схема (рис. 1).

ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать 24-луночные планшеты.

  1. Лечение макрофагов человеческого происхождения конидиями T. stromaticum
    1. Добавьте стерильное круглое стеклянное покровное стекло (13 мм) в каждую лунку стерильным пинцетом.
    2. Отрегулируйте объем клеточной суспензии, полученной на шагах 3,7-3,8, до пластины 8 x 105 клеток на лунку до конечного объема 1 мл со средой R10. Используйте инвертированный микроскоп для оценки морфологии клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки должны быть взвешены в среде и иметь округлую морфологию.
    3. Инкубируют клетки при 37 °C в атмосфере 5%CO2 в течение 7 дней и заменяют среду свежей средой R10 каждые 2 дня для дифференцировки моноцитов в макрофаги32. Наблюдайте за морфологией клеток с помощью инвертированного микроскопа. Макрофаги будут иметь веретенообразную морфологию с уплощенными и вытянутыми формами; Также может наблюдаться повышенное цитоплазматическое соотношение и наличие псевдоподий. Ищите адгезивные мононуклеарные макрофаги.
      Примечание: Очень небольшая доля недифференцированных моноцитов может оставаться во взвешенном состоянии в среде.
    4. Удалите среду из каждой лунки с помощью пипетки и промойте клетки 1 мл PBS, чтобы удалить мусор и неприлипшие клетки.
    5. Суспензию, приготовленную на стадии 2.2, используют для приготовления новой суспензии конидий T. stromaticum в конечной концентрации 8 x 104 конидии/мл в среде R10.
    6. Добавляют 1 мл суспензии конидий, приготовленной на стадии 4.1.5, в каждую лунку для обработки (3 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч, 96 ч и 120 ч) до получения MOI 1:10. К контролю добавляют в лунку только 1 мл среды R10.
    7. Макрофаги в течение 3 ч подвергают воздействию конидий T. stromaticum при 37 °C в атмосфере 5%CO2 . Через 3 ч среду удалить и промыть клетки, чтобы удалить нефагоцитированные конидии.
    8. Добавьте 1 мл среды R10 в каждую лунку и инкубируйте планшет в течение разного времени (3 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч, 96 ч и 120 ч) при 37 °C в атмосфере 5%CO2 .
  2. Окрашивание и анализ
    1. Удалите среду из каждой лунки после завершения соответствующей инкубации (шаг 4.1.8) и добавьте в эту лунку 1 мл PBS.
    2. Извлеките круглые стеклянные покровные стекла из лунок с помощью стерильного пинцета и иглы для окрашивания с набором для окрашивания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно окрашивать с помощью краски May Grünwald-Giemsa33.
    3. К каждому из круглых стеклянных покровных листов добавьте пятнозакрепитель (5 с), краситель 1 (5 с), краситель 2 (2 с) и буферную воду pH 7,0 (5 с), которые являются компонентами набора для окрашивания. Подождите, пока они высохнут, и закрепите покровные стекла на предметном стекле с помощью монтажного средства.
    4. Количественная оценка результата: Подсчитайте в общей сложности 100 макрофагов (Mø) для каждого временного условия. С помощью оптического микроскопа подсчитывают количество макрофагов с фагоцитированными конидиями с помощью 100-кратного объектива и иммерсионного масла (уравнение [1]).
      Equation 1 (1)
    5. Получить число фагоцитированных конидий на один макрофаг: Соотнесите конидии, присутствующие в 100 макрофагах, деленное на число макрофагов по крайней мере с одним фагоцитированным конидием (уравнение [2])34.
      Equation 2 (2) См.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки и подсчета конидий можно использовать программное обеспечение ImageJ35.
    6. Сфотографируйте фагоцитоз из каждого образца и временных условий, используя 40-кратные и 100-кратные объективы, чтобы представить результаты.

Figure 1
Рисунок 1: Схематическое изображение анализа фагоцитоза и конидиальной жизнеспособности с использованием мононуклеарных макрофагов периферической крови человека. (1—10) Анализ на фагоцитоз: T. stromaticum должен быть выращен в PDA, а конидии извлекаются путем промывания планшета PBS. МПМК выделяют методом барьера плотности по описанному протоколу, культивируют в 24-луночные планшеты со стерильными круглыми стеклянными покровными стеклами в течение 7 дней для дифференцировки в макрофаги, а затем обрабатывают MOI 1:10 с различными временными интервалами. Круглые стеклянные покровные стекла удаляются и окрашиваются с помощью набора для окрашивания, а результаты анализируются с помощью световой микроскопии. (1-8,11-13) Анализ жизнеспособности конидий: После выделения PBMC культивируют в 24-луночных планшетах без круглых стеклянных покровных стекол в течение 7 дней для дифференцировки в макрофаги, а затем обрабатывают MOI 1:10 в течение различных временных интервалов. Клетки должны быть лизированы путем инкубации с дистиллированной водой; затем суспензию центрифугируют, а затем ресуспендированную гранулу покрывают ФДА для анализа кинетики роста триходермы. Эта фигура была разработана с использованием базы данных изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

5. Анализ конидиальной жизнеспособности после фагоцитоза

ПРИМЕЧАНИЕ: Приведена экспериментальная рисунка (Рисунок 1).

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 24-луночные планшеты.

  1. Бросьте вызов макрофагам человеческого происхождения с помощью конидий T. stromaticum .
    1. Повторите шаги 4.1.2-4.1.8 для дифференцировки моноцитов и обработки макрофагов конидиями T. stromaticum .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте круглые стеклянные покровные стекла в колодцах. Используйте те же интервалы времени, которые используются для определения кинетики фагоцитоза, чтобы фагоцитоз можно было коррелировать с жизнеспособностью конидий.
    2. Оценивают влияние среды R10 на рост T. stromaticum , используя в качестве контроля лунки со суспензией, приготовленной на стадии 4.1.5 (среда R10 + конидии).
  2. Анализ конидиальной жизнеспособности
    1. Удаляйте среду после каждого инкубационного периода (3 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч, 96 ч и 120 ч) и дважды промывают клетки PBS, чтобы удалить конидии, которые не были фагоцитированы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Контроль, содержащий среду R10 + конидии, не следует мыть.
    2. Добавьте 0,5 мл стерильной дистиллированной воды в каждую лунку и инкубируйте планшет при 37 °C и 5% CO2 в течение 30 мин. По истечении этого времени наблюдайте за морфологией клеток под инвертированным микроскопом, чтобы убедиться, что клетки были лизированы.
    3. Соберите суспензию и перелейте ее в пробирки по 1,5 мл. Центрифугируйте суспензию с помощью мини-центрифуги при 6 000 x g в течение 5 минут при комнатной температуре.
    4. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу в 10 мкл стерильной дистиллированной воды и засейте 10 мкл суспензии в пластину, содержащую КПК, при температуре 28 °C в темноте.
    5. Подготовьте положительный контроль роста T. stromaticum : используйте суспензию конидий T. stromaticum (шаг 2.2) для приготовления новой суспензии с конечной концентрацией 8 x 106 конидий/мл. Замочите 10 мкл этой суспензии в КПК при 28 °С в темноте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 10 мкл этой суспензии будут содержать такое же количество конидий (8 x 104), которое было использовано для заражения мононуклеарных макрофагов крови. Разница между этим положительным контролем и контролем, упомянутым на этапе 5.1.2, заключается в том, что контроль, упомянутый выше на этапе 5.1.2, используется для оценки возможного влияния среды R10 на рост триходермы во время фагоцитоза. Этот положительный контроль на этапе 5.2.5 с использованием суспензии конидий T. stromaticum, собранных в PBS, представляет собой контроль роста триходермы без влияния среды R10, отражающей естественный рост грибка. Используя этот контроль, можно оценить, влияет ли среда R10 на рост триходермы .
    6. Наблюдайте за кинетикой роста T. stromaticum в ПИТ каждый день и фотографируйте культуру.
    7. Анализ: Для оценки результатов можно использовать два пункта: 1) время (в днях), необходимое для того, чтобы культура заняла всю культуральную пластину, и 2) время (в днях) до появления характерной зеленой пигментации конидий T. stromaticum в культуре.

6. Статистический анализ

  1. Используйте тест Краскела-Уоллиса для определения статистически значимых различий между 8 группами/методами лечения. Считать р < 0,05 статистически значимыми. Все данные представлены в виде средних значений ± стандартному отклонению (SD). На рисунках # обозначает статистическую значимость при p < 0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Методика фагоцитоза грибковых конидий макрофагами широко используется для исследований, оценивающих модуляцию иммунных реакций против грибов. Мы использовали фагоцитоз конидий T. stromaticum для оценки жизнеспособности конидий после фагоцитоза, поскольку уклонение от фагоцитоза и выход фагосом являются механизмами вирулентности грибов. Исследователи должны использовать эти методы в качестве одного из первых тестов при исследовании вида, представляющего клинический интерес.

Figure 2
Рисунок 2: Фагоцитоз конидий T. stromaticum мононуклеарными макрофагами периферической крови человека. Репрезентативные результаты кинетики фагоцитоза (A) при 40x и (B) 100x объективах, показывающих макрофаги, полученные из PBMC, содержащие конидии T. stromaticum . (C) T. stromaticum conidia свободны и прикреплены к наружной мембране; (D) конидии T. stromaticum, полностью интернализируемые макрофагами; (E) T. stromaticum conidia в верхней плоскости; (F) множественный фагоцитоз; и (G) прорастание конидий внутри (H) и снаружи макрофагов. Стрелки: желтые, свободные конидии; белые, конидии прикреплены к наружной оболочке; черные, полностью интернализованные конидии; красный, прорастание конидий внутри макрофагов. Пунктирные стрелки: черные, множественный фагоцитоз; красные, конидии, прорастающие в среде R10 вне макрофагов; белый, конидии в верхней плоскости. Масштабная линейка показывает 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

На рисунке 2 представлены репрезентативные результаты кинетики фагоцитоза. В начале процесса фагоцитоза могут наблюдаться свободные конидии T. stromaticum, а также конидии, прикрепленные к наружной мембране макрофагов или полностью интернализованные ими (рис. 2А-В). С увеличением времени фагоцитоза можно наблюдать меньшее количество свободных или прикрепленных к наружной мембране макрофагов конидий.

Примечательно, что в этой работе конидии могут быть найдены свободными и прикрепленными к внешней мембране (рис. 2C) в начале процесса фагоцитоза, полностью интернализованными макрофагами (рис. 2D) или в верхней плоскости по сравнению с макрофагами (рис. 2E), но не фагоцитированными, и в одном и том же макрофаге может быть обнаружено более одного конидия (рис. 2F). Через длительные периоды времени (96 ч) фагоцитированные конидии могут прорастать внутри макрофагов (рис. 2G), а свободные конидии могут прорастать в среде R10 с образованием гиф при 37 °C (рис. 2H).

После фагоцитоза можно было наблюдать, что конидии T. stromaticum оставались жизнеспособными даже после 120 ч взаимодействия с макрофагами, полученными из PBMC человека. Репрезентативные результаты показывают культуру восстановленных конидий (рис. 3А) и представляют собой время (в днях), необходимое для того, чтобы культура заняла всю культуральную пластину (рис. 3В) и сформировала окрашенные в зеленый цвет конидии (рис. 3С). Только дискретные конидии T. stromaticum смогли уклониться от фагосомы и быть обнаруженными свободными в цитоплазме мононуклеарных макрофагов периферической крови человека29. Способность Trichoderma снижать продукцию активных форм кислорода и азота также может способствовать выживанию конидий внутри фагосомы и объясняет жизнеспособность после фагоцитоза 28,29,36. На сегодняшний день мы показали, что фагоцитированные конидии остаются жизнеспособными и способны расти в среде КПК даже через 120 часов. Сообщалось также, что другие микроорганизмы выживают после поглощения макрофагами, такие как Aspergillus27,37 и Cryptococcus38.

Figure 3
Рисунок 3: Клиренсная способность мононуклеарных макрофагов периферической крови человека, инфицированных конидиями T. stromaticum . После испытания с конидиями T. stromaticum (3 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч, 96 ч или 120 ч) макрофаги, полученные из PBMC, лизировали, а суспензию помещали в ОАП для оценки жизнеспособности фагоцитированных конидий. (А) Показаны репрезентативные результаты роста T. stromaticum после фагоцитоза макрофагами, полученными из PBMC. Мониторинг (B) роста T. stromaticum и (C) кондиации в разные дни для положительного контроля с T. stromaticum в PBS (см. шаг 5.2.5), контроля среды R10 (см. шаг 5.1.2) и фагоцитирования конидий, подвергшихся макрофагам, в течение различных периодов времени (3 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч, 96 ч, 120 ч). Репрезентативные результаты от четырех здоровых доноров. Среднее ± стандартное отклонение (SD). Критерий Краскела-Уоллиса. Символ # указывает на значимость при p < 0,05, n = 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Для некоторых грибковых патогенов, включая Aspergillus fumigatus, Cryptococcus, Candida albicans и другие, конидиальный или дрожжевой фагоцитоз является ключевым процессом, позволяющим исследовать цитоплазматические и молекулярные события во взаимодействиях макрофагов и патогенов, а также определить время гибели интернализованных конидий 14,39,40. Фагоцитоз является ключевым процессом во взаимодействии триходермы с хозяином. Род Trichoderma модулирует несколько путей фагоцитоза, включая Дектин-1 и Дектин-2, Toll-подобный рецептор 2 и Toll-подобный рецептор 4, MHC и NF-κB 25,28,41,42,43. Триходермия вызывает триходермоз у лиц с ослабленным и неослабленным иммунитетом9. Важно отметить, что несколько видов этого рода используются в сельском хозяйстве и являются потенциальным источником триходермоза. Понимание факторов вирулентности T. stromaticum и механизма иммунного ответа в организме человека против этих грибов срочно необходимо, поскольку профессиональные риски, вызываемые видами Trichoderma, включая T.stromaticum, вызывают тревогу. Представленный здесь метод позволяет детально провести фагоцитоз и киллинг-анализ для изучения взаимодействия триходермы и макрофагов в макрофагах периферической крови человека; Однако этот метод также может быть использован для изучения макрофагов из различных тканей, включая альвеолярные, перитонеальные или линейные макрофаги.

Первый шаг в этом протоколе начинается с суспензии маточного подвоя (М1) для получения свежих культур гриба. Культуры триходермы растут быстро, так как они обычно занимают всю пластину и начинают проявлять конидии зеленого цвета в течение 5 дней. Температура и свет являются решающими факторами для роста триходермы , и изменения в этих факторах могут повлиять на кинетику триходермы и поставить под угрозу эксперимент44.

После промывки культуры T. stromaticum следует восстановить окончательный объем от 5 до 8 мл. Интенсивность окраски суспензии пропорциональна концентрации конидий. Полученная суспензия конидий может быть использована для анализов in vitro и in vivo, таких как для оценки фагоцитоза26, внеклеточных ловушек нейтрофилов28, интраназального воздействия36,41, внутрибрюшинного воздействия26, внутрикожной инфекции45 и внутривенной инфекции46. Предыдущие исследования, проведенные с макрофагами человека, оценивали аутофагию, индуцированную Trichoderma29, и способность рода ингибировать образование внеклеточных ловушек в нейтрофилах28, что является механизмом, используемым для уничтожения грибковых патогенов и других микроорганизмов.

Важно отметить, что питательная среда, используемая для поддержания клеток, может влиять на прорастание конидий (рис. 3G, H). Если проращивание не требуется для конкретного эксперимента, мы рекомендуем провести первичный скрининговый анализ на среде клеточной культуры, чтобы установить кинетику роста Trichoderma в этой конкретной среде. Этот анализ должен быть выполнен до начала экспериментов in vitro с желаемой клеточной линией, и эксперимент должен быть остановлен через 72 часа, если среда окажется несовместимой. Прорастание конидий Trichoderma (рис. 3G, H) можно наблюдать с 96 часов внутри и снаружи макрофагов.

Поскольку виды Trichoderma имеют различия в морфологии и оптимальной температуре и рН для их роста, результаты, представленные здесь, могут быть воспроизводимы не для всех видов рода, и этот протокол может потребовать адаптации при выполнении с другими видами. Например, конидии Trichoderma asperelloides прорастают в культуре быстрее, чем конидии T. stromaticum.

Ранее документированные протоколы оценки фагоцитоза и уничтожения патогена с помощью проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии требовали дорогостоящих реагентов, но они давали конкретную информацию о процессе фагоцитоза19. Протокол, представленный в этой статье, требует только оптического микроскопа и планшета для оценки фагоцитоза и обеспечивает исчерпывающие изображения процесса фагоцитоза. Для получения дифференцированных макрофагов и индуцирования лизиса макрофагов могут использоваться различные протоколы. Эти протоколы включают использование различного времени для дифференцировки макрофагов вместо 7 дней, используемых здесь26 , или использование 2,5% дезоксихолата47 для лизиса макрофагов вместо дистиллированной воды при 37 °C и 5% CO2 в течение 30 мин, как это используется здесь в данном протоколе. Эти методы были эффективно использованы для различных видов грибов, таких как A. fumigatus27, A. nidulans18 и Cryptococcus neoformans15.

Некоторые ограничения этого протокола связаны с использованием PBS, который не является свободным от эндотоксинов, использованием круглых стеклянных покровных стекол и использованием человеческой крови. Мы рекомендуем тестировать PBS (не свободный от эндотоксинов) на клетках, чтобы убедиться, что он не может активировать моноциты и повлиять на эксперимент. Использование круглых стеклянных покровных стекол очень полезно для окрашивания и подсчета клеток, но клетки могут неравномерно распространяться под предметным стеклом, так как некоторые клетки хорошо мигрируют к краю пластины, и эта разница может повлиять на предполагаемое общее количество клеток в круглых стеклянных покровных стеклах. Поскольку мы не используем иммунофлюоресценцию или аналогичные методы в этом протоколе, наличие нефагоцитированных конидий в верхней плоскости по сравнению с макрофагами может привести к неправильной интерпретации результатов фагоцитоза. Поскольку мы используем кровь доноров-людей, окончательный подсчет PBMC варьируется от донора к донору, и низкого количества донорских клеток может быть недостаточно для всех экспериментов.

Таким образом, эти методы могут быть использованы для измерения функции макрофагов и грибкового клиренса, особенно для нитчатых грибов, таких как Trichoderma и других микробов, таких как дрожжи и бактерии. Кроме того, этот протокол обеспечивает будущие направления для изучения реальной изменчивости иммунного ответа против конидиеобразующих грибов в человеческих популяциях, которая не может быть обнаружена на изогенных животных моделях или клеточных линиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Все авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана следующими бразильскими финансовыми учреждениями: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) с грантами RED0011/2012 и RED008/2014. U.R.S., J.O.C. и M.E.S.M. признают стипендию, предоставленную Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) и FAPESB, соответственно.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL centrifuge tubes Corning CLS431470 15 mL centrifuge tubes, polypropylene, conical bottom with lid, individually sterile
24-Well Flat Bottom Cell Culture Plate Kasvi K12-024 Made of polystyrene with alphanumeric identification; The Cell Culture Plate is DNase, RNase and pyrogen-free and free of cytotoxic substances; Sterilized by gamma radiation;
Cell culture CO2 incubator Sanyo 303082 A CO2 incubator serves to create and control conditions similar to a human body, thus allowing the in vitro growth and proliferation of different cell types.
Centrifuge Microtube (eppendorf type) 1.5 mL Capp 5101500 Made from polypropylene, with a cap attached to the tube for opening and closing with just one hand. It has a polished interior against protein adhesion and for sample visibility, being free of DNase, RNase and Pyrogens
Circular coverslip 15 mm Olen K5-0015 Circular coverslips are used for microscopy techniques in cell culture. Made of super transparent translucent glass; with thickness of 0.13 mm
Class II Type B2 (Total Exhaust) Biosafety Cabinets Esco Lifesciences group 2010274 Airstream Class II Type B2 Biosafety Cabinets (AB2) provide product, operator and environmental protection and are suitable for work with trace amounts of toxic chemicals and agents assigned to biological safety levels I, II or III. In a Class II Type B2 cabinet, all inflow and downflow air is exhausted after HEPA/ULPA filtration to the external environment without recirculation across the work surface.
Dextrose Potato Agar medium Merck 145 Potato Dextrose Agar is used in the cultivation and enumeration of yeasts and fungi
EDTA vacuum blood collection tube FirstLab FL5-1109L EDTA is the recommended anticoagulant for hematology routines as it is the best anticoagulant for preserving cell morphology.
Entellan Merck 1.07961  Fixative agent; Entellan is a waterless mounting medium for permanent mounting for microscopy.
Fetal Bovine Serum Gibco A2720801 Fetal bovine serum (FBS) is a universal growth supplement of cell and tissue culture media. FBS is a natural cocktail of most of the factors required for cell attachment, growth, and proliferation, effective for most types of human and animal (including insect) cells.
Flaticon  database of images
Glycerol Merck 24900988 The cryoprotectant agent glycerol is used for freezing cells and spores
Histopaque-1077 polysucrose solution
Image J  Image analysis software
Microscopy slides Precision 7105 Slide for Microscopy 26 x 76 mm Matte Lapped Thickness 1.0 to 1.2 mm. Made of special optical glass and packaged with silk paper divider with high quality transparency free of imperfections
Mini centrifuge Prism C1801 The Prism Mini Centrifuge was designed to be extremely compact with an exceptionally small footprint. Includes 2 interchangeable quick-release rotors that spin up to 6000 rpm. An electronic brake provides quick deceleration and the self-opening lid allows easy access to the sample, reducing handling time.
Neubauer chamber Kasvi K5-0011 The Neubauer Counting Chamber is used for counting cells or other suspended particles.
Panoptic fast  Laborclin 620529 Laborclin's  panoptic fast c is a kit for quick staining in hematology
Penicillin/Streptomycin Solution - 10,000U LGC- Biotechnology  BR3011001 antibiotic is used in order to avoid possible contamination by manipulation external to the laminar flow.
Petri dish 90 x 15 mm Smooth Cralplast 18248 Disposable Petri dish; Made of highly transparent polystyrene (PS); flat bottom; Smooth;Size: 90 x 15 mm.
Phosphate buffered saline (PBS) thermo fisher Scientific 10010001 PBS is a water-based saline solution with a simple formulation. It is isotonic and non-toxic to most cells. It includes sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock while maintaining the water balance of living cells.
Pipette Pasteur 3 mL Sterile Accumax AP-3-B-S STERILE ACCUMAX PASTEUR 3 ML PIPETTE with 3 mL capacity, made of transparent low-density polyethylene (LDPE) and individually sterile
Refrigerated Centrifuge Thermo Scientific TS-HM16R The Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R Refrigerated Centrifuge is a refrigerated centrifuge with the user-friendly control panel makes it easy to pre-set the speed, RCF value, running time, temperature, and running profile. The Megafuge 16R can reach maximum speeds of 15,200 RPM and maximum RCF of 25,830 x g.
RPMI-1640 Medium Merck MFCD00217820 HEPES Modification, with L-glutamine and 25 mM HEPES, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture
The single channel micropipettes Eppendorf Z683809 Single-channel micropipettes are used to accurately transfer and measure very small amounts of liquids.
Tip for Micropipettor Corning 4894 Capacity of 10 µL and 1,000 µL Autoclavable
Triocular inverted microscope LABOMED VU-7125500 It allows you to observe cells inside tubes and bottles, without having to open them, thus avoiding contamination problems.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Samuels, G. J. Trichoderma: A review of biology and systematics of the genus. Mycological Research. 100 (8), 923-935 (1996).
  2. Nevalainen, H., Peterson, R. Chapter 7 - Heterologous expression of proteins in Trichoderma. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  3. Do Vale, L. H. F., Filho, E. X. F., Miller, R. N. G., Ricart, C. A. O., de Sousa, M. V. Chapter 16 - Cellulase systems in Trichoderma: An overview. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  4. Ferreira, N. L., Margeot, A., Blanquet, S., Berrin, J. G. Chapter 17 - Use of cellulases from Trichoderma reesei in the twenty-first century part I: Current industrial uses and future applications in the production of second ethanol generation. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  5. Puranen, T., Alapuranen, M., Vehmaanperä, J. Chapter 26 - Trichoderma enzymes for textile industries. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  6. Kunamneni, A., Plou, F. J., Alcalde, M., Ballesteros, A. Chapter 24 - Trichoderma enzymes for food industries. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  7. Mukherjee, P. K., Horwitz, B. A., Herrera-Estrella, A., Schmoll, M., Kenerley, C. M. Trichoderma research in the genome era. Annual Review of Phytopathology. 51 (1), 105-129 (2013).
  8. Mukherjee, M., et al. Trichoderma-plant-pathogen interactions: Advances in genetics of biological control. Indian Journal of Microbiology. 52 (4), 522-529 (2012).
  9. dos Santos, U. R., dos Santos, J. L. Trichoderma after crossing kingdoms: Infections in human populations. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B. 26 (2), 97-126 (2023).
  10. Asis, A., et al. Identification patterns of Trichoderma strains using morphological characteristics, phylogenetic analyses and lignocellulolytic activities. Molecular Biology Reports. 48 (4), 3285-3301 (2021).
  11. Antal, Z., et al. Comparative study of potential virulence factors in human pathogenic and saprophytic Trichoderma longibrachiatum strains. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. 52 (3-4), 341-350 (2005).
  12. Hatvani, L., Manczinger, L., Vágvölgyi, C., Kredics, L. Trichoderma as a human pathogen. Trichoderma: Biology and Applications. Mukherjee, P. K., Horwitz, B. A., Singh, U. S., Mukherjee, M., Schmoll, M. , Wallingford, UK. (2013).
  13. Kredics, L., et al. Clinical importance of the genus Trichoderma: A review. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. 50 (2-3), 105-117 (2003).
  14. Erwig, L. P., Gow, N. A. R. Interactions of fungal pathogens with phagocytes. Nature Reviews Microbiology. 14 (3), 163-176 (2016).
  15. Nicola, A. M., Casadevall, A. In vitro measurement of phagocytosis and killing of Cryptococcus neoformans by macrophages. Methods in Molecular Biology. 844, 189-197 (2012).
  16. Medina, E., Goldmann, O. In vivo and ex vivo protocols for measuring the killing of extracellular pathogens by macrophages. Current Protocols in Immunology. , Chapter 14, Unit 14 1-17 (2011).
  17. Drevets, D. A., Canono, B. P., Campbell, P. A. Measurement of bacterial ingestion and killing by macrophages. Current Protocols in Immunology. 109, 1-17 (2015).
  18. Gresnigt, M. S., et al. Differential kinetics of Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus phagocytosis. Journal of Innate Immunity. 10 (2), 145-160 (2018).
  19. Steinberg, B. E., Grinstein, S. Analysis of macrophage phagocytosis: Quantitative assays of phagosome formation and maturation using high-throughput fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 531, 45-56 (2009).
  20. Yan, Q., Ahn, S. H., Fowler, V. G. Macrophage phagocytosis assay of Staphylococcus aureus by flow cytometry. Bio-Protocol. 5 (4), 1406 (2015).
  21. Marr, K. A., Koudadoust, M., Black, M. Early events in macrophage killing of Aspergillus fumigatus conidia New flow cytometric viability assay. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1240-1247 (2001).
  22. Surewaard, B. G. J., Kubes, P. Measurement of bacterial capture and phagosome maturation of Kupffer cells by intravital microscopy. Methods. 128, 12-19 (2017).
  23. Siggins, M. K., et al. Differential timing of antibody-mediated phagocytosis and cell-free killing of invasive African Salmonella allows immune evasion. European Journal of Immunology. 44 (4), 1093-1098 (2014).
  24. Cannon, G. J., Swanson, J. A. The macrophage capacity for phagocytosis. Journal of Cell Science. 101 (4), 907-913 (1992).
  25. Harvath, L., Terle, D. A. Assay for phagocytosis. Methods in Molecular Biology. 115, 281-290 (1999).
  26. dos Santos, A. G., et al. Trichoderma asperelloides spores downregulate dectin1/2 and TLR2 receptors of mice macrophages and decrease Candida parapsilosis phagocytosis independent of the M1/M2 polarization. Frontiers in Microbiology. 8, 1681 (2017).
  27. Souza, J. A. M., et al. Characterization of Aspergillus fumigatus extracellular vesicles and their effects on macrophages and neutrophils functions. Frontiers in Microbiology. 10, 2008 (2019).
  28. Oliveira-Mendonça, L. S., et al. Inhibition of extracellular traps by spores of Trichoderma stromaticum on neutrophils obtained from human peripheral blood. Molecular Immunology. 141, 43-52 (2022).
  29. Oliveira-Mendonça, L. S., et al. Trichoderma stromaticum spores induce autophagy and downregulate inflammatory mediators in human peripheral blood-derived macrophages. Current Research in Microbial Sciences. 3, 100145 (2022).
  30. Johnston, L., Harding, S. A., La Flamme, A. C. Comparing methods for ex vivo characterization of human monocyte phenotypes and in vitro responses. Immunobiology. 220 (12), 1305-1310 (2015).
  31. Abedon, S. T., Bartom, E. Multiplicity of infection. Brenner's Encyclopedia of Genetics. Second Edition. Maloy, S., Hughes, K. , Academic Press. Cambridge, MA. (2013).
  32. Rios, F. J., Touyz, R. M., Montezano, A. C. Isolation and differentiation of human macrophages. Methods in Molecular Biology. 1527, 311-320 (2017).
  33. Lombard, Y., Giaimis, J., Makaya-Kumba, M., Fonteneau, P., Poindron, P. A new method for studying the binding and ingestion of zymosan particles by macrophages. Journal of Immunological Methods. 174 (1-2), 155-165 (1994).
  34. Ghoneum, M., Gollapudi, S. Phagocytosis of Candida albicans by metastatic and non metastatic human breast cancer cell lines in vitro. Cancer Detection and Prevention. 28 (1), 17-26 (2004).
  35. Nunes, J. P. S., Dias, A. A. M. ImageJ macros for the user-friendly analysis of soft-agar and wound-healing assays. BioTechniques. 62 (4), 175-179 (2017).
  36. Alves-Filho, E. R., et al. The biocontrol fungus Trichoderma stromaticum downregulates respiratory burst and nitric oxide in phagocytes and IFN-gamma and IL-10. Journal of Toxicology and Environmental Health - Part A: Current Issues. 74 (14), 943-958 (2011).
  37. Slesiona, S., et al. Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages. PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).
  38. Johnston, S. A., May, R. C. Cryptococcus interactions with macrophages: Evasion and manipulation of the phagosome by a fungal pathogen. Cellular Microbiology. 15 (3), 403-411 (2013).
  39. Alonso, M. F., et al. The nature of the fungal cargo induces significantly different temporal programmes of macrophage phagocytosis. The Cell Surface. 8, 100082 (2022).
  40. Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. Interaction of phagocytes with filamentous fungi. Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).
  41. Dos Santos, U. R., et al. Exposition to biological control agent Trichoderma stromaticum increases the development of cancer in mice injected with murine melanoma. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 252 (2020).
  42. Wang, G., et al. Exopolysaccharide from Trichoderma pseudokoningii induces macrophage activation. Carbohydrate Polymers. 149, 112-120 (2016).
  43. Xu, Y., et al. Exopolysaccharide from Trichoderma pseudokoningii promotes maturation of murine dendritic cells. International Journal of Biological Macromolecules. 92, 1155-1161 (2016).
  44. Schmoll, M., Esquivel-Naranjo, E. U., Herrera-Estrella, A. Trichoderma in the light of day - Physiology and development. Fungal Genetics and Biology. 47 (11), 909-916 (2010).
  45. Zhang, G., Li, D. Trichoderma longibrachiatum-associated skin inflammation and atypical hyperplasia in mouse. Frontiers in Medicine. 9, 865722 (2022).
  46. Paredes, K., Capilla, J., Mayayo, E., Guarro, J. Virulence and experimental treatment of Trichoderma longibrachiatum, a fungus refractory to treatment. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (8), 5029-5032 (2016).
  47. Perkhofer, S., Speth, C., Dierich, M. P., Lass-Flörl, C. In vitro determination of phagocytosis and intracellular killing of Aspergillus species by mononuclear phagocytes. Mycopathologia. 163 (6), 303-307 (2007).

Tags

Анализ жизнеспособности Trichoderma stromaticum конидии мононуклеарные макрофаги периферической крови человека фагоцитоз макрофагально-патогенные взаимодействия иммунные реакции против грибов побег фагосом вирулентность грибов агент биоконтроля агент биоудобрения инфекции человека культура триходермы промывка конидий мононуклеарные клетки периферической крови (МПКМ) дифференцировка макрофагов метод фагоцитоза in vitro анализ клиренса эффективность клиренса грибов
Анализ жизнеспособности конидий <em>Trichoderma stromaticum</em> в мононуклеарных макрофагах периферической крови человека
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

dos Santos, U. R., de Castro, J. O., … More

dos Santos, U. R., de Castro, J. O., Santos Matos, M. E., De Bonis, G., dos Santos, J. L. Viability Assay of Trichoderma stromaticum Conidia Inside Human Peripheral Blood Mononuclear-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (200), e65231, doi:10.3791/65231 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter