Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Viabilitetsanalys av Trichoderma stromaticum Conidia inuti humana mononukleära makrofager i perifert blod

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65231
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Laboratory of Immunobiology - Department of Biological Sciences, State University of Santa Cruz - UESC, 2Università Degli Studi di Genova
* These authors contributed equally

Summary

Tekniken som involverar fagocytos av svampkonidier av makrofager används i stor utsträckning för studier som utvärderar moduleringen av immunsvaret mot svampar. Syftet med detta manuskript är att presentera en metod för att utvärdera fagocytos och clearanceförmåga hos humana mononukleära makrofager i perifert blod stimulerade med Trichoderma stromaticum conidia.

Abstract

Makrofager utgör en viktig försvarslinje och är ansvariga för att förhindra tillväxt och kolonisering av patogener i olika vävnader. Konidial fagocytos är en nyckelprocess som möjliggör undersökning av cytoplasmatiska och molekylära händelser som är involverade i makrofag-patogeninteraktioner, samt för bestämning av tidpunkten för döden av internaliserad konidi. Tekniken som involverar fagocytos av svampkonidier av makrofager används i stor utsträckning för studier som utvärderar moduleringen av immunsvaret mot svampar. Undvikande av fagocytos och flykt av fagosomer är mekanismer för svampvirulens. Här redovisar vi de metoder som kan användas för analys av fagocytos, clearance och livsduglighet hos T. stromaticum conidia, en svamp som används som biobekämpning och biogödselmedel och som kan inducera infektioner hos människor. Protokollet består av 1) Trichoderma-odling , 2) tvättning för att erhålla konidier, 3) isolering av mononukleära celler i perifert blod (PBMC) med hjälp av polysackaroslösningsmetoden och differentiering av PBMC till makrofager, 4) en in vitro-fagocytosmetod med hjälp av runda glastäckglas och färgning, och 5) en clearance-analys för att bedöma konidiernas livskraft efter konidifagocytos. Sammanfattningsvis kan dessa tekniker användas för att mäta svampelimineringen av makrofager.

Introduction

Släktet Trichoderma (Ordning: Hypocreales, Familj: Hypocreaceae) består av allestädes närvarande, saprofytiska svampar som är parasiter på andra svamparter och som kan producera en rad kommersiellt användbara enzymer. Dessa svamparter används för produktion av heterologa proteiner2, produktion av cellulosa3, etanol, öl, vin och papper4, inom textilindustrin5, livsmedelsindustrin6 och inom jordbruket som biologiska bekämpningsmedel 7,8. Förutom det industriella intresset för dessa svamparter har det ökande antalet infektioner hos människor gett vissa Trichoderma-arter status som opportunistiska patogener9.

Trichoderma spp. växer snabbt i odling, med till en början vita och bomullsartade kolonier som blir gröngula till mörkgröna10. De är anpassade för att leva i ett brett spektrum av pH- och temperaturförhållanden, och de opportunistiska arterna kan överleva vid fysiologiska pH och temperaturer och därmed kolonisera olika mänskliga vävnader 11,12,13. Det är viktigt att notera att ökningen av infektionsfrekvensen hos Trichoderma spp. kan vara förknippad med virulensfaktorer, och dessa är inte väl studerade. Dessutom är studier som fokuserar på att förstå immunsvaret mot opportunistiska Trichoderma-arter fortfarande sällsynta.

Under en infektion, tillsammans med neutrofiler, representerar makrofager försvarslinjen som är ansvarig för fagocytos och förhindrar därmed tillväxt och kolonisering av patogener i olika vävnader. Med hjälp av mönsterigenkänningsreceptorer, såsom Toll-liknande receptorer och lektinreceptorer av C-typ, fagocytossvampar och bearbetar dem till fagolysosomer, vilket främjar en andningsbristning, frisättning av proinflammatoriska cytokiner och förstörelse av de fagocytoserade mikroorganismerna14. Mekanismen för fagocytos kan dock påverkas och undvikas av olika mikrobiella strategier, såsom svampcellernas storlek och form; närvaron av kapslar som hindrar fagocytos; minska antalet fagocytosinducerande receptorer; ombyggnad av strukturen av aktinfibrer i cytoplasman; hindrar bildandet av pseudopodier; och fagosomen eller fagolysosomen flyr efter fagocytosprocessen14.

Många patogener, inklusive Cryptococcus neoformans, använder makrofager som en nisch för att överleva i värden, sprida sig och inducera infektion15. Fagocytos- och clearanceanalysen används för att utvärdera immunsvaret mot patogener och för att identifiera de mikrobiella strategier som används för att undvika det medfödda immunsystemet 15,16,17. Denna typ av teknik kan också användas för att undersöka den differentiella kinetiken för fagocytos, fördröjd fagosomförsurning och oxidativ burst som resulterar i minskadsvampdöd.

Olika metoder kan användas för att utvärdera fagocytos, svampöverlevnad och undvikande av fagosommognadsprocessen. Dessa inkluderar fluorescensmikroskopi, som används för att observera fagocytos, cellulär lokalisering och de molekyler som produceras under fagocytos19; flödescytometri, som ger kvantitativa data om fagocytos och används för att utvärdera de olika markörer som är involverade i processen20,21; intravital mikroskopi, som används för att bedöma mikrobiell infångning och fagosommognad22; Antikroppsmedierad fagocytos, som används för att bedöma specificiteten hos fagocytosprocessen för en patogen23. och andra 24,25,26,27.

Protokollet som presenteras här använder en vanlig, billig och direkt metod som använder ett optiskt mikroskop och platttillväxtanalys för att bedöma fagocytos och avdödning av svampkonidier. Detta protokoll kommer att ge läsarna steg-för-steg-instruktioner för att utföra fagocytos- och clearanceanalysen med hjälp av humana mononukleära makrofager från perifert blod som exponerats för T. stromaticum. PBMC användes eftersom Trichoderma conidia används som en biologisk bekämpning mot fytopatogener och ett biogödselmedel för växtgrödor över hela världen och har orsakat flera infektioner hos människor, så kallad Trichodermosis. Utöver det finns det bara två tidigare arbeten som fokuserar på interaktionen mellan Trichoderma conidia och det mänskliga immunsystemet, där vi undersökte neutrofiler28 och autofagi i makrofager29. Denna artikel visar först hur fagocytosen av konidierna hos T. stromaticum av PBMC-härledda makrofager kan studeras, och sedan hur livskraften hos de uppslukade konidierna kan bedömas med hjälp av enkla mikroskopibaserade tekniker. Detta protokoll kan ytterligare underlätta undersökningar av makrofagassocierat immunsvar eller immunsystemmoduleringsrelaterade mekanismer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etiska överväganden och människor
Alla experiment med människor som beskrivs i denna studie utfördes i enlighet med Helsingforsdeklarationen och brasilianska federala lagar och godkändes av State University of Santa Cruz etiska kommitté (projektidentifieringskod: 550.382/2014).

Humant perifert blod samlades in från friska frivilliga från staden Ilhéus, Bahia, Brasilien, som inte exponerats för yrkesaktiviteter relaterade till den studerade svampen. Individer med rapporterade hälsomedicinska tillstånd eller som använder läkemedel exkluderades. Alla försökspersoner gick frivilligt med på att delta och undertecknade ett informerat samtyckesformulär innan de inkluderades i denna studie.

1. Beredning av reagenser och lösningar

OBS: Förbered följande reagenser och lösningar innan du fortsätter. Se materialtabellen (TOM) för information om reagens och materialleverantör.

  1. Bered en balanserad steril fosfatbuffrad koksaltlösning 1x (PBS).
    OBS: I detta protokoll användes inte endotoxinfri PBS.
  2. Förbered potatisdextrosagar (PDA) medium och häll 20 ml i varje petriskål för T. stromaticum-kulturen . Förbered sex plattor med PDA för varje donator och använd en platta för varje tillstånd: 3 timmar, 24 timmar, 48 timmar, 72 timmar, 96 timmar och 120 timmar. Använd dessutom tre plattor för varje kontroll: tre för Trichoderma-kontrollen och tre för R10-mediumkontrollen. Använd petriskålar på 60 mm x 15 mm eller 100 mm x 15 mm för optimal konidiåterhämtning.
  3. Sterilisera 100% glycerol.
  4. Förbered ett R10-medium för cellodlingen: RPMI-medium kompletterat med 10 % fetalt bovint serum och 1 % antibiotika (penicillin/streptomycin).
  5. Sterilisera destillerat vatten för celllysen.
  6. Förbered vatten med pH 7,0 för färgningsprocessen.
    OBS: Justera vid behov pH med en pH-mätare och lösningar på 0.1 M/L NaOH och 0.1 M/L HCl.
  7. Sterilisera rund glastäcke (13 mm) och pincett.

2. Odling och bearbetning av Trichoderma stromaticum

  1. Beredning av moderstam (M1) av T. stromaticum:
    OBS: En moderstam (M1) krävs för att säkerställa att alla experiment görs från odlingen av samma färska generation (F1).
    1. Odla en T. stromaticum inoculum i petriskålar med PDA vid 28 °C i mörker i 7-10 dagar tills konidierna observeras och kulturen blir grön.
    2. Tvätta kulturen av T. stromaticum. Tillsätt 3-5 ml PBS till odlingsytan med hjälp av en pipett. Samla upp PBS från plattan och fördela den igen över kulturen för att gradvis avlägsna konidierna med hjälp av pipetten. Upprepa denna process så mycket som behövs tills suspensionen blir mörkgrön.
      OBS: Alternativt föreslås skonsam tvättning av kulturen genom att tillsätta 3-5 ml PBS till plattan följt av att utföra en cirkulär rörelse tills suspensionen blir grön för att återställa konidierna. Med upprepad pipettering kan fler konidier samlas in.
    3. Överför den återvunna suspensionen från plattan till ett 15 ml sterilt rör med en pipett. Upprepa steg 2.1.2-2.1.3 så många gånger som behövs för att få mer konidier.
    4. Centrifugera suspensionen vid 1 160 x g i 5 minuter vid 12 °C och återsuspendera pelleten i 5 ml PBS. Upprepa detta steg (2.1.4) tre gånger för att få en hyferfri suspension.
      OBS: För att återsuspendera pelleten ordentligt, efter centrifugering, rekommenderas kort virvning.
    5. Återsuspendera den slutliga pelleten i 2-3 ml PBS och räkna konidierna i en Neubauer-kammare med en utspädning på 1:100 eller 1:1 000.
      ANMÄRKNING: Under optimala förhållanden kan en slutlig koncentration på 2 x 108 konidier/ml återvinnas från kulturen. Bedömning av konidiernas livskraft med hjälp av trypanblå uteslutningsmetoden är frivillig.
    6. Fördela suspensionen i 1,5 ml sterila rör genom att tillsätta 0,5 ml konidiasuspension (från steg 2.1.5) till varje rör. Tillsätt sedan 0,5 ml steril 100 % glycerol för att få M1-lager. Virvla kortfattat, identifiera rören och förvara vid −20 °C eller −80 °C.
  2. Odling av T. stromaticum och erhållande av konidier för experimentet
    1. Plakplatta 10 μL av M1-suspensionen (bereds i steg 2.1) i PDA vid 28 °C i mörker i 7–10 dagar tills konidierna observeras och grödan blir grön för att erhålla den färska F1-generationen.
      OBS: För att säkerställa en ny T. stromaticum-kultur för experimentet, bedöm den tid som krävs för svamptillväxt och den tid som krävs för makrofagdifferentiering.
    2. Samla in konidierna genom att upprepa steg 2.1.2-2.1.4.
    3. Återsuspendera den sista pelleten i 2-3 ml PBS. Bedöm konidiernas livsduglighet med hjälp av trypanblå uteslutningsmetoden, eller räkna konidierna enligt beskrivningen i steg 2.1.5.

3. Isolering av mononukleära celler i perifert blod (PBMC)

ANM.: PBMC erhålls genom densitetsbarriärmetoden med en polysackaroslösning med densiteten 1,077 g/ml30.

  1. Alikvot 15 ml polysackaroslösning till ett 50 ml rör för varje donatorprov som kommer att samlas in.
  2. Samla in 20 ml blod från varje givare med hjälp av tre till fyra EDTA-rör. Rekrytera minst fyra donatorer per experiment. Samla inte blodgivare från givare; Använd istället varje prov separat som ett biologiskt replikat. För varje donator, överför blodet till ett 50 ml rör och tillsätt PBS för att få en slutlig volym på 35 ml.
  3. Överför blodsuspensionen (steg 3.2) långsamt längs väggen på röret som innehåller polysackaroslösningen (steg 3.1) för att bilda en bifasisk suspension.
    OBS: För att förhindra att blodet blandas med polysackaroslösningen, tillsätt blodet långsamt. Användning av minst 7 ml blod från varje givare för PBMC-isolering rekommenderas.
  4. Centrifugera omedelbart röret med den bifasiska suspensionen vid 1 600 x g i 30 minuter vid 24 °C. Programmera centrifugeringen av PBMC: använd acceleration 1 och retardation 0 för att undvika ett abrupt stopp av centrifugeringen.
  5. Observera bildandet av en vit ring som innehåller PBMC efter centrifugering. De röda blodkropparna och granulocyterna finns i det nedre skiktet, nästa lager innehåller polysackaroslösningen och PBMC finns i den vita ringen mellan polysackaroslösningen och plasman (övre skiktet). Samla upp den vita ringen genom att aspirera försiktigt med en pipett eller en steril Pasteur-pipett för att inte fånga upp röda blodkroppar, plasma eller polysackaroslösning och överför till ett 15 ml rör.
  6. Tillsätt PBS till 15 ml-röret som innehåller PBMC för att få en slutlig volym på 10 ml. Homogenisera suspensionen och centrifugera röret vid 1 600 x g i 30 minuter vid 24 °C.
  7. Tvätta cellerna tre gånger i 1 600 x g i 5 minuter vid 24 °C med 10 ml PBS. Återsuspendera sedan den slutliga pelleten i 2 ml R10-medium.
  8. Bedöm cellviabiliteten med hjälp av trypanblå uteslutningsmetoden och räkna cellerna i en Neubauer-kammare.

4. Fagocytos-kinetik

OBS: Humana mononukleära makrofager från perifert blod behandlas med T. stromaticum conidia vid en multiplicitet av infektion (MOI) på 1:10 eller endast R10-medium som kontroll. Infektionsmultipliciteten (MOI) representerar förhållandet mellan de smittämnen som läggs till infektionsmålen och presenteras som absoluta tal: MOI = agens:mål31. Här använder vi 1 T. stromaticum conidia (medel) för 10 makrofager (mål). Därefter inkuberas cellerna vid 37 °C och 5 % CO2 under olika tidsperioder (3 timmar, 24 timmar, 48 timmar, 72 timmar, 96 timmar och 120 timmar). Därefter används ett runt glastäcke för att visualisera de vidhäftande makrofager som är involverade i fagocytosprocessen under ett mikroskop. En experimentell designfigur tillhandahålls (figur 1).

OBS: Användning av 24-brunnars plattor rekommenderas.

  1. Behandling av makrofager från människa med T. stromaticum conidia
    1. Lägg till ett sterilt runt glasglas (13 mm) i varje brunn med en steril pincett.
    2. Justera volymen på cellsuspensionen som erhölls i steg 3.7-3.8 till plattan 8 x 105 celler per brunn till en slutlig volym på 1 ml med R10-medium. Använd ett inverterat mikroskop för att bedöma cellmorfologin.
      OBS: Cellerna måste vara suspenderade i mediet och ha en rundad morfologi.
    3. Inkubera cellerna vid 37 °C i en atmosfär på 5 % CO2 i 7 dagar och ersätt mediet med nytt R10-medium varannan dag för differentiering av monocyterna till makrofager32. Observera cellmorfologin med hjälp av ett inverterat mikroskop. Makrofagerna kommer att uppvisa spindelform, med tillplattade och förlängda former; En ökad cytoplasmatisk kvot och förekomst av pseudopodier kan också observeras. Leta efter vidhäftande mononukleära makrofager.
      Anmärkning: En mycket liten andel odifferentierade monocyter kan förbli suspenderade i mediet.
    4. Ta bort mediet från varje brunn med en pipett och tvätta cellerna med 1 ml PBS för att avlägsna skräp och icke-vidhäftande celler.
    5. Använd suspensionen som beretts i steg 2.2 för att bereda en ny suspension av T. stromaticum conidia vid en slutlig koncentration av 8 x 104 konidier/ml i R10-medium.
    6. Tillsätt 1 ml konidisuspension som beretts i steg 4.1.5 till varje behandlingsbrunn (3 timmar, 24 timmar, 48 timmar, 72 timmar, 96 timmar och 120 timmar) för att erhålla ett MOI på 1:10. Tillsätt endast 1 ml R10-medium till brunnen till kontrollerna.
    7. Utmana makrofagerna i 3 timmar med T. stromaticum conidia vid 37 °C under en 5% CO2 atmosfär. Efter 3 timmar tar du bort mediet och tvättar cellerna för att avlägsna den icke-fagocytoserade konidien.
    8. Tillsätt 1 ml R10-medium till varje brunn och inkubera plattan under olika tider (3 timmar, 24 timmar, 48 timmar, 72 timmar, 96 timmar och 120 timmar) vid 37 °C under en atmosfär på 5 % CO2 .
  2. Färgning och analys
    1. Ta bort mediet från varje brunn efter att motsvarande inkubation (steg 4.1.8) är klar och tillsätt 1 ml PBS till brunnen.
    2. Ta bort de runda glastäckena från brunnarna med en steril pincett och en nål för färgning med ett färgningskit.
      OBS: Alternativt kan färgning göras med May Grünwald-Giemsa bets33.
    3. Till var och en av de runda glastäckena, tillsätt fläckfixator (5 s), färgämne 1 (5 s), färgämne 2 (2 s) och buffrat vatten pH 7.0 (5 s), som är komponenterna i färgningssatsen. Vänta tills de är torra och fäst täckglasen på en glasskiva med hjälp av monteringsmedel.
    4. Kvantifiera resultatet: Räkna totalt 100 makrofager (Mø) för varje tidsvillkor. Använd ett optiskt mikroskop för att räkna antalet makrofager med fagocytoserade konidier med hjälp av ett 100x objektiv och nedsänkningsolja (ekvation [1]).
      Equation 1 Nej (1)
    5. Erhåll antalet konidier fagocytoserade per makrofag: Korrelera konidierna som finns i 100 makrofager dividerat med antalet makrofager med minst en fagocytoserad konidium (ekvation [2])34.
      Equation 2 Nej (2)
      OBS: För att utvärdera och räkna konidierna kan programvaran ImageJ användas35.
    6. Fotografera fagocytosen från varje prov och tidsförhållande med hjälp av 40x och 100x objektiv för att presentera resultaten.

Figure 1
Figur 1: Schematisk representation av fagocytos- och konidial viabilitetsanalys med användning av humana mononukleära makrofager från perifert blod. (1–10) Fagocytosanalys: T. stromaticum måste odlas i PDA, och konidierna återvinns genom att tvätta plattan med PBS. PBMC bör isoleras med densitetsbarriärmetoden med hjälp av det beskrivna protokollet, odlas i 24-hålsplattor med sterila runda glastäcken i 7 dagar för differentiering till makrofager och sedan behandlas med en MOI på 1:10 med olika tidsintervall. De runda glastäckena avlägsnas och färgas med färgningssatsen, och resultaten analyseras med hjälp av ljusmikroskopi. (1–8,11–13) Konidi-viabilitetsanalys: Efter isolering odlas PBMC i 24-brunnars plattor utan runda glastäcken i 7 dagar för differentiering till makrofager och behandlas sedan med en MOI på 1:10 för olika tidsintervall. Cellerna skall lyseras genom inkubation med destillerat vatten. suspensionen centrifugeras sedan och sedan pläteras den återsuspenderade pelleten i PDA för att analysera tillväxtkinetiken hos Trichoderma. Denna figur designades med hjälp av en databas med bilder. Klicka här för att se en större version av denna figur.

5. Bestämning av konidial viabilitet efter fagocytos

OBS: En experimentell designfigur tillhandahålls (figur 1).

OBS: Använd 24-brunnars plattor.

  1. Utmana de mänskliga makrofagerna med T. stromaticum conidia.
    1. Upprepa steg 4.1.2-4.1.8 för att differentiera monocyterna och behandla makrofagerna med T. stromaticum conidia.
      OBS: Använd inte runda glastäcken i brunnarna. Använd samma tidsintervall som används för analys av fagocytoskinetiken så att fagocytosen kan korreleras med den konidiella viabiliteten.
    2. Utvärdera effekten av R10-mediet på T. stromaticum-tillväxten genom att använda brunnar med suspensionen beredd i steg 4.1.5 (R10-medium + konidier) som kontroll.
  2. Analys av konidial viabilitet
    1. Ta bort mediet efter varje inkubationstid (3 timmar, 24 timmar, 48 timmar, 72 timmar, 96 timmar och 120 timmar) och tvätta cellerna två gånger med PBS för att avlägsna konidier som inte har fagocytoserats.
      OBS: Kontrollen som innehåller R10 medium + konidier ska inte tvättas.
    2. Tillsätt 0,5 ml sterilt destillerat vatten i varje brunn och inkubera plattan vid 37 °C och 5 % CO2 i 30 minuter. Efter denna tid, observera cellmorfologin under ett inverterat mikroskop för att säkerställa att cellerna har lyserats.
    3. Samla upp suspensionen och överför den till 1,5 ml rör. Centrifugera suspensionen med en minicentrifug vid 6 000 x g i 5 minuter vid rumstemperatur.
    4. Kassera supernatanten försiktigt, återsuspendera pelleten i 10 μl sterilt destillerat vatten och inokulera 10 μL av suspensionen i den PDA-innehållande plattan vid 28 °C i mörker.
    5. Bered en positiv kontroll för T. stromaticum-tillväxt : Använd suspensionen av T. stromaticum conidia (steg 2.2) för att bereda en ny suspension med en slutlig koncentration på 8 x 106 conidia/ml. Platta 10 μL av denna suspension i PDA vid 28 °C i mörker.
      Anm.: 10 μl av denna suspension kommer att innehålla samma antal konidier (8 x 104) som användes för att infektera makrofagerna från mononukleär utvinning i blodet. Skillnaden mellan denna positiva kontroll och den som nämns i steg 5.1.2 är att den kontroll som nämns ovan i steg 5.1.2 används för att utvärdera den möjliga effekten av R10-mediet på Trichodermas tillväxt under tiden för fagocytos. Denna positiva kontroll i steg 5.2.5 med suspension av T. stromaticum conidia som samlats in i PBS representerar en kontroll av Trichoderma-tillväxt utan påverkan av R10-medium för att återspegla hur svampen växer naturligt. Med hjälp av denna kontroll är det möjligt att utvärdera om R10-mediet påverkar Trichoderma-tillväxten .
    6. Observera tillväxtkinetiken hos T. stromaticum i PDA varje dag och fotografera kulturen.
    7. Analys: Två punkter kan användas för att utvärdera resultaten: 1) den tid (i dagar) som krävs för att kulturen ska uppta hela odlingsplattan, och 2) tiden (i dagar) tills den karakteristiska gröna pigmenteringen av T. stromaticum conidia uppträder i kulturen.

6. Statistisk analys

  1. Använd ett Kruskal-Wallis-test för att bestämma statistiskt signifikanta skillnader mellan de 8 grupperna/behandlingarna. Betrakta p < 0,05 som statistiskt signifikant. Alla data presenteras som medelvärden ± standardavvikelse (SD). I figurerna anger # statistisk signifikans vid p < 0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tekniken som involverar fagocytos av svampkonidier av makrofager används i stor utsträckning för studier som utvärderar moduleringen av immunsvaret mot svampar. Vi använde fagocytos av T. stromaticum conidia för att bedöma livskraften hos konidierna efter fagocytos, eftersom undvikande av fagocytos och flykt av fagosomer är mekanismer för svampvirulens. Forskare bör utföra dessa tekniker som en av de första analyserna när de undersöker en art av kliniskt intresse.

Figure 2
Figur 2: Fagocytos av T. stromaticum conidia av humana mononukleära makrofager från perifert blod. Representativa resultat av fagocytoskinetik (A) under 40x och (B) 100x objektiv som visar PBMC-härledda makrofager innehållande T. stromaticum conidia. C) T. stromaticum conidia fri och fäst vid det yttre membranet. (D) T. stromaticum conidia helt internaliserad av makrofager; E) T. stromaticum conidia i ett övre plan. F) Multipel fagocytos. och (G) konidia groning inuti (H) och utanför makrofagerna. Pilar: gula, fria konidier; vit, konidier fäst vid det yttre membranet; svart, helt internaliserad konidier; röd, konidia groning inuti makrofagerna. Streckade pilar: svarta, multipel fagocytos; röd, konidier som gror i R10-mediet utanför makrofagerna; vit, konidier i övre planet. Skalstapeln visar 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2 visar de representativa resultaten av fagocytoskinetiken. I början av fagocytosprocessen kan fri T. stromaticum conidia observeras, liksom konidier som är fästa vid makrofagernas yttre membran eller helt internaliserade av dem (Figur 2A-C). Färre konidier kan observeras fria eller fästa vid makrofagernas yttre membran med ökande fagocytostid.

Noterbart är att i detta arbete kunde konidier hittas fria och fästa vid det yttre membranet (Figur 2C) i början av fagocytosprocessen, helt internaliserade av makrofagerna (Figur 2D), eller i ett övre plan jämfört med makrofagerna (Figur 2E) men inte fagocytoserade, och mer än ett konidium kunde hittas i samma makrofag (Figur 2F). Efter långa tidsperioder (96 timmar) kunde fagocytoserade konidier gro inuti makrofagerna (Figur 2G), och fria konidier kunde gro i R10-mediet för att bilda hyfer vid 37 °C (Figur 2H).

Efter fagocytos var det möjligt att observera att T. stromaticum conidia förblev livskraftig även efter 120 timmars interaktion med de humana PBMC-härledda makrofagerna. De representativa resultaten visar odlingen av återfunna konidier (Figur 3A) och representerar den tid (i dagar) som krävs för att kulturen ska uppta hela odlingsplattan (Figur 3B) och bilda färgade gröna konidier (Figur 3C). Endast diskreta T. stromaticum conidia kunde undgå fagosomen och hittas fri i cytoplasman hos de humana mononukleära makrofagerna i perifert blod29. Trichodermas förmåga att minska produktionen av reaktiva syre- och kväveföreningar kan också bidra till överlevnaden av konidier inuti fagosomen och förklara livskraften efter fagocytos 28,29,36. Hittills har vi visat att de fagocytoserade konidierna förblir livskraftiga och kan växa i PDA-mediet även efter 120 timmar. Andra mikroorganismer har också rapporterats överleva efter att ha uppslukats av makrofager, såsom Aspergillus27,37 och Cryptococcus38.

Figure 3
Figur 3: Clearanceförmåga hos humana mononukleära makrofager från perifert blod infekterade med T. stromaticum conidia. Efter en provokation med T. stromaticum conidia (3 timmar, 24 timmar, 48 timmar, 72 timmar, 96 timmar eller 120 timmar) lyserades de PBMC-härledda makrofagerna och suspensionen pläterades i PDA för att utvärdera livskraften hos den fagocytoserade konidien. (A) Representativa resultat av T. stromaticum-tillväxt efter fagocytos med PBMC-härledda makrofager visas. Övervakning av (B) T. stromaticum-tillväxten och (C) konidiationen på olika dagar för den positiva kontrollen med T. stromaticum i PBS (se steg 5.2.5), kontrollen för R10-mediet (se steg 5.1.2) och konidifagocytoserad av makrofager under olika tidsperioder (3 timmar, 24 timmar, 48 timmar, 72 timmar, 96 timmar, 120 timmar). Representativa resultat från fyra friska donatorer. Genomsnittlig ± standardavvikelse (SD). Kruskal-Wallis-testet. Symbolen # anger signifikans vid p < 0,05, n = 4. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

För flera svamppatogener inklusive Aspergillus fumigatus, Cryptococcus, Candida albicans och andra, är konidial eller jästfagocytos en nyckelprocess som möjliggör undersökning av cytoplasmatiska och molekylära händelser i makrofag-patogeninteraktioner, såväl som för bestämning av tidpunkten för döden av den internaliserade konidien 14,39,40. Fagocytos är nyckelprocessen i interaktionen mellan Trichoderma och värd. Trichoderma-släktet modulerar flera fagocytosvägar, inklusive Dectin-1 och Dectin-2, Toll-liknande receptor 2 och Toll-liknande receptor 4, MHC och NF-κB 25,28,41,42,43. Trichodermi orsakar trihodermos hos komprometterade och icke-immunsupprimerade individer9. Det är viktigt att notera att flera arter av detta släkte används inom jordbruket och är den potentiella källan till trichodermos. Det finns ett akut behov av att förstå virulensfaktorerna hos T. stromaticum och mekanismen för immunsvaret i människokroppen mot dessa svampar, eftersom yrkesriskerna orsakade av Trichoderma-arterna, inklusive T. stromaticum, ökar på ett oroväckande sätt. Metoden som presenteras här ger detaljer för att utföra fagocytos- och avdödningsanalysen för att studera Trichoderma-makrofag-interaktionen i humana makrofager som härrör från perifert blod; Denna metod kan dock också användas för att studera makrofager från olika vävnader, inklusive alveolära, peritoneala eller härstamningsmakrofager.

Det första steget i detta protokoll börjar med en moderstamssuspension (M1) för att erhålla färska kulturer av svampen. Trichoderma-kulturer växer snabbt, eftersom de vanligtvis tar över hela plattan och börjar visa grönfärgade konidier inom 5 dagar. Temperaturen och ljuset är avgörande faktorer för Trichodermas tillväxt, och förändringar i dessa faktorer kan påverka Trichodermas kinetik och äventyra experimentet44.

Efter tvättning av T. stromaticum-kulturen bör en slutlig volym på mellan 5 och 8 ml återvinnas. Suspensionens färgintensitet är proportionell mot konidiakoncentrationen. Den erhållna konidiesuspensionen kan användas för in vitro- och in vivo-analyser, t.ex. för bedömning av fagocytos26, neutrofila extracellulära fällor28, intranasal exponering36,41, intraperitoneal exponering26, intrakutan infektion45 och intravenös infektion46. Tidigare forskning utförd med mänskliga makrofager har utvärderat autofagi inducerad av Trichoderma29 och släktets förmåga att hämma bildandet av extracellulära fällor i neutrofiler28, vilket är en mekanism som används för att eliminera svamppatogener och andra mikroorganismer.

Det är viktigt att notera att odlingsmediet som används för att underhålla cellerna kan påverka konidiell groning (Figur 3G,H). Om groning inte är önskvärd för ett visst experiment rekommenderar vi att du utför en första screeninganalys med cellodlingsmediet för att fastställa tillväxtkinetiken för Trichoderma i just det mediet. Denna analys bör utföras innan in vitro-försöken med den önskade cellinjen inleds, och försöket bör avbrytas efter 72 timmar om mediet inte är kompatibelt. Groningen av Trichoderma conidia (Figur 3G,H) kan observeras från 96h inuti och utanför makrofagerna.

Eftersom Trichoderma-arter uppvisar skillnader i morfologi och optimal temperatur och pH för deras tillväxt, kan det hända att resultaten som presenteras här inte är reproducerbara för alla arter i släktet, och detta protokoll kan behöva anpassas när det utförs med andra arter. Som ett exempel gror Trichoderma asperelloides conidia snabbare i odling än de av T. stromaticum.

Tidigare dokumenterade protokoll för att utvärdera fagocytos och avdödning av patogenen med hjälp av flödescytometri och fluorescensmikroskopi kräver dyra reagenser, men de ger specifik information om fagocytosprocessen19. Protokollet som presenteras i den här artikeln kräver endast ett optiskt mikroskop och platttillväxt för att utvärdera fagocytos och ger omfattande bilder av fagocytosprocessen. Olika protokoll kan användas för att erhålla differentierade makrofager och inducera makrofaglys. Dessa protokoll inkluderar användning av olika tidpunkter för makrofagdifferentiering i stället för de 7 dagar som används här26 eller användning av 2,5 % deoxikolat47 för att lysera makrofagerna i stället för destillerat vatten vid 37 °C och 5 % CO2 i 30 minuter, som används här i detta protokoll. Dessa metoder har använts effektivt för olika svamparter som A. fumigatus27, A. nidulans18 och Cryptococcus neoformans15.

Vissa begränsningar i detta protokoll är relaterade till användningen av PBS som inte är endotoxinfri, användningen av runda glastäcken och användningen av humant blod. Vi rekommenderar att du testar PBS (inte endotoxinfri) på celler för att säkerställa att den inte kan aktivera monocyterna och påverka experimentet. Användningen av runda glastäcken är mycket användbar för färgning och räkning av cellerna, men cellerna kanske inte sprider sig jämnt under glaset, eftersom vissa celler migrerar till kanten av plattan väl, och denna skillnad kan ha en inverkan på det uppskattade totala cellantalet i de runda glastäckena. Eftersom vi inte använder immunofluorescens eller liknande tekniker i detta protokoll, kan närvaron av icke-fagocytoserade konidier i ett övre plan jämfört med makrofagerna leda till feltolkning av fagocytosresultaten. Eftersom vi använder blod från mänskliga donatorer varierar det slutliga PBMC-antalet mellan donatorerna, och lågt antal donatorceller kanske inte är tillräckligt för alla experiment.

Sammanfattningsvis kan dessa tekniker användas för att mäta funktionen hos makrofager och svampelimineringen, specifikt för filamentösa svampar som Trichoderma och andra mikrober, såsom jäst och bakterier. Dessutom ger detta protokoll framtida riktningar för att studera verklig variabilitet i immunsvaret mot konidibildande svampar i mänskliga populationer, som inte kan observeras med hjälp av isogena djurmodeller eller cellinjer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Samtliga författare uppger att det inte föreligger några intressekonflikter.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av följande brasilianska finansinstitut: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) med bidrag RED0011/2012 och RED008/2014. U.R.S., J.O.C. och M.E.S.M. erkänner stipendiet som beviljats av Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) respektive FAPESB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL centrifuge tubes Corning CLS431470 15 mL centrifuge tubes, polypropylene, conical bottom with lid, individually sterile
24-Well Flat Bottom Cell Culture Plate Kasvi K12-024 Made of polystyrene with alphanumeric identification; The Cell Culture Plate is DNase, RNase and pyrogen-free and free of cytotoxic substances; Sterilized by gamma radiation;
Cell culture CO2 incubator Sanyo 303082 A CO2 incubator serves to create and control conditions similar to a human body, thus allowing the in vitro growth and proliferation of different cell types.
Centrifuge Microtube (eppendorf type) 1.5 mL Capp 5101500 Made from polypropylene, with a cap attached to the tube for opening and closing with just one hand. It has a polished interior against protein adhesion and for sample visibility, being free of DNase, RNase and Pyrogens
Circular coverslip 15 mm Olen K5-0015 Circular coverslips are used for microscopy techniques in cell culture. Made of super transparent translucent glass; with thickness of 0.13 mm
Class II Type B2 (Total Exhaust) Biosafety Cabinets Esco Lifesciences group 2010274 Airstream Class II Type B2 Biosafety Cabinets (AB2) provide product, operator and environmental protection and are suitable for work with trace amounts of toxic chemicals and agents assigned to biological safety levels I, II or III. In a Class II Type B2 cabinet, all inflow and downflow air is exhausted after HEPA/ULPA filtration to the external environment without recirculation across the work surface.
Dextrose Potato Agar medium Merck 145 Potato Dextrose Agar is used in the cultivation and enumeration of yeasts and fungi
EDTA vacuum blood collection tube FirstLab FL5-1109L EDTA is the recommended anticoagulant for hematology routines as it is the best anticoagulant for preserving cell morphology.
Entellan Merck 1.07961  Fixative agent; Entellan is a waterless mounting medium for permanent mounting for microscopy.
Fetal Bovine Serum Gibco A2720801 Fetal bovine serum (FBS) is a universal growth supplement of cell and tissue culture media. FBS is a natural cocktail of most of the factors required for cell attachment, growth, and proliferation, effective for most types of human and animal (including insect) cells.
Flaticon  database of images
Glycerol Merck 24900988 The cryoprotectant agent glycerol is used for freezing cells and spores
Histopaque-1077 polysucrose solution
Image J  Image analysis software
Microscopy slides Precision 7105 Slide for Microscopy 26 x 76 mm Matte Lapped Thickness 1.0 to 1.2 mm. Made of special optical glass and packaged with silk paper divider with high quality transparency free of imperfections
Mini centrifuge Prism C1801 The Prism Mini Centrifuge was designed to be extremely compact with an exceptionally small footprint. Includes 2 interchangeable quick-release rotors that spin up to 6000 rpm. An electronic brake provides quick deceleration and the self-opening lid allows easy access to the sample, reducing handling time.
Neubauer chamber Kasvi K5-0011 The Neubauer Counting Chamber is used for counting cells or other suspended particles.
Panoptic fast  Laborclin 620529 Laborclin's  panoptic fast c is a kit for quick staining in hematology
Penicillin/Streptomycin Solution - 10,000U LGC- Biotechnology  BR3011001 antibiotic is used in order to avoid possible contamination by manipulation external to the laminar flow.
Petri dish 90 x 15 mm Smooth Cralplast 18248 Disposable Petri dish; Made of highly transparent polystyrene (PS); flat bottom; Smooth;Size: 90 x 15 mm.
Phosphate buffered saline (PBS) thermo fisher Scientific 10010001 PBS is a water-based saline solution with a simple formulation. It is isotonic and non-toxic to most cells. It includes sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock while maintaining the water balance of living cells.
Pipette Pasteur 3 mL Sterile Accumax AP-3-B-S STERILE ACCUMAX PASTEUR 3 ML PIPETTE with 3 mL capacity, made of transparent low-density polyethylene (LDPE) and individually sterile
Refrigerated Centrifuge Thermo Scientific TS-HM16R The Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R Refrigerated Centrifuge is a refrigerated centrifuge with the user-friendly control panel makes it easy to pre-set the speed, RCF value, running time, temperature, and running profile. The Megafuge 16R can reach maximum speeds of 15,200 RPM and maximum RCF of 25,830 x g.
RPMI-1640 Medium Merck MFCD00217820 HEPES Modification, with L-glutamine and 25 mM HEPES, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture
The single channel micropipettes Eppendorf Z683809 Single-channel micropipettes are used to accurately transfer and measure very small amounts of liquids.
Tip for Micropipettor Corning 4894 Capacity of 10 µL and 1,000 µL Autoclavable
Triocular inverted microscope LABOMED VU-7125500 It allows you to observe cells inside tubes and bottles, without having to open them, thus avoiding contamination problems.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Samuels, G. J. Trichoderma: A review of biology and systematics of the genus. Mycological Research. 100 (8), 923-935 (1996).
  2. Nevalainen, H., Peterson, R. Chapter 7 - Heterologous expression of proteins in Trichoderma. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  3. Do Vale, L. H. F., Filho, E. X. F., Miller, R. N. G., Ricart, C. A. O., de Sousa, M. V. Chapter 16 - Cellulase systems in Trichoderma: An overview. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  4. Ferreira, N. L., Margeot, A., Blanquet, S., Berrin, J. G. Chapter 17 - Use of cellulases from Trichoderma reesei in the twenty-first century part I: Current industrial uses and future applications in the production of second ethanol generation. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  5. Puranen, T., Alapuranen, M., Vehmaanperä, J. Chapter 26 - Trichoderma enzymes for textile industries. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  6. Kunamneni, A., Plou, F. J., Alcalde, M., Ballesteros, A. Chapter 24 - Trichoderma enzymes for food industries. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  7. Mukherjee, P. K., Horwitz, B. A., Herrera-Estrella, A., Schmoll, M., Kenerley, C. M. Trichoderma research in the genome era. Annual Review of Phytopathology. 51 (1), 105-129 (2013).
  8. Mukherjee, M., et al. Trichoderma-plant-pathogen interactions: Advances in genetics of biological control. Indian Journal of Microbiology. 52 (4), 522-529 (2012).
  9. dos Santos, U. R., dos Santos, J. L. Trichoderma after crossing kingdoms: Infections in human populations. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B. 26 (2), 97-126 (2023).
  10. Asis, A., et al. Identification patterns of Trichoderma strains using morphological characteristics, phylogenetic analyses and lignocellulolytic activities. Molecular Biology Reports. 48 (4), 3285-3301 (2021).
  11. Antal, Z., et al. Comparative study of potential virulence factors in human pathogenic and saprophytic Trichoderma longibrachiatum strains. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. 52 (3-4), 341-350 (2005).
  12. Hatvani, L., Manczinger, L., Vágvölgyi, C., Kredics, L. Trichoderma as a human pathogen. Trichoderma: Biology and Applications. Mukherjee, P. K., Horwitz, B. A., Singh, U. S., Mukherjee, M., Schmoll, M. , Wallingford, UK. (2013).
  13. Kredics, L., et al. Clinical importance of the genus Trichoderma: A review. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. 50 (2-3), 105-117 (2003).
  14. Erwig, L. P., Gow, N. A. R. Interactions of fungal pathogens with phagocytes. Nature Reviews Microbiology. 14 (3), 163-176 (2016).
  15. Nicola, A. M., Casadevall, A. In vitro measurement of phagocytosis and killing of Cryptococcus neoformans by macrophages. Methods in Molecular Biology. 844, 189-197 (2012).
  16. Medina, E., Goldmann, O. In vivo and ex vivo protocols for measuring the killing of extracellular pathogens by macrophages. Current Protocols in Immunology. , Chapter 14, Unit 14 1-17 (2011).
  17. Drevets, D. A., Canono, B. P., Campbell, P. A. Measurement of bacterial ingestion and killing by macrophages. Current Protocols in Immunology. 109, 1-17 (2015).
  18. Gresnigt, M. S., et al. Differential kinetics of Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus phagocytosis. Journal of Innate Immunity. 10 (2), 145-160 (2018).
  19. Steinberg, B. E., Grinstein, S. Analysis of macrophage phagocytosis: Quantitative assays of phagosome formation and maturation using high-throughput fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 531, 45-56 (2009).
  20. Yan, Q., Ahn, S. H., Fowler, V. G. Macrophage phagocytosis assay of Staphylococcus aureus by flow cytometry. Bio-Protocol. 5 (4), 1406 (2015).
  21. Marr, K. A., Koudadoust, M., Black, M. Early events in macrophage killing of Aspergillus fumigatus conidia New flow cytometric viability assay. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1240-1247 (2001).
  22. Surewaard, B. G. J., Kubes, P. Measurement of bacterial capture and phagosome maturation of Kupffer cells by intravital microscopy. Methods. 128, 12-19 (2017).
  23. Siggins, M. K., et al. Differential timing of antibody-mediated phagocytosis and cell-free killing of invasive African Salmonella allows immune evasion. European Journal of Immunology. 44 (4), 1093-1098 (2014).
  24. Cannon, G. J., Swanson, J. A. The macrophage capacity for phagocytosis. Journal of Cell Science. 101 (4), 907-913 (1992).
  25. Harvath, L., Terle, D. A. Assay for phagocytosis. Methods in Molecular Biology. 115, 281-290 (1999).
  26. dos Santos, A. G., et al. Trichoderma asperelloides spores downregulate dectin1/2 and TLR2 receptors of mice macrophages and decrease Candida parapsilosis phagocytosis independent of the M1/M2 polarization. Frontiers in Microbiology. 8, 1681 (2017).
  27. Souza, J. A. M., et al. Characterization of Aspergillus fumigatus extracellular vesicles and their effects on macrophages and neutrophils functions. Frontiers in Microbiology. 10, 2008 (2019).
  28. Oliveira-Mendonça, L. S., et al. Inhibition of extracellular traps by spores of Trichoderma stromaticum on neutrophils obtained from human peripheral blood. Molecular Immunology. 141, 43-52 (2022).
  29. Oliveira-Mendonça, L. S., et al. Trichoderma stromaticum spores induce autophagy and downregulate inflammatory mediators in human peripheral blood-derived macrophages. Current Research in Microbial Sciences. 3, 100145 (2022).
  30. Johnston, L., Harding, S. A., La Flamme, A. C. Comparing methods for ex vivo characterization of human monocyte phenotypes and in vitro responses. Immunobiology. 220 (12), 1305-1310 (2015).
  31. Abedon, S. T., Bartom, E. Multiplicity of infection. Brenner's Encyclopedia of Genetics. Second Edition. Maloy, S., Hughes, K. , Academic Press. Cambridge, MA. (2013).
  32. Rios, F. J., Touyz, R. M., Montezano, A. C. Isolation and differentiation of human macrophages. Methods in Molecular Biology. 1527, 311-320 (2017).
  33. Lombard, Y., Giaimis, J., Makaya-Kumba, M., Fonteneau, P., Poindron, P. A new method for studying the binding and ingestion of zymosan particles by macrophages. Journal of Immunological Methods. 174 (1-2), 155-165 (1994).
  34. Ghoneum, M., Gollapudi, S. Phagocytosis of Candida albicans by metastatic and non metastatic human breast cancer cell lines in vitro. Cancer Detection and Prevention. 28 (1), 17-26 (2004).
  35. Nunes, J. P. S., Dias, A. A. M. ImageJ macros for the user-friendly analysis of soft-agar and wound-healing assays. BioTechniques. 62 (4), 175-179 (2017).
  36. Alves-Filho, E. R., et al. The biocontrol fungus Trichoderma stromaticum downregulates respiratory burst and nitric oxide in phagocytes and IFN-gamma and IL-10. Journal of Toxicology and Environmental Health - Part A: Current Issues. 74 (14), 943-958 (2011).
  37. Slesiona, S., et al. Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages. PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).
  38. Johnston, S. A., May, R. C. Cryptococcus interactions with macrophages: Evasion and manipulation of the phagosome by a fungal pathogen. Cellular Microbiology. 15 (3), 403-411 (2013).
  39. Alonso, M. F., et al. The nature of the fungal cargo induces significantly different temporal programmes of macrophage phagocytosis. The Cell Surface. 8, 100082 (2022).
  40. Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. Interaction of phagocytes with filamentous fungi. Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).
  41. Dos Santos, U. R., et al. Exposition to biological control agent Trichoderma stromaticum increases the development of cancer in mice injected with murine melanoma. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 252 (2020).
  42. Wang, G., et al. Exopolysaccharide from Trichoderma pseudokoningii induces macrophage activation. Carbohydrate Polymers. 149, 112-120 (2016).
  43. Xu, Y., et al. Exopolysaccharide from Trichoderma pseudokoningii promotes maturation of murine dendritic cells. International Journal of Biological Macromolecules. 92, 1155-1161 (2016).
  44. Schmoll, M., Esquivel-Naranjo, E. U., Herrera-Estrella, A. Trichoderma in the light of day - Physiology and development. Fungal Genetics and Biology. 47 (11), 909-916 (2010).
  45. Zhang, G., Li, D. Trichoderma longibrachiatum-associated skin inflammation and atypical hyperplasia in mouse. Frontiers in Medicine. 9, 865722 (2022).
  46. Paredes, K., Capilla, J., Mayayo, E., Guarro, J. Virulence and experimental treatment of Trichoderma longibrachiatum, a fungus refractory to treatment. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (8), 5029-5032 (2016).
  47. Perkhofer, S., Speth, C., Dierich, M. P., Lass-Flörl, C. In vitro determination of phagocytosis and intracellular killing of Aspergillus species by mononuclear phagocytes. Mycopathologia. 163 (6), 303-307 (2007).

Tags

Viabilitetsanalys Trichoderma Stromaticum Conidia humana mononukleära makrofager i perifert blod fagocytos interaktioner mellan makrofag och patogen immunsvar mot svampar fagosomflykt svampvirulens biologiskt bekämpningsmedel biogödselmedel humana infektioner trichodermakultur tvättkonidier mononukleära celler i perifert blod (PBMC) makrofagdifferentiering in vitro-fagocytosmetod clearanceanalys svampclearanceeffektivitet
Viabilitetsanalys av <em>Trichoderma stromaticum</em> Conidia inuti humana mononukleära makrofager i perifert blod
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

dos Santos, U. R., de Castro, J. O., … More

dos Santos, U. R., de Castro, J. O., Santos Matos, M. E., De Bonis, G., dos Santos, J. L. Viability Assay of Trichoderma stromaticum Conidia Inside Human Peripheral Blood Mononuclear-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (200), e65231, doi:10.3791/65231 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter