Summary
Denne protokol beskriver det obligatoriske fodringsassay for at evaluere den potentielt toksiske virkning af et fytokemisk på de lepidopteranske insektlarver. Dette er et meget skalerbart insektbioassay, let at optimere den subletale og dødelige dosis, afskrækkende aktivitet og fysiologisk effekt. Dette kan bruges til screening af miljøvenlige insekticider.
Abstract
Helicoverpa armigera, et lepidopteran insekt, er et polyfagisk skadedyr med en verdensomspændende distribution. Dette planteædende insekt er en trussel mod planter og landbrugsproduktivitet. Som reaktion producerer planter flere fytokemikalier, der negativt påvirker insektets vækst og overlevelse. Denne protokol demonstrerer en obligatorisk fodringsanalysemetode til evaluering af effekten af en fytokemisk (quercetin) på insektvækst, udvikling og overlevelse. Under kontrollerede forhold blev de nyfødte opretholdt indtil den anden stjerne på en foruddefineret kunstig diæt. Disse andenstjernelarver fik lov til at fodre på en kontrol- og quercetinholdig kunstig diæt i 10 dage. Insekternes kropsvægt, udviklingsstadium, frass vægt og dødelighed blev registreret på alternative dage. Ændringen i kropsvægt, forskellen i fodringsmønster og udviklingsfænotyper blev evalueret gennem hele analysetiden. Det beskrevne obligatoriske fodringsassay simulerer en naturlig indtagelsesmåde og kan skaleres op til et stort antal insekter. Det tillader en at analysere fytokemikaliernes virkning på vækstdynamikken, udviklingsovergangen og den generelle egnethed af H. armigera. Desuden kan denne opsætning også bruges til at evaluere ændringer i ernæringsparametre og fordøjelsesfysiologiske processer. Denne artikel indeholder en detaljeret metode til fodring af analysesystemer, som kan have anvendelser i toksikologiske undersøgelser, screening af insekticidmolekyler og forståelse af kemiske virkninger i plante-insektinteraktioner.
Introduction
De biotiske faktorer, der påvirker afgrødeproduktiviteten, er hovedsageligt patogene stoffer og skadedyr. Flere skadedyr forårsager 15-35 % af tabet af landbrugsafgrøder og påvirker den økonomiske bæredygtighedspraksis1. Insekter, der tilhører ordrerne Coleoptera, Hemiptera og Lepidoptera, er de største ordrer af ødelæggende skadedyr. Miljøets meget adaptive natur har gavnet lepidopteraner i udviklingen af flere overlevelsesmekanismer. Blandt lepidopteranske insekter kan Helicoverpa armigera (bomuldsbollorm) fodre på omkring 180 forskellige afgrøder og forårsage betydelig skade på deres reproduktive væv2. På verdensplan har H. armigera-angreb resulteret i et tab på omkring 5 milliarder dollars3. Bomuld, kikærter, dueærter, tomater, solsikke og andre afgrøder er værter for H. armigera. Det fuldender sin livscyklus på forskellige dele af værtsplanter. Æg lagt af kvindelige møller bliver udklækket på bladene, efterfulgt af deres fodring på vegetative væv under larvestadier. Larvestadiet er det mest ødelæggende på grund af dets glubske og meget tilpasningsdygtige natur 4,5. H. armigera viser en global fordeling og indgreb i nye territorier på grund af dets bemærkelsesværdige egenskaber, såsom polyfagi, fremragende migrationsevner, højere frugtbarhed, stærk diapause og fremkomsten af resistens over for eksisterende insektbekæmpelsesstrategier6.
Forskellige kemiske molekyler fra terpener, flavonoider, alkaloider, polyphenoler, cyanogene glucosider og mange andre anvendes i vid udstrækning til bekæmpelse af H. armigera-angreb 7. Imidlertid giver hyppig anvendelse af kemiske molekyler negative virkninger på miljøet og menneskers sundhed på grund af erhvervelsen af deres rester. De viser også en skadelig virkning på forskellige skadedyrsbekæmpere, hvilket resulterer i en økologisk ubalance 8,9. Derfor er det nødvendigt at undersøge sikre og miljøvenlige muligheder for kemiske molekyler til skadedyrsbekæmpelse.
Naturlige insekticide molekyler produceret af planter (fytokemikalier) kan bruges som et lovende alternativ til kemiske pesticider. Disse fytokemikalier omfatter forskellige sekundære metabolitter, der tilhører klasserne alkaloider, terpenoider og phenoler 7,10. Quercetin er en af de mest rigelige flavonoider (phenolforbindelse), der findes i forskellige korn, grøntsager, frugter og blade. Det viser fodring afskrækkende og insekticid aktivitet mod insekter; Det er heller ikke skadeligt for naturlige fjender af skadedyr11,12. Således demonstrerer denne protokol fodringsanalysen ved hjælp af quercetin til vurdering af dens toksiske virkning på H. armigera.
Forskellige bioassaymetoder er blevet udviklet til at evaluere effekten af naturlige og syntetiske molekyler på et insekts fodring, vækst, udvikling og adfærdsmønstre13. Almindeligt anvendte metoder inkluderer bladskiveanalysen, valgfodringsanalyse, dråbefodringsanalyse, kontaktanalyse, diætdækkende assay og obligatorisk fodringsanalyse13,14. Disse metoder klassificeres ud fra, hvordan pesticider anvendes på insekter. Det obligatoriske fodringsassay er en af de mest almindeligt anvendte, følsomme, enkle og tilpasningsdygtige metoder til at teste sandsynlige insekticider og deres dødelige dosis14. I et obligatorisk fodringsassay blandes molekylet af interesse med en kunstig kost. Dette giver konsistens og kontrol over kostsammensætningen, hvilket genererer robuste og reproducerbare resultater. Vigtige variabler, der påvirker fodringsassays, er insektets udviklingsstadium, valg af insekticid, miljøfaktorer og prøvestørrelse. Varigheden af analysen, intervallet mellem to dataregistreringer, hyppigheden og mængden af fodret foder, insekternes sundhed og operatørernes håndteringsevne kan også påvirke resultatet af fodringsassays 14,15.
Denne undersøgelse har til formål at demonstrere det obligatoriske fodringsassay for at evaluere effekten af quercetin på H. armigera overlevelse og kondition. Vurdering af forskellige parametre, såsom insektets kropsvægt, dødelighed og udviklingsfejl, vil give indsigt i de insekticide virkninger af quercetin. I mellemtiden vil måling af ernæringsmæssige parametre, herunder effektiviteten af omdannelse af indtaget mad (ECI), effektiviteten af omdannelsen af fordøjet mad (ECD) og omtrentlig fordøjelighed (AD), fremhæve quercetins antifeederende egenskaber.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
H. armigera larver blev erhvervet fra ICAR-National Bureau of Agricultural Insect Resources (NBAIR), Bangalore, Indien. I alt 21 anden instar larver blev brugt til denne undersøgelse.
1. Tilberedning af kikærtbaseret kunstig diæt
BEMÆRK: En liste over ingredienser, der kræves til tilberedning af en kunstig diæt, er nævnt i tabel 1.
- Alle fraktionerne afvejes separat i et bægerglas, jf. tabel 1, og der fremstilles en homogen blanding ved hjælp af en spatel/magnetisk omrører.
- Kog fraktion C ved ca. 100 °C ved hjælp af en mikrobølgeovn i 5 minutter, tilsæt til fraktion A, og bland den grundigt.
- Efter grundig blanding skal du lade den blandede fraktion køle lidt af, før du tilføjer fraktion B (fraktion B indeholder varmelabile komponenter).
- Hæld i en gennemsigtig, polystyren, 150 mm x 150 mm petriskål.
2. Tilberedning af quercetinholdig kunstig diæt
- Afvej den passende mængde (1.000 ppm) quercetinhydrat (se materialetabellen) og opløs det korrekt i minimumsvolumenet af organiske opløsningsmidler, såsom ethanol (2 mg / ml), dimethylsulfoxid (DMSO; 30 mg / ml) eller dimethylformamid (DMF). Her bruges DMSO til opløsning af quercetin.
- Der tilsættes opløst quercetin i fraktion B efterfulgt af tilsætning til blandingen af fraktionerne A og C (mængden af vand reduceret fra fraktion B er lig med mængden af tilsat DMSO).
- Tilsæt et tilsvarende volumen organisk opløsningsmiddel, der anvendes til opløsning af quercetin i kontroldiet.
BEMÆRK: Figur 1 viser den skematiske repræsentation af tilberedning af kunstige og quercetinholdige diæter.
3. Opdræt og vedligeholdelse af H. armigera-kulturen
BEMÆRK: Brug passende rengjorte og steriliserede materialer til insektopdræt og vedligeholdelse. Håndter insekterne omhyggeligt ved at følge al sterilitets- og sikkerhedsrelateret standardpraksis 16,17,18.
- Opbevar H. armigera-æg i avlskammeret (plastikbeholder dækket med musselinklud) under opretholdte forhold som beskrevet i trin 3.3. Overfør derefter forsigtigt nyfremkomne nyfødte ved hjælp af en fin pensel på en frisklavet kikærtebaseret kunstig kost.
- Brug en kunstig diæt til opdræt af larverne og 20% (w / v) saccharoseopløsning med 1% (w / v) multivitamin (se materialetabel) til voksne møl19,20.
BEMÆRK: Da tredje og ældre stjernelarver af H. armigera viser en kannibalistisk tendens, er det nødvendigt at opdrætte hver larve i et separat hætteglas. - Hold temperaturen på 25 ± 1 °C og den relative luftfugtighed på 70 % i insektkulturrummet med en 16 timers lys:8 h mørk fotoperiode21.
- Bageste en generation af insekter i laboratoriet for homogenitet og brug den derefter til fodringsanalyse.
- Forøg eventuelt temperaturen i insektkulturrummet til 28 °C for at fremskynde væksten af larver og pupper22.
4. Opsætning til fodringsanalyse
- Saml 21 sekunders stjernelarver for hvert sæt (kontrol og behandling) og hold dem væk fra kosten i ca. 1-3 timer.
- Skær kontrol- og quercetinholdig diæt i små stykker, registrer vægten af den givne diæt og insektets krop, og overfør forsigtigt insekterne til kulturhætteglas. Lad insekterne fodre på den respektive diæt.
BEMÆRK: Dette skal betragtes som dag 0 i fodringsanalysen. - Registrer vægten af insektkroppen, givet kost, ufortyndet diæt og frass på alternative dage (dag 2, 4, 6, 8 og 10) indtil den 10. analysedag.
- Efter dag 10 skal du holde dem fodring på deres respektive kost for at observere yderligere udviklingsmæssige og morfologiske ændringer.
BEMÆRK: Udviklingsændringerne ved hjælp af: (1) larve-puppe-mellemprodukter, såsom den bageste halve krop af pupper med larvebåndspletter, en hovedkapsel og brystben; (2) prepupae med en helt sort krop; (3) underdimensionerede pupper med kropskrympning; (4) Puppe-møl mellemliggende møl med den gamle puppehud. Morfologiske ændringer omfatter misdannede møl voksne med unormale kroppe, snoede vinger og ledede ben. Disse ændringer sammenlignes derefter med insekter fodret med kontroldiet. - Frys insekterne på dag 10, hvis undersøgelsen af udviklingsmæssige og morfologiske defekter ikke er påkrævet.
BEMÆRK: Før frysning af larverne skal de holdes berøvet kosten i mindst 3 timer for at fjerne resterende kost fra fordøjelseskanalen.
5. Registrering og analyse af data
- I GraphPad Prism-software (se Materialetabel) skal du vælge en XY-datatabel fra dialogboksen "Velkommen eller ny tabel" og indtaste antallet af insekter, der replikerer værdier side om side i underkolonnerne. Giv derefter titelnavnet til X-aksen som antal dage, og giv titelnavnet i gruppe A og B som henholdsvis kontrol- og quercetinbehandling. Sæt kropsvægten for hvert insekt under kontrol og behandling for at generere kropsvægtgrafen.
BEMÆRK: Analyse i GraphPad kan variere afhængigt af prøvestørrelsen og antallet af behandlinger. - Sammenlign insektets kropsvægt mellem kontrol- og behandlingsgrupperne ved hjælp af en elev-t-test (α = 0,05).
- Tæl de levende og døde larver og pupper på dag 10 for at plotte en Kaplan-Meier-kurve for overlevelsesprocent ved hjælp af grafsoftwaren.
- Tæl antallet af pupper og beregn procentdelen af hvalpen ved hjælp af den givne formel:
- Procentdel af forpupninger (%) = (antal dannede pupper/samlet antal larver) x 100
- Larveudviklingen sammenlignes i form af ernæringsindeks23 ved hjælp af følgende formler, ECI (%) = (vægtforøgelse af larver/vægt af spist foder) x 100
ECD (%) = (vægtøgning af larver/[vægt af spist foder - vægt af frass]) x 100
AD (%) = ([vægt af spist foder - vægt af frass]/vægt af spist foder) x 100
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Insektlarver fodret med en diæt indeholdende 1.000 ppm quercetin viste et signifikant fald i kropsvægt på ~ 57% sammenlignet med kontrolgruppen (figur 2A). Reduktionen i kropsvægt resulterede i en reduceret kropsstørrelse af quercetinbehandlede larver (figur 2B). Der blev observeret en bemærkelsesværdig reduktion i fodringshastigheden for quercetinfodrede larver sammenlignet med kontrollen (figur 2C).
Også larver fodret med quercetin viste et fald i puppehastigheden med ~ 14% og forsinket hvalp, hvilket tyder på udviklingshæmning efter behandling (figur 3A, B). Desuden blev ~ 77,65% af overlevelse og dødelige fænotyper observeret hos insektlarver fodret med en quercetinholdig diæt (figur 4A, B). Ernæringsparametrene blev beregnet for kontrollarver og larver, der fodres med quercetin, baseret på indtagelse og anvendelse af føde (supplerende tabel 1). ECI til kropsmateriale og ECD for insekter fodret med 1.000 ppm quercetinholdig diæt blev reduceret med henholdsvis ~ 9% og ~ 49%. Faldet i ECD kan skyldes manglen på tilgængelige metabolitter i insektkroppen20. AD for quercetin-fodrede insekter blev øget med ~5% sammenlignet med kontrollen (tabel 2). Samlet set indikerer de opnåede resultater, at quercetin har signifikante negative virkninger på insektvækst og udviklingen af H. armigera.
Figur 1: Skematisk gengivelse af tilberedningen af en kunstig diæt og quercetinholdig diæt. Fraktionerne A, B og C blandes for at lave en kunstig og quercetinholdig diæt. Larverne fodres på den respektive diæt i 10 dage. Blå procespile repræsenterer en kunstig diæt, mens røde procespile repræsenterer forberedelsen af en quercetinholdig diæt. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentative data fra quercetinfodringsassayet. (A) Kropsvægtgraf for H. armigera larver efter fodring af 1.000 ppm quercetin sammenlignet med kontrollen på dag 2, 4, 6, 8 og 10. Larvernes kropsvægt er i milligram (mg). (B) Den gennemsnitlige størrelse af larver registreres på dag 10. Vægtstang = 1 cm. (C) Gennemsnitlig fodringshastighed registreret på dag 2, 4, 6, 8 og 10. Foderets vægt er i milligram (mg). Blå cirkler og røde firkanter repræsenterer de gennemsnitlige data for henholdsvis kontrol- og quercetinbehandlede insekter på alternative dage. Student t-test bruges til sammenligning af de to grupper (parret). Data repræsenterer gennemsnitlig ± SEM (n = 21 sekunder instar larver; *p < 0,05 indikerer statistisk signifikant). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentative data for forpupningen fra foderassayet. (A) Grafen over forpupningens procent. (B) Billeder af pupper (dag 15), der viser en forsinket og reduceret pupperate i quercetinbehandling. Vægtstang = 1 cm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentative data for overlevelse på dag 10 efter fodring af 1.000 ppm quercetin sammenlignet med kontrol. (A) Kaplan-Meier-overlevelsesgraf for quercetinfodrede insekter indikerer nedsat overlevelsesrate. Kontrolinsekterne viser en ~ 96% overlevelsesrate, og de quercetinbehandlede insekter viser en ~ 77,65% overlevelse. (B) Billeder af dødelige fænotyper af quercetinfodrede larver taget på dag 10. Vægtstang = 1 cm. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Brøkdel A | ||
| 1 | Bengalsk Gram | 50 g |
| 2 | Gærekstrakt | 12 g |
| 3 | Kasein | 3,5 g |
| 4 | Sorbinsyre | 0,5 g |
| 5 | Methylparabener | 1 g |
| 6 | dH2O | 150 ml |
| Brøkdel B | ||
| 1 | Cholinchlorid | 0,35 g |
| 2 | Streptomycin | 0,02 g |
| 3 | Askorbinsyre | 2 g |
| 4 | Kolesterol | 0,15 g |
| 5 | Multivitamin kapsel | 1 |
| 6 | Vitamin E kapsel | 1 |
| 7 | dH2O | 30 ml |
| Brøkdel C | ||
| 1 | Agar Agar | 6,5 g |
| 2 | dH2O | 180 ml |
Tabel 1: Den kunstige kosts sammensætning.
| Behandling (Quercentin-koncentration) | Ernæringsindeks (%) | ||
| Borgerinitiativ | ECD | ANNONCE | |
| 0 sider/min. | 73.044 | 208.148 | 35.092068 |
| 1000 sider/min. | 64.2771 | 159.871 | 40.2056684 |
Tabel 2: Effekt af quercetin indtagelse på H. armigera fodringsadfærd og kostudnyttelse. Forkortelser: ECI = effektiviteten af omdannelsen af indtagne fødevarer; ECD = effektiviteten af omdannelsen af fordøjede fødevarer AD = omtrentlig fordøjelighed.
Supplerende tabel 1: Eksempel på datablad for quercetinfodringsassayet. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Laboratoriebioassays er nyttige til at forudsige resultater og producere komparative toksicitetsdata for flere forbindelser på kort tid til en rimelig pris. Foderbioassayet hjælper med at fortolke interaktionerne mellem insekt-insekticid og insekt-plante-insekticider. Det er en effektiv metode til måling af toksiciteten af en række stoffer, som i væsentlig grad forenkler processen med at bestemme den dødelige dosis 50 (LD50), den dødelige koncentration 50 (LC50) eller enhver anden dødelig koncentration eller dosis24,25. Forskellige laboratoriebioassays anvendes til at bestemme insekticidaktivitet, insekticidresistens og toksicitet af forbindelser, herunder diætdækning, topisk anvendelse, obligatorisk fodring, injektionsmetoden, kontakt eller rester og filmmetoden13,14. Alle disse metoder kan anvendes baseret på formålet med en bestemt undersøgelse, men den ideelle bioassay-tilgang bør være hurtig og effektiv26. Derfor kan den obligatoriske fodringsanalysemetode, der diskuteres i dette manuskript, være det foretrukne bioassay i flere tilfælde, bortset fra sugende insekter.
Det obligatoriske fodringsassay, der er beskrevet i dette manuskript, kan bruges til at studere virkningen af enhver forbindelse på insektlarvernes vækst, udvikling, fodring og overlevelse. I de repræsentative resultater, der er vist her, blev quercetins insekticide aktivitet undersøgt mod H. armigera-larver , hvilket gav en begrundelse for yderligere udforskning. Signifikante reduktioner i kropsvægt på ~ 57% (figur 2A, B), ændringer i fodringshastighed (figur 2C) og nedsat overlevelsesrate på ~ 18% (figur 4A, B) blev observeret hos quercetin-fodrede larver. Også insekter fodret med en quercetin diæt viste forsinket og reduceret hvalp med ~ 14% (figur 3A, B). Der blev også observeret en signifikant ændring i ernæringsindekser, herunder ECI, ECD og AD (tabel 2), sammenlignet med kontrolgruppen. Samlet set indikerer disse resultater, at quercetin har en skadelig virkning på vækst, udvikling og overlevelse af H. armigera larver. Alle disse observationer følger quercetins antibioseeffekt på Aedes aegypti27, Bactrocera cucurbitae Coquillett28 og Drosophila melanogaster29. Desuden viser disse observationer sig at være i overensstemmelse med øget dødelighed i Bombyx mori på grund af nedsat immunsystem30, nedsat larvevægt og frugtbarhed i Spodoptera litura31, Hyphantria cunea12 og Eriosoma lanigerum32.
At tage forholdsregler, såsom ensartethed i prøvestørrelse, er afgørende for at reducere biologisk varians mellem eksperimenter. For at sikre reproducerbarhed skal fodringsanalysen udføres med insektlarver af samme stjerne i et insektkulturrum ved ensartede temperaturer og fugtighedsniveauer. Under forberedelsen af en kunstig kost skal det sikres, at fytokemikaliet blandes ensartet med kosten. For at minimere fejlen på grund af fytokemisk nedbrydning over tid foretrækkes en frisklavet diæt til analyse. Fytokemikaliernes egenskaber, såsom termosensitivitet, lysfølsomhed, opløselighed osv., Bør overvejes under tilberedning og opbevaring af den kunstige kost. Kostvaner, der er blevet tørret ud over tid, kan ændre farve og krympe, og de bør ikke bruges til fodringsanalysen. Analyseresultaterne må ikke tages i betragtning, når kontrolpersonens dødelighed er større end 10 %33. De materialer, såsom spatel, bægerglas, petriskåle osv., der kræves til tilberedning af foder og insektvejning, bør være adskilt for kontrol- og behandlingsgrupperne for at undgå fejl som følge af krydskontaminering.
Bioassay til insektfodring er meget specifik og reproducerbar, men har nogle begrænsninger. For eksempel, når et insekt angriber en plante, producerer planteimmunitet strukturelle eller kemiske træk for at reducere planteædende fodring og derved minimere planteædende skader34. Imidlertid observeres disse defensive træk og deres virkninger ikke under dette assay. En anden begrænsning er, at den bestemte koncentration af fytokemikalier, der indtages af insekter, ikke kan bestemmes14. Stabiliteten af næringsindholdet i kosten og brugt fytokemisk er en vigtig begrænsende faktor, der kan påvirke dens virkning på insekter.
På trods af ovennævnte begrænsninger er den obligatoriske fodringsanalyse overkommelig og kan teste et stort antal mange insekter samtidigt. Dette assay kan også tilpasses til at screene flere molekyler for at studere deres antifeedant og insekticide egenskaber mod forskellige klasser af insekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærede ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
SM, YP og VN anerkender stipendiet tildelt af University Grants Commission, Indiens regering, New Delhi. RJ anerkender Council of Scientific and Industrial Research (CSIR), Indien, og CSIR-National Chemical Laboratory, Pune, Indien, for økonomisk støtte under projektkoderne MLP036626, MLP101526 og YSA000826.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar Agar | Himedia | RM666 | Solidifying agent |
| Ascorbic acid | Himedia | CMS1014 | Vitamin C source |
| Bengal Gram | NA | NA | Protein and carbohydrate source |
| Casein | Sigma | C-5890 | Protein source |
| Cholesterol | Sisco Research Laboratories | 34811 | Fatty acid source |
| Choline Chloride | Himedia | GRM6824 | Ammonium salt |
| DMSO | Sigma | 67-68-5 | Solvent |
| GraphPad Prism v8.0 | https://www.graphpad.com/guides/prism/latest/user-guide/using_choosing_an_analysis.htm | ||
| Methyl Paraben | Himedia | GRM1291 | Antifungal agent |
| Multivitamin capsule | GalaxoSmithKline | NA | Vitamin source |
| Quercetin | Sigma | Q4951-10G | Phytochemical |
| Sorbic Acid | Himedia | M1880 | Antimicrobail agent |
| Streptomycin | Himedia | CMS220 | Antibiotic |
| Vitamin E capsule | Nukind Healthcare | NA | Vitamin E source |
| Yeast Extract | Himedia | RM027 | Amino acid source |
References
- Popp, J., Pető, K., Nagy, J. Pesticide productivity and food security. A review. Agronomy for Sustainable Development. 33 (1), 243-255 (2013).
- da Silva, F. R., et al. Comparative toxicity of Helicoverpa armigera and Helicoverpa zea (Lepidoptera: Noctuidae) to selected insecticides. Insects. 11 (7), 431 (2020).
- Usman, A., Ali, M. I., Shah, M., e Amin, F., Sarwar, J. Comparative efficacy of indigenous plant extracts and a synthetic insecticide for the management of tomato fruit worm (Helicoverpa armigera Hub.) and their effect on natural enemies in tomato crop. Pure and Applied Biology. 7 (3), 1014-1020 (2018).
- Honnakerappa, S. B., Udikeri, S. S. Abundance of Helicoverpa armigera (Hubner) on different host crops. Journal of Farm Science. 31, 436-439 (2018).
- Edosa, T. T. Review on bio-intensive management of African bollworm, Helicoverpa armigera (Hub.): Botanicals and semiochemicals perspectives. African Journal of Agricultural Research. 14 (1), 1-9 (2019).
- Zhou, Y., et al. Migratory Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) exhibits marked seasonal variation in morphology and fitness. Environmental Entomology. 48 (3), 755-763 (2019).
- Souto, A. L., et al. Plant-derived pesticides as an alternative to pest management and sustainable agricultural production: Prospects, applications and challenges. Molecules. 26 (16), 4835 (2021).
- Özkara, A., Akyıl, D., Konuk, M. Pesticides, environmental pollution, and health. Environmental Health Risk-Hazardous Factors to Living Species. , (2016).
- Alengebawy, A., Abdelkhalek, S. T., Qureshi, S. R., Wang, M. -Q. Heavy metals and pesticides toxicity in agricultural soil and plants: Ecological risks and human health implications. Toxics. 9 (3), 42 (2021).
- Tlak Gajger, I., Dar, S. A. Plant allelochemicals as sources of insecticides. Insects. 12 (3), 189 (2021).
- Riddick, E. W. Potential of quercetin to reduce herbivory without disrupting natural enemies and pollinators. Agriculture. 11 (6), 476 (2021).
- Gao, Y. -L., et al. The effect of quercetin on the growth, development, nutrition utilization, and detoxification enzymes in Hyphantria cunea Drury (Lepidoptera: Arctiidae). Forests. 13 (11), 1945 (2022).
- Durmuşoğlu, E., Hatipoğlu, A., Gürkan, M. O., Moores, G. Comparison of different bioassay methods for determining insecticide resistance in European Grapevine Moth, Lobesia botrana (Denis & Schiffermüller) (Lepidoptera: Tortricidae). Turkish Journal of Entomology. 39 (3), 271-276 (2015).
- Paramasivam, M., Selvi, C. Laboratory bioassay methods to assess the insecticide toxicity against insect pests-A review. Journal of Entomology and Zoology Studies. 5 (3), 1441-1445 (2017).
- Clark, E. L., Isitt, R., Plettner, E., Fields, P. G., Huber, D. P. W. An inexpensive feeding bioassay technique for stored-product insects. Journal of Economic Entomology. 107 (1), 455-461 (2014).
- Waldbauer, G. P., Cohen, R. W., Friedman, S. An improved procedure for laboratory rearing of the corn earworm, Heliothis zea (Lepidoptera: Noctuidae). The Great Lakes Entomologist. 17 (2), 10 (2017).
- Friesen, K., Berkebile, D. R., Zhu, J. J., Taylor, D. B. Laboratory rearing of stable flies and other muscoid Diptera. JoVE. (138), e57341 (2018).
- Zheng, M. -L., Zhang, D. -J., Damiens, D. D., Lees, R. S., Gilles, J. R. L. Standard operating procedures for standardized mass rearing of the dengue and chikungunya vectors Aedes aegypti and Aedes albopictus (Diptera: Culicidae)-II-Egg storage and hatching. Parasites & Vectors. 8, 1-7 (2015).
- Nagarkatti, S., Prakash, S. Rearing Heliothis armigera (Hubn.) on an artificial diet. Technical Bulletin Commonwealth Institute of Biological Control. , (1974).
- Adhav, A. S., Kokane, S. R., Joshi, R. S. Functional characterization of Helicoverpa armigera trehalase and investigation of physiological effects caused due to its inhibition by Validamycin A formulation. International Journal of Biological Macromolecules. 112, 638-647 (2018).
- Abbasi, B. H., et al. Rearing the cotton bollworm, Helicoverpa armigera, on a tapioca-based artificial diet. Journal of Insect Science. 7 (1), 35 (2007).
- Armes, N. J., Jadhav, D. R., Bond, G. S., King, A. B. S. Insecticide resistance in Helicoverpa armigera in South India. Pesticide Science. 34 (4), 355-364 (1992).
- Waldbauer, G. P. The consumption and utilization of food by insects. Advances in Insect Physiology. 5, Academic Press. 229-288 (1968).
- Carpinella, M. C., Defago, M. T., Valladares, G., Palacios, S. M. Antifeedant and insecticide properties of a limonoid from Melia azedarach (Meliaceae) with potential use for pest management. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51 (2), 369-374 (2003).
- Diaz Napal, G. N., Palacios, S. M. Bioinsecticidal effect of the flavonoids pinocembrin and quercetin against Spodoptera frugiperda. Journal of Pest Science. 88, 629-635 (2015).
- ffrench-Constant, R. H., Roush, R. T. Resistance detection and documentation: the relative roles of pesticidal and biochemical assays. Pesticide Resistance in Arthropods. , 4-38 (1990).
- Gikonyo, N. K., Mwangi, R. W., Midiwo, J. O. Toxicity and growth-inhibitory activity of Polygonum senegalense (Meissn.) surface exudate against Aedes aegypti larvae. International Journal of Tropical Insect Science. 18 (3), 229-234 (1998).
- Sharma, R., Sohal, S. K. Bioefficacy of quercetin against melon fruit fly. Bulletin of Insectology. 66 (1), 79-83 (2013).
- Després, L., David, J. -P., Gallet, C. The evolutionary ecology of insect resistance to plant chemicals. Trends in Ecology & Evolution. 22 (6), 298-307 (2007).
- Shi, G., Kang, Z., Ren, F., Zhou, Y., Guo, P. Effects of quercetin on the growth and expression of immune-pathway-related genes in silkworm (Lepidoptera: Bombycidae). Journal of Insect Science. 20 (6), 23 (2020).
- Selin-Rani, S., et al. Toxicity and physiological effect of quercetin on generalist herbivore, Spodoptera litura Fab. and a non-target earthworm Eisenia fetida Savigny. Chemosphere. 165, 257-267 (2016).
- Ateyyat, M., Abu-Romman, S., Abu-Darwish, M., Ghabeish, I. Impact of flavonoids against woolly apple aphid, Eriosoma lanigerum (Hausmann) and its sole parasitoid, Aphelinus mali (Hald). Journal of Agricultural Science. 4 (2), 227 (2012).
- Brito-Sierra, C. A., Kaur, J., Hill, C. A. Protocols for testing the toxicity of novel insecticidal chemistries to mosquitoes. JoVE. (144), e57768 (2019).
- Mitchell, C., Brennan, R. M., Graham, J., Karley, A. J. Plant defense against herbivorous pests: exploiting resistance and tolerance traits for sustainable crop protection. Frontiers in Plant Science. 7, 1132 (2016).
