Summary
Dieses Protokoll beschreibt den obligatorischen Fütterungstest, um die potenziell toxische Wirkung eines sekundären Pflanzenstoffs auf die Larven der Lepidoptera-Insekten zu bewerten. Dabei handelt es sich um einen hochgradig skalierbaren Insekten-Bioassay, mit dem sich die subletale und letale Dosis, die abschreckende Wirkung und die physiologische Wirkung leicht optimieren lassen. Dies könnte für das Screening umweltfreundlicher Insektizide verwendet werden.
Abstract
Helicoverpa armigera, ein Lepidoptera-Insekt, ist ein polyphager Schädling mit weltweiter Verbreitung. Dieses pflanzenfressende Insekt ist eine Bedrohung für Pflanzen und die landwirtschaftliche Produktivität. Als Reaktion darauf produzieren Pflanzen mehrere sekundäre Pflanzenstoffe, die sich negativ auf das Wachstum und Überleben des Insekts auswirken. Dieses Protokoll demonstriert eine obligatorische Fütterungstestmethode, um die Wirkung eines sekundären Pflanzenstoffs (Quercetin) auf das Wachstum, die Entwicklung und das Überleben von Insekten zu bewerten. Unter kontrollierten Bedingungen wurden die Neugeborenen bis zum zweiten Instar mit einer vordefinierten künstlichen Diät gehalten. Diese Larven durften sich 10 Tage lang von einer Kontroll- und Quercetin-haltigen Kunstnahrung ernähren. Das Körpergewicht, das Entwicklungsstadium, das Fraßgewicht und die Sterblichkeit der Insekten wurden an abwechselnden Tagen aufgezeichnet. Die Veränderung des Körpergewichts, der Unterschied im Fütterungsmuster und die Entwicklungsphänotypen wurden während der gesamten Testzeit bewertet. Der beschriebene obligatorische Fütterungsassay simuliert eine natürliche Art der Aufnahme und kann auf eine große Anzahl von Insekten hochskaliert werden. Es ermöglicht die Analyse der Wirkung von sekundären Pflanzenstoffen auf die Wachstumsdynamik, den Entwicklungsübergang und die allgemeine Fitness von H. armigera. Darüber hinaus kann dieser Aufbau auch verwendet werden, um Veränderungen von Ernährungsparametern und verdauungsphysiologischen Prozessen zu bewerten. Dieser Artikel enthält eine detaillierte Methodik für Fütterungs-Assay-Systeme, die in toxikologischen Studien, beim Screening von insektiziden Molekülen und zum Verständnis chemischer Effekte bei Pflanzen-Insekten-Interaktionen eingesetzt werden können.
Introduction
Die biotischen Faktoren, die die Produktivität der Pflanzen beeinflussen, sind hauptsächlich Krankheitserreger und Schädlinge. Mehrere Schadinsekten verursachen 15 % bis 35 % der landwirtschaftlichen Ernteverluste und beeinträchtigen die wirtschaftliche Nachhaltigkeit1. Insekten, die zu den Ordnungen Coleoptera, Hemiptera und Lepidoptera gehören, sind die Hauptordnungen der verheerenden Schädlinge. Die hochgradig anpassungsfähige Natur der Umwelt hat den Schmetterlingen bei der Entwicklung mehrerer Überlebensmechanismen geholfen. Unter den Schmetterlingsinsekten kann sich Helicoverpa armigera (Baumwollkapselwurm) von etwa 180 verschiedenen Nutzpflanzen ernähren und deren Fortpflanzungsgewebe erheblich schädigen2. Weltweit hat der Befall mit H. armigera zu einem Verlust von rund 5 Milliarden US-Dollar geführt3. Baumwolle, Kichererbsen, Taubenerbsen, Tomaten, Sonnenblumen und andere Nutzpflanzen sind Wirte für H. armigera. Es vervollständigt seinen Lebenszyklus an verschiedenen Teilen der Wirtspflanze. Die Eier der Mottenweibchen schlüpfen auf den Blättern, gefolgt von ihrer Ernährung im vegetativen Gewebe während der Larvenstadien. Das Larvenstadium ist aufgrund seiner gefräßigen und sehr anpassungsfähigen Natur am zerstörerischsten 4,5. H. armigera zeigt eine globale Verbreitung und ein Vordringen in neue Territorien aufgrund seiner bemerkenswerten Eigenschaften wie Polyphagie, ausgezeichnete Wanderfähigkeiten, höhere Fruchtbarkeit, starke Diapause und das Aufkommen von Resistenzen gegen bestehende Insektenbekämpfungsstrategien6.
Verschiedene chemische Moleküle aus Terpenen, Flavonoiden, Alkaloiden, Polyphenolen, cyanogenen Glucosiden und vielen anderen werden häufig zur Bekämpfung des H. armigera-Befalls verwendet7. Die häufige Anwendung chemischer Moleküle hat jedoch aufgrund der Aufnahme ihrer Rückstände nachteilige Auswirkungen auf die Umwelt und die menschliche Gesundheit. Außerdem wirken sie sich nachteilig auf verschiedene Schädlingsfresser aus, was zu einem ökologischen Ungleichgewicht führt 8,9. Daher besteht die Notwendigkeit, sichere und umweltfreundliche Optionen für chemische Moleküle zur Schädlingsbekämpfung zu untersuchen.
Natürliche insektizide Moleküle, die von Pflanzen produziert werden (sekundäre Pflanzenstoffe), können als vielversprechende Alternative zu chemischen Pflanzenschutzmitteln eingesetzt werden. Zu diesen sekundären Pflanzenstoffen gehören verschiedene Sekundärmetaboliten, die zu den Klassen Alkaloide, Terpenoide und Phenole gehören 7,10. Quercetin ist eines der am häufigsten vorkommenden Flavonoide (phenolische Verbindung), die in verschiedenen Getreidesorten, Gemüse, Obst und Blättern enthalten sind. Es zeigt eine abschreckende und insektizide Wirkung gegen Insekten; Es ist auch nicht schädlich für natürliche Feinde von Schädlingen11,12. Somit demonstriert dieses Protokoll den Fütterungsassay mit Quercetin, um seine toxische Wirkung auf H. armigera zu bewerten.
Es wurden verschiedene Bioassay-Methoden entwickelt, um die Wirkung natürlicher und synthetischer Moleküle auf die Nahrungs-, Wachstums-, Entwicklungs- und Verhaltensmuster eines Insekts zu bewerten13. Zu den häufig verwendeten Methoden gehören der Blattscheiben-Assay, der Choice-Fütterungs-Assay, der Tröpfchen-Fütterungs-Assay, der Kontakt-Assay, der Diät-Covering-Assay und der obligate Fütterungs-Assay13,14. Diese Methoden werden danach klassifiziert, wie Pestizide auf Insekten angewendet werden. Der obligate Fütterungstest ist eine der am häufigsten verwendeten, empfindlichsten, einfachen und anpassungsfähigsten Methoden, um wahrscheinliche Insektizide und ihre tödliche Dosis zu testen14. In einem obligaten Fütterungsassay wird das interessierende Molekül mit einer künstlichen Nahrung vermischt. Dies sorgt für Konsistenz und Kontrolle über die Zusammensetzung des Futters und führt zu robusten und reproduzierbaren Ergebnissen. Wichtige Variablen, die die Fütterungstests beeinflussen, sind das Entwicklungsstadium des Insekts, die Wahl des Insektizids, Umweltfaktoren und die Probengröße. Die Dauer des Assays, das Intervall zwischen zwei Datenaufzeichnungen, die Häufigkeit und Menge der gefütterten Nahrung, die Gesundheit der Insekten und die Handhabungsfähigkeit der Bediener können das Ergebnis der Fütterungsassays ebenfalls beeinflussen14,15.
Ziel dieser Studie ist es, den obligatorischen Fütterungsassay zu demonstrieren, um die Wirkung von Quercetin auf das Überleben und die Fitness von H. armigera zu bewerten. Die Bewertung verschiedener Parameter, wie z.B. das Körpergewicht der Insekten, die Sterblichkeitsrate und Entwicklungsstörungen, wird Einblicke in die insektizide Wirkung von Quercetin geben. In der Zwischenzeit wird die Messung von Ernährungsparametern, einschließlich der Effizienz der Umwandlung von aufgenommener Nahrung (ECI), der Effizienz der Umwandlung von verdauter Nahrung (ECD) und der ungefähren Verdaulichkeit (AD), die antifeedativen Eigenschaften von Quercetin hervorheben.
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Protocol
Die Larven von H. armigera wurden vom ICAR-National Bureau of Agricultural Insect Resources (NBAIR) in Bangalore, Indien, erworben. Für die vorliegende Studie wurden insgesamt 21 Second-Instar-Larven verwendet.
1. Zubereitung einer künstlichen Diät auf Kichererbsenbasis
HINWEIS: Eine Liste der Zutaten, die für die Zubereitung einer künstlichen Diät erforderlich sind, ist in Tabelle 1 aufgeführt.
- Alle Fraktionen werden separat in einem Becherglas abgewogen, wie in Tabelle 1 aufgeführt, und mit einem Spatel/Magnetrührer eine homogene Mischung hergestellt.
- Fraktion C bei ca. 100 °C in der Mikrowelle 5 min kochen, zu Fraktion A geben und gründlich mischen.
- Nach gründlichem Mischen die gemischte Fraktion etwas abkühlen lassen, bevor man Fraktion B hinzufügt (Fraktion B enthält hitzelabile Bestandteile).
- In eine durchsichtige Petrischale aus Polystyrol (150 mm x 150 mm) geben.
2. Zubereitung von quercetinhaltiger künstlicher Diät
- Wiegen Sie die entsprechende Menge (1.000 ppm) Quercetinhydrat (siehe Materialtabelle) ab und lösen Sie es ordnungsgemäß in der Mindestmenge organischer Lösungsmittel wie Ethanol (2 mg/ml), Dimethylsulfoxid (DMSO; 30 mg/ml) oder Dimethylformamid (DMF) auf. Hier wird DMSO zum Lösen von Quercetin eingesetzt.
- Gelöstes Quercetin in Fraktion B geben, gefolgt von Zugabe in die Mischung der Fraktionen A und C (das von Fraktion B reduzierte Wasservolumen entspricht dem Volumen des zugegebenen DMSO).
- Geben Sie ein gleiches Volumen des organischen Lösungsmittels, das zum Auflösen von Quercetin verwendet wird, in die Kontrolldiät.
HINWEIS: Abbildung 1 zeigt die schematische Darstellung der Zubereitung von künstlichen und quercetinhaltigen Diäten.
3. Aufzucht und Pflege der H. armigera-Kultur
HINWEIS: Verwenden Sie entsprechend gereinigte und sterilisierte Materialien für die Aufzucht und Pflege von Insekten. Gehen Sie vorsichtig mit den Insekten um, indem Sie alle Sterilitäts- und sicherheitsrelevanten Standardarbeitsanweisungen 16,17,18 befolgen.
- Bewahren Sie die Eier von H. armigera in der Zuchtkammer (mit Musselintuch abgedecktes Plastikglas) unter den in Schritt 3.3 beschriebenen Bedingungen auf. Übertragen Sie dann frisch geschlüpfte Neugeborene vorsichtig mit einem feinen Pinsel auf eine frisch zubereitete künstliche Diät auf Kichererbsenbasis.
- Verwenden Sie eine künstliche Ernährung für die Aufzucht der Larven und 20 % (w/v) Saccharoselösung mit 1 % (w/v) Multivitamin (siehe Materialtabelle) für erwachsene Motten19,20.
HINWEIS: Da die dritte und ältere Larve von H. armigera eine kannibalische Tendenz zeigen, ist es notwendig, jede Larve in einem separaten Fläschchen aufzuziehen. - Halten Sie die Temperatur bei 25 ± 1 °C und die relative Luftfeuchtigkeit bei 70 % im Insektenkulturraum mit einer 16 h Licht:8 h dunklen Photoperiode21.
- Züchten Sie eine Generation von Insekten im Labor, um die Homogenität zu gewährleisten, und verwenden Sie sie dann für den Fütterungstest.
- Erhöhen Sie optional die Temperatur des Insektenkulturraums auf 28 °C, um das Wachstum von Larven und Puppen zu beschleunigen22.
4. Aufbau für den Fütterungsassay
- Sammeln Sie 21 Sekunden Instar-Larven für jeden Satz (Kontrolle und Behandlung) und halten Sie sie ca. 1-3 Stunden lang von der Nahrung fern.
- Schneiden Sie die Kontroll- und Quercetin-haltige Nahrung in kleine Stücke, notieren Sie das Gewicht der verabreichten Nahrung und den Körper des Insekts und geben Sie die Insekten vorsichtig in Kulturfläschchen um. Lassen Sie die Insekten sich von der jeweiligen Nahrung ernähren.
HINWEIS: Dies sollte als Tag 0 des Fütterungstests betrachtet werden. - Notieren Sie das Gewicht des Insektenkörpers, die erhaltene Nahrung, die nicht gefressene Nahrung und den Frass an abwechselnden Tagen (Tag 2, 4, 6, 8 und 10) bis zum 10. Tag der Untersuchung.
- Lassen Sie sie nach Tag 10 mit ihrer jeweiligen Ernährung füttern, um weitere Entwicklungs- und morphologische Veränderungen zu beobachten.
ANMERKUNG: Die Entwicklungsveränderungen durch: (1) Larven-Puppen-Zwischenprodukte, wie z. B. den hinteren Puppenhalbkörper mit Larven-Kutikulaflecken, einer Kopfkapsel und Brustbeinen; (2) Prepupae mit einem vollständig geschwärzten Körper; (3) untermaßige Puppen mit Körperschrumpfung; (4) Puppenmotte intermediär Motten mit der alten Puppenhaut. Zu den morphologischen Veränderungen gehören missgebildete erwachsene Motten mit abnormen Körpern, verdrehten Flügeln und gelenkigen Beinen. Diese Veränderungen werden dann mit Insekten verglichen, die mit der Kontrollnahrung gefüttert wurden. - Frieren Sie die Insekten an Tag 10 ein, wenn die Untersuchung von Entwicklungs- und morphologischen Defekten nicht erforderlich ist.
HINWEIS: Bevor die Larven eingefroren werden, müssen sie mindestens 3 Stunden lang von der Nahrung befreit werden, um Futterreste aus dem Verdauungstrakt zu entfernen.
5. Datenerfassung und -analyse
- Wählen Sie in der GraphPad Prism-Software (siehe Materialtabelle) eine XY-Datentabelle aus dem Dialog "Willkommen oder Neue Tabelle" aus und geben Sie darin die Anzahl der Insekten ein, die Werte nebeneinander in den Unterspalten replizieren. Geben Sie dann der X-Achse den Titelnamen als Anzahl der Tage an, und geben Sie in den Gruppen A und B den Titelnamen als Kontroll- bzw. Quercetin-Behandlung an. Kontrollieren Sie das Körpergewicht jedes Insekts und behandeln Sie es, um das Körpergewichtsdiagramm zu erstellen.
HINWEIS: Die Analyse in GraphPad kann je nach Stichprobengröße und Anzahl der Behandlungen variieren. - Vergleichen Sie das Körpergewicht der Insekten zwischen der Kontroll- und der Behandlungsgruppe mit einem studentischen t-Test (α = 0,05).
- Zählen Sie die lebenden und toten Larven und Puppen an Tag 10, um mit der Grafiksoftware eine Kaplan-Meier-Kurve für den Überlebensprozentsatz zu zeichnen.
- Zählen Sie die Anzahl der Puppen und berechnen Sie den Prozentsatz der Verpuppung mit der angegebenen Formel:
- Prozentsatz der Verpuppung (%) = (Anzahl der gebildeten Puppen/Gesamtzahl der Larven) x 100
- Vergleichen Sie die Larvenentwicklung in Bezug auf die Nährwertindizes23 mit den folgenden Formeln: ECI (%) = (Gewichtszunahme der Larven/Gewicht des gefressenen Futters) x 100
ECD (%) = (Gewichtszunahme der Larven/[Gewicht des gefressenen Futters - Gewicht des Frass]) x 100
AD (%) = ([Gewicht des gefressenen Futters - Gewicht des Futters]/Gewicht des gefressenen Futters) x 100
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Representative Results
Insektenlarven, die mit einer Diät gefüttert wurden, die 1.000 ppm Quercetin enthielt, zeigten eine signifikante Abnahme des Körpergewichts von ~57% im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abbildung 2A). Die Verringerung des Körpergewichts führte zu einer reduzierten Körpergröße der mit Quercetin behandelten Larven (Abbildung 2B). Es wurde eine deutliche Verringerung der Fressrate der mit Quercetin gefütterten Larven im Vergleich zur Kontrollgruppe beobachtet (Abbildung 2C).
Außerdem zeigten Larven, die mit Quercetin gefüttert wurden, eine Abnahme der Verpuppungsrate um ~14% und eine verzögerte Verpuppung, was auf eine Entwicklungsverzögerung nach der Behandlung hindeutet (Abbildung 3A,B). Darüber hinaus wurden ~77,65% der Überlebens- und letalen Phänotypen bei Insektenlarven beobachtet, die mit einer quercetinhaltigen Diät gefüttert wurden (Abbildung 4A,B). Die Nährwertparameter wurden für Kontroll- und Quercetin-gefütterte Larven auf der Grundlage des Nahrungsverzehrs und der Futterverwertung berechnet (Ergänzende Tabelle 1). Die ECI für Körpermaterial und die ECD für Insekten, die mit der 1.000 ppm quercetinhaltigen Diät gefüttert wurden, waren um ~9 % bzw. ~49 % reduziert. Die Abnahme der ECD kann auf den Mangel an verfügbaren Metaboliten im Insektenkörper zurückzuführensein 20. Die AD der mit Quercetin gefütterten Insekten war im Vergleich zur Kontrolle um ~5% erhöht (Tabelle 2). Insgesamt deuten die erhaltenen Ergebnisse darauf hin, dass Quercetin signifikante negative Auswirkungen auf das Insektenwachstum und die Entwicklung von H. armigera hat.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Zubereitung einer künstlichen Diät und einer quercetinhaltigen Diät. Die Fraktionen A, B und C werden gemischt, um eine künstliche und quercetinhaltige Diät herzustellen. Die Larven werden 10 Tage lang mit dem jeweiligen Futter gefüttert. Blaue Prozesspfeile stehen für eine künstliche Diät, während rote Prozesspfeile für die Zubereitung einer quercetinhaltigen Diät stehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative Daten aus dem Quercetin-Fütterungs-Assay. (A) Körpergewichtsdiagramm der H. armigera-Larven nach Fütterung von 1.000 ppm Quercetin im Vergleich zur Kontrolle an den Tagen 2, 4, 6, 8 und 10. Das Körpergewicht der Larven wird in Milligramm (mg) angegeben. (B) Die durchschnittliche Größe der Larven wird am 10. Tag aufgezeichnet. Maßstabsbalken = 1 cm. (C) Durchschnittliche Fütterungsrate, die an den Tagen 2, 4, 6, 8 und 10 aufgezeichnet wurde. Das Gewicht des Futters wird in Milligramm (mg) angegeben. Blaue Kreise und rote Quadrate stellen die durchschnittlichen Daten der Kontroll- bzw. Quercetin-behandelten Insekten an abwechselnden Tagen dar. Der Schüler-t-Test wird für den Vergleich der beiden Gruppen (paarweise) verwendet. Die Daten stellen die mittlere ± REM dar (n = 21 Sekunden Instar-Larven; *p < 0,05 steht für statistisch signifikant). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative Daten für die Verpuppung aus dem Fütterungstest. (A) Diagramm des Prozentsatzes der Verpuppung. (B) Bilder von Puppen (Tag 15), die eine verzögerte und reduzierte Verpuppungsrate bei Quercetin-Behandlung zeigen. Maßstabsleiste = 1 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentative Daten zum Überleben an Tag 10 bei Fütterung von 1.000 ppm Quercetin im Vergleich zur Kontrolle. (A) Die Kaplan-Meier-Überlebenskurve für mit Quercetin gefütterte Insekten zeigt eine verringerte Überlebensrate. Die Kontrollinsekten zeigen eine Überlebensrate von ~96% und die mit Quercetin behandelten Insekten eine Überlebensrate von ~77,65%. (B) Bilder von letalen Phänotypen von mit Quercetin gefütterten Larven, aufgenommen am Tag 10. Maßstabsleiste = 1 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Fraktion A | ||
| 1 | Bengalisches Gramm | 50 g |
| 2 | Hefeextrakt | 12 g |
| 3 | Casein | 3,5 g |
| 4 | Sorbinsäure | 0,5 g |
| 5 | Methylparaben | 1 g |
| 6 | dH2O | 150 ml |
| Fraktion B | ||
| 1 | Cholinchlorid | 0,35 g |
| 2 | Streptomycin | 0,02 Gramm |
| 3 | Ascorbinsäure | 2 g |
| 4 | Cholesterin | 0,15 g |
| 5 | Multivitamin-Kapsel | 1 |
| 6 | Vitamin E Kapsel | 1 |
| 7 | dH2O | 30 ml |
| Fraktion C | ||
| 1 | Agar-Agar | 6,5 g |
| 2 | dH2O | 180 ml |
Tabelle 1: Zusammensetzung der künstlichen Ernährung.
| Behandlung (Quercentin-Konzentration) | Nährwertindizes (%) | ||
| EBI | ECD | INSERAT | |
| 0 Seiten/Min. | 73.044 | 208.148 | 35.092068 |
| 1000 Seiten/Min. | 64.2771 | 159.871 | 40.2056684 |
Tabelle 2: Wirkung der Quercetin-Aufnahme auf das Fressverhalten und die Nahrungsverwertung von H. armigera . Abkürzungen: ECI = Effizienz der Umwandlung von aufgenommenen Lebensmitteln; ECD = Effizienz der Umwandlung von verdauter Nahrung; AD = ungefähre Verdaulichkeit.
Ergänzende Tabelle 1: Beispiel für das Datenblatt für den Quercetin-Fütterungstest. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Labor-Bioassays sind nützlich, um Ergebnisse vorherzusagen und vergleichende Toxizitätsdaten für mehrere Verbindungen in kurzer Zeit zu vertretbaren Kosten zu erstellen. Der Fütterungsbioassay hilft bei der Interpretation der Wechselwirkungen zwischen Insekten-Insektizid und Insekten-Pflanze-Insektiziden. Es handelt sich um eine effiziente Methode zur Messung der Toxizität einer Vielzahl von Substanzen, die den Prozess der Bestimmung der letalen Dosis 50 (LD50), der letalen Konzentration 50 (LC50) oder einer anderen letalen Konzentration oder Dosis24,25 erheblich vereinfacht. Verschiedene Laborbioassays werden verwendet, um die insektizide Aktivität, die Insektizidresistenz und die Toxizität von Verbindungen zu bestimmen, einschließlich der Nahrungsabdeckung, der topischen Anwendung, der obligaten Fütterung, der Injektionsmethode, des Kontakts oder des Rückstands und der Filmmethode13,14. Alle diese Methoden können je nach Ziel einer bestimmten Studie eingesetzt werden, der ideale Bioassay-Ansatz sollte jedoch schnell und effektiv sein26. Daher kann die in diesem Manuskript diskutierte Methode des obligaten Fütterungstests in mehreren Fällen der Bioassay der Wahl sein, außer bei saugenden Insekten.
Der in diesem Manuskript beschriebene obligate Fütterungsassay kann verwendet werden, um die Wirkung jeder Verbindung auf das Wachstum, die Entwicklung, die Fütterung und das Überleben von Insektenlarven zu untersuchen. In den hier gezeigten repräsentativen Ergebnissen wurde die insektizide Wirkung von Quercetin gegen H. armigera-Larven untersucht, was eine Begründung für weitere Untersuchungen liefert. Signifikante Reduktionen des Körpergewichts um ~57% (Abbildung 2A,B), Veränderungen in der Fütterungsrate (Abbildung 2C) und eine verringerte Überlebensrate von ~18% (Abbildung 4A,B) wurden bei mit Quercetin gefütterten Larven beobachtet. Auch Insekten, die mit einer Quercetin-Diät gefüttert wurden, zeigten eine verzögerte und reduzierte Verpuppung um ~14% (Abbildung 3A,B). Eine signifikante Veränderung wurde auch bei den Nährwertindizes, einschließlich ECI, ECD und AD (Tabelle 2), im Vergleich zur Kontrolle beobachtet. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Quercetin eine schädliche Wirkung auf das Wachstum, die Entwicklung und das Überleben von H. armigera-Larven hat. Alle diese Beobachtungen folgen der antibiosischen Wirkung von Quercetin auf Aedes aegypti27, Bactrocera cucurbitae Coquillett28 und Drosophila melanogaster29. Darüber hinaus stimmen diese Beobachtungen mit einer erhöhten Letalität bei Bombyx mori aufgrund einer Beeinträchtigung des Immunsystems30, eines reduzierten Larvengewichts und einer geringeren Fruchtbarkeit bei Spodoptera litura31, Hyphantria cunea12 und Eriosoma lanigerum32 überein.
Vorsichtsmaßnahmen, wie z. B. die Einheitlichkeit der Stichprobengröße, sind entscheidend, um die biologische Varianz zwischen den Experimenten zu reduzieren. Um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, muss der Fütterungstest mit Insektenlarven desselben Instars in einem Insektenkulturraum bei gleichbleibenden Temperaturen und Luftfeuchtigkeiten durchgeführt werden. Bei der Zubereitung einer künstlichen Diät muss sichergestellt werden, dass der sekundäre Pflanzenstoff gleichmäßig mit dem Futter vermischt wird. Um den Fehler aufgrund des phytochemischen Abbaus im Laufe der Zeit zu minimieren, ist eine frisch zubereitete Diät für den Assay vorzuziehen. Die Eigenschaften von sekundären Pflanzenstoffen wie Wärmeempfindlichkeit, Lichtempfindlichkeit, Löslichkeit usw. sollten bei der Zubereitung und Lagerung der künstlichen Ernährung berücksichtigt werden. Futtermittel, die im Laufe der Zeit ausgetrocknet wurden, können sich in ihrer Farbe verändern und schrumpfen, und sie sollten nicht für den Fütterungstest verwendet werden. Die Untersuchungsergebnisse dürfen nicht berücksichtigt werden, wenn die Mortalitätsraten der Kontrolle über 10 % liegen33. Die für die Futterzubereitung und das Wiegen der Insekten erforderlichen Materialien wie Spatel, Bechergläser, Petrischalen usw. sollten für die Kontroll- und Behandlungsgruppen getrennt sein, um Fehler aufgrund von Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
Der Bioassay zur Insektenfütterung ist hochspezifisch und reproduzierbar, hat aber einige Einschränkungen. Wenn beispielsweise ein Insekt eine Pflanze angreift, produziert die pflanzliche Immunität strukturelle oder chemische Merkmale, um die Nahrungsaufnahme durch Pflanzenfresser zu reduzieren und dadurch Schäden durch Pflanzenfresser zu minimieren34. Diese defensiven Eigenschaften und ihre Auswirkungen werden jedoch während dieses Assays nicht beobachtet. Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass die endgültige Konzentration der von Insekten aufgenommenen sekundären Pflanzenstoffe nicht bestimmt werden kann14. Die Stabilität des Nährstoffgehalts der Nahrung und der verwendeten sekundären Pflanzenstoffe ist ein wichtiger limitierender Faktor, der ihre Wirkung auf Insekten beeinflussen kann.
Trotz der oben genannten Einschränkungen ist der obligatorische Fütterungsassay erschwinglich und kann eine große Anzahl vieler Insekten gleichzeitig testen. Außerdem kann dieser Assay angepasst werden, um mehrere Moleküle zu screenen, um ihre antifütterungshemmenden und insektiziden Eigenschaften gegen verschiedene Insektenklassen zu untersuchen.
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Disclosures
Die Autoren erklärten, dass kein Interessenkonflikt bestehe.
Acknowledgments
SM, YP und VN würdigen das Stipendium, das von der University Grants Commission, Government of India, New Delhi, vergeben wird. RJ dankt dem Council of Scientific and Industrial Research (CSIR), Indien, und dem CSIR-National Chemical Laboratory, Pune, Indien, für die finanzielle Unterstützung im Rahmen der Projektcodes MLP036626, MLP101526 und YSA000826.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar Agar | Himedia | RM666 | Solidifying agent |
| Ascorbic acid | Himedia | CMS1014 | Vitamin C source |
| Bengal Gram | NA | NA | Protein and carbohydrate source |
| Casein | Sigma | C-5890 | Protein source |
| Cholesterol | Sisco Research Laboratories | 34811 | Fatty acid source |
| Choline Chloride | Himedia | GRM6824 | Ammonium salt |
| DMSO | Sigma | 67-68-5 | Solvent |
| GraphPad Prism v8.0 | https://www.graphpad.com/guides/prism/latest/user-guide/using_choosing_an_analysis.htm | ||
| Methyl Paraben | Himedia | GRM1291 | Antifungal agent |
| Multivitamin capsule | GalaxoSmithKline | NA | Vitamin source |
| Quercetin | Sigma | Q4951-10G | Phytochemical |
| Sorbic Acid | Himedia | M1880 | Antimicrobail agent |
| Streptomycin | Himedia | CMS220 | Antibiotic |
| Vitamin E capsule | Nukind Healthcare | NA | Vitamin E source |
| Yeast Extract | Himedia | RM027 | Amino acid source |
References
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