Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול חזותי מפורט לביצוע מודל קשירת פרוזדורים שמאלית (LAL) בעובר העופות. מודל LAL משנה את הזרימה התוך-לבבית, אשר משנה את העמסת הלחץ של גזירת הקיר, ומחקה תסמונת לב שמאל היפופלסטית. מוצגת גישה להתגבר על האתגרים של מודל מיקרוכירורגיה קשה זה.
Abstract
בשל תצורת החדר הבוגר בעל ארבעת החדרים, קלות התרבית, הגישה להדמיה והיעילות, עובר העופות הוא מודל מועדף של בעלי חוליות לחקר התפתחות הלב וכלי הדם. מחקרים שמטרתם להבין את ההתפתחות התקינה ואת הפרוגנוזה של מומי לב מולדים מאמצים באופן נרחב מודל זה. טכניקות כירורגיות מיקרוסקופיות מוצגות כדי לשנות את דפוסי ההעמסה המכנית הרגילים בנקודת זמן עוברית ספציפית ולעקוב אחר המפל המולקולרי והגנטי במורד הזרם. ההתערבויות המכניות הנפוצות ביותר הן קשירת ורידים ויטלין שמאלי, פסים קונוטרונליים וקשירת פרוזדורים שמאלית (LAL), המווסתים את לחץ כלי הדם התוך-גווארי ואת לחץ הגזירה בקיר עקב זרימת הדם. LAL, במיוחד אם היא מבוצעת באובו, היא ההתערבות המאתגרת ביותר, עם תפוקת דגימות קטנה מאוד בשל הפעולות המיקרוכירורגיות הרציפות העדינות ביותר. למרות הסיכון הגבוה שלה, ב ovo LAL הוא בעל ערך מדעי רב כפי שהוא מחקה hypoplastic תסמונת הלב השמאלי (HLHS) פתוגנזה. HLHS היא מחלת לב מולדת מורכבת ורלוונטית מבחינה קלינית שנצפתה ביילודים אנושיים. פרוטוקול מפורט עבור in ovo LAL מתועד במאמר זה. בקצרה, עוברי עופות מופרים הודגרו בטמפרטורה של 37.5 מעלות צלזיוס ולחות קבועה של 60%, בדרך כלל עד שהגיעו לשלבי המבורגר-המילטון (HH) 20 עד 21. קליפות הביצים נסדקו והקרומים החיצוניים והפנימיים הוסרו. העובר סובב בעדינות כדי לחשוף את פקעת הפרוזדורים השמאלית של האטריום המשותף. מיקרו-קשרים שהורכבו מראש מתפרי ניילון 10-0 מוקמו בעדינות ונקשרו סביב ניצן הפרוזדורים השמאלי. לבסוף, העובר הוחזר למקומו המקורי, ו-LAL הושלם. חדרים תקינים ו-LAL הדגימו הבדלים מובהקים סטטיסטית בדחיסת הרקמות. צינור ייצור יעיל של מודל LAL יתרום למחקרים המתמקדים במניפולציה מכנית וגנטית מסונכרנת במהלך ההתפתחות העוברית של רכיבים קרדיווסקולריים. כמו כן, מודל זה יספק מקור תאים מוטרד למחקר תרביות רקמות וביולוגיה של כלי הדם.
Introduction
מומי לב מולדים (CHDs) הם הפרעות מבניות המתרחשות עקב התפתחות עוברית לא תקינה1. בנוסף לתנאים גנטיים, הפתוגנזה מושפעת מעומס מכני משתנה 2,3. תסמונת לב שמאל היפופלסטית (HLHS), מחלת לב מולדת, גורמת לחדר / אבי העורקים לא מפותח בלידה4 עם שיעור תמותה גבוה 5,6. למרות ההתקדמות האחרונה בניהול הקליני שלה, צמיחת כלי הדם ודינמיקת ההתפתחות של HLHS עדיין לא ברורים7. בהתפתחות עוברית תקינה, אנדוקרדיום החדר השמאלי (LV) ושריר הלב מקורם באבות הלב עם התקדמות היווצרות צינור הלב העוברי המוקדם. נוכחות הדרגתית של טרבקולציה שריר הלב, שכבות עיבוי, והתפשטות cardiomyocyte מדווח2. עבור HLHS, שינוי trabecular remodeling ו flattening החדר השמאלי נצפים, תורם עוד יותר hypoplasia שריר הלב עקב נדידת cardiomyocyte חריג 2,8,9,10
מבין יצורי המודל הנפוצים לחקר התפתחות הלב ולהבנת מצבים המודינמיים 11, עובר העופות מועדף בשל ליבו הבוגר בעל ארבעת החדרים וקלות התרבית שלו11,12,13,14. מצד שני, גישה מתקדמת להדמיה של עוברי דגי זברה ועכברים טרנסגניים/נוקאאוט מספקת יתרונות ברורים11,12. התערבויות מכניות שונות נבדקו עבור עובר העופות המשנות את הלחץ התוך-קיראלי ואת לחץ הגזירה בקיר בפיתוח רכיבים קרדיווסקולריים. מודלים אלה כוללים קשירת ויטלין שמאלי, פס קונוטרונקל15 וקשירת פרוזדורים שמאלית (LAL) 11,12,16. הפנוטיפ שנוצר עקב העומס המכני שהשתנה ניתן לראות כ 24-48 שעות לאחר ההתערבות הכירורגית במחקרים המתמקדים בפרוגנוזה מוקדמת11,13. התערבות LAL היא טכניקה פופולרית לצמצום הנפח התפקודי של האטריום השמאלי (LA) על ידי הצבת לולאת תפר סביב הפתח האטריובנטריקולרי. כמו כן, בוצעו גם התערבויות מיקרוכירורגיות המכוונות לקשירת פרוזדורים ימנית (RAL) 17,18. באופן דומה, חלק מהחוקרים מכוונים לתוספתן פרוזדורים שמאלי (LAA) באמצעות מיקרוקליפים כדי להפחית את עוצמת הקול של LA19,20. במחקרים מסוימים, חוט ניילון כירורגי מוחל על הצומת אטריובנטריקולרי19,21. אחת ההתערבויות בהן נעשה שימוש היא LAL, אשר יכול לחקות HLHS אך הוא גם המודל הקשה ביותר לביצוע, עם תפוקת דגימות קטנה מאוד בשל הפעולות המיקרוכירורגיות העדינות ביותר הנדרשות. במעבדה שלנו, LAL מבוצע באובו בין שלבי המבורגר-המילטון (HH) 20 ו -21, לפני שהאטריום המשותף הוא מלא 6,14,22,23. תפר כירורגי ממוקם סביב לוס אנג'לס, אשר משנה את זרימת הדם intracardiac. במודלים LAL של HLHS, קשיחות מוגברת של דופן החדר, זוויות מיופייבר משתנות וגודל חלל LV מופחת נצפים14,24.
במאמר וידאו זה, פרוטוקול מפורט וגישה עבור in ovo LAL מסופק. בקצרה, עוברי העופות המופרים הודגרו לצורך מיקרו-כירורגיה, קליפת הביצה נסדקה והקרומים החיצוניים והפנימיים נוקו. לאחר מכן סובב את העובר באיטיות כך שלוס אנג'לס הייתה נגישה. תפר כירורגי מניילון 10-0 נקשר לניצן הפרוזדורים, והעובר הוחזר לכיוונו המקורי, תוך השלמת הליך LAL25. LAL וחדרים נורמליים מושווים עבור דחיסת רקמות ונפח החדר באמצעות טומוגרפיה קוהרנטית אופטית והיסטולוגיה בסיסית.
צינור מודל LAL המבוצע בהצלחה, כמתואר כאן, יתרום למחקרים בסיסיים המתמקדים בהתפתחות העוברית של רכיבים קרדיווסקולריים. מודל זה יכול לשמש גם יחד עם מניפולציות גנטיות ושיטות הדמיה מתקדמות. כמו כן, מודל LAL חריף הוא מקור יציב של תאי כלי דם חולים לניסויים בתרביות רקמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ביצי לגהורן לבנות פוריות מתקבלות מספקים מהימנים ומודגרות על פי הנחיות שאושרו על ידי האוניברסיטה. עוברי אפרוחים, שלבים 18 (יום 3) עד 24 (יום 4) (השלבים המוצגים במאמר זה) אינם נחשבים לבעלי חוליות חיים על פי הנחיית האיחוד האירופי (EU) 2010/63/EU והנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) בארה"ב. עוברי אפרוחים נחשבים ל"בעלי חיים חיים" לאחר היום ה-19 של הדגירה על פי חוקי ארה"ב, אך לא עבור האיחוד האירופי. כל ביצה מסומנת בתאריך תחילת הבקיעה ומתוכננת לבקוע לא יאוחר מהיוםהעשירי לדגירה. לאחר בקיעת הביצים מוציאים את האפרוחים מהאינקובטור. הפרוטוקול מבוצע בשתי תחנות הפעלה (תחנה 1 ותחנה 2), תוך התמקדות בשלבי ייצור דגמים מיוחדים.
1. הכנה לפני מיקרו-כירורגיה
- להשיג ביציות מופרות ממרכז פיתוח חיסונים עם ציון ספציפי ללא פתוגן (SPF) או דרך חוות ספק מסחרית מהימנה על ידי שליח משלוח שביר במיכלי פוליסטירן יבשים. לפני הדגירה, נקו בעדינות את קליפת הביצה עם מגבונים ללא סיבים שהושרו באתנול 70% כדי להסיר זיהום.
- קריטריונים להכללה/אי הכללת עוברים
- אין לדגור על ביצים שנסדקו או ניזוקו במהלך ההובלה.
- אם הדימום נרשם במהלך הליך LAL או לאחר דגירה מחדש, אין להשתמש בעובר.
- אין להשתמש בעוברים המתפתחים במצב צד שמאל, מכיוון שזרימת הדם המודינמית עשויה להיות שונה מהכיוון הרגיל.
- עוברי Dıscard המתפתחים עם מומים מולדים בהליכים לפני ואחרי הניתוח.
- כלול עוברים המגיעים לשלב היעד המתפתחים במיקומם המקורי, תוך חיקוי HLHS כמודל ZAL.
- יש לדגור על ביצי התרנגולת הלבנה-לגורן המופרית (Gallus gallus domesticus L.), עד לשלב הרצוי בדרך כלל ב-HH20-2115 (37.5°C, 60% לחות, 3.5 ימים) (איור 1).
הערה: חשוב לשמור על הביצים בטמפרטורה ולחות קבועות כדי להגדיל את היבול. בהתאם לדגם האינקובטור, תוספת של מחבת מלאה במים מזוקקים תשמור על לחות יציבה. שרטוטים של מערכת בקרת טמפרטורה ולחות נוספת/עזר שתתאים לרוב האינקובטורים מפותחים על ידי המחברים ומומלצים. פרטי האלקטרוניקה, החומרה והקוד של יחידת חיישן/בקרה מובנית זו מסופקים במאגר נתונים26. טלטול עדין מתמשך (סיבוב) של הביציות במהלך הדגירה עשוי לאפשר מיקום אופטימלי של העובר ובכך להוביל לאחוז גבוה יותר של עוברים "ניתנים לניתוח". טלטול יכול גם לעבוד עם חממות עם יכולת זו ולהגדיל את התפוקה עוד יותר. - לפני תחילת ההליך, הכינו את מספר הקשרים הנדרש על ידי קשירת קשר רופף לתפר 10-0 באורך 1.5 ס"מ. ודאו שהקשר אינו הדוק ושהוא גדול מספיק כדי להיכנס מעל האטריה בקלות במהלך הניתוח (איור 2).
הערה: קשרו את הקשרים מראש ושמרו אותם בתמיסת צלצול אפרוחים סטרילית לפני השימוש. פעולת הקשירה דורשת שימוש בשתי ידיים כדי להפעיל את הפינצטה באופן סינכרוני. מאחר שזהו שלב קריטי בפרוטוקול, ניתן ליצור מודל של האטריום ממרק לתרגול השלב הזה (איור 3). זה ישפר את מיומנויות המיקרו-כירורגיה התלת-ממדיות הדרושות לביצוע שלב 3.2.3 בתחנה 2 (איור 4).
2. פעילות בתחנה 1 (איור 4א')
- פתחו חלון מהקצה הקהה של הביצה והוציאו את הקרומים החיצוניים והפנימיים15 (איור 5A-D).
- פתחו את קליפת הביצה על ידי פיצוח עדין עם הקצה האחורי של הפינצטה, כאשר האצבעות החופשיות תומכות היטב בביצה כדי להפחית התפשטות סדק לא רצויה.
- מאז LAL הוא הליך ארוך, לשמור על הטמפרטורה והלחות של העובר, כמו קצב הלב תלוי בטמפרטורה. לכן, ודא את חלון פגז הראשוני נוצר קטן ככל האפשר, בדיוק מספיק כדי לבצע את הפעולות.
הערה: לא נעשה שימוש במערכות בקרת לחות או טמפרטורה במהלך הפעולה, אך מערכות אלה, אם זמינות, יועילו לתפוקה. במידת האפשר, מערכת מיזוג האוויר במעבדה מושבתת, וההליך מבוצע בטמפרטורת החדר (RT) הגבוהה ביותר האפשרית. אופטימיזציה של קצב הלב העוברי, אשר ניתן לשלוט על ידי הטמפרטורה, במהלך הניתוח מומלץ גם. מעבדות מסוימות שומרות על קצב הלב בקצב מעט נמוך יותר מ-120 פעימות לדקה באמצעות בקרת טמפרטורה במהלך פעולת RAL. לפיכך, בקרת לחות המופעלת סביב אזור הניתוח תגדיל את התשואה עוד יותר. חלונות קליפת הביצה נוצרים קטנים ככל האפשר, גדולים מספיק כדי לאפשר גישה כירורגית. זה חל גם על הקרום החיצוני העבה, שהוא בדרך כלל קטן יותר מקליפת הביצה רק עד היקף העובר. אלה מבטיחים לשמור על הטמפרטורה והלחות של העובר. בעת פתיחת חלון מהקצה הקהה של הביצה, מנקים את שברי הקליפה הקטנים כך שחתיכות אלה לא יפגעו בשלמות כלי הדם הוויטליניים או יובילו לממצאים לא רצויים. בנוסף, מעבדות אחרות משתמשות במספריים מיקרו-משוננים מעוקלים להכנת חלונות. כמו כן, ניתן להשתמש בשני רוחבים של סקוטש טייפ כדי לייצב את קליפת הביצה כדי לשלוט בפיצוח. - הסר רק את קרום ויטלין הדרוש באמצעות מספריים מיקרו (וידאו משלים 1).
- התפתחות עוברית תקינה היא בצד ימין. ברגע שהעובר נקי מקרום הוויטליין, הניחו את הפינצטה עם קצוות סגורים מתחת למקטע הגבי של העובר והפכו אותו בעדינות כדי לחשוף את הצד השמאלי (כלומר, תצורת צד שמאל) (איור 6A,B; סרטון משלים 2).
- ודא כי ניצן פרוזדורים שמאלי חשוף כעת אך עדיין מכוסה על ידי מערכת קרום מורכבת, המורכבת בדרך כלל משכבה כפולה של קרום הלב.
- הסר את הממברנות, כולל אלה העדינות, מיד סביב ניצן פרוזדורים. זהו שלב קריטי נוסף; לבצע הוצאת קרום מברנות גסות ולהתקדם לעדינות, סביב ניצן פרוזדורים שמאלי. שמרו את הפינצטה המשובחת ביותר להסרת הקרום הדק (סרטון משלים 3).
- במהלך תהליך הסרת הממברנה, כוונו את העובר במצב צד שמאל כלפי מעלה, כך שניתן יהיה לבצע את פעולת מיקום הקשר בשלב 3.2 ללא מיקום מחדש נוסף. כדי להשיג זאת, להרים את העובר באמצעות הממברנות בשלב 2.6 ולתלות אותו על קליפת הביצה, להבטיח את הצד השמאלי פונה כלפי מעלה.
הערה: חלק מהעוברים יכולים להיות ממוקמים קרוב לפריפריה של קליפת הביצה ויכולים להיות מאתגרים לניתוח. עם זאת, עוברים אלה יהיו ככל הנראה בכיוון ימין כלפי מעלה ויציגו התנהגות נורמלית, וניתן לכלול אותם במחקר. במקרים אלה, במידת הצורך, ניתן להפוך את האטריום המוסתר לנגיש יותר על ידי ניקוי עדין של קרום הלב עם פינצטה עדינה #4 והסרת קליפת הביצה בכיוון ההפוך (לכיוון פתח הקליפה). ניתן להרים עוברים אלה גם באמצעות חלקים של הקרומים החוץ-עובריים ולקבע אותם במיקום הרצוי על ידי הצמדת קצה אחד של הממברנה (קצה הפינצטה) לקליפת הביצה, תוך שימוש בדביקות הטבעית שלה. בנוסף, ניתן להרחיב את החלל בין אזור הראש וחוט השדרה של העובר בעזרת פינצטה כדי לחשוף את האטריום המוסתר.
3. פעולות בתחנה 2 (איור 4B)
- מתחת לסטריאומיקרוסקופ, מקמו את הקשר שהוכן מראש משלב 1.4 קרוב לעובר במיקום נגיש (איור 6B). ניצן הפרוזדורים מוכן כעת לקשירה (סרטון משלים 4).
- שלפו את הקשר הפתוח שהוכן מראש וכוונו אותו מעל ניצן הפרוזדורים השמאלי. כדי ש-LAL יעבוד, הניחו את הביצה בכיוון תלת-ממדי בעל נטייה ייחודית.
- כיוון נכון את הקשר לביצוע תהליך ההידוק מבלי לפגוע בעוברים.
- נקה את הקרומים העדינים בצורה אופטימלית בשלב 2.7 כדי להפחית את ההשפעה של לב פועם.
- הדקו את התפר (איור 6C). עבור שלב זה, תרגול עם מרק הוא מאוד שימושי. עבור עוברים מזויפים, הדקו את הקשר בדיוק מספיק כדי להחזיק את הקשר.
- לאחר מכן, השתמש במספריים מיקרו כדי לחתוך את הקצוות העודפים של התפר קרוב ככל האפשר לניצן (וידאו משלים 5).
- היזהר מאוד כי הקצוות שזה עתה נחתכו של התפר קשור אינם במצב לנקב כלי דם סמוכים במהלך סיבוב או עקב פעימות הלב.
- בעזרת הפינצטה, הסר את חתיכות התפר העודפות שנחתכו בשלב 3.3.
- לבסוף, באמצעות פינצטה סגורה, להחזיר את העובר למקומו המקורי, כמו בשלב 2.5 (וידאו משלים 6).
- לאחר השלמת תהליך LAL, מכסים את הביצה בשכבה כפולה של פרפילם ודוגרים עליה שוב. סגירה הדוקה וסטרילית של הביצים היא בעלת חשיבות עליונה להישרדות, במיוחד לאחר 24 שעות הדגירה. אם רוצים גם גישה חזותית, השתמשו בשעוות פרפין עם שקופיות זכוכית.
הערה: כאשר התקופה העוברית המוקדמת נחקרת, הביציות מודגרות בדרך כלל במשך 24-48 שעות עד שהן מגיעות בערך HH25 או HH27. עם זאת, אין גבול, ושלבים מאוחרים יותר ניתן ללמוד, כפי שניסו חוקרים אחרים. עבור מהירויות פעולה גבוהות, מומלץ צוות של שני אנשים לפחות. אדם אחד צריך להיות מאומן ואחראי על פתיחת ביציות, ניקוי ראשוני של הממברנה, סיבוב, וניקוי קרום סביב ניצן פרוזדורים שמאלי. האדם השני אחראי רק על הכנת הקשר הראשונית, מיקום הקשר והידוק הקשר. סיבוב העובר הסופי יכול להתבצע על ידי אדם 1. הפעולה הכירורגית לעובר יחיד אורכת כ-4-5 דקות. - לפני/אחרי ניתוחים יש לנקות את המשטחים והמכשירים עם אתנול. הקפידו למרוח תמיסת רינגר אפרוחים טריים (NaCl, KCl, CaCl2 ו-NaHCO3)16,27 על מכשירי המתכת הנוגעים ברקמות העובריות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניתן להשתמש בטכניקות הדמיה מתקדמות שנפתרו בזמן כדי לבחון את השינויים המבניים והמורפולוגיים עקב התערבות LAL10. יתר על כן, דגימות LAL מקובלות גם על שיטות מולקולריות וביולוגיות19,28. בטבלה 1 מובאים מחקרים מדגמיים שהשתמשו בתוצאות מודל LAN. בהקשר זה, התערבות LAL בוצעה בעוברי אפרוחים שהגיעו ל- HH20-21. גם לבבות הבקרה (בריאים) וגם לבבות LAL הוצאו מהעובר ב- HH25-26. לאחר מכן, הדגימות היו קבועות 4% paraformaldehyde (PFA) ב 4 ° C 6,15. דגימות הלב שהוצאו התייבשו בתמיסות אתנול בריכוזים הולכים וגדלים (70%, 96% ו-100%) למשך שעה כל אחת. לבסוף, הדגימות נשמרו בקסילן ב-RT במשך 0.5 שעות, והטמעת פרפין בוצעה לפני חתך בעובי של 10 מיקרומטר. הדגימות שהועברו למגלשת הזכוכית הוכתמו בכתם אלסטיקה ואן גיסון. הקטעים נבדקו תחת סטריאומיקרוסקופ, שם נמדד הקוטר הרוחבי של החדר. ביצענו גם שיטה תלת מימדית לא פולשנית, סריקת טומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT), בחלק מהדגימות11,29. הן לבבות הבקרה והן לבבות LAL ב- HH25-26 נכרתו, וקוטרם הצולב-לומן שלהם נמדד תחת OCT.
התוצאות הראו כי עבור LAL, מבנה שריר הלב קומפקטי יותר מושג עם שינויים מורפולוגיים משמעותיים בהשוואה להתפתחות נורמלית (איור 7). בנוסף, התצהיר של רכיבי מטריצה חוץ-תאיים, כגון קולגן, נצפה סביב interstitium הלב, הדומה פיברוזיס שריר הלב דומה HLHS30. כדי להבין טוב יותר עיבוי שריר הלב ודחיסה טרבקולרית, בוצעו מדידות נקבוביות מורפומטריות הן בדגימות בקרה והן בדגימות RAL. כצפוי, התערבות LAL הביאה לחלל קטן יותר של החדר השמאלי ולדחיסה טרבקולרית על ידי הידוק הגומחות הבין-טרבקולריות. ממצאים אלה מאשרים את ההשערה כי LAL משנה את הארכיטקטורה החדרית הבריאה ומשנה את כיוון ההיבט הטרבקולרי22. כמו כן, מודל LAL ב- HH29 הביא לחלל חדר ימין מוגדל, שינוי בארכיטקטורה טרבקולרית ונפח שריר הלב24.
כדי לתמוך בתוצאות שהתקבלו במחקר זה, נעשה שימוש בהדמיית OCT כדי למדוד את שטח הצלב של לומן החדר ואת אורך הציר (איור 8). LAL הראה ירידה משמעותית בגודל וקוטר החדר השמאלי בהשוואה לקבוצת הביקורת. בעוד שרק החדרים מתמקדים כאן, ההשפעה של LAL על התפתחות קשת אבי העורקים מדווחת גם31. מחקר שתרמנו לו לאחרונה דיווח בתלת-ממד כי זני שריר הלב האמצעיים גדלו בשני החדרים לאחר LAL ב-HH2532. בנוסף, קבוצות LAL הציגו עלייה בעובי הדופן בהשוואה לקבוצות ביקורת ב- HH25. מחקר זה עולה בקנה אחד עם המחקר הקודם של Tobita et al.25, אשר הדגים עלייה משמעותית בזנים ההיקפיים של אפיקרדיאלי סיסטולי ב- LAL LV ב- HH27.
איור 1: מערכת הדגירה לגדילת עוברים. ביצי תרנגולת לגהורן לבנות מופרות (Gallus gallus) הודגרו באינקובטור בלחות קבועה (60%) ובטמפרטורה (37.5 מעלות צלזיוס). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הכנת קשר RAL. קשרים מרובים ~ 0.5-1 מ"מ בקוטר וחתיכות באורך 1-2 ס"מ הוכנו באמצעות תפרים כירורגיים 10-0 ניילון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: העתק של אטריום שמאלי עוברי עשוי מרק. העתק של קטע פרוזדורים שמאלי נוצר כדי להתאמן ולתרגל כיוון קשר ושלבי סגירת קשר באמצעות שתי פינצטה. זה אפשר לנו לעשות ניסויים רבים ולשכלל את השלבים האלה לפני יישום מיומנות זו בעובר בפועל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הכנת התחנה . (A,B) כל החומרים והתמיסות למיקרו-כירורגיה הונחו באזור הנקי עבור תחנה 1 ותחנה 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: פתיחת חלון מהקצה הקהה של הביצית והסרת הקרומים החיצוניים והפנימיים. (A,B) נפתח חלון קטן באמצעות מכשירים מיקרוכירורגיים על קליפת הביצה וכולל את כל העובר ב- HH20-21. (ג) שברי קליפת הביצה הוסרו בשלב הפיצוח הראשון. (ד,ה) גם קרומים חוץ-עובריים נותחו תחת המיקרוסקופ. (F) לאחר השלמת תהליך LAL כוסתה הביצה בשכבה כפולה של פרפילם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: תמונת מצב של ניתוח קשירת פרוזדורים שמאלית (LAL). (A) מבט גבי על עובר הגוזל בכיוונו הרגיל. לחדר העוברי המגיע ל- HH20-21 יש אטריום משותף פרימיטיבי (a), חדר (v) ודרכי זרימה (ot). (B) מוצג מבט תקריב גבי של העובר ההפוך מצד שמאל ומיקום הקשר. (C) LA עם קשר התפר. קיצורים: LA = אטריום שמאלי; AA = קשת אבי העורקים. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: הסרה ובדיקה של לבבות הבקרה וה-RAL. גם (A) ביקורת וגם (B) לבבות LAL שהגיעו לשלב HH25-26 הוצאו מהעובר ונבדקו תחת סטריאומיקרוסקופ. גרף העמודות מציג את ההבדלים בקוטר הלב הרוחבי בין קבוצת LAL לקבוצת הביקורת, ואת סטיית התקן הממוצעת ± (SD) של לפחות ארבעה עותקים משוכפלים. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. בדיקה היסטולוגית של רקמות הלב בבקרה (C) ו-(D) דגימות LAL באמצעות טכניקת הצביעה של אלסטיקה ואן גיסון. גרף העמודות מראה את ההבדלים בנקבוביות (%) כדי להראות דחיסת שריר הלב בין LAL לקבוצת הביקורת, ואת ממוצע ± SD של לפחות שני עותקים משוכפלים. **P < 0.01. GraphPad Prism גרסה 9.5.1 שימשה לניתוח סטטיסטי. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצורים: LAL = קשירת פרוזדורים שמאלית; LA = אטריום שמאלי; RA = אטריום ימני; RV = החדר הימני; LV = החדר השמאלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: טומוגרפיית קוהרנטיות אופטית. גם (A) בקרה וגם (B) לבבות LAL המגיעים ל- HH25-26 נבדקו על ידי OCT. (C,D) גודלו ואורכו של צלב לומן בחדרים מסומנים בלוחות (C) ו- (D), בהתאמה. ההיסטוגרמות מייצגות את הממוצע ± SD עם שלוש חזרות לפחות. *P < 0.05; **P < 0.01; GraphPad Prism גרסה 9.5.1 שימשה לניתוח סטטיסטי. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: LAL = קשירת פרוזדורים שמאלית; RV = החדר הימני; LV = החדר השמאלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 1: סקירת מחקרים המשתמשים במודל קשירת פרוזדורים שמאלית (LAL) בעוברי עופות 6,10,12,14,22,24,27,30,32,33.
כמעט בכל העיתונים, לוס אנג'לס קשורה ב- HH21. ההשפעה של LAL נחקרת בשלבים מאוחרים יותר של HH (שלב ההערכה). קיצורים: AVC = כרית אטריובנטריקולרית; LAV = תעלה אטריובנטריקולרית שמאלית; RAV = תעלה אטריובנטריקולרית ימנית; RA = אטריה ימנית; LA = אטריה שמאלית; RV = החדר הימני; LV = החדר השמאלי; SEN = subendocardium; IVS = מחיצה בין-חדרית; micro-CT = טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 2: יעילות אופיינית של מודל קשירת פרוזדורים שמאלית (LAL) שנוצר ב- HH21 והודגר עד HH25. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
סרטון משלים 1: שני הקרומים החיצוניים והפנימיים של עובר העופות מוסרים. לאחר מכן, רק קרום ויטלין מוסר, כפי שמוצג באמצעות מספריים מיקרו. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
סרטון משלים 2: פינצטה ממוקמת מתחת לחלק הגבי של העובר הימני כלפי מעלה והופכת בזהירות כדי לחשוף את ניצן הפרוזדורים השמאלי שלו. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
סרטון משלים 3: הקרומים סביב ניצן הפרוזדורים השמאלי מנוקים בהדרגה. האטריום מתרחב מעט, מה שמאפשר מיקום קשר וקשירה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
סרטון משלים 4: תפר באורך של כ-0.1-0.3 מ"מ ממוקם בסמוך לעובר ומהדק סביבו באמצעות שתי פינצטה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
סרטון משלים 5: קצוות התפרים העודפים של הקשר נחתכים בזהירות באמצעות מספריים מיקרו. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
סרטון משלים 6: העובר מוחזר בעדינות לכיוונו הרגיל. LAL הושלם. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ב- HLHS, זרימת הדם משתנה עקב פגמים מבניים, מה שמוביל למורפולוגיה לא תקינה בצד שמאל 4,6. המודל הנוכחי מספק מערכת ניסויית מעשית כדי להבין טוב יותר את ההתקדמות של HLHS ואולי אפילו לחקות את הפתוגנזה שלו8. עם זאת, הקמת מודל בעלי חיים HLHS שווה ערך לחלוטין מבחינה קלינית היא משימה מאתגרת. בנוסף למודל LAL העופות המוצג כאן, מחקרים אחרונים בעכברים, כבשים עובריות וצפרדעים ניסו לשכפל את התכונות המורפולוגיות, המודינמיות והפתופיזיולוגיות של פרוגנוזת HLHS. בעוברי עכברים, העומס המכני משתנה באמצעות חומר אמבוליזציה המוזרק ללוס אנג'לס באמצעות התערבות עוברית ביום העובר (ED) 14.5 (בערך HH40-41 בעוברי אפרוחים)34. בסך הכל 48% מהעוברים עם תסחיף חיובי שרדו הריון עם LVs קטנים וזרימת אבי העורקים המדרדרת. תקופת ההיריון הארוכה, אתגרים נוספים בהתערבויות בנקודות זמן מוקדמות וניתוח עובר מאתגר יכולים להגביל את ההיתכנות של מודל זה. היפופלזיה LV חיקתה גם בדגמי הטלה העוברית על ידי מילוי לוס אנג'לס בגומי סיליקון באמצעות קטטר בלון35. במודל בעלי חיים גדולים זה, נפח LV מופחת מספיק, אך זמן ההישרדות אינו ארוך, וכתוצאה מכך חדירת המחלה נמוכה. גישת התערבות חלופית היא לשלול את הפתח באמצעות צנתור טרנסהפטי מלעורי, כפי שנעשה ב- fetal lamb36, למרות שהכוונת הסטנט החוסם ל- foramen ovale מאתגרת מאוד. מודלים של כבשים באופן כללי מאתגרים מאוד בשל מורפולוגיות כלי הדם הקיימות שלהם ופיזיולוגיה ריאתית שלילית. לפיכך, הצורך ברבייה עונתית, גיל הריון מאוחר יותר וגודל מדגם קטן מגבילים עוד יותר מודל זה. לבסוף, עובר Xenopus מוצג גם כמודל נוח נוסף לחיקוי מחלת לב אנושית37, למרות הלב בעל שלושת החדרים שלו עם חדר יחיד והבדלים בדפוסי תאי הפסגה העצבית. הזמינות של מיקרו-הזרקה מלאה מבוססת גנום והתערבויות מיקרו-כירורגיות וזמן ההישרדות הארוך הופכים גם מודל זה לאטרקטיבי.
במחקרים קודמים, חדירת המחלה של שישה מתוך 39 עוברי עופות מנותחים הוצגה כ-15% במודל LAL34. עם זאת, חדירת ה-HLHS הממוצעת של מודל עוברי האפרוחים שבדקנו בשלב מוקדם (הגעה ל-HH25 ו-HH27) הייתה 66% (12 מתוך 18 עוברי עופות מנותחים). פרופ' סדמרה דיווח כי זמן ההישרדות הממוצע של עוברים יכול להיות HH40 (ED14)19. קבוצות אחרות המבצעות קשירה זו באופן קבוע דיווחו על שיעורי הצלחה גבוהים בנקודות זמן מוקדמות (למשל, 75% עד HH29, 50% עד HH34 ו-20% עד HH38)30. עם זאת, בשלבים מאוחרים יותר, פנוטיפ מובהק מופיע ותמותה עולה. למרות שחדירת המחלה יכולה להיות נמוכה יחסית בעוברי אפרוחים, מטרת מודל זה היא לבחון טוב יותר את האטיולוגיה והפתולוגיה של HLHS טרום לידתי, במיוחד בשלבים המוקדמים.
בשל גודלו הקטן מאוד של עובר האפרוח בשלב מוקדם, התערבות LAL לפני ואחרי הניתוח עלולה להוביל למספר סיבוכים. כתרופה למניעת זיהום, קליפות ביצים וספסלים מנוקים עם אתנול 70%, וכפפות ניתן להשתמש לאורך כל ההליך. שלב קריטי בפרוטוקול LAL הוא הסרת כל קרום הלב כדי לאפשר התאמה טובה של הקשר סביב ניצן פרוזדורים שמאלי. בנוסף, מצאנו שצוות של שני אנשים הוא שימושי ביותר, במיוחד בהכשרה ובהתמחות בסט מיומנויות ספציפי הדרוש במהלך שלבי הפרוטוקול. גישה זו מאיצה את ההליך ואת עקומת הלמידה שלו. ככזה, הסיכון לדימום וזיהום הוא משני ועולה על היתרונות של מערכת החברים המוצעת. מומלץ להשתמש בתפר מוכן מראש המאוחסן בתמיסת רינגר אפרוחים סטרילית. בנוסף, שמירה על חוזק הידוק נמוך של התפר היא קריטית גם לתנובת עובר גבוהה יותר. קשרים הדוקים יותר על ניצן הפרוזדורים המיושמים ב- HH21 עלולים להוביל לכשל מוקדם מדי של ה- LV שאינו מסוגל לפרט את המעורבות הקריטית מבחינה קלינית של פגמים בהולכה, כלילית ומיוארכיטקטורה משנית, אשר תוארו היטב במחקרים קודמים22. באופן ספציפי, שימוש בפינצטה ובמספריים המשובחים והלא בשימוש בשלבים מסוימים ובמספריים בוטים יחסית באחרים יכול להפחית דימום בשוגג. לבסוף, מיד לאחר השלמת הקשר, יש להפנות את העובר למיקומו המקורי במהירות, ולסגור את חלון קליפת הביצה בשכבה כפולה של פרפילם כדי לשמור על הטמפרטורה והלחות שלו. התשואה האופיינית למודל LAL המגיע ל-HH25 מוצגת בטבלה 2. בנוסף לירידה בגודל החדר, עלולים להתפתח גם מומים מסתמיים, כגון אטרזיה מיטרלית / אבי העורקים. חומרת הנגעים הללו מגבירה את התחלואה בשלבים מאוחרים יותר, כמו ב-HLHS. בשל האתגרים שנדונו כאן, בהשוואה להתערבויות מכניות אחרות המבוצעות בעוברי אפרוחים, כגון פסים קונוטרונקליים, מודל LAL מביא לרמות תפוקה נמוכות בהרבה. אנו מאמינים, באמצעות אמצעי הזהירות שהוצגו כאן, תשואה של 50% היא ברת השגה.
עובר העופות הוא מודל אידיאלי של בעלי חוליות לחקר התפתחות הלב וכלי הדם בשל המבנה המורפולוגי שלו, גודלו, עלותו הנמוכה, קלות התרבית והמניפולציהשלו 38,39. מודל זה מספק גם הגנה טבעית מפני פתוגנים40. ניתן להשתמש בעוברים מכשור בהדמיית in vivo מתקדמת ובמניפולציה מקומית של siRNA. לפיכך, אזורי גנים שמורים של האדם והתרנגולת זמינים באמצעות ריצוף רובה ציד סנגר ומיפוי פיזי39, מה שמוביל למחקרים מתקדמים רגישים למכנו19. יתר על כן, גישת המיקרו-מערך המיושמת על ידי Krejčí et al. שימשה למדידת ההצלחה לגבי הפיכות פוטנציאלית של שינויים המודינמיים במבנה שריר הלב. לפיכך, זיהוי גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי בין החדר השמאלי והימני יכול לשמש כקריטריון לתקופה האידיאלית של התערבות כאשר שינויים בלתי הפיכים מתחילים33.
לסיכום, כיוונים עתידיים אפשריים ליישומים מיקרוכירורגיים במודל עובר האפרוחים כוללים שימוש בטכניקות עריכה של גנים קרדיווסקולריים תוך התמקדות בגנים ספציפיים של מטריצה ומסלולי איתות מולקולריים, תמיכה בהתקדמות בתרבית תאי רקמה ובטכנולוגיות הדמיה32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מכירים בפרס החוקר הראשי של Tubitak 2247A 120C139 המספק מימון. המחברים רוצים גם להודות לפאקטבוק גידה. A. S., איסטנבול, טורקיה, על אספקת ביציות פוריות ותמיכה במחקר הלב וכלי הדם.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-0 nylon surgical suture | Ethicon | ||
| Elastica van Gieson staining kit | Sigma-Aldrich | 115974 | For staining connective tissues in histological sections |
| Ethanol absolute | Interlab | 64-17-5 | For the sterilization step, 70% ethanol was obtained by diluting absolute ethanol with distilled water. |
| Incubator | KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A | AZYSS600-110 | |
| Kimwipes | Interlab | 080.65.002 | |
| Microscissors | World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL | 555640S | Vannas STR 82 mm |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | Sealing stage for egg reincubation |
| Paraplast Bulk | Leica Biosystems | 39602012 | Tissue embedding medium |
| Stereo Microscope | Zeiss Stemi 508 | Stemi 508 | Used at station 1 |
| Stereo Microscope | Zeiss Stemi 2000-C | Stemi 2000-C | Used at station 2 |
| Tweezer (Dumont 4 INOX #F4) | Adumont & Fils, Switzerland | Used to return the embryo | |
| Tweezer (Super Fine Dumont #5SF) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL | 501985 | Used to remove the membranes on the embryo |
References
- Wang, T., et al. Congenital heart disease and risk of cardiovascular disease: A meta-analysis of cohort studies. Journal of the American Heart Association. 8 (10), e012030 (2019).
- Chaudhry, B., et al. The left ventricular myocardium in hypoplastic left heart syndrome. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (8), 279 (2022).
- Lashkarinia, S. S., Çoban, G., Ermek, E., Çelik, M., Pekkan, K. Spatiotemporal remodeling of embryonic aortic arch: stress distribution, microstructure, and vascular growth in silico. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 19 (5), 1897-1915 (2020).
- Ho, S., Chan, W. X., Yap, C. H. Fluid mechanics of the left atrial ligation chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 20 (4), 1337-1351 (2021).
- Gordon, B. M., Rodriguez, S., Lee, M., Chang, R. K. Decreasing number of deaths of infants with hypoplastic left heart syndrome. The Journal of Pediatrics. 153 (3), 354-358 (2008).
- Salman, H. E., et al. Effect of left atrial ligation-driven altered inflow hemodynamics on embryonic heart development: clues for prenatal progression of hypoplastic left heart syndrome. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 20 (2), 733-750 (2021).
- Fruitman, D. S. Hypoplastic left heart syndrome: Prognosis and management options. Paediatrics & Child Health. 5 (4), 219-225 (2000).
- Rahman, A., Chaturvedi, R. R., Sled, J. G. Flow-mediated factors in the pathogenesis of hypoplastic left heart syndrome. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (5), 154 (2022).
- Henderson, D. J., Anderson, R. H. The development and structure of the ventricles in the human heart. Pediatric Cardiology. 30 (5), 588-596 (2009).
- Kowalski, W. J., Pekkan, K., Tinney, J. P., Keller, B. B. Investigating developmental cardiovascular biomechanics and the origins of congenital heart defects. Frontiers in Physiology. 5, 408 (2014).
- Midgett, M., Rugonyi, S. Congenital heart malformations induced by hemodynamic altering surgical interventions. Frontiers in Physiology. 5, 287 (2014).
- Kowalski, W. J., et al. Left atrial ligation alters intracardiac flow patterns and the biomechanical landscape in the chick embryo. Developmental Dynamics. 243 (5), 652-662 (2014).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451 (7181), 943-948 (2008).
- Sedmera, D., et al. Cellular changes in experimental left heart hypoplasia. The Anatomical Record. 267 (2), 137-145 (2002).
- Celik, M., et al. Microstructure of early embryonic aortic arch and its reversibility following mechanically altered hemodynamic load release. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 318 (5), H1208-H1218 (2020).
- Tobita, K., Schroder, E. A., Tinney, J. P., Garrison, J. B., Keller, B. B. Regional passive ventricular stress-strain relations during development of altered loads in chick embryo. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 282 (6), H2386-H2396 (2002).
- Alser, M., Shurbaji, S., Yalcin, H. C. Mechanosensitive pathways in heart development: findings from chick embryo studies. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 8 (4), 32 (2021).
- Alser, M., et al. Blood flow disturbance and morphological alterations following the right atrial ligation in the chick embryo. Frontiers in Physiology. 13, 849603 (2022).
- Sedmera, D.
- Rychter, Z., Rychterová, V., Lemez, L. Formation of the heart loop and proliferation structure of its wall as a base for ventricular septation. Herz. 4 (2), 86-90 (1979).
- Harh, J. Y., Paul, M. H., Gallen, W. J., Friedberg, D. Z., Kaplan, S. Experimental production of hypoplastic left heart syndrome in the chick embryo. The Americal Journal of Cardiology. 31 (1), 51-56 (1973).
- Sedmera, D., Pexieder, T., Rychterova, V., Hu, N., Clark, E. B. Remodeling of chick embryonic ventricular myoarchitecture under experimentally changed loading conditions. The Anatomical Record. 254 (2), 238-252 (1999).
- Karakaya, C., et al. Asymmetry in mechanosensitive gene expression during aortic arch morphogenesis. Scientific Reports. 8 (1), 16948 (2018).
- Trinidad, F., et al. Effect of blood flow on cardiac morphogenesis and formation of congenital heart defects. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (9), 303 (2022).
- Tobita, K., Keller, B. B. Right and left ventricular wall deformation patterns in normal and left heart hypoplasia chick embryos. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 279 (3), H959-H969 (2000).
- Bortecine, S., Merve Nur, C., Faruk, K., Kerem, P. Auxiliary humidifier system design and construction for research grade egg incubators. Zenodo. , (2023).
- Schroder, E. A., Tobita, K., Tinney, J. P., Foldes, J. K., Keller, B. B. Microtubule involvement in the adaptation to altered mechanical load in developing chick myocardium. Circulation Research. 91 (4), 353-359 (2002).
- Rufaihah, A. J., Chen, C. K., Yap, C. H., Mattar, C. N. Z. Mending a broken heart: In vitro, in vivo and in silico models of congenital heart disease. Disease Models & Mechanisms. 14 (3), (2021).
- Siddiqui, H. B., Dogru, S., Lashkarinia, S. S., Pekkan, K. Soft-tissue material properties and mechanogenetics during cardiovascular development. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (2), 64 (2022).
- Pesevski, Z., et al. Endocardial fibroelastosis is secondary to hemodynamic alterations in the chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Developmental Dynamics. 247 (3), 509-520 (2018).
- Hu, N., et al. Dependence of aortic arch morphogenesis on intracardiac blood flow in the left atrial ligated chick embryo. Anatomical Record. 292 (5), 652-660 (2009).
- Lashkarinia, S. S., et al. Myocardial biomechanics and the consequent differentially expressed genes of the left atrial ligation chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Annals of Biomedical Engineering. 51 (5), 1063-1078 (2023).
- Krejčí, E., et al. Microarray analysis of normal and abnormal chick ventricular myocardial development. Physiological Research. 61, S137-S144 (2012).
- Rahman, A., et al. A mouse model of hypoplastic left heart syndrome demonstrating left heart hypoplasia and retrograde aortic arch flow. Disease Models & Mechanisms. 14 (11), (2021).
- Fishman, N. H., Hof, R. B., Rudolph, A. M., Heymann, M. A. Models of congenital heart disease in fetal lambs. Circulation. 58 (2), 354-364 (1978).
- Wong, F. Y., et al. Induction of left ventricular hypoplasia by occluding the foramen ovale in the fetal lamb. Scientific Reports. 10 (1), 880 (2020).
- Nie, S. Use of frogs as a model to study the etiology of HLHS. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 10 (2), 51 (2023).
- Vilches-Moure, J. G. Embryonic chicken (Gallus gallus domesticus) as a model of cardiac biology and development. Comparative Medicine. 69 (3), 184-203 (2019).
- Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Developmental Dynamics. 243 (2), 216-228 (2014).
- Sukparangsi, W., Thongphakdee, A., Intarapat, S. Avian embryonic culture: A perspective of in ovo to ex ovo and in vitro studies. Frontiers in Physiology. 13, 903491 (2022).
