Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Screening av ionekanaler i kreftceller

Published: June 16, 2023 doi: 10.3791/65427
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 3, 3
1Department of Neurology and Rehabilitation Medicine, Division of Neuro-Oncology, University of Cincinnati College of Medicine, 2Department of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, University of Saint Joseph, 3The Vontz Center for Molecular Studies, University of Cincinnati College of Medicine

Summary

Den farmakologiske målrettingen av ionkanaler er en lovende tilnærming til behandling av solide svulster. Detaljerte protokoller er gitt for å karakterisere ionkanalfunksjon i kreftceller og analysere effekten av ionkanalmodulatorer på kreftens levedyktighet.

Abstract

Ionkanaler er kritiske for celleutvikling og opprettholdelse av cellehomeostase. Forstyrrelsen av ionkanalfunksjonen bidrar til utviklingen av et bredt spekter av lidelser eller kanalopatier. Kreftceller bruker ionkanaler for å drive sin egen utvikling, samt å forbedre seg som en svulst og å assimilere i et mikromiljø som inkluderer forskjellige ikke-kreftceller. Videre kan økninger i nivåer av vekstfaktorer og hormoner i tumormikromiljøet resultere i forbedret ionkanaluttrykk, noe som bidrar til kreftcelleproliferasjon og overlevelse. Dermed er den farmakologiske målrettingen av ionkanaler potensielt en lovende tilnærming til behandling av solide maligniteter, inkludert primær og metastatisk hjernekreft. Her beskrives protokoller for å karakterisere funksjonen til ionkanaler i kreftceller og tilnærminger for å analysere modulatorer av ionkanaler for å bestemme deres innvirkning på kreftens levedyktighet. Disse inkluderer farging av en celle (er) for en ionkanal (er), testing av den polariserte tilstanden til mitokondrier, etablering av ionkanalfunksjon ved hjelp av elektrofysiologi og utførelse av levedyktighetsanalyser for å vurdere stoffets styrke.

Introduction

Membrantransportproteiner er kritiske for kommunikasjon mellom celler, samt for å opprettholde cellulær homeostase. Blant membrantransportproteinene tjener ionkanaler til å drive vekst og utvikling av celler og for å opprettholde tilstanden til celler i utfordrende og skiftende miljøer. Ionekanaler har også blitt rapportert å drive og støtte utviklingen av solide svulster, både systemisk og i sentralnervesystemet (CNS)1,2. For eksempel er KCa3.1-kanaler ansvarlige for å regulere membranpotensialet og kontrollere cellevolumet, noe som er viktig i cellesyklusregulering. Defekte KCa3.1-kanaler har blitt rapportert å bidra til unormal spredning av tumorceller3. Videre kan ionekanaler bidra til metastatisk spredning av kreft. Transient receptor potential (TRP) kanaler, for eksempel, er involvert i Ca 2+ og Mg2+ tilstrømning; Denne tilstrømningen aktiverer flere kinaser og varmesjokkproteiner som fungerer for å regulere den ekstracellulære matrisen rundt en svulst, noe som igjen er viktig for å initiere kreftmetastase4.

Siden ionekanaler kan bidra til utvikling av kreft, kan de også være mål for legemiddelrelatert kreftbehandling. For eksempel er resistens mot behandlingsmodaliteter, inkludert kjemoterapi og ny immunterapi, relatert til dysregulering av ionkanalfunksjon 5,6,7. I tillegg fremstår ionkanaler som viktige legemiddelmål for å hindre vekst og utvikling av kreft, med repurposed small molecule (FDA-godkjente) legemidler som undersøkes, samt biopolymerer, inkludert monoklonale antistoffer 1,2,8,9. Mens det har vært mye fremgang på denne fronten, er ionkanal kreftmedisinoppdagelse fortsatt underutviklet. Dette skyldes delvis de unike utfordringene ved å studere ionekanaler i kreftceller. For eksempel er det tekniske begrensninger i å sette opp elektrofysiologianalyser for langsomvirkende forbindelser og tidsmessige forskjeller i kanalaktivering og medikamentvirkning. Videre kan løseligheten av forbindelser også hindre fremgang, da de fleste av de automatiserte elektrofysiologisystemene som vanligvis brukes i dag, bruker hydrofobe substrater, noe som kan bidra til artefakter som følge av sammensatt adsorpsjon. I tillegg er store bioorganiske molekylære terapier som naturlige produkter, peptider og monoklonale antistoffer teknisk utfordrende å screene ved hjelp av konvensjonelle elektrofysiologianalyser10. Endelig forblir de bioelektriske egenskapene til kreftceller dårlig forstått11.

I mellomtiden er immunfluorescensfarging av ionkanaler ofte utfordrende. Dette skyldes delvis kompleksiteten i deres strukturer og deres kontekst i membranen, noe som påvirker evnen til både å generere og anvende antistoffer for mikroskopistudier. Det er spesielt viktig at antistoffene som brukes til å flekke ionekanaler er validert for spesifisitet, affinitet og reproduserbarhet. Kommersielle antistoffer for ionekanaler bør vurderes basert på deres valideringsstrategi og publikasjonsrekord. Eksperimenter bør inkludere negative kontroller for å demonstrere mangelen på uspesifikk binding ved enten knockdown eller knockout av målproteinet. Alternativt kan cellelinjer der målproteinet er fraværende eller i lav overflod basert på mRNA- eller proteinbestemmelser, tjene som negative kontroller. For eksempel viser denne studien lokaliseringen av (GABA) reseptorunderenheten Gabra5 i en medulloblastomcellelinje (D283). D283-celler med siRNA-knockdown og Daoy-celler, en annen cerebellar medulloblastomcellelinje, ble farget for Gabra5 og viste ingen nevneverdig farging (data ikke vist).

Her presenteres metoder for å analysere og analysere ionkanalfunksjonen, samt effekten av ionkanalmodulatorer på kreftceller. Protokoller er gitt for (1) fargeceller for en ionkanal, (2) testing av den polariserte tilstanden til mitokondrier, (3) etablering av ionkanalfunksjon ved hjelp av elektrofysiologi og (4) in vitro legemiddelvalidering. Disse protokollene legger vekt på studier av type A gamma-aminosmørsyre (GABAA) reseptor 2,12,13,14,15,16, en kloridanionkanal og viktig hemmende nevrotransmitterreseptor. Metodene som presenteres her gjelder imidlertid for å studere mange andre kreftceller og ionekanaler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Immunmerking ionkanaler i dyrkede celler

  1. Klargjøring av cellene og eksperimentelt oppsett
    1. Opprettholde cellene som en aktivt voksende kultur i 75 cm2 kulturflasker. Pass cellene en gang til de blir 50% -90% sammenflytende, avhengig av doblingstiden til cellelinjen som brukes.
      MERK: For denne studien ble D283-celler, en gruppe 3-medulloblastomcellelinje, brukt.
    2. Samle cellene fra kulturkolben inn i et sentrifugerør (15 ml eller 50 ml), og tilsett 2 ml 0,25% trypsin-EDTA for å løsne adherente celler. Inkuber i 5 minutter ved romtemperatur (RT). Etter 5 min, bank kolben tre til fem ganger for å hjelpe til med å løsne cellene. Samle cellene i 10 ml medium med 10% FBS for å stoppe virkningen av trypsinet.
    3. Sentrifuge ved 480 x g i 5 min ved RT. Aspirer mediet forsiktig. Ikke forstyrr cellepelleten.
    4. Resuspender cellene i 5 ml til 10 ml medium, avhengig av tettheten av kulturen.
      MERK: Tettheten må være konsistent med aktivt voksende celler og er avhengig av sammenløp av celler i kolben. Visuell vurdering bør brukes til å tilnærme den optimale celletettheten; Spesielt bør cellene være mellom 40% -90% konfluerende og jevnt fordelt.
    5. Fjern 100 μL celler, og legg til et 1,5 ml rør som inneholder 100 μL 0,4% trypanblå for å markere ikke-levedyktige celler. Inkuber 5-15 min ved RT, avhengig av cellelinjen.
    6. Telle cellene manuelt ved hjelp av et hemocytometer (se materialtabellen) i 10 μL oppløsning. Telle de levende, ufargede cellene i hvert av de fire hjørnene av de 16 kvadratene i hemocytometeret. Multipliser det gjennomsnittlige celletallet med fortynningsfaktoren og med 10.000 for å gi cellene per milliliter (celler / ml). Alternativt kan en automatisert celleteller brukes.
    7. Fortynn celler til 1 x 105 celler/ml til dyrkningsmediet spesifisert for hver cellelinje. Frø 1. 8 ml celler i hver brønn i en 6-brønns plate som inneholder en 22 mm x 22 mm coverslip forhåndsbelagt med 0,1 mg / ml poly-D-lysin i henhold til produsentens instruksjoner (se materialfortegnelsen).
      MERK: Man vil kanskje teste bruken av både poly-D-lysin og poly-L-lysin, da det er rapporter om cellelinjespesifikke preferanser17,18. Noen cellelinjer har proteaser som kan bryte ned poly-L-lysin, mens det er rapporter om at poly-D-lysin er giftig for noen cellelinjer. I motsetning til dette har nevronceller, som PC12, blitt rapportert å være sunnere på poly-D-lysinoverflater.
    8. Dyrk cellene i en inkubator med et fuktet 5% CO2 -miljø ved 37 ° C over natten for å la cellene feste seg til dekselet. Undersøk vedlegget av cellene under et omvendt mikroskop med et 20x mål.
      MERK: Cellene må være helt festet til dekselet før behandling eller direkte immunfarging. På dette tidspunktet kan cellene behandles med legemidler (eller kjøretøykontroll) ved enten tilsetning av en konsentrert bestand (for eksempel 600 μL av en 4x stamløsning) eller erstatning av mediet med friskt medium som inneholder legemidlet ved ønsket 1x konsentrasjon; Cellene kan deretter returneres til inkubatoren i opptil ytterligere 48 timer. Løsningsmiddelbehandlede celler er inkludert for å vurdere effekten av stoffet på nivået og lokaliseringen av målmolekylet. I denne studien ble D283-celler behandlet med 600 μL av en 3,2 μM-løsning av en GABAA-reseptorpositiv allosterisk modulator, QH-II-06614 (se materialtabellen), i 48 timer. Kontrollcellene ble behandlet med et tilsvarende volum DMSO.
  2. Forberedelse for immunmerking: Fiksering, permeabilisering og blokkering
    1. Skyll cellene med 2,5 ml 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH2PO4, se materialfortegnelsen), og aspirer oppløsningen umiddelbart.
    2. Fest cellene ved hjelp av 1 ml 4% PFA i 1x PBS i 1 time ved RT.
      MERK: Mens 4% PFA er standardfikseringsmiddelet for immunfarging, kan glutaraldehyd eller glyoksal også brukes til å fikse membranproteiner for immunfluorescens. Alkoholbaserte fikseringsmetoder, som behandlinger med iskald metanol, kan føre til mindre godt bevart morfologi og tap av membranproteiner19,20.
    3. Vask seks ganger med 2,0 ml 1x PBS (5 min per vask) ved omrøring på en shaker. Inkuber i 1 time ved RT i en blokkeringsbuffer sammensatt av 1x PBS med 0,8 % Triton X-100 og 10 % normalt serum som matcher vertsarten til det primære antistoffet (alternativt kan 3 % BSA eller bovin serumfraksjon V-albumin brukes i stedet for normalt serum).
      MERK: Dette trinnet brukes til å blokkere ikke-spesifikk binding.
  3. Immunmerking
    MERK: Etter tilsetning av antistoffene som er konjugert til fluoroforer, må målinger tas snart for å forhindre fotobleking. Inkubasjoner med konjugerte antistoffer må beskyttes mot lys. Bruken av et monteringsmedium som inneholder midler som scavenge frie radikaler vil redusere fotobleking. Oppbevar lysbildene i en lystett, ugjennomsiktig beholder (ved 4 °C) etter at dekslene er tettet. Ved avbildning kan fotobleking minimeres ved å begrense intensiteten av eksitasjonsbelysningen og eksponeringstider.
    1. Forbered et fuktet kammer ved å fôre bunnen av en 150 mm kulturfat med filterpapir. Fukt filterpapiret med sterilt destillert vann. Tegn et 3 x 2 rutenett på et stykke laboratoriefilm kuttet for å passe på toppen av filterpapiret, og merk det for å bevare orienteringen av dekslene i 6-brønnsplaten. Plasser laboratoriefilmen på toppen av filterpapiret, og utsett øvre og nedre kant for å befukte kammeret.
    2. Klargjør 100 μL per coverslip av ønsket fortynning av primærantistoff i 1x PBS med 3 % BSA. For å påvise GABRA-genproteinproduktet , bruk kaninrekombinant monoklonalt primærantistoff ved en fortynning på 1:200 (Gabra5 antistoff, midtre region; se materialfortegnelsen).
      MERK: For empirisk å bestemme den primære antistoffkonsentrasjonen som produserer det optimale signalet over bakgrunnen, bruk en fortynningsserie av det primære antistoffet mens du holder den sekundære konsentrasjonen konstant. Fortynninger på 1:100, 1:250, 1:500, 1:750 og 1:1000 anbefales for å etablere optimale primære antistoffkonsentrasjoner.
    3. Overfør dekselet fra blokkløsningen i 6-brønnsplaten til riktig sted på rutenettet tegnet på laboratoriefilmen. Kast blokkløsningen fra 6-brønnsplaten, og behold platen for vasketrinnene.
    4. Tilsett forsiktig 100 μL fortynnet primærantistoff til midten av hver dekkslip. Unngå å plassere oppløsningen over kanten av dekslen. Inkubere i 1 time ved RT.
    5. Tilsett 2,5 ml 1x PBS til hver brønn på 6-brønnsplaten. Overfør dekselet tilbake til riktig sted i 6-brønnsplaten.
    6. Utfør seks vasker i 5 minutter hver med 2,5 ml 1x PBS.
      NOTAT: Ikke la dekslene tørke under skylletrinnene, da dette kan bidra til et bakgrunnsfluorescenssignal.
    7. Sett dekslene tilbake på riktig sted på laboratoriefilmen. For hver dekkslipp, tilsett 100 μL sekundært antistoff fortynnet i 1x PBS + 1% -5% BSA.
      MERK: I utgangspunktet brukes sekundære antistoffer konjugert til Alexa Fluor 488 (se materialfortegnelsen) ved en 1: 1,000 fortynning i 1x PBS + 3% BSA. Den sekundære antistoffkonsentrasjonen kan optimaliseres ved å øke konsentrasjonen for å oppdage målproteiner med lav overflod eller redusere konsentrasjonen for å redusere bakgrunnen, om nødvendig.
    8. For de resterende trinnene, minimer lyseksponeringen for å forhindre fotobleking av det konjugerte sekundære antistoffet. Dekk kulturfatet med aluminiumsfolie, og rug i 1 time på RT.
    9. Overfør dekslene tilbake til 6-brønnsplaten. Bruk en shaker, utfør seks vasker i 5 minutter hver med 2,5 ml 1x PBS. Fjern PBS ved å snu platen over vasken eller en avfallsbeholder. Etter siste vask, la PBS ligge i brønnen for å lette fjerningen av dekselet.
    10. Merk et mikroskopglass for hver omslagsseddel. Tilsett en dråpe glyserolholdig monteringsmedium med DAPI (for å flekke kjernene) (se materialfortegnelsen) til midten av lysbildet.
    11. Bruk tang, fjern dekselet fra brønnen og legg det forsiktig på dråpen monteringsmedium på midten av lysbildet.
      MERK: Unngå dannelse av luftbobler i monteringsmediet.
    12. Bruk små biter filterpapir for å fjerne overflødig monteringsmedium. Forsegl kantene på dekselet med neglelakk, og la lakken tørke helt før avbildning. Oppbevar glassslidene ved 4 °C i en ugjennomsiktig plastboks.
  4. Avbildning og analyse
    1. Ta bilder med et fluorescensmikroskop under et 40x objektiv med nedsenkningsolje (se materialtabellen).
    2. Visualiser fluorescensbildene med de riktige filtrene.
    3. MERK: For Alexa Fluor 488, bruk en eksitasjon / utslipp på 496 nm / 519 nm; for DAPI, bruk en eksitasjon / utslipp på 358 nm / 461 nm.
    4. Ta og lagre de digitale bildefilene. En binning-verdi på 4 x 4 brukes til å lette bildeinnsamlingshastighetene og redusere bakgrunnen.
    5. Forbered de endelige bildene. Bildene kan behandles med ImageJ eller kommersielt tilgjengelig programvare. Resultatene er illustrert i figur 1.

2. Testing av den polariserte tilstanden til mitokondrier

MERK: Denne protokollen benytter TMRE (tetrametylrhodamin, etylester) analysen for å merke membranpotensialet i aktive mitokondrier, og opprettholder en negativ ladning21,22. TMRE er et cellegjennomtrengelig, rød-oransje, positivt ladet fargestoff som akkumuleres i aktive mitokondrier på grunn av deres relative negative ladning. Inaktive eller depolariserte mitokondrier har redusert membranpotensial og klarer ikke å proporsjonalt binde TMRE. FCCP (karbonylcyanid 4-[trifluormetoksy] fenylhydrazon), en ionofor uncoupler av oksidativ fosforylering (OXPHOS), depolariserer mitokondriemembraner, og forhindrer dermed akkumulering og sekvestrering av TMRE23. Dette er illustrert i figur 2.

  1. Klargjøring av cellene og eksperimentelt oppsett
    1. Vedlikehold cellene i 75 cm2 kulturflasker. Aspirer kulturmediet, og skyll cellene med 1x PBS uten kalsium og magnesium.
    2. Tilsett 2 ml 0,25% trypsin-EDTA for å løsne de adherente cellene. Inkuber i 5 minutter ved RT, og resuspender cellene i 10 ml medium.
    3. Samle cellene fra kulturkolben i et 15 ml sentrifugerør. Sentrifuge ved 480 x g i 5 min ved RT. Aspirer mediet.
    4. Resuspender cellene i 5 ml til 10 ml medium, avhengig av kulturens opprinnelige sammenløp, slik at cellekonsentrasjonen er 50-100 celler per kvadrat på hemocytometeret. Juster volumet, om nødvendig, for å gi den nødvendige celletettheten for nøyaktig telling.
    5. Fjern 100 μL celler, og legg til et 1,5 ml rør inneholdende 100 μL av 0,4% trypanblått. Telle cellene ved hjelp av et hemocytometer eller automatisert celleteller. Fortynn cellene til 3 x 104 celler/ml i dyrkningsmedium uten fenolrødt.
      MERK: DMEM-medium som mangler fenolrødt brukes fordi fenolrød eksponering hemmer membranpermeabilitet og kan bidra til bakgrunnsautofluorescens.
    6. Frø 2,5 ml av cellesuspensjonen (75 000 celler) per brønn i en 6-brønnsplate som inneholder en 22 x 22 mm coverslip forhåndsbelagt med poly-D-lysin i henhold til produsentens instruksjoner (se materialfortegnelsen).
    7. Dyrk cellene i en inkubator med fuktet 5% CO2 ved 37 ° C over natten for å la cellene feste seg til dekselet.
    8. Undersøk vedlegget av celler under et omvendt mikroskop med et 20x mål. Cellene må være helt festet til dekselet før du fortsetter.
  2. Forbereder lagerløsninger
    1. For å klargjøre en 1 mM stamløsning (1000x) TMRE (MW = 514,96 g/mol) (se materialfortegnelsen), oppløs 1 mg TMRE i 1,94 ml DMSO. Aliquot og oppbevares ved -20 °C, beskyttet mot lys. Unngå gjentatte fryse-/tinesykluser.
    2. For å fremstille en 50 mM (2 500x) stamløsning av FCCP (MW = 254,17 g/mol) (mitokondriell oksidativ fosforyleringsfrakobler), oppløs 10 mg FCCP i 786,9 μL DMSO. Aliquot og oppbevares ved -20 °C, beskyttet mot lys. Unngå gjentatte fryse-/tinesykluser.
    3. MERK: Forberedte stamløsninger er en del av TMRE Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit (se materialtabellen).
  3. Etablering av TMRE-konsentrasjonen for cellelinjene
    1. Forbered en 500 nM fungerende TMRE-løsning i cellekulturmedium. Beskytt arbeidsløsningen mot lys.
    2. Legg TMRE til celler dyrket på dekslene i medium til et endelig konsentrasjonsområde mellom 50-200 nM. Gjør dette ved først å aspirere kulturmediet og erstatte det med kulturmedium som inneholder TMRE.
    3. Inkuber i 20 minutter ved 37 °C. Sørg for å forskyve behandlingstidene for å tillate avbildning, siden cellene vises live.
    4. Vask cellene to ganger med 1x PBS, og snu dekselet på et mikroskopglass merket med den endelige TMRE-konsentrasjonen.
    5. Avbilde umiddelbart de levende cellene (topp Ex / Em = 549 nm / 575 nm).
      MERK: Umiddelbart bilde prøvene en gang fjernet fra kulturforholdene, siden mitokondriell helse er kompromittert når cellene er fjernet fra mediet og plassert på et mikroskopglass. Som et alternativ til coverslips kan cellene avbildes i glassbunnsfat.
    6. Ta bildene ved hjelp av tilgjengelig mikroskop og programvare.
      MERK: Etablere eksperimentelle mikroskopiavbildningsparametere under TMRE-konsentrasjonsoptimaliseringsprosessen, og opprettholde de samme forholdene i påfølgende eksperimenter for å sikre nøyaktig datasammenligning. Den detaljerte protokollen benyttet et konfokalmikroskop og kompatibel programvare (se materialfortegnelsen).
    7. Velg den optimale TMRE-konsentrasjonen, som er cellelinjeavhengig.
      MERK: TMRE-konsentrasjonen som gir det beste signalet for å løse endringer i mitokondrielle TMRE-nivåer, er generelt den laveste TMRE-konsentrasjonen, noe som gir et jevnt og lett detekterbart fluorescenssignal.
  4. Testing av den polariserte tilstanden til en celle
    1. Analyse forberedelse
      1. Forbered behandlingslagerløsningene ved de ønskede konsentrasjonene, og klargjør medier med den endelige forbindelseskonsentrasjonen som skal analyseres. For FCCP bør stamløsningen være 20 mM (tilberedt med DMSO fra en 50 mM stamløsning).
      2. Arbeid på en enkelt dekselslip om gangen, legg til 1,8 ml medium pluss testforbindelsen til cellene.
      3. Inkuber cellene med testforbindelsen ved 37 °C og 5% CO2 i et fuktet miljø i ønsket tidsperiode.
        MERK: Behandlingstidene vil variere avhengig av mekanismen som testforbindelsen kan endre mitokondriemembranpotensialet. Potentielle protonoforer som FCCP som raskt og direkte depolariserer mitokondriemembranpotensialer krever analyse kort tid etter behandling (i løpet av minutter). I motsetning til dette kan behandlingseffekter med forbindelser som indirekte påvirker mitokondriell elektrontransportkjedefunksjon, slik som de som endrer proteinaktivering eller proteinomsetning eller krever proteinsyntese, ta lengre tid å vise effekt.
      4. Under inkubasjon, slå på mikroskopet, og sett det til de forhåndsbestemte optimale bildebehandlingsparametrene, inkludert når det gjelder forsterkning, laserintensitet, bildeopptakshastighet, gjennomsnitt og eksponeringstid.
      5. Etter medikamentbehandlingsperioden, tilsett 200 μL 10x TMRE (optimal konsentrasjon bestemt ovenfor) til kontroll- og legemiddelbehandlede celler.
      6. Inkuber i 15-30 minutter ved 37 °C i 5% CO2 i et fuktet miljø. Aspirer mediet forsiktig, og skyll cellene en gang med 1x PBS.
      7. Gjenta 1x PBS-skylletrinnet for å unngå bakgrunn forårsaket av cellekulturmediet eller behandlingsforbindelsene, og snu dekselet på et mikroskopglass merket med behandlingsbetingelsene.
      8. Bilde cellene lever på Ex / Em = 549 nm / 575 nm. Ved hjelp av et konfokalmikroskop, samle flere z-stack-felt med høyhastighets bildeopptak (512 piksler x 512 piksler, gjennomsnitt = 4) før tap av celleintegritet.
      9. Lagre og lagre bildefilen for analyse. Prosedyren gjentas for neste eksperimentelle tilstand.
    2. Eksperimentelle kontroller
      1. Bruk en ikke-behandling (negativ) kontroll, utført som beskrevet ovenfor (trinn 3.1.1-3.1.8), mangler testforbindelsen i mediet.
      2. Bruk en mitokondriell membran potensialforstyrrelse (positiv) kontroll bestående av protonoforforbindelsen FCCP. Tilsett 1,8 ml 20 μM FCCP (se materialfortegnelsen) i medium til cellene. Som beskrevet ovenfor (trinn 3.1.1–3.1.2; og celleavbildning, som beskrevet i trinn 3.1.3–3.1.8), ruges det i 10 minutter ved 37 °C i 5 % CO2 i fuktige omgivelser før farging med TMRE.
        MERK: Både positive og negative kontroller kreves for disse eksperimentene.
    3. Kvantifisering
      1. Mål bildepunktintensiteten til individuelle celler fra ett enkelt representativt bilde fra det sentrale området i hver z-stakk. I dette arbeidet ble et enkelt fokusplan valgt for å lette analysen.
      2. Analyser pikselintensitetene fra minst 30 celler (i sin helhet) per behandling. Bruk Excel eller Prism til å beregne gjennomsnittet av bildepunktintensitetene for hver behandling, og presenter i stolpediagramformat med standardfeilen til gjennomsnittet.
        MERK: ImageJ kan også brukes til fluorescenskvantifisering. Alternativt kan TMRE-fargefluorescens kvantifiseres med kommersielle programvareplattformer.

3. Etablering av ionkanalfunksjon ved hjelp av elektrofysiologi

MERK: Prosedyren i dette avsnittet beskriver bruken av en automatisert elektrofysiologianalyse for å screene testforbindelser i en kreftcellelinje (figur 3).

  1. Forbereder cellene
    1. Høst celler fra en sunn kultur som mangler døde celler og / eller celle overvekst. Bruk enten den kjemiske celleavløsningsløsningen TrypLE eller en manuell celleskraper for å høste adherente og klyngede celler. Dissosiere celler som vokser i klumper eller kuler, som er spesielt vanlige blant CNS-kreftceller.
      MERK: Lett dissosiasjon av cellene bidrar til å opprettholde integriteten til membranproteinene som er essensielle for ionkonduktans.
    2. Sentrifuge cellene ved 561 x g i 10 minutter ved RT. Kast supernatanten, og suspender pelleten i DMEM (uten fenolrød), HEPES og penicillin / streptomycin med 20% FBS og 4 mM L-glutamin (se materialtabellen) opprettholdt ved 37 ° C.
      MERK: DMEM-medium som mangler fenolrødt brukes fordi fenolrød eksponering hemmer membranpermeabilitet.
    3. Plate cellene på et poly-L-lysinbelagt deksel ved lav tetthet, så det er separasjon mellom enkeltcellene.
      MERK: Poly-L-lysin brukes her, og ikke poly-D-lysin, da poly-L-lysin har bedre beleggegenskaper.
    4. Inkuber cellene ved 37 °C og 5 % CO2 i et fuktet kammer i 12 timer til 24 timer (en optimal tid må etableres) før du tar et opptak.
  2. Registrering av elektrofysiologi
    1. Fjern mediet fra dekslene. Vask cellene forsiktig to ganger med 1x PBS. Tilsett ~300 μL TrypLE-løsning. Bruk pipetten til å pipette forsiktig opp/ned fire til fem ganger til cellene er løsnet.
    2. Legg til serumfritt medium (DMEM) (fenol rødfritt), og oppretthold et endelig celleantall per volum på minst 1 million celler/ml. Bruk en 1 ml pipette til å rydde opp i cellene for å oppnå en cellesuspensjon som mangler celleklynger.
    3. Overfør cellesuspensjonen til et 1 ml rør. Inkuber cellene ved 4 °C i 10 minutter for å stabilisere cellemembranen. Hold cellene roterende på en shaker (mild syklus) for å unngå dannelse av celleklumper.
    4. Forbered oppsettet for Port-a-Patch (se materialfortegnelsen). Slå på datamaskinen, forsterkeren og perfusjonssystemet. Åpne Patch-Master-programvaren, og opprett en ny fil.
    5. Ta bufferne (ekstracellulære og interne) til RT, og legg deretter bufferne inn i de respektive perfusjonsrørene.
      MERK: Opptak av GABAA-reseptoren krever både en "ekstracellulær (bad) løsning" inneholdende 161 mM NaCl, 3 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 1,5 mM CaCl 2, 10 mM HEPES og 6 mM D-glukose (pH justert til 7,4 ved bruk av NaOH) og en "intern løsning" inneholdende 120 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 10 mM EGTA, og 10 mM HEPES (pH justert til 7,2 ved bruk av NaOH).
    6. Fyll bunnen av en elektrodebrikke (produsentgitt) med 5 μL intern løsning, og plasser elektrodebrikken på Faraday-toppen av Port-a-Patch. Legg til 10 μL ekstern løsning til brikken, og observer den rektangulære pulsen på oscilloskopet ved hjelp av Patch-Master-programvaren (se materialfortegnelsen).
      MERK: Motstanden kan ligge i området 2-3 MΩ, men dette er cellelinjeavhengig.
    7. Start opptak når den rektangulære pulsen er synlig, etter de første elektroniske justeringene, og etter at programvaren ber brukeren om å legge til celler.
    8. Legg forsiktig 20 μL enkeltcellesuspensjon på den sentrale delen av elektroden, og vent på celleplaster etterfulgt av en Giga-Ohm-tetning ved å observere motstandsverdiene i programvaren.
    9. Live fremgangen til cellepatching kan observeres i venstre kolonne i programvaren. Når cellen er "opprettholdt i helcellemodus", begynner opptakene ved å åpne en protokoll i programvaren.
    10. Sett holdepotensialet til -80 mV. Kjør en gapfri kontinuerlig opptaksprotokoll ved hjelp av Patch-Master-programvaren for å registrere strømmen fra cellen.
    11. Få en stabil grunnlinje, og bytt til en ligand og respektive sammensatt applikasjon for en spesifisert varighet ved å bruke den automatiserte perfusjonsfanen på venstre panel av programvaren.
    12. Innhent data ved hjelp av Patch-Master-programvaren.
      MERK: Dataene er lavpassfiltrert ved 1 kHz og digitalisert ved 100 kHz.
    13. Utfør dataanalyse ved å beregne maksimal amplitude av gjeldende respons ved hjelp av Nest-o-Patch-programvaren (se materialfortegnelsen).

4. In vitro styrke

MERK: Denne prosedyren beskriver en MTS-analyse for å bestemme stoffets styrke. One Solution Cell Proliferation Assay kombinerer alle nødvendige analysereagenser i en forberedt løsning som kan tilsettes i ett trinn til cellekulturbrønner for å vurdere cellens levedyktighet og spredning etter behandling med eksperimentelle forbindelser. Reagenset rekonstitueres i henhold til produsentens anbefalinger (se materialfortegnelsen), alisitert og oppbevares ved −20 °C. Avsnittet beskriver bruken av analysen for å bestemme IC50 av testforbindelser i en bestemt cellelinje (figur 4). Dette MTS-reagenset kan også brukes til høy gjennomstrømningsscreening av et stort antall forbindelser ved kjente konsentrasjoner.

  1. Forbereder cellene
    MERK: Celletallet avhenger av veksten og metabolismen til hver enkelt cellelinje. Bestem det optimale cellenummeret eksperimentelt før du bruker analysen for å evaluere eventuelle undersøkelsesbehandlinger.
    1. Høst adherente celler fra kulturen ved trypsinisering, og bruk Accutase (se materialtabellen) for å dissosiere cellene som vokser i klumper eller kuler.
      MERK: Glioblastom og primære medulloblastomcellelinjer krever ofte Accutase da de har en tendens til å vokse i klumper eller kuler.
    2. Tell cellene, og lag en celleløsning med 10.000 celler per brønn i et volum på 75 μL. Gjør fortynninger av aksjen for cellenumrene som skal testes. Forbered minst 1 ml per fortynning.
    3. Plate 75 μL av hver fortynning i sett med fem påfølgende brønner i en 96-brønnsplate. Inkuber ved 37 °C og 5 % CO2 over natten i et fuktet miljø (dvs. en inkubator).
      MERK: Cellelinjer med langsom vekst eller metabolisme (som forsurer vekstmediet i mer enn 3 dager) kan kreve mer enn 10.000 celler som øvre cellenummerområde, mens cellelinjer som vokser raskt (vanligvis raskere enn 20 timers doblingstid) krever færre celler. Cellelinjer med høy metabolisme kan kreve færre enn 1000 celler per brønn. Celleområdet kan justeres for å bestemme den optimale pletteringstettheten for MTS-analysen for disse cellelinjene.
  2. Kontroll av liksombehandling
    1. Tilsett 25 μL medium per brønn for å simulere tilsetning av testforbindelsen i MTS-analysen.
      MERK: I selve MTS-analysen vil 25 μL av en 4x bestand av den valgte behandlingskonsentrasjonen for testforbindelsen (her en GABA A-reseptormodulator, QH-II-066) bli tilsatt cellene for å gi 1x endelig behandlingskonsentrasjon i et totalt volum på 100 μL per brønn.
    2. Inkuber ved 37 °C og 5 % CO2 i fuktet miljø i 48 timer. Dette simulerer standard inkubasjon i nærvær av et stoff.
  3. MTS-analyse
    1. Tine de nødvendige alikotene av MTS-reagenset. Tilsett 20 μL MTS-reagens per brønn. Inkuber ved 37 °C og 5 % CO2 i fuktet miljø i 1 time.
    2. Sentrifuger platen (1 350 x g i 5 minutter) ved romtemperatur for å fjerne bobler, noe som kan forstyrre absorbansavlesningen.
      MERK: Fjern eventuelle bobler med en finmasket nål.
    3. Les av absorbansen ved 490 nm. Lagre dataene som en Excel-fil.
    4. Sett platene tilbake til 37 °C i 5 % CO2, og les gjentatte ganger innenfor den lineære perioden på 4 timer for analysen.
      MERK: Det er ikke nødvendig å sentrifugere på nytt før absorbansen er avlest. Data fra senere avlesninger, spesielt 2-timers avlesning, kan være viktige for å undersøke hvor raskt en cellelinje metaboliserer MTS-reagenset og er nyttige ved valg av antall celler til platen for analysen.
    5. Plott den optiske absorbanstettheten (OD) ved 490 nm (OD490) versus det belagte cellenummeret ved hjelp av Excel eller Prism.
    6. Velg cellenummeret for analysen. Det optimale antall celler vil være i det lineære området og under metning (OD490 = 1).
      MERK: For celler med langsom vekst kan det høyeste celletallet som er belagt justeres til 20 000 celler per brønn, og 500 celler per brønn kan utelates fra analysen.
  4. Bestemme IC50
    1. Dag 1: Plate cellene for MTS-analysen
      1. Registrer cellelinjenavnet og passasjenummeret for hver linje i studien. For å motvirke fordampning under analysen, fyll i det minste de ytre omkrets topp- og bunnradene og enden venstre og høyre omkretskolonner av 96-brønnplaten med 1x PBS, 100 μL per brønn, for å motvirke fordampning under analysen.
      2. Plate det optimale antall celler for hver cellelinje som bestemt før starten av analysen. Plate cellene i 75 μL per brønn av fenolfri, antibiotikafritt medium som ikke inneholder HEPES-buffer. FBS kan økes til 20% for å støtte veksten av cellelinjene.
        MERK: Medium mangler fenolrødt brukes fordi fenolrød eksponering hemmer membranpermeabilitet.
      3. Plate prøven i minst femdobbelt for behandlingskonsentrasjon. Telle cellene ved hjelp av en manuell eller automatisert hemocytometer.
        MERK: For å bruke et manuelt hemocytometer, (1) forberede en 1: 1 fortynning av celler resuspendert i medium i trypan blå; (2) inkubere 5-15 min, avhengig av cellelinjen; (3) last 10 μL av cellene i trypanblå inn i hemocytometertellingskammeret; (4) telle levedyktige celler i de fire hjørnene og midterste firkantene, og bestemme gjennomsnittlig antall celler per kvadrat; (5) beregne levedyktige celler per milliliter som følger:
        Levedyktige celler per ml = Gjennomsnittlig levedyktige celler × 2 (fortynningsfaktor) × 104
      4. Bruk et tilstrekkelig volum for å forberede ønsket konsentrasjon av celler i fenolfritt, antibiotikafritt medium som ikke inneholder HEPES-buffer (dvs. 75 μL per brønn x 60 brønner per plate = 4,5 ml celler per plate).
        MERK: Hver plate må ha en middels ren kontroll for bakgrunnssubtraksjonen. Mediumkontrollen kan erstatte PBS-brønnene om nødvendig.
    2. Dag 2: Tilsetning av behandlingsforbindelsen
      1. Forbered forsøksbehandlingene ved 4x ønsket sluttkonsentrasjon for å gi ønsket sluttkonsentrasjon når 25 μL behandlingsløsninger tilsettes celler belagt i 75 μL medium (= 100 μL totalvolum per brønn).
      2. Forbered testløsningene (i dette tilfellet GABA A-reseptormodulatoren QH-II-066) ved seriell fortynning av de høyeste konsentrasjonsbestandene. For eksempel, hvis de endelige legemiddelkonsentrasjonene skal være 5,0 μM, 2,5 μM, 1,25 μM, 0,625 μM og 0,3125 μM, må du forberede 1:1 serielle fortynninger som begynner med 20 μM for å oppnå henholdsvis 10 μM, 5 μM, 2,5 μM og 1,25 μM konsentrasjoner.
        MERK: Hver plate krever to cellebaserte kontroller i tillegg til den middels eneste kontrollen: ubehandlede celler (medium alene) og celler løsemiddelbehandlet (ofte DMSO) ved en kjent konsentrasjon. Det er god praksis å sikre at kjøretøyet ikke påvirker celleproliferasjon i det aktive området av forbindelsen.
      3. Når testforbindelsen er tilsatt, inkuber cellene ved 37 °C og 5 % CO2 i et fuktet miljø i 48 timer.
    3. Dag 3: Utføre celleproliferasjonsanalysen (MTS)
      1. Beregn volumet av MTS-reagens som trengs (20 μL per 100 μL testkultur), og tine det nødvendige volumet av aliquoted MTS-reagens (se materialfortegnelsen).
      2. Vortex, og sørg for at reagenset er helt i oppløsning før bruk. Pipet det tinte reagenset inn i et sterilt 25 ml reagensreservoar.
      3. Pipet 20 μL MTS-reagens (ved bruk av en flerkanalspipette) inn i hver brønn i 96-brønnplaten som inneholder prøver i 100 mikrol kulturmedium.
      4. Inkuber platen ved 37 °C og 5 %CO2 i fuktet miljø i 1 time til 4 timer. Plater kan leses på flere tidspunkter. Vanligvis leses platene ved 1 time og ved 2 timer eller 3 timer.
      5. Bobler i mediet kan føre til feilaktige resultater. Før du leser i tallerkenleseren, snurrer du platen ved 1,350 x g i 5 minutter ved romtemperatur. En nål eller en pipettespiss kan brukes til å fjerne eventuelle bobler som er igjen etter sentrifugering.
      6. Mål absorbansen ved 490 nm ved hjelp av en egnet mikroplateleser eller spektrofotometer (se materialfortegnelsen).
      7. Lagre dataene som en Excel-fil.
        MERK: Inkubasjonstiden i nærvær av testforbindelsen vil variere avhengig av metabolismehastigheten og veksten av cellelinjen som studeres, i tillegg til forbindelsen som testes. En inkubasjonstid på 48 timer er et godt utgangspunkt for de fleste cellelinjer og testforbindelser.
  5. Analyse av data
    1. Overfør dataene i en Excel-fil, og organiser dataene for hver replikering ved å øke konsentrasjonen av testforbindelser. Beregne gjennomsnittet av kontrollverdien med bare middels, og trekk denne verdien fra de eksperimentelle dataene.
    2. Bestem prosentandelen av celleproliferasjon i behandlingsbrønnene sammenlignet med kjøretøybrønnene (eller løsemiddelbehandlede kontrollbrønner) ved å sette kontrollen til 100 % spredning for hver replikat.
    3. Overfør dataene som genereres i Excel, til et valgfritt program. Forfatterne bruker vanligvis Prism-programvare (se materialfortegnelsen) for å bestemme legemiddelkonsentrasjonen som hemmer celleproliferasjonen med 50% (IC50).
    4. I Prism-programvare oppretter du en datatabell med X-kolonne som cellenummer og Y-kolonne som gjennomsnittlig OD for fem replikere verdier i side-ved-side-underkolonner.
    5. Skriv inn behandlingskonsentrasjonsverdiene i X-kolonnen når du analyserer en legemiddelbehandling. Merk x-aksen med behandlingsforbindelsens navn og konsentrasjonsenheter.
    6. Skriv inn de beregnede levedyktighetsverdiene for replikere celler fra Excel-analysen i Y-underkolonnene. Merk y-aksen som celleproliferasjon (%).
    7. Bruk analyseverktøyet til å velge Ikke-lineær regresjon (kurvetilpasning) under XY-analyser.
    8. Velg dose-respons [inhibering] vs. normalisert respons-variabel stigningstall.
    9. Utfør analysefunksjonen. Vis resultattabellen for å se de beregnede verdiene for best tilpasning for IC50 og kurvetilpasningsgrafen. X-aksen i grafen kan endres til en loggskala om ønskelig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ovenfor er utvalgte prosedyrer som kan brukes til å karakterisere ionkanaler i kreftceller. Den første protokollen fremhever fargingen av en ionkanal. Som beskrevet er det mange utfordringer når du farger en ionkanal eller for den saks skyld noe protein som er tilstede i den ekstracellulære membranen. Vist i figur 1 er fargingen for en underenhet av den pentameriske GABA A-reseptoren. Den andre protokollen fremhever resultatene av å teste den polariserte tilstanden til mitokondrier i kreftceller. Mitokondrier spiller roller som er avgjørende for celle levedyktighet og spredning, samt celledød. I pattedyrceller aktiverer mitokondrier apoptose som respons på cellulær stress gjennom frigjøring av Bcl-2-familieproteinene som finnes mellom mitokondrielle indre og ytre membraner. I cytosolen aktiverer proteinene i Bcl-2-familien caspase-proteaser, som medierer programmert celledød. Endringer i plasmamembranionkanalfunksjonen kan resultere i en forstyrrelse av intracellulær ionhomeostase, inkludert når det gjelder ionenivåene i mitokondriene, noe som kan føre til tap av membranpotensial, og dermed utløse apoptose14. Nivåer av Ca2+, K +, Na + og H + er viktige determinanter i signalhendelser som kan utløse mitokondrie-initiert celledød. Vist i figur 2 er farging med det cellepermeable, positivt ladede fargestoffet TMRE for å merke og avbilde membranpotensialet i aktive mitokondrier, som opprettholder en negativ ladning21,22. TMRE er et rød-oransje fargestoff som binder seg med aktive mitokondrier på grunn av deres relative negative ladning. Depolariserte eller inaktive mitokondrier har redusert membranpotensial og klarer dermed ikke å binde TMRE. I dette eksperimentet er ionoforkoblingen FCCP en viktig kontroll, da den depolariserer mitokondriemembraner, og dermed forhindrer akkumulering av TMRE23. Den tredje protokollen fremhever elektrofysiologi med enkeltcellelapp-klemme. Vist i figur 3 er representative registreringer av spor registrert fra den pasientderiverte medulloblastomcellelinjen D283. Til slutt fremhever den fjerde protokollen en analyse for å bestemme tilstanden for spredning av kreftceller. Vist i figur 4 er detaljer om hvordan MTS-analysen fungerer og en illustrasjon av platen og avlesningen når den inkuberes med et middel som svekker levedyktigheten til kreftcellene som studeres (i dette tilfellet DAOY).

Figure 1
Figur 1: Farging av celler for ionekanaler. (A) Farging av proteinet Gabra5, en underenhet av GABA A-reseptoren, i D283 medulloblastom kreftceller. (B) Faste celler behandlet med fluorescerende flekk 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI), som binder seg til DNA. (C) Sammenslåing av medulloblastom kreftceller farget for både Gabra5 og DAPI. Skalastenger = 10 μm. Figuren er tilpasset fra Kallay et al.14. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Testing av den polariserte tilstanden til mitokondrier . (A) Levende D283 medulloblastom kreftceller behandles med økende konsentrasjoner av legemidlet QH-II-066. Cellene behandles deretter med positivt ladet, cellegjennomtrengelig TMRE (tetrametylrhodamin, etylester), som akkumuleres i aktive (negativt ladede) mitokondrier. Depolariserte eller inaktive mitokondrier har redusert membranpotensial og klarer derfor ikke å beholde TMRE-fargestoffet; Som et resultat viser de et lavt fluorescenssignal. Avbildet ved fluorescensmikroskopi; FCCP (karbonylcyanid 4-[trifluormetoksy] fenylhydrazon). Topp: λex, 549 nm; λem, 575 nm. Skalastenger = 10 μm. (B) Kvantifisering av TMRE-farging (bilder vist i panel A) ved hjelp av programvareplattformen. Data presenteres som gjennomsnitts- og standardfeil for gjennomsnittet. Figuren er tilpasset fra Kallay et al.14. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Etablering av ionekanalfunksjon ved hjelp av elektrofysiologi. (A) Vist er et Port-a-Patch-oppsett eller rigg, bestående av et Faraday-bur (a), opptakskammer (b) og sugeenhet (c, høyre). (B) Sett ovenfra av Port-a-Patch-riggen som markerer opptakskammeret utstyrt med perfusjonsinntak (a), utløp (b) og referanseelektrode (c). (C) Port-a-Patch er koblet til et perfusjonssystem for hurtigløsningsutveksling med automatiserte og manuelle driftsmåter og løsningsreservoarer. (D) Representativt strømspor fra en helcelle patch-clamp elektrofysiologi opptak ved hjelp av en Port-a-Patch rigg (Nanion) og D283 medulloblastom kreftceller. GABA (10 μM) ble påført for 5 s med et holdepotensial på -80 mV. (E) Representativt strømspor fra et elektrofysiologisk opptak av helcellelapp-klemme ved bruk av en Port-a-Patch-rigg (Nanion) og D283 medulloblastomkreftceller med samtidig påføring av GABA (1 μM) og GABA-A-reseptoragonisten (generell bedøvelse) propofol (50 μM), som potenserer strømmen indusert av GABA alene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: MTS-analyse for å vurdere legemiddelets styrke . (A) Kjemiske reaksjoner som ligger til grunn for "MTS-analysen" som brukes til å vurdere styrken til et middel, som reflektert ved en reduksjon i celleproliferasjon. Reduksjon av MTS-tetrazolium av celler som er levedyktige, genererer fargestoffet formazan. (B) En 96-brønnplate som viser de kolorimetriske resultatene av en MTS-analyse med økende legemiddelkonsentrasjoner. I dette eksperimentet behandles DAOY-medulloblastomkreftceller med økende konsentrasjoner av et preklinisk legemiddel, KRM-II-08, en positiv allosterisk modulator av GABAA-reseptoren . (C) En dose-responskurve generert med MTS-analysen (fra kvantifisering av 96-brønnplate). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Håndbok Halv-/helautomatisk
Gjennomstrømning Lav Høy
Raskt løsningsbytte Mulig Ja
Kostnad Høy Lav
Operatør Erfaren Nybegynner/Middels
Celletype Alle celler; Vev Primære enkeltceller; Cellelinjer
Cellenumre kreves Minimum* Høy*
Legemiddel-/løsningsvolum Høy Lav
Ressurser/verktøy Høy Lav
Vedlikehold Høy Lav
Kontroll av eksperimenter Veldig bra Bra
Levende celleavbildning Ja Nei
*Port-a-Patch, for eksempel, krever minst en million celler/ml for opptak, mens et manuelt oppsett vanligvis trenger noen hundre celler på en coverslip.

Tabell 1: Sammenligning av manuelle versus halv- og/eller helautomatiske elektrofysiologioppsett.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Endringer i ionkanalfunksjonen endrer intracellulære signalkaskader, noe som kan påvirke den generelle funksjonen til en celle. I løpet av det siste tiåret har det blitt stadig tydeligere at ionkanaler er viktige for kreftcellevekst og metastase. Det er viktig at mange ionkanaler er primære mål for godkjente terapier rettet mot et bredt spekter av lidelser24. Etterforskere har undersøkt om ionkanaler kan være anti-kreftmål, og de første resultatene er lovende 2,16,25. Feltet har akkurat begynt å undersøke ionekanalenes rolle i kreftutvikling og som terapeutiske mål, og fremtiden ser lys ut på begge fronter.

I dette arbeidet er det gitt detaljerte prosedyrer for å analysere ionekanaler i kreftceller og avgjøre om en kanal er en terapeutisk sårbarhet. Disse analysene tjener som en veiledning for å hjelpe til med å studere ionkanaler i kreftceller. Metoder har blitt beskrevet som fokuserer på visualisering av ionkanaler i kreftceller, bestemmelsen av hvordan moduleringen av ionkanaler endrer den polariserte tilstanden til kreftceller, forskjellige tilnærminger for å analysere ionkanalfunksjonen ved hjelp av elektrofysiologi og måling av kreftcellenes levedyktighet.

Immunfluorescensfarging kan brukes til å oppdage tilstedeværelse og cellulær lokalisering av ionkanaler. De eksperimentelle forholdene må optimaliseres nøye for å nøyaktig representere hvor en kanal finnes i cellen. Intuitivt kan man forvente at fargingen av ionkanaler skal være relativt grei, da de mest sannsynlig er tilgjengelige løsemidler. Det er imidlertid viktig å huske at immunfluorescensepitopen kanskje ikke er lett tilgjengelig, avhengig av om den er en del av et ekstracellulært eller intracellulært domene. Videre er ionkanaler ofte tett gruppert på cellemembraner, slik at deres deteksjon ved immunfarging kan kreve mer omfattende optimalisering av fikserings- og permeabiliseringsprosedyrene sammenlignet med andre klasser av proteiner14,26.

Mitokondriemembranpotensialet er avgjørende for mange mitokondriassosierte prosesser, inkludert ATP-syntese, generering av reaktive oksygenarter (ROS), kalsiumsekvestrasjon, import av mitokondrielle proteiner, membrandynamikk og utløsende apoptose. Denne protokollen benytter TMRE-analysen til å merke membranpotensial i aktive mitokondrier i enkeltceller. For skjermer med høy gjennomstrømning kan TMRE-nivåene måles med en fluorescensplate i mikroplateformat.

Patch-klemme elektrofysiologi er "gullstandard" -metoden for studiet av ionkanalkinetikk. Helcelle- og enkeltkanalsmetoder er også de høyeste oppløsningsmetodene for nøyaktig bestemmelse av struktur-funksjonsforhold og farmakologi av ionkanalmodulatorer. Denne metoden benytter studiet av små elektriske forandringer over en membran forårsaket av bevegelse av ioner gjennom ionkanaler27. Elektrofysiologiske eksperimenter utføres tradisjonelt ved hjelp av manuelle patch-klemme elektrofysiologiske opptak av en enkelt celle om gangen, noe som resulterer i en lav gjennomstrømningstilnærming som krever at brukeren har en rekke spesialiserte ferdighetssett. Automatiserte patch-clamp elektrofysiologi teknikker, for eksempel Port-a-Patch, IonFlux Mercury, Patchliner og / eller Synchropatch teknologier, tilbyr flere opptak om gangen, og disse teknikkene er utstyrt med et sofistikert perfusjonsoppsett for sammensatt applikasjon, noe som resulterer i semi-høy gjennomstrømning eller høy gjennomstrømning uten å kreve spesielle ferdigheter. For noen eksperimenter er manuell patchklemming uerstattelig (tabell 1). Likevel har automatisert patch-clamp-teknologi akselerert ionkanalbiofysikkforskning og relaterte legemiddeloppdagelsesprogrammer. En av begrensningene ved opptak fra primære / ikke-transfekterte celler er bidraget fra lekke, ikke-spesifikke endogene strømmer. I våre registreringer observerte vi små baselinevariasjoner, noe som tyder på et potensielt bidrag av endogene strømmer fra D283-celler.

Celleproliferasjonsanalyser måler forstyrrelsen av cellevekstaktivitet som respons på et kjemisk middel. Slike analyser er kritiske verktøy for å vurdere virkningen av et legemiddel på celleproliferasjon. For å evaluere celleproliferasjon bruker etterforskerne oftest MTT (3-[4,5-dimetyltiazol-2-yl]-2,5-difenyltetrazoliumbromid), MTS (3-[4,5-dimetyltiazol-2-yl]-5-[3-karboksymetoksyfenyl]-2-[4-sulfofenyl]-2H-tetrazolium) og/eller klonogene analyser. MTT- og MTS-analyser måler omdannelsen (reduksjonen) av et vannløselig tetrazoliumsalt (gult) til et kvantifiserbart formazanprodukt (lilla i MTT-analysen), som katalyseres av dehydrogenase-enzymsystemet av metabolsk aktive celler. Intensiteten av det fargede produktet gir en estimering av antall "levedyktige" (f.eks. metabolsk aktive) celler. I motsetning til dette analyserer den klonogene analysen evnen til enkeltceller i kultur for å danne en koloni (minst 50 celler eller seks påfølgende divisjoner) etter behandling med et legemiddel28,29. MTT, MTS og klonogene analyser har hver fordeler og ulemper, og man bør nøye vurdere egnetheten til disse analysene for å bestemme styrken til et legemiddel (er) med en gitt cellelinje (er). Optimalt anbefales det å bruke mer enn én av disse analysene (f.eks. klonogene og MTT- eller MTS-analyser) for å bestemme styrken til et legemiddel (er).

MTT- og MTS-analysene vurderer den metabolske aktiviteten til levende celler, som kan variere etter celletype og analysetilstand. MTT- eller MTS-analysene er fordelaktige, da disse analysene er enkle å utføre, kan utføres i replikat og er egnet til screening med høy gjennomstrømning30. MTT- eller MTS-analysene kan fullføres på 3-4 dager, mens den klonogene analysen kan ta 10-21 dager, avhengig av egenskapene til cellelinjen som brukes28. I motsetning til dette er ulempene med både MTS- og MTT-analysene mulig interferens av reagensene som kreves for å utføre analysen med kulturmedium, vanskeligheten ved å bruke analysen og den potensielle variabiliteten mellom replikater på grunn av cellens metabolske status og kulturbetingelser31. Når det gjelder valget mellom MTT- og MTS-analysene, bør man vurdere at MTT-analysen krever et oppløselighetstrinn for å lyse cellene og la formazankrystallene oppløses i mediet og viser absorbans ved 570 nm, mens MTS-analysen er en "ett-trinns analyse", hvor formazanen blir direkte solubilisert i mediet uten de intermitterende trinnene (f.eks. cellelysetrinnet). Formazan-produktet i MTS-analysen er mørkere i fargen og har et mer følsomt absorbansverdiområde (490-500 nm), noe som gjør det lettere å fastslå en positiv respons. MTS-analysen er raskere enn MTT-analysen, da 2-3 timer er nødvendig for reaksjonen mot 4 timer for reaksjonen pluss 1-2 timers oppløseliggjøring i MTT-analysen. I tillegg forblir MTS-analysen formazan-produktet i suspensjon, og analysen er mer egnet for suspensjonsceller enn MTT-analysen, siden ingen middels endring er nødvendig under MTS-analysen32. Imidlertid er det utviklet en modifisert MTT-analyse der oppløselighetstrinnet er forbedret ved hjelp av en kombinasjon av DMSO og SDS lysisløsning. Denne modifiserte MTT-analysen kan brukes for både adherente og suspensjonsceller. Hvis man velger å bruke MTT-analysen, bør man være forsiktig med å velge cellekultur og betingelsene / reagensene som brukes til cellevekst. For eksempel vil resultatene variere hvis cellene dyrkes som et monolag, differensiert, som et konfluent monolag eller senescent. I tillegg kan visse ikke-mitokondrielle dehydrogenaser, som noen intracellulære reduktaser og flavinoksidaser, redusere MTT-reagenset, muligens fremkalle falske positive avlesninger33. Videre har MTT-reagenset en grad av toksisitet, så inkubasjonstiden bør være begrenset. Hastigheten av MTT-reduksjon kan også endres med kulturforholdene, for eksempel pH og glukoseinnhold i mediet og den fysiologiske tilstanden til cellene32,34. For eksempel reduserer forekomsten av askorbinsyre angivelig MTT til formazan, og denne effekten forsterkes i nærvær av retinol35. Når det gjelder potensielle problemer med den klonogene analysen, er det viktig å være klar over at etter tilsetning av legemidlet kan cellene bli for tidlig senescent og "klonogent inaktive" (dvs. de danner ikke kolonier), men forblir metabolsk aktive og viser aktivitet i MTT- eller MTS-analysene. Et annet poeng å huske er at den klonogene analysen er begrenset til studiet av adherente celler, og ikke alle adherente celler kan danne kolonier når de belegges ved lave celletettheter, siden celle-cellekommunikasjon går tapt36. På grunn av utilstrekkelig cellekommunikasjon og begrensningene i egenproduserte vekstfaktorer, reagerer den klonogene analysen på lavere legemiddeldoser enn MTT- og MTS-analysene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

D.A.P.K. er medstifter, president og administrerende direktør i Amlal Pharmaceuticals Inc. SS er medstifter av Amlal Pharmaceuticals Inc. og sitter i Drug Safety Monitoring Board of Bexion Pharmaceuticals, Inc.

Acknowledgments

Forfatterne anerkjenner støtte fra Thomas E. & Pamela M. Mischell Family Foundation til SS og Harold C. Schott Foundation finansiering av Harold C. Schott Endowed Chair, UC College of Medicine, til SS

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ABS SpectraMax Plate Reader Molecular Devices ABS
Accutase Invitrogen 00-4555-56
Alexa Flor 488 Invitrogen A32723 Goat Anti-Rabbit
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240-062 100x
B27 Supplement Gibco 12587-010 Lacks vitamin A
Biosafety Cabinet LABCONCO 302381101 Class II, Type A2
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1606-100
CO2 Incubator Fisher Scientific 13-998-211 Heracell VIOS 160i
Calcium Chloride Fisher Scientific C7902 Dihydrate
Cell Culture Dishes, 150 mm Fisher Scientific 12-600-004 Cell culture treated
Cell Culture Flasks, 75 cm2 Fisher Scientific 430641U Cell culture treated
Cell Culture Plates, 6 well Fisher Scientific 353046 Cell culture treated
Cell Culture Plates, 96 well Fisher Scientific 353072 Cell culture treated
Centrifuge Eppendorf EP-5804R Refrigerated
Corning CoolCell Fisher Scientific 07-210-0006
Coverslips, 22 x 22 mm Fisher Scientific 12-553-450 Corning brand
D283 Med ATCC HTB-185
DABCO Mounting Media EMS 17989-97
D-Glucose Sigma Life Sciences D9434
Dimethyl Sulfoxide Sigma Aldrich D2650 Cell culture grade
DMEM/F12, base media Fisher Scientific 11330-032 With phenol red
DMEM/F12, phenol red free Fisher Scientific 21041-025
EGTA Sigma Aldrich E4378
Epidermal Growth Factor STEMCELL 78006.1
FCCP Abcam AB120081
Fetal Bovine Serum, Qualified Gibco 10437-028
Fibroblast Growth Factor, Basic Millipore GF003
GARBA5 Antibody Aviva ARP30687_P050 Rabbit Polyclonal
Glutamax Gibco 35050-061
Glycerol Mounting Medium EMS 17989-60 With DAPI+DABCO
Hemocytometer Millipore Sigma
Heparin STEMCELL 7980
HEPES HyClone SH3023701 Solution
HEPES Fisher Scientific BP310-500 Solid
ImageJ Open platform With Fiji plugins
Immuno Mount DAPI EMS 17989-97
KRM-II-08 experimental compounds not available from a commercial source
Leica Application Suite X Leica Microsystems
Leukemia Inhibitory Factor Novus N276314100U
L-Glutamine Gibco 25030-081
Magnesium Chloride Sigma Aldrich M9272 Hexahydrate
Microscope, Confocal Leica SP8
Microscope, Light VWR 76382-982 DMiL Inverted
MTS - Promega One Step Promega G3581
Multi-channel pipette, 0.5-10 µL Eppendorf Z683914
Multi-channel pipette, 10-100 µL Eppendorf Z683930
Multi-channel pipette, 30-300 µL Eppendorf Z683957
Nest-O-Patch Heka
Neurobasal-A Medium Gibco 10888022 Without vitamin A
Neurobasal-A Medium Gibco 12348-017 Phenol red free
Non-Essential Amino Acids Gibco 11140-050
NOR-QH-II-66 experimental compounds not available from a commercial source
Parafilm Fisher Scientific 50-998-944 4 inch width
Paraformaldehyde EMS RT-15710
PATHCHMASTER Heka
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
Perfusion System Nanion 4000120
PFA EMS RT-15710
Phosphate Bufered Saline Fisher Scientific AAJ75889K2 Reagent grade
Poly-D-Lysine Fisher Scientific A3890401
Poly-L-Lysine Sigma Life Sciences P4707
Port-a-Patch Nanion 21000072
Potassium Chloride Sigma Life Sciences P5405
Primary Antibody Invitrogen MA5-34653 Rabbit Monoclonal
Prism GraphPad
Propofol Fisher Scientific NC0758676 1 mL ampule
QH-II-66 experimental compounds not available from a commercial source
Reagent Reservoirs VWR 89094-664 Sterile
Slides, 75 x 25 mm Fisher Scientific 12-544-7 Frosted one side
Sodium Bicarbonate Corning 25-035-Cl
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-3
Sodium Pyruvate Gibco 11360-070
Synth-a-Freeze Medium Gibco R00550 Cryopreservation
TMRE Fisher Scientific 50-196-4741 Reagent
TMRE Kit Abcam AB113852 Kit
Triton X-100 Sigma Aldrich NC0704309
Trypan Blue Gibco 15-250-061 Solution, 0.4%
Trypsin/EDTA Gibco 25200-072 Solution, 0.25%
Vortex Mixer VWR 97043-562
Whatman Filter Paper Fisher Scientific 09-927-841

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prevarskaya, N., Skryma, R., Shuba, Y. Ion channels in cancer: Are cancer hallmarks oncochannelopathies. Physiological Reviews. 98 (2), 559-621 (2018).
  2. Rao, R., et al. Ligand-gated neurotransmitter receptors as targets for treatment and management of cancers. Frontiers in Physiology. 13, 839437 (2022).
  3. Mohr, C. J., et al. Cancer-associated intermediate conductance Ca2+-activated K+ channel KCa3.1. Cancers. 11 (1), 109 (2019).
  4. Fels, B., Bulk, E., Petho, Z., Schwab, A. The role of TRP channels in the metastatic cascade. Pharmaceuticals. 11 (2), 48 (2018).
  5. Eil, R., et al. Ionic immune suppression within the tumour microenvironment limits T cell effector function. Nature. 537 (7621), 539-543 (2016).
  6. Haustrate, A., Hantute-Ghesquier, A., Prevarskaya, N., Lehen'kyi, V. Monoclonal antibodies targeting ion channels and their therapeutic potential. Frontiers in Pharmacology. 10, 606 (2019).
  7. Kischel, P., et al. Ion channels: New actors playing in chemotherapeutic resistance. Cancers. 11 (3), 376 (2019).
  8. Tuszynski, J., Tilli, T. M., Levin, M. Ion channel and neurotransmitter modulators as electroceutical approaches to the control of cancer. Current Pharmaceutical Design. 23 (32), 4827-4841 (2017).
  9. Kale, V. P., Amin, S. G., Pandey, M. K. Targeting ion channels for cancer therapy by repurposing the approved drugs. Biochimica Biophysica Acta. 1848 (10), 2747-2755 (2015).
  10. Wickenden, A., Priest, B., Erdemli, G. Ion channel drug discovery: Challenges and future directions. Future Medicinal Chemistry. 4 (5), 661-679 (2012).
  11. Rocha, P. R. F., Elghajiji, A., Tosh, D. Ultrasensitive system for electrophysiology of cancer cell populations: A review. Bioelectricity. 1 (3), 131-138 (2019).
  12. Sengupta, S., et al. α5-GABAA receptors negatively regulate MYC-amplified medulloblastoma growth. Acta Neuropathologica. 127 (4), 593-603 (2014).
  13. Jonas, O., et al. First in vivo testing of compounds targeting Group 3 medulloblastomas using an implantable microdevice as a new paradigm for drug development. Journal of Biomedical Nanotechnology. 12 (6), 1297-1302 (2016).
  14. Kallay, L., et al. Modulating native GABAA receptors in medulloblastoma with positive allosteric benzodiazepine-derivatives induces cell death. Journal of Neurooncology. 142 (3), 411-422 (2019).
  15. Pomeranz Krummel, D. A., et al. Melanoma cell intrinsic GABAA receptor enhancement potentiates radiation and immune checkpoint response by promoting direct and T cell-mediated anti-tumor activity. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 109 (4), P1040-P1053 (2021).
  16. Bhattacharya, D., et al. Therapeutically leveraging GABAA receptors in cancer. Experimental Biology and Medicine. 246 (19), 2128-2135 (2021).
  17. Mazia, D., Schatten, G., Sale, W. Adhesion of cells to surfaces coated with polylysine. Applications to electron microscopy. Journal of Cell Biology. 66 (1), 198-200 (1975).
  18. Wiatrak, B., Kubis-Kubiak, A., Piwowar, A., Barg, E. PC12 cell line: Cell types, coating of culture vessels, differentiation and other culture conditions. Cells. 9 (4), 958 (2020).
  19. Baker, J. R. Fixation in cytochemistry and electron-microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 6 (5), 303-308 (1958).
  20. Chung, J. Y., et al. Histomorphological and molecular assessments of the fixation times comparing formalin and ethanol-based fixatives. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (2), 121-135 (2018).
  21. Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), (2016).
  22. Cory, A. H., Owen, T. C., Barltrop, J. A., Cory, J. G. Use of an aqueous soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth assays in culture. Cancer Communications. 3 (7), 207-212 (1991).
  23. Maro, B., Marty, M. C., Bornens, M. In vivo and in vitro effects of the mitochondrial uncoupler FCCP on microtubules. EMBO Journal. 1 (11), 1347-1352 (1982).
  24. IUPHAR/BPS Guide to Pharmacology. , Available from: www.guidetopharmacology.org/GRAC/ReceptorFamiliesForward?type=IC (2022).
  25. Zheng, J., et al. Mechanism for regulation of melanoma cell death via activation of thermo-TRPV4 and TRPV. Journal of Oncology. 2019, 7362875 (2019).
  26. Konno, K., Watanabe, M. Immunohistochemistry for ion channels and their interacting molecules: Tips for improving antibody accessibility. Receptor and Ion Channel Detection in the Brain. Luján, R., Ciruela, F. , Humana Press. New York, NY. (2016).
  27. Mortensen, M., Smart, T. G. Single-channel recording of ligand-gated ion channels. Nature Protocols. 2 (11), 2826-2841 (2007).
  28. Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).
  29. Rafehi, H., et al. Clonogenic assay: Adherent cells. Journal of Visualized Experiments. (49), 2573 (2011).
  30. Scudiero, D. A., et al. Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines. Cancer Research. 48 (17), 4827-4833 (1988).
  31. Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PLoS One. 5, e10202 (2010).
  32. Berridge, M. V., Tan, A. S. Characterization of the cellular reduction of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT): subcellular localization, substrate dependence, and involvement of mitochondrial electron transport in MTT reduction. Archives of Biochemistry and Biophysics. 303 (2), 474-482 (1993).
  33. Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. Effects of the pH dependence of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide-formazan absorption on chemosensitivity determined by a novel tetrazolium-based assay. Cancer Research. 49 (16), 4435-4440 (1989).
  34. Chakrabarti, R., Kundu, S., Kumar, S., Chakrabarti, R. Vitamin A as an enzyme that catalyzes the reduction of MTT to formazan by vitamin C. Journal of Cellular Biochemistry. 80 (1), 133-138 (2000).
  35. Dong, G. W., Preisler, H. D., Priore, R. Potential limitations of in vitro clonogenic drug sensitivity assays. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 13 (3), 206-210 (1984).
  36. Sun, J., et al. STIM1- and Orai1-Mediated Ca2+oscillation orchestrates invadopodium formation and melanoma invasion. Journal of Cell Biology. 207 (4), 535-548 (2014).

Tags

Kreftforskning utgave 196 Membrantransport ionekanaler cellelevedyktighet kreftceller medulloblastom GABAA-reseptorer
Screening av ionekanaler i kreftceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kallay, L., Gawali, V. S., Toukam,… More

Kallay, L., Gawali, V. S., Toukam, D. K., Bhattacharya, D., Jenkins, A., Sengupta, S., Pomeranz Krummel, D. A. Screening Ion Channels in Cancer Cells. J. Vis. Exp. (196), e65427, doi:10.3791/65427 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter