Summary
Skeletmuskulatur omfatter flere celletyper, herunder residente stamceller, hver med et særligt bidrag til muskelhomeostase og regenerering. Her beskrives 2D-kulturen af muskelstamceller og muskelcellenichen i en ex vivo-indstilling, der bevarer mange af de fysiologiske, in vivo og miljømæssige egenskaber.
Abstract
Skeletmuskulatur er kroppens største væv og udfører flere funktioner, fra bevægelse til kropstemperaturkontrol. Dens funktionalitet og genopretning fra skader afhænger af en lang række celletyper og af molekylære signaler mellem kernemuskelcellerne (myofibre, muskelstamceller) og deres niche. De fleste eksperimentelle indstillinger bevarer ikke dette komplekse fysiologiske mikromiljø, og de tillader heller ikke ex vivo-undersøgelse af muskelstamceller i hvile, en celletilstand, der er afgørende for dem. Her skitseres en protokol for ex vivo-kulturen af muskelstamceller med cellulære komponenter i deres niche. Gennem mekanisk og enzymatisk nedbrydning af muskler opnås en blanding af celletyper, som sættes i 2D-kultur. Immunfarvning viser, at inden for 1 uge er flere nicheceller til stede i kultur sammen med myofibre og vigtigere Pax7-positive celler, der viser egenskaberne ved hvilende muskelstamceller. Disse unikke egenskaber gør denne protokol til et kraftfuldt værktøj til celleforstærkning og generering af hvilende-lignende stamceller, der kan bruges til at løse grundlæggende og translationelle spørgsmål.
Introduction
Bevægelse, vejrtrækning, stofskifte, kropsholdning og vedligeholdelse af kropstemperatur afhænger alle af skeletmuskulatur, og funktionsfejl i skeletmuskulaturen kan således forårsage svækkende patologier (dvs. myopatier, muskeldystrofier osv.) 1. I betragtning af dets væsentlige funktioner og overflod har skeletmuskulatur henledt opmærksomheden fra forskningslaboratorier over hele verden, der stræber efter at forstå de vigtigste aspekter, der understøtter normal muskelfunktion og kan tjene som terapeutiske mål. Derudover er skeletmuskulatur en meget anvendt model til at studere regenerering og stamcellefunktion, da sund muskel fuldt ud kan reparere sig selv efter fuldstændig skade og degeneration, hovedsagelig på grund af dens hjemmehørende stamceller2; Disse kaldes også satellitceller og er lokaliseret under basal lamina i periferien af muskelfibrene3.
Kernecellerne i voksen skeletmuskulatur er myofibrene (lange syncytiale multinukleære celler) og satellitcellerne (stamceller med myogent potentiale, der er hvilende, indtil en skade aktiverer dem). Sidstnævnte celler er de centrale celler i muskelregenerering, og denne proces kan ikke forekomme i deres fravær 4,5,6,7. I deres umiddelbare mikromiljø er der flere celletyper og molekylære faktorer, der signalerer til dem. Denne niche etableres gradvist gennem udvikling og indtil voksenalderen8. Voksen muskel indeholder flere celletyper (endotelceller, pericytter, makrofager, fibro-adipogene stamceller-FAP'er, regulatoriske T-celler osv.) 9,10 og ekstracellulære matrixkomponenter (lamininer, kollagener, fibronectin, fibrilliner, periostin osv.) 11, der interagerer med hinanden og med satellitcellerne i forbindelse med sundhed, sygdom og regenerering.
Bevarelse af denne komplekse niche i eksperimentelle indstillinger er grundlæggende, men udfordrende. Lige så vanskeligt er det at opretholde eller vende tilbage til hvile, en celletilstand, der er kritisk for satellitceller9. Der er indført flere metoder til delvist at tackle disse udfordringer, hver med sine fordele og ulemper (detaljeret i diskussionsafsnittet). Her præsenteres en metode, der delvist kan overvinde disse to barrierer. Muskler høstes først og nedbrydes derefter mekanisk og enzymatisk, før den heterogene celleblanding sættes i kultur. I løbet af kulturen detekteres mange celletyper af nichen, og satellitceller, der er vendt tilbage til hvile, observeres. Som et sidste trin i protokollen præsenteres immunofluorescenstrinnene, der muliggør påvisning af hver celletype ved brug af universelt accepterede markører.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg overholdt franske og EU-dyrebestemmelser på Institut Mondor de Recherche Biomédicale (INSERM U955), navnlig direktiv 2010/63/EU. Dyrene blev holdt i et kontrolleret og beriget miljø på dyrefaciliteterne med certificeringsnumrene A94 028 379 og D94-028-028. De blev kun håndteret af autoriserede forskere og dyrepassere, og de blev visuelt inspiceret af dyrestaldpersonale for tegn på ubehag i løbet af deres levetid. De blev aflivet ved cervikal dislokation før dissektion. Der blev ikke udført interventionsprocedurer i dyrenes levetid. Det var således ikke nødvendigt at indhente godkendelse af proceduren fra en etisk komité og det franske ministerium for videregående uddannelse, forskning og innovation. Der kræves ingen etisk godkendelse for eutanisering og post mortem-dissektion i henhold til direktiv 2010/63/EU. Resultaterne præsenteret i dette manuskript er fra vildtypen C57BL/6NRj-linjen (se materialetabel) og den transgene Tg:Pax7-nGFP linje12 (opdrættet af vores team). Protokollen blev anvendt på han- og hunmus i alderen 8-12 uger.
1. Reagens og forberedelse af udstyr før fordøjelsen
- Sprøjt dissektionsværktøjerne (lige og buet saks, tang, se materialetabellen) med 70% ethanol, og tør dem med papir. Overtræk en korkplade med aluminiumsfolie, og hold 10 cm petriskåle (en pr. Dyr) i nærheden. Hav papir og 70% ethanol inden for rækkevidde.
BEMÆRK: Ved afslutningen af dissektionen skylles dissektionsværktøjerne med vand, sprøjtes derefter med 70% ethanol og tørres med papir. - Indstil et roterende vandbad til 37 °C, og forbered fordøjelsesblandingen (20 ml / dyr) ved at kombinere DMEM med 1% penicillin-streptomycin, 0,5 E / ml collagenase, 3 E / ml dispase (se materialetabellen) og 0,2% BSA i 50 ml rør (er).
- Før fordøjelsesblandingen gennem et 0,22 μm filter i en cellekulturhætte.
BEMÆRK: Det anbefales at forberede fordøjelsesblandingen frisk hver gang.
2. Forberedelse af reagens og udstyr efter fordøjelsen
- Efter fordøjelsen kan blandingen fryses eller dyrkes. Til frysning fremstilles 10% DMSO:90% føtalt bovint serum (FBS) samt et sæt kryotuber (1 ml cellesuspension pr. 2 ml kryotube). Til kulturen fremstilles dyrkningsmedium (DMEM suppleret med 1% penicillin-streptomycin, 4 ng/ml bFGF og 20% FBS) og et sæt 8-brøndsplader. Pladerne skal belægges, før cellerne pletteres (nærmere oplysninger findes i trin 7.1).
- Til farvningen fremstilles 4 % paraformaldehyd (PFA) i fosfatbufret saltvand (PBS) (0,15 ml/hul i 8-brøndpladen) og blokerende opløsning (5 % IgG-frit bovint serumalbumin [BSA] i PBS; 0,15 ml/hul i 8-brøndpladen).
FORSIGTIG: Indånd ikke PFA-pulveret; Forbered og håndter det under en kemisk hætte.
3. Dissektion
- Sprøjt det aflivede dyr med 70% ethanol. Lav et vandret snit (venstre side af kroppen til højre side) med stor saks på underlivets niveau og skær rundt om taljen. Træk huden ud af bagbenene for at afsløre musklerne (figur 1A).
- Placer dyret på den aluminiumsfoliedækkede korkplade, og fastgør det modsatte forben og bagben. Fjern hurtigt alle bagbenets muskler (for og bag) i en 10 cm petriskål placeret på is (figur 1B, C). Vær særlig omhyggelig med at fjerne fedtvævet fra områderne omkring quadriceps og de bageste muskler. Fascia, nerver og sener kan også fjernes på dette tidspunkt, hvis dette ikke kompromitterer den samlede tid, der bruges på dissektion.
BEMÆRK: En optimal dissektionstid for begge bagben bør være omkring 15-20 min. Det anbefales, at dissektionstiden ikke overstiger 30 min. - Tilføj dråber DMEM til musklerne lejlighedsvis for at holde dem fugtige, men ikke for meget, da dette vil gøre hakning vanskelig. Gentag for det andet bagben. Når alle musklerne hos et dyr er i petriskålen (figur 1D), hak dem fint med en saks i 7-10 minutter for at opnå et glat homogenat (figur 1E).
BEMÆRK: I denne protokol anvendes DMEM suppleret med L-glutamin, pyruvat og 4,5 g / L D-glucose.
Figur 1: Forberedelse af muskler før kultur. (A) Huden fjernes for at afsløre bagbenets muskler som beskrevet i trin 3.1. (B,C) Alle bagbenets muskler høstes (B) omkring og (C) mellem knoglerne som beskrevet i trin 3.2. (D) De høstede muskler anbringes i en 10 cm petriskål på is med DMEM-dråber for at holde dem fugtige som beskrevet i trin 3.3. (E) Musklerne hakkes fint med en saks, indtil der opnås en glat pasta med den konsistens, der er afbildet på dette billede. F) et billede af pellet efter den endelige centrifugering Den blå pil fremhæver pelleten, som er mod røret, under den stiplede blå linje. Klik her for at se en større version af denne figur.
4. Fordøjelse
BEMÆRK: Ved afslutningen af fordøjelsen kræves en centrifuge ved 4 °C, en spand is, tre cellesier (100 um, 70 um, 40 um) og tre 50 ml rør (pr. dyr) til sektion 5.
- Blødgør og filtrer fordøjelsesblandingen som beskrevet i trin 1.2. Hold blandingen på is.
- Når alle muskler er hakket, placeres homogenatet i et 50 ml rør med 20 ml fordøjelsesblanding. Pak lågets kanter ind med fleksibel film for at forhindre lækage, og anbring røret i et 37 °C rystevandbad ved lav til medium hastighed (50 o / min).
- Efter 1 time ved 37 °C åbnes låget, og blandingen blandes ved forsigtigt at pipettere syv gange op og ned med en 10 ml pipette for at opnå en homogen blanding. Påfør ny film omkring låget, og læg den tilbage i rystevandbadet. Efter 1 time skal du fjerne røret og slukke for badet.
BEMÆRK: Brug denne inkubationstid til at belægge pladerne som beskrevet i trin 7.1, før du går videre til afsnit 5.
5. Filtrering
- Fyld fordøjelsesrøret med kold DMEM (suppleret med 1% penicillin-streptomycin) op til 50 ml. Bland ved at vende røret tre gange. Opbevar DMEM i en isspand til de næste trin.
- Placer en 100 μm cellesi på et nyt 50 ml rør. Før den fordøjede blanding gennem cellesilen ind i det nye rør. Der centrifugeres ved 600 x g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten hældes ud i en beholder til flydende affald.
- Resuspender pellet i 1 ml kold DMEM (suppleret med 1% penicillin-streptomycin). Fyld røret op til 50 ml med den samme DMEM. BEMÆRK: Hvis centrifugeringen springes over, vil den næste pellet være vanskeligere at identificere og vedligeholde.
- Placer en 70 μm cellesi på et nyt 50 ml rør. Den centrifugerede/resuspenderede blanding ledes gennem cellesien ind i det nye rør. Der centrifugeres ved 80 x g i 5 minutter ved 4 °C.
BEMÆRK: Dette trin er ikke obligatorisk, men anbefales at fjerne celleaffald. - Placer en 40 μm cellesi på et nyt 50 ml rør. Supernatanten ledes gennem cellesien ind i det nye glas. Supernatanten centrifugeres ved 600 x g i 5 minutter ved 4 °C, hældes i en beholder til flydende affald, og pelletsen opslæmmes igen i FBS under kulturhætten. Pelleten er meget lille på dette trin (figur 1F).
BEMÆRK: Filtrering gennem 40 μm sien fjerner snavs, hvilket ville give et uspecifikt signal i den senere farvning af kulturerne.
6. (Valgfrit) frysning
BEMÆRK: Afsnit 6 er valgfrit. Protokollen kan sættes på pause efter filtrering, men dette kan reducere celleoverlevelsen og kulturens succes.
- Tilsæt DMSO for at opnå et 10% DMSO: 90% FBS-forhold, og overfør til kryorør (1 ml resuspenderet pellet pr. 2 ml kryotube).
- Kryorøret anbringes ved -80 °C i en polystyrenbeholder natten over. Flyt til -150 °C den næste dag til langtidsopbevaring.
BEMÆRK: Kortvarig opbevaring ved -80 °C er også mulig. - Når kulturen påbegyndes, tøs cryosonden hurtigt op i et 37 °C vandbad, indtil cellesuspensionen er optøet. Bland med 4 ml DMEM under kulturhætten. Spin ved 600 x g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten pipetteres ud, og fortsæt som beskrevet i trin 7.2.
7. Dyrkning
BEMÆRK: Frosne eller friske cellesuspensioner kan forventes at fylde 24-32 brønde med tre til fire 8-brøndsplader.
- Overtræk plader med 8 brønde med overfladebehandlingsopløsningen, som skal optøs ved 4 °C eller på is (stambelægningsopløsningen opbevares normalt ved -20 °C). Tilsæt 0,4 ml belægningsopløsning til en brønd, og pipette den fra brønd til brønd. Efter overførsel af belægningsopløsningen gennem alle brønde kan den opsamles og genfryses til fremtidige kulturer. Opbevar de coatede plader ved 37 °C i 30 minutter, før cellerne pletteres.
- Tilsæt DMEM (suppleret med 1% penicillin-streptomycin) suppleret med 4 ng/ml bFGF (se materialetabel) til FBS-cellesuspensionen for at opnå et 20% FBS:80% DMEM-forhold.
BEMÆRK: Selvom tilsætning af bFGF kan være gavnlig i primære myoblastkulturer og i satellitlignende celleproduktion i bulkkulturer, er dens tilsætning valgfri, da dens udeladelse i bulkkulturer på ~ 7 dage ikke alvorligt kompromitterer celleudbytterne. - Plade 0,4 ml opslæmning pr. brønd (fra trin 7.2) i de coatede plader med 8 huller.
BEMÆRK: Beregn 30cm2 kultur pr. dyr for frosne og friske tilberedninger. - Inkuber kulturerne ved 37 °C med 5% CO2 i op til 10 dage, skift substrat hver dag, efter at kulturen begynder at skifte til en gullig farve (normalt 5-7 dage).
BEMÆRK: For at kvantificere celler i S-fasen af cellecyklussen13 tilsættes 10 μM EdU 2 timer før fiksering. For at fange den første S-fase tilsættes 10 μM EdU fra pletteringen og fastgøres ved 40 timers kultur.
8. Optagelse
BEMÆRK: Afsnit 8-10 skal udføres ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet.
- Pipetter dyrkningsmediet ud, og fastgør cellerne med 4% PFA (0,15 ml / brønd).
FORSIGTIG: Tilsæt PFA under en kemisk hætte.
BEMÆRK: Hvis alle brønde er fastgjort på samme tid, inkuberes med PFA ved stuetemperatur i 10 min. Hvis brøndene er fastgjort på forskellige tidspunkter, tilsættes PFA til de brønde, der skal fastgøres, og pladen opbevares i inkubatoren ved 37 °C i 5 minutter. - PFA'en pipetteres ud, og PBS tilsættes i 10 s (0,15 ml/hul). Pipette PBS ud, og tilsæt frisk PBS i 5 minutter (0,15 ml/hul).
BEMÆRK: Hvis alle brønde er fastgjort på samme tid, inkuberes med PBS ved stuetemperatur. Hvis hullerne er fastgjort på forskellige tidspunkter, tilsættes PBS til de faste huller, og pladen opbevares i inkubatoren ved 37 °C i 5 minutter. Derefter tilsættes 0,4 ml PBS, og opbevar pladen i inkubatoren i op til 1 uge.
9. Permeabilisering og blokering
- Når PBS er klar til farvning, pipetteres den ud, og den permeabiliseres med 0,5 % TritonX 100 i PBS (0,15 ml/hul) i 8 min. TritonX 100 pipetteres ud, skylles med PBS i 10 sek. (0,15 ml/brønd), PBS pipetteres ud, og vaskes med PBS i 5 minutter (0,15 ml/hul).
- Blok med 5% IgG-fri BSA i PBS i 30-60 min (0,15 ml / brønd).
10. Farvning
- BSA pipetteres ud, og den primære antistofblanding fortyndes i PBS (0,15 ml/hul) (se materialetabellen; fortyndinger: anti-CD31 1:100, anti-FOSB 1:200, anti-GFP 1:1.000, anti-KI67 1:1.000, anti-MyHC 1:400, anti-MYOD 1:200, anti-MYOG 1:150, anti-PAX7 1:100, anti-PDGFRa 1:50) til inkubation natten over ved 4 °C.
BEMÆRK: Efter antistofinkubationen opsamles antistofblandingen, tilsættes natriumazid, og opbevares ved 4 °C eller -20 °C (i henhold til antistofproducentens anvisninger) til fremtidig genbrug. - Pipette antistofblandingen ud, skyl med PBS i 10 s (0,15 ml/hul), pipette PBS ud og vask med PBS i 5 minutter (0,15 ml/hul).
- Pipetter vaske-PBS'en ud, tilsæt den sekundære antistofblanding (gede-anti-mus Alexa Fluor 488, gede-antikanin Alexa Fluor 555, ged-anti-rotte Alexa Fluor 647, gede-anti-mus Alexa Fluor 555, gede-anti-kylling Alexa Fluor 488, alle brugt ved fortyndinger på 1:500-1.000) og kernemarkør (f.eks. DAPI) fortyndet i PBS (0,15 ml/brønd) (se materialetabel), og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur, beskyttet mod lys.
- Afpipetter den sekundære antistofblanding, skyl med PBS i 10 s (0,15 ml/hul), pipette PBS ud, vask med PBS i 5 minutter (0,15 ml/brønd), pipette PBS ud og monter.
BEMÆRK: Hvis der anvendes 8-brøndsplader med aftagelige separatorer, skal separatorerne fjernes inden montering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol giver mulighed for muskelcellekultur, samtidig med at satellitcellerne og de fleste celler bevares fra deres endogene niche. Figur 2 opsummerer protokollens vigtigste trin, mens væsentlige dele af dissektionen og fordøjelsen er vist i figur 1. Dissektion af bagbenets muskulatur anbefales (figur 1A-C), da denne gruppe muskler er godt undersøgt og deler en udviklingsmæssig oprindelse og molekylære hierarkier14. Det anbefales at forberede alle blandinger under sterile forhold. Derudover blev der bemærket lavere kulturforurening, når fordøjelsesblandingen blev ført gennem et 0,22 μm filter under en cellekulturhætte.
Ved plettering af 1/30 af en bulkforberedelse på belagte 1 cm2 brøndplader er aflange celler synlige 3-4 dage efter, at kulturen er startet. Dette kan dog variere afhængigt af cellekoncentrationen, og aflange celler kan begynde at dukke op senere, især når frosne bulkpræparater udvides. Ca. 7 dage senere skulle mediet være blevet gult, og på dette tidspunkt kræves daglige medieændringer. Derudover skal brøndene på dette tidspunkt dækkes med myorør. Endotelcellerne udgør en mindre brøkdel af kulturen. Hovedindikationen for en vellykket kultur er rigelige PAX7+ celler, som kan kræve fiksering og farvning. En praktisk musemodel, der kan bruges, når det er muligt, er Tg:Pax7-nGFP linje12, som giver mulighed for visualisering af PAX7-positivitet i form af GFP-ekspression; således kan satellitcellerne let detekteres af reporteren GFP. GFP kan observeres ved 20x forstørrelse på et inverteret epifluorescensmikroskop, hvilket giver mulighed for analyse af kulturens succes, mens kulturen er i gang. Dette muliggør også levende billeddannelse af PAX7-GFP-celler i bulkkulturer. Kulturer må ikke efterlades længere end 10 dage. Derefter begynder reservecellerne at falde i antal, og myorørene kan løsne sig fra pladen. Mislykkede kulturer, herunder baseret på nylige erfaringer med kulturer fra frosne celler, kan stadig generere en stor andel fibre, men meget få PAX7-GFP-celler. Når du bruger mus uden en fluorescerende markør til PAX7, er det nødvendigt at udføre farvning for at vurdere effektiviteten af reservecellegenerering.
Følgende antistoffer er blevet testet og fungerer godt sammen med farvningsprotokollen, der præsenteres i protokolafsnit 10: anti-PAX7 (en markør for satellitceller og aktiverede myoblaster 15; også en markør for reserveceller, der opstår i denne kultur), anti-myosin (en markør for myorør15), anti-CD31 (en markør for endotelceller16), anti-GFP (hvis der anvendes reportermus), anti-MYOD (en markør for myoblaster 15), anti-MYOG (en markør for differentiering af myocytter 15), anti-KI67 (en markør for prolifererende celler17) og anti-PDGFRα (en markør for FAPs15). Figur 3 viser myogene celler og nicheceller efter 7 dage i kultur. Med hensyn til figur 3A-C blev muskelbulks dyrket fra vildtypemus, mens muskelbulks for figur 3D-F blev dyrket fra den førnævnte Tg: Pax7-nGFP-linje. Dobbeltfarvning med PAX7 og KI67 (figur 3A) tillod markering af reservecellerne, der optrådte efter 5 dage i kultur og havde muskelstamcelleegenskaber, såsom udgangen fra cellecyklussen (KI67- status) og en lokalisering som "satellitter" til de dannede myorør. Dobbeltfarvning med MyHC og MYOG (figur 3B, D, E) tillod markering af cellerne, der avancerede gennem muskeldifferentiering og således gradvist udtrykte MYOG og derefter fusionerede til dannelse af multinucleated MyHC + myorør. Farvning med CD31 eller PDGFRα tillod mærkning af nicheceller (figur 3C), såsom endotelceller og FAP'er. Figur 3D,E viser nye reserveceller præget af GFP. Co-farvning med GFP og MyHC tillod evaluering af reservecellernes satellitcelleposition (figur 3E), mens co-farvning med GFP og andre aktiverings-/differentieringsmarkører tillod evaluering af reservecellernes hvilende lignende natur (figur 3F).
Figur 2: En oversigt over protokoltrinnene. (A–D) Sekventielle trin af (A) dissektion, (B) fordøjelse, (C) filtrering og (D) kultur. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Immunfarvning af cellepopulationerne. (A) Immunofluorescens af myogene (markeret med PAX7; grøn) og cyklus (markeret med KI67; røde) celler. Kernerne modfarves med DAPI (blå). Tilstedeværelsen af ikke-cyklende myogene celler (KI67-PAX7+) viser, at protokollen kan producere hvilende celler fra vildtypemus, der er rigelige efter 7 dages dyrkning. (B) Immunofluorescens af myorør (markeret med myosin tung kæde [MyHC]; grøn) og myocytter (markeret med MYOG; rød) efter 7 dages dyrkning af celler fra vildtypemus. Kernerne modfarves med DAPI (blå). (C) Immunofluorescens af myogene celler (markeret med PAX7; grøn), mesenkymale fibro-adipogene forfædre (markeret med PDGFRa; rød) og endotelceller (markeret med CD31; magenta) efter 7 dages dyrkning af celler fra vildtypemus. Kerner er modfarvet med DAPI (blå). (D) Immunofluorescens af GFP+ celler (grøn) og myocytter (markeret med MYOG; magenta) efter 8 dages dyrkning af celler fra Tg:Pax7-nGFP mus, hvor PAX7-ekspressive celler er markeret med nuklear GFP. (E) Immunofluorescens af GFP+ celler (grøn) og myorør (markeret med MyHC; rød) efter 7 dages dyrkning af celler fra Tg:Pax7-nGFP mus. Bemærk, at de satellitcellelignende celler vises i kulturen efter 7 dage. (F) Kvantificering af GFP+-celleandelen, der co-udtrykker markører for satellitceller (PAX7), aktivering (FOSB), proliferation (KI67) eller myogen differentiering (MYOD, MYOG). Fejlbjælkerne angiver standardafvigelsen. Skala bar: 100 um. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Voksen skeletmuskelfunktion understøttes af et fint orkestreret sæt cellulære interaktioner og molekylære signaler. Her præsenteres en metode, der giver mulighed for undersøgelse af disse parametre i en ex vivo-indstilling , der ligner det fysiologiske mikromiljø.
Flere grupper har rapporteret in vitro metoder til dyrkning af myogene celler. Disse metoder havde til formål at isolere satellitceller for at studere deres myogene stamfaderegenskaber. To hovedmetoder anvendes til at isolere rene satellitceller, enten fra kulturer af isolerede fibre fra soleus og / eller EDL muskler18eller fra FACS-isolerede satellitceller, fra bulkmuskler, ved hjælp af et panel af antistoffer til Pax7, CD34 og a7-integrin til positiv selektion og CD45, CD31 og Sca1 til negativ selektion 19,20,21. Andre har også brugt mekaniske vandhaner til at isolere primære myoblaster fra bulkkulturer på gelatinebelagte plader på grund af deres skrøbelige vedhæftningsegenskaber sammenlignet med andre celler såsom FAP'er22,23. Mens disse tilgange er egnede til at studere aktiveringen af satellitceller eller til at udvide dem i kultur, vokser cellerne i et miljø berøvet de understøttende celler, der normalt bidrager til deres niche. Derudover kræver disse tilgange, at de myogene forfædre opbevares i mere end 2 uger for at etablere hvilende mononukleerede reserveceller med høj Pax7-ekspression18. Co-kulturer af satellitceller og andre celletyper, såsom makrofager, er også blevet rapporteret. Dette har gjort det muligt at undersøge en specifik celles direkte bidrag til myogene egenskaber såsom spredning, differentiering og fusion24. Flere enkeltcellede RNA-seq-undersøgelser har detaljeret den cellulære sammensætning af skeletmuskulaturen25,26. Da vores dyrkningsbetingelser favoriserer dannelsen af myogene celler, har vi observeret en meget højere andel af reserveceller og en lavere andel af støtteceller i bulkkulturer sammenlignet med disse in vivo-undersøgelser.
Der er identificeret tre kritiske trin i metoden beskrevet her, der kan øge effektiviteten. For det første er hurtig og effektiv hakning nødvendig for at sikre optimal muskeldissociation i løbet af 2 timers fordøjelse og derefter et højere celleudbytte. For det andet er kontinuerlig rotation under fordøjelsen meget vigtig for at sikre korrekt diffusion af enzymerne gennem vævet. Endelig er skånsom mekanisk dissociation også vigtig for optimal vævsdissociation.
Der er fire hovedbegrænsninger i denne protokol. For det første forbliver det et ex vivo-system, hvilket betyder, at nogle fysiologiske og biofysiske signaler kan gå tabt eller ændres. Dette inkluderer signalering til / fra muskelfibrene, da fibrene går tabt før plettering, og myorørene genopbygges under kultur. For det andet er det stadig at se, om de dannede myorør har embryonale eller voksne egenskaber, og om de repræsenterer de forskellige fibertyper i langsomme og hurtige muskler. Til reference har kulturer af C2C12-muskelcellelinjen og humane myoblaster vist, at myorør i 2D-kultur er mindre modne end deres in vivo-modstykker27,28, mens primære musemyoblastkulturer synes at føre til myosintyper, der er repræsentative for dem, der findes in vivo 29. For det tredje mister cellerne med denne metode deres in situ-position under vævsdissociation, og de nydannede myorør mangler neuromuskulære og myotendinøse kryds; Resultaterne af rumlige træk bør derfor fortolkes med forsigtighed. For det fjerde er den præsenterede protokol optimeret til raske voksne muskler, men tilpasninger kan være nødvendige, hvis udgangsmaterialet stammer fra ældre eller myopatiske muskler, der præsenterer omfattende fibrose, øget adipogen aflejring eller kompromitteret celleaktivering.
De fleste af disse begrænsninger er fælles for andre metoder til ex vivo muskelundersøgelser, men denne protokol har flere fordele i forhold til dem. Det er den eneste protokol, der giver mulighed for at høste et stort antal hvilende-lignende reserve satellitceller. Derudover repræsenterer det en billig og ligetil metode, der ikke kræver de særlige dyrkningsforhold eller ekspertise, der er forbundet med inducerede pluripotente stamceller, embryonale stamceller, myosfærekultur eller organoidkultur. Desuden afhænger bulkkulturen ikke af den komplicerede infrastruktur og standardisering, der er forbundet med kulturer af myogene celler i hydrogeler eller andre stilladser. Sammenlignet med kulturer af isolerede myofibre, FACS-isolerede primære celler eller pletteringsberigede primære celler bevarer bulkkulturen flere cellepopulationer, der er til stede i det fysiologiske muskelmiljø. Disse celler passerer gennem en relativt fysiologisk vej til aktivering og differentiering drevet af kulturmediets vækstfaktorer snarere end de ekstreme og usædvanlige signaler fra slangegiftene, der almindeligvis bruges til at studere muskelregenerering in vivo30,31. Endelig er den præsenterede cellekultur fordelagtig i forhold til at bruge C2C12-celler, som som med enhver cellelinje har genetiske ændringer sammenlignet med endogene eller primære celler.
Ovennævnte fordele gør denne protokol til et kraftfuldt værktøj til applikationer som celleforstærkning og generering af en hvilende-lignende satellitcellepulje, som er nødvendige for at udvikle celleterapier eller endda besvare grundlæggende spørgsmål om hviletilstand og cellulær / molekylær regulering. Derudover kan protokollen bruges til at modificere molekylær signalering via lægemidler, siRNA-målretning eller transfektion med vektorer (plasmid, vira), der inducerer overekspression eller ekspression af dominerende negative former for faktorerne af interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Til figur 2 blev der brugt skabeloner fra Servier Medical Art (https://smart.servier.com/). FR-laboratoriet støttes af Association Française contre les Myopathies - AFM via TRANSLAMUSCLE (tilskud 19507 og 22946), Fondation pour la Recherche Médicale - FRM (EQU202003010217, ENV202004011730, ECO201806006793), Agence Nationale pour la Recherche - ANR (ANR-21-CE13-0006-02, ANR-19-CE13-0010, ANR-10-LABX-73) og La Ligue Contre le Cancer (IP/SC-17130). Ovennævnte bidragydere havde ingen rolle i udformningen, indsamlingen, analysen, fortolkningen eller rapporteringen af denne undersøgelse eller skrivningen af dette manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-CD31 | BD | 550274 | dilution 1:100 |
| anti-FOSB | Santa Cruz | sc-7203 | dilution 1:200 |
| anti-GFP | Abcam | ab13970 | dilution 1:1000 |
| anti-Ki67 | Abcam | ab16667 | dilution 1:1000 |
| anti-MyHC | DSHB | MF20-c | dilution 1:400 |
| anti-MYOD | Active Motif | 39991 | dilution 1:200 |
| anti-MYOG | Santa Cruz | sc-576 | dilution 1:150 |
| anti-Pax7 | Santa Cruz | sc-81648 | dilution 1:100 |
| anti-PDGFRα | Invitrogen | PA5-16571 | dilution 1:50 |
| b-FGF | Peprotech | 450-33 | concentration 4 ng/mL |
| Bovine serum albumin (BSA) – used for digestion | Sigma Aldrich | A7906-1006 | concentration 0.2% |
| BSA IgG-free, protease-free – used for staining | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | concentration 5% |
| Cell strainer 40 um | Dominique Dutscher | 352340 | |
| Cell strainer 70 um | Dominique Dutscher | 352350 | |
| Cell strainer 100 um | Dominique Dutscher | 352360 | |
| Collagenase | Roche | 10103586001 | concentration 0.5 U/mL |
| Culture plate | Sarstedt | 94.6140.802 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Euromedex | UD8050-05-A | |
| Dispase | Roche | 4942078001 | concentration 3 U/mL |
| Dissection forceps size 5 | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Dissection forceps size 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dissection scissors (big, straight) | Fine Science Tools | 9146-11 | ideal for chopping |
| Dissection scissors (small, curved) | Fine Science Tools | 15017-10 | |
| Dissection scissors (small, straight) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ThermoFisher | 41966-029 | |
| EdU Click-iT kit | ThermoFisher | C10340 | |
| Fetal bovine serum – option 1 | Eurobio | CVF00-01 | |
| Fetal bovine serum – option 2 | Gibco | 10270-106 | |
| Matrigel | Corning Life Sciences | 354234 | coating solution |
| Parafilm | Dominique Dutscher | 090261 | flexible film |
| Paraformaldehyde – option 1 | PanReac AppliChem ITW Reagents | 211511.1209 | concentration 4% |
| Paraformaldeyde – option 2 | ThermoFisher | 28908 | concentration 4% |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Shaking water bath | ThermoFisher | TSSWB27 | |
| TritonX100 | Sigma Aldrich | T8532-500 ML | concentration 0.5% |
| Wild-type mice | Janvier | C57BL/6NRj |
References
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: A brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- Forcina, L., Cosentino, M., Musarò, A. Mechanisms regulating muscle regeneration: Insights into the interrelated and time-dependent phases of tissue healing. Cells. 9 (5), 1297 (2020).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. -M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
- McCarthy, J. J., et al. Effective fiber hypertrophy in satellite cell-depleted skeletal muscle. Development. 138 (17), 3657-3666 (2011).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
- Hicks, M. R., Pyle, A. D. The emergence of the stem cell niche. Trends in Cell Biology. 33 (22), 112-123 (2022).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Gama, J. F. G., et al. Role of regulatory T cells in skeletal muscle regeneration: A systematic review. Biomolecules. 12 (6), 817 (2022).
- Loreti, M., Sacco, A. The jam session between muscle stem cells and the extracellular matrix in the tissue microenvironment. NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 16 (2022).
- Sambasivan, R., et al. Distinct regulatory cascades govern extraocular and pharyngeal arch muscle progenitor cell fates. Developmental Cell. 16 (6), 810-821 (2009).
- Pereira, P. D., et al. Quantification of cell cycle kinetics by EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity analysis. Oncotarget. 8 (25), 40514-40532 (2017).
- Bismuth, K., Relaix, F. Genetic regulation of skeletal muscle development. Experimental Cell Research. 316 (18), 3081-3086 (2010).
- Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. A. Satellite cells and the muscle stem cell niche. Physiological Reviews. 93 (1), 23-67 (2013).
- Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31). Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).
- Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: From the known and the unknown. Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).
- Abou-Khalil, R., Le Grand, F., Chazaud, B. Human and murine skeletal muscle reserve cells. Stem Cell Niche. 1035, 165-177 (2013).
- Pasut, A., Oleynik, P., Rudnicki, M. A. Isolation of muscle stem cells by fluorescence activated cell sorting cytometry. Methods in Molecular Biology. 798, 53-64 (2011).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
- Qu, Y., Edwards, K., Barrow, J. Isolation, culture, and use of primary murine myoblasts in small-molecule screens. STAR Protocols. 4 (2), 102149 (2023).
- Danoviz, M. E., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells: Background and methods for isolation and analysis in a primary culture system. Methods in Molecular Biology. 798, 21-52 (2011).
- Saclier, M., Theret, M., Mounier, R., Chazaud, B. Effects of macrophage conditioned-medium on murine and human muscle cells: analysis of proliferation, differentiation, and fusion. Methods in Molecular Biology. 1556, 317-327 (2017).
- Giordani, L., et al. High-dimensional single-cell cartography reveals novel skeletal muscle-resident cell populations. Molecular Cell. 74 (3), 609-621 (2019).
- Tabula Muris Consortium et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
- Brunetti, J., Koenig, S., Monnier, A., Frieden, M. Nanopattern surface improves cultured human myotube maturation. Skeletal Muscle. 11 (1), 12 (2021).
- Denes, L. T., et al. Culturing C2C12 myotubes on micromolded gelatin hydrogels accelerates myotube maturation. Skeletal Muscle. 9 (1), 17 (2019).
- LaFramboise, W. A., et al. Effect of muscle origin and phenotype on satellite cell muscle-specific gene expression. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 35 (10), 1307-1318 (2003).
- Azhar, M., Wardhani, B. W. K., Renesteen, E. The regenerative potential of Pax3/Pax7 on skeletal muscle injury. Journal of Generic Engineering and Biotechnology. 20 (1), 143 (2022).
- Hardy, D., et al. Comparative study of injury models for studying muscle regeneration in mice. PLoS One. 11 (1), e0147198 (2016).
