Summary
توضح هذه المقالة بالتفصيل عملية تصنيع الخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري للاستخدام السريري ، وتحديدا باستخدام معالج خلوي آلي قادر على إجراء نقل فيروسي وزراعة الخلايا التائية. نحن نقدم توصيات ونصف المزالق التي يجب مراعاتها أثناء تطوير العملية وتنفيذ تجربة سريرية في مرحلة مبكرة.
Abstract
تمثل الخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري (CAR) نهجا علاجيا مناعيا واعدا لعلاج مختلف الأمراض الخبيثة وغير الخبيثة. الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية هي خلايا تائية معدلة وراثيا تعبر عن بروتين خيمري يتعرف على هدف سطح الخلية ويرتبط به، مما يؤدي إلى قتل الخلية المستهدفة. طرق تصنيع الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية التقليدية كثيفة العمالة ومكلفة وقد تحمل خطر التلوث. يسمح CliniMACS Prodigy ، وهو معالج خلوي آلي ، بتصنيع منتجات العلاج بالخلايا على نطاق سريري في نظام مغلق ، مما يقلل من مخاطر التلوث. تحدث المعالجة بشكل شبه تلقائي تحت سيطرة الكمبيوتر وبالتالي تقلل من المشاركة البشرية في العملية ، مما يوفر الوقت ويقلل من التباين والأخطاء.
تصف هذه المخطوطة والفيديو عملية نقل الخلايا التائية (TCT) لتصنيع الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية باستخدام هذا المعالج. تتضمن عملية TCT إثراء الخلايا التائية CD4 + / CD8 + ، والتنشيط ، والتحويل باستخدام ناقل فيروسي ، والتوسع ، والحصاد. باستخدام مصفوفة الأنشطة، وهي وظيفة تسمح بطلب هذه الخطوات وتوقيتها، يمكن تخصيص عملية TCT على نطاق واسع. نحن نقدم جولة تفصيلية لتصنيع الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية وفقا لممارسات التصنيع الجيدة الحالية (cGMP) ونناقش اختبار الإطلاق المطلوب والتجارب قبل السريرية التي ستدعم تطبيق الدواء الجديد البحثي (IND). نوضح جدوى ومناقشة مزايا وعيوب استخدام عملية شبه أوتوماتيكية لتصنيع الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية السريرية. أخيرا ، وصفنا تجربة سريرية مستمرة بدأها الباحث والتي تستهدف الأورام الخبيثة في الخلايا البائية لدى الأطفال [NCT05480449] كمثال على كيفية تطبيق عملية التصنيع هذه في بيئة سريرية.
Introduction
أظهر النقل بالتبني للخلايا التائية المهندسة للتعبير عن مستقبلات المستضد الخيمري (CAR) فعالية ملحوظة في علاج المرضى الذين يعانون من الأورام الخبيثة في الخلايا البائيةالمقاومة للحرارة 1،2،3،4،5. ومع ذلك ، فإن طرق التصنيع التقليدية للخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية كثيفة العمالة وتستغرق وقتا طويلا وتتطلب فنيين مدربين تدريبا عاليا لتنفيذ خطوات متخصصة للغاية. على سبيل المثال ، تتضمن عملية التصنيع التقليدية لمنتج الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية ذاتية المنشأ الطرد المركزي المتدرج الكثافة أو الشطف أو الفصل المغناطيسي لإثراء الخلايا التائية والتنشيط والتحويل باستخدام ناقل فيروسي في دورق معقم ، والتوسع في مفاعل حيوي قبل الحصاد والتركيب. ظهرت أنظمة مختلفة مؤخرا تهدف إلى أتمتة هذه العملية جزئيا. على سبيل المثال ، Miltenyi CliniMACS Prodigy (المشار إليه فيما يلي باسم "المعالج") هو جهاز معالجة خلايا آلي يمكنه تنفيذ العديد من هذه الخطوات بطريقة آلية6،7،8،9. تم تقديم مناقشة متعمقة لطرق تصنيع CAR-T التقليدية والآلية في مقالة مراجعةحديثة 10.
يعتمد المعالج على وظائف CliniMACS Plus ، وهو جهاز طبي معتمد من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) لمعالجة الخلايا السلفية المكونة للدم. يشتمل المعالج على وحدة زراعة الخلايا التي تسمح بالغسيل الآلي للخلايا وتجزئتها وزراعتها (الشكل 1). عملية نقل الخلايا التائية (TCT) هي برنامج محدد مسبقا داخل جهاز المعالج يكرر إلى حد كبير التصنيع اليدوي للخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية. يسمح TCT بمعالجة الخلايا القابلة للتخصيص باستخدام واجهة مستخدم رسومية ("مصفوفة النشاط" ، الشكل 2). نظرا لأن المعالج يقوم بأتمتة العديد من الخطوات ويدمج وظائف أجهزة متعددة في جهاز واحد ، فإنه يتطلب تدريبا أقل ومهارات متخصصة في استكشاف الأخطاء وإصلاحها من التقنيين. نظرا لأن جميع الخطوات يتم تنفيذها داخل مجموعة أنابيب مغلقة تستخدم مرة واحدة ، فقد يتم تشغيل المعالج في مرافق ذات بنية تحتية أقل صرامة لمعالجة الهواء مما يمكن اعتباره مقبولا لعملية التصنيع المفتوحة. على سبيل المثال ، نقوم بتشغيل المعالج في منشأة معتمدة من فئة ISO 8 (يمكن مقارنتها بدرجة الاتحاد الأوروبي C).
الشكل 1: تصنيع الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية باستخدام نظام نقل الخلايا التائية. يظهر المعالج مع مجموعة الأنابيب المثبتة. تسمح مجموعة الأنابيب بتوصيل مكونات أخرى مثل الأكياس التي تحتوي على مخزن مؤقت للمعالجة ووسط استزراع وناقل عدسي عن طريق اللحام المعقم. بمجرد إضافة منتج فصادة الكريات البيض إلى كيس التطبيق ، يمكن تمييزه بخرز اختيار الخلايا التائية ، وتمريره عبر عمود الفصل ، ثم نقله إلى كيس إعادة التطبيق. ثم يتم توجيه الخلايا المختارة إلى وحدة الزراعة الخاصة بأداة الاستزراع وتنشيطها باستخدام كاشف التنشيط (انظر جدول المواد). يتم جمع المنتج النهائي في كيس الخلية المستهدفة. طوال العملية ، من الممكن إزالة العينات لمراقبة الجودة بشكل معقم. تمثل الأرقام الرمادية داخل الدوائر الصمامات المرقمة على المعالج التي توجه مسار السائل عبر مجموعة الأنابيب. مستنسخة بإذن من 11. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مصفوفة النشاط. بعد اختيار الخلايا التائية وتنشيطها ، يصبح ما تبقى من عملية تصنيع الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية قابلا للتخصيص بالكامل. يمكن إضافة الأنشطة أو حذفها وجدولتها لليوم والوقت المناسبين ، ويمكن تحديد حجم الثقافة بعد النشاط (Volume). على سبيل المثال ، تم تكوين نشاط النقل ليبدأ في الساعة 10:00 صباحا في اليوم الأول ، وتم تعيين حجم الثقافة في نهاية النشاط على أنه 100 مل. يمكن تحرير مصفوفة النشاط طوال فترة الزراعة. يمكن مراقبة حالة العملية على الشاشة المدمجة لجهاز المعالجة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الهدف من هذه المخطوطة هو توفير جولة مفصلة لتصنيع الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية باستخدام المعالج بالإضافة إلى تقديم إرشادات حول اختبار إطلاق المنتج والمنتج الذي من المحتمل أن يكون مطلوبا من قبل المنظمين للموافقة على تطبيق دواء جديد بحثي (IND). يبقى البروتوكول المقدم قريبا من النهج الموصى به للبائع وهو البروتوكول الأساسي ل IND 28617 ، والذي يتم تقييمه حاليا في المرحلة الأولى / الثانية من التجارب السريرية التي بدأها باحث واحد. تهدف هذه التجربة إلى تحديد سلامة وفعالية استخدام هذا المعالج لتصنيع خلايا CAR-T ذاتية المنشأ موجهة بالبشر CD19 للمرضى الذين يعانون من سرطان الدم الليمفاوي الحاد للخلايا البائية (B-ALL) أو سرطان الغدد الليمفاوية B-lineage (B-Lly) [NCT05480449]. بدأت التجربة في سبتمبر 2022 ومن المقرر أن تسجل ما يصل إلى 89 مريضا تتراوح أعمارهم بين 0-29 عاما مع B-ALL أو B-Lly. نبلغ عن بعض نتائج التصنيع من التجربة في المخطوطة.
نود أن نشير إلى أنه على الرغم من تقديم المخطوطة كبروتوكول مع خطوات يجب اتباعها ، إلا أنه يجب اعتبارها نقطة انطلاق للآخرين للبدء في تحسين عملية تصنيع الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية الخاصة بهم. وتشمل قائمة غير شاملة بالاختلافات المحتملة في البروتوكول المقدم ما يلي: استخدام الخلايا التائية الطازجة بدلا من الخلايا التائية المحفوظة بالتبريد كمواد أولية؛ واستخدام الخلايا التائية الطازجة بدلا من الخلايا التائية المحفوظة بالتبريد كمواد أولية؛ واستخدام الخلايا التائية الطازجة بدلا من الخلايا التائية المحفوظة بالتبريد كمواد أولية؛ واستخدام الخلايا التائية الطازجة بدلا من الخلايا التائية المحفوظة بالتبريد كمواد أولية؛ واستخدام الخلايا الت باستخدام طريقة مختلفة لتخصيب الخلايا التائية أو حذفها تماما ؛ استخدام وسائط مختلفة وكوكتيلات السيتوكين مثل IL7 / IL15 بدلا من IL2 ؛ تغيير تركيز مصل AB البشري أو حذفه تماما ؛ توقيت التنبيغ باستخدام عمليات نقل "متعددة الضربات" ؛ الإثارة المتفاوتة ، وأحجام الثقافة ، وجدول التغذية ؛ استخدام طرق مختلفة للنقل الجيني بما في ذلك التثقيب الكهربائي للأحماض النووية أو النواقل غير الفيروسية ؛ استخدام محلول عازل و/أو واقي بالتبريد مختلف؛ وغرس الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية طازجة بدلا من حفظها بالتبريد للتسريب في وقت لاحق. قد يكون لهذه الاختلافات تأثير كبير على التركيب الخلوي وفعالية المنتج العلاجي.
| خطوة العملية الشاملة | يوم العملية | تفاصيل تقنية | |||
| إثراء الخلايا | اليوم 0 | اختيار الخلايا التائية CD4 + / CD8 + | |||
| تنشيط الخلية | بذر وتنشيط زراعة الخلايا التائية | ||||
| نقل الخلايا | اليوم 1 | نقل الفيروسات النسرية (حجم مزرعة 100 مل) | |||
| توسيع الخلية (تليها صياغة الخلية) | اليوم 2 | -- | |||
| اليوم 3 | غسل الثقافة (1 دورة) ؛ شاكر تفعيل. زيادة حجم الثقافة إلى 200 مل | ||||
| اليوم 4 | -- | ||||
| اليوم 5 | تغذية (50 مل) ؛ حجم الثقافة يصل إلى الحجم النهائي 250 مل | ||||
| اليوم 6 | عينة قيد المعالجة تبادل الوسائط (-125 مل / +125 مل) | ||||
| اليوم 7 | تبادل الوسائط (-150 مل / +150 مل) أو الحصاد | ||||
| اليوم 8 | عينة قيد المعالجة تبادل الوسائط (-150 مل / +150 مل) أو الحصاد | ||||
| اليوم 9 | تبادل الوسائط (-180 مل / +180 مل) أو الحصاد | ||||
| اليوم 10 | عينة قيد المعالجة تبادل الوسائط (-180 مل / +180 مل) أو الحصاد | ||||
| اليوم 11 | تبادل الوسائط (-180 مل / +180 مل) أو الحصاد | ||||
| اليوم 12 | تبادل الوسائط (-180 مل / +180 مل) أو الحصاد | ||||
| اليوم 13 | حصاد | ||||
الجدول 1: الجدول الزمني للعملية ونظرة عامة. يلخص هذا الجدول خطوات عملية TCT المستخدمة في تجربة سريرية حالية [NCT05480449]. تبدأ العملية بتخصيب الخلايا التائية عن طريق اختيار CD4 + / CD8 + ، وبذر الثقافة ، والتنشيط في اليوم 0 ، يليه التحويل في اليوم 1. تستريح الخلايا لمدة 48 ساعة ، تليها غسل الثقافة ، وزيادة حجم الثقافة إلى 200 مل ، والإثارة باستخدام آلية الاهتزاز. في اليوم 6 ، يتم أخذ أول عينة قيد المعالجة. يتم حصاد الخلايا بمجرد توفر خلايا كافية لثلاث جرعات كاملة على الأقل من الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية (5 × 10 6 خلايا CAR-T / كجم إذا كان المريض <50 كجم ، وإلا 2.5 × 108 خلايا CAR-T) واختبار مراقبة الجودة (~ 2 × 106 خلايا CAR-T) ؛ أو بمجرد أن تصل الثقافة إلى ما مجموعه 4-5 × 109 خلايا. الاختصارات: TCT = نقل الخلايا التائية ؛ CAR-T = الخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري ؛ MACS = فرز الخلايا المنشط مغناطيسيا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء جميع الأبحاث وفقا للإرشادات المؤسسية بموافقة مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) بالمستشفى ، وقدم جميع الأشخاص موافقة مستنيرة لنشر البيانات التي تم جمعها في سياق التجربة.
ملاحظة: يقدم القسم الأول من البروتوكول نظرة عامة رفيعة المستوى لعملية تصنيع CAR-T. توفر الأقسام المتبقية إرشادات خطوة بخطوة. يصف البروتوكول سير العمل باستخدام الإصدار 1.4 من برنامج TCT ، وهو الإصدار الحالي حتى كتابة هذه السطور. قد تختلف واجهة المستخدم للإصدارات الأخرى من برنامج TCT.
1. الجدول الزمني للعملية ونظرة عامة (الجدول 1)
- استعد للإجراء يوم الاثنين (اليوم -1) مع فحوصات الاختبار المبدئي. تأكد من أن المعالج والمعدات الأخرى تعمل كما هو متوقع وأن جميع الكواشف والمواد الاستهلاكية متوفرة ومحدثة لتشغيل التصنيع بالكامل.
- في اليوم 0 ، قم بتثبيت مجموعة الأنابيب على الجهاز. قم بإذابة الخلايا التائية المحفوظة بالتبريد سابقا في حمام جاف وقم بتوصيلها عن طريق اللحام المعقم بمجموعة الأنابيب المثبتة على الجهاز.
ملاحظة: يفترض هذا البروتوكول أن الخلايا التائية الذاتية تم جمعها عن طريق الفصادة وحفظها بالتبريد وتخزينها حتى بدء التصنيع. في حين أنه من الممكن استخدام الخلايا التائية التي تم جمعها حديثا ، فإن هذا يزيد من العبء اللوجستي لأنه يتطلب تنسيق جمع الفصادة مع تصنيع الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية. نوصي بشدة باستخدام عملية الذوبان الجاف بدلا من حمام مائي لتقليل مخاطر التلوث البكتيري. - قم بتسمية الخلايا التائية بكواشف CD4 و CD8 (انظر جدول المواد) وإثرائها عن طريق الانتقاء المغناطيسي.
ملاحظة: من الممكن حذف تخصيب الخلايا التائية أو تنفيذه قبل تحميل الخلايا على المعالج. انظر القسم 5 من البروتوكول. - بعد إثراء خلايا CD4+/CD8+، خذ عينة لعدد الخلايا. بذر المستزرع ب 1-2 × 108 خلايا في حجم أولي قدره 70 مل من الوسط (انظر جدول المواد) مكملا بمصل AB بشري بنسبة 5٪ و IL2 البشري المؤتلف (25 نانوغرام / مل).
- أضف قارورة من كاشف التنشيط (مصفوفة نانوية بوليمرية غروانية مترافقة مع الأجسام المضادة المضادة ل CD3 و CD28 ؛ انظر جدول المواد) لتنشيط الخلايا التائية واحتضان الثقافة دون إثارة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في جو CO2 بنسبة 5٪. احتفظ بالتبريد بأي خلايا CD4 + / CD8 + متبقية كنسخة احتياطية ، إذا رغبت في ذلك.
ملاحظة: في حالة فشل التصنيع ، يمكن استخدام الخلايا المحددة CD4 + / CD8 + المتبقية كمواد أولية. إذا كان الفشل تقنيا بحتا ، مثل التلوث أو خطأ المشغل ، وتبقى خلايا كافية ، فيمكن النظر في استخدام الخلايا المتبقية لإجراء عملية تصنيع إضافية. إذا كانت جودة المواد الأولية مثيرة للقلق ، فيمكن تبرير إجراء فصادة جديد ؛ ومع ذلك ، هذا في نهاية المطاف قرار سريري. في كلتا الحالتين ، يعد فشل التصنيع حدثا مهما يجب التحقيق فيه ، ويجب إبلاغ الراعي وربما المنظمين. - بعد 24 ساعة من التنشيط ، قم بتحويل الخلايا التائية مع ناقل الفيروسات العدسية عند تعدد مناسب للعدوى (MOI).
ملاحظة: من الأهمية بمكان تحديد عيار ناقل الفيروسات العدسية وإنشاء MOI مناسب قبل البدء في تصنيع المنتجات السريرية. يجب تحديد عيار المتجه عن طريق إجراء تجربة صغيرة النطاق يتم فيها تحويل الخلايا التائية الأولية البشرية بتركيزات مختلفة من المتجه. تشمل اعتبارات سبل التنفيذ المناسبة تكلفة المتجه ، وكفاءة النقل المطلوبة ، ورقم نسخة متجه مقبول. يستخدم هذا البروتوكول MOI بنسبة 30-50٪ لتقليل تكلفة المتجه والحفاظ على متوسط عدد نسخ المتجه أقل من 8 نسخ لكل خلية محولة. - في اليوم 3 ، قم بتشغيل نشاط غسيل الثقافة ، وابدأ التحريض على مستوى منخفض. زيادة حجم الثقافة إلى 200 مل.
- في اليوم 5 ، أضف 50 مل من الوسط إلى الثقافة ، مما يزيد من حجم الثقافة إلى 250 مل.
- في اليوم 6 من الزراعة ، خذ عينة من المزرعة ، وقم بتعداد خلايا CAR-T عن طريق قياس التدفق الخلوي. استخدم هذا القياس لتقدير معدل نمو الثقافة وتحديد الوقت الأمثل للحصاد.
ملاحظة: ينتج عن كل أخذ عينات أثناء العملية 3 مل للاختبار ويزيل إجمالي 7 مل من حجم الثقافة. - من اليوم 7 إلى 13 ، إذا لم يتم إنهاء الثقافة ، خذ ما يصل إلى عينتين إضافيتين أثناء المعالجة في أيام بديلة ، وقم بإجراء تبادلات إعلامية يومية لتغذية الثقافة المتنامية. احصد المنتج عندما يصل إجمالي عدد الخلايا النواة (TNC) إلى 5 × 109 و / أو عندما تتوفر خلايا كافية للعدد المطلوب من الجرعات واختبار الإطلاق.
- في يوم الحصاد ، خذ عينة قيد المعالجة من الثقافة المتنامية بنشاط. استخدم هذه العينة لاختبار الميكوبلازما ، والذيفان الداخلي ، واختبار فيروس العدس المختص بالتكرار (RCL) ، واختبار رقم نسخة المتجهات (VCN) ، وعدد الخلايا ، وتحليل حجم الخلية ، وقياس التدفق الخلوي ، وصبغة الجرام.
- بدء برنامج الحصاد النهائي ، والذي يؤدي إلى إزالة وسط الاستزراع وغسل الخلايا باستخدام محلول التركيبة النهائي (محلول بلوري معقم متساوي التوتر مكمل ب 4٪ من ألبومين المصل البشري ؛ انظر جدول المواد). بعد اكتمال الحصاد ، ستحتوي حقيبة الخلية المستهدفة على 100 مل من منتج الخلية في محلول التركيبة النهائي. أضف ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) إلى تركيز 10٪ (v / v) ، وقسم المنتج إلى جرعات فردية ، وحفظه بالتبريد باستخدام مجمد معدل مضبوط.
2. اليوم -1: فحوصات التحضير والاختبار المبدئي
- تحقق من أنمستويات غاز ثاني أكسيد الكربون والهواء المضغوط كافية لإنتاج ضغط مدخل لا يقل عن 20 رطل لكل بوصة مربعة في كل خط.
- قم بتشغيل المعالج وتأكد من عدم وجود أخطاء عند بدء التشغيل. إذا لزم الأمر ، اضبط الساعة على الوقت الصحيح. قم بإيقاف تشغيل المعالج.
- تأكد من معرفة عدد الخلايا وحجمها وإجمالي CD4+ وإجمالي عدد CD8+ لمواد بدء تشغيل الخلايا التائية.
- تأكد من وجود كميات كافية من الناقل الفيروسي والكواشف والمواد الاستهلاكية لتشغيل التصنيع بأكمله.
- ضع زجاجة من مصل AB البشري في الثلاجة لتذوب طوال الليل.
3. اليوم 0: تركيب مجموعة الأنابيب
- تحضير 3 لتر من محلول المعالجة (0.5٪ (وزن / حجم) ألبومين مصل الدم البشري (HSA) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات / حمض إيثيلين ديامينيترايتيك (PBS / EDTA).
- تحضير 2 لتر من وسط الاستزراع (2 لتر من الوسط المكمل ب 100 مل من مصل AB البشري إلى تركيز نهائي قدره 5٪ وقنينتين من IL2 البشري المؤتلف عند 25 ميكروغرام / قارورة ؛ انظر جدول المواد لمزيد من المعلومات حول هذه الكواشف). انقل وسط استزراع سعة 10 مل إلى كيس كاشف سعة 20 مل واحفظه في درجة حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل.
- قم بتشغيل الجهاز وحدد عملية نقل الخلايا التائية (TCT) من واجهة الشاشة التي تعمل باللمس. انقر فوق تشغيل لبدء عملية TCT ؛ دع الأداة توجه المستخدم خلال الإجراء باستخدام التعليمات والمطالبات التي تظهر على الشاشة.
- في شاشة إدخال المعلمة ، أدخل الأحرف الأولى من اسم المشغل ، ورقم مجموعة الأنابيب ، وتاريخ انتهاء صلاحيتها عند المطالبة بذلك.
- تعرض شاشة إعداد العملية أربع عمليات مختلفة. اختر العملية الكاملة (1).
ملاحظة: تشمل العمليات الأخرى المتاحة البدء من الخلايا التائية المحددة CD4+/CD8+ (انظر القسم 5 أدناه) وإعادة تشغيل عملية التصنيع التي تم إيقافها مسبقا. - عند المطالبة، اختر قارونينين من كاشف التحديد لتعكس طريقة التحديد CD4+/CD8+.
- قم بتثبيت مجموعة الأنابيب وفقا للتعليمات التي تظهر على الشاشة. تأكد من أن جميع وصلات Luer محكمة وأنه لا توجد عيوب في مجموعة الأنابيب.
- اتبع التعليمات التي تظهر على الشاشة لبدء اختبارات السلامة العلوية والسفلية الآلية.
ملاحظة: قد يفشل اختبار السلامة بسبب مجموعة أنابيب معيبة أو مجموعة أنابيب مثبتة بشكل غير صحيح أو عيب في المضخة التمعجية للماكينة. نوصي بشدة بوجود أنبوب إضافي واحد على الأقل في متناول اليد لتشغيل الإنتاج. نوصي أيضا بأن يتحقق تقني ثان من التثبيت الصحيح لمجموعة الأنابيب. - اتبع التعليمات التي تظهر على الشاشة لتوصيل الأكياس العازلة المتوسطة والمعالجة.
- ابدأ التحضير التلقائي لمجموعة الأنابيب.
ملاحظة: يجب أن تستمر عملية TCT في غضون 3 ساعات بعد التحضير. تأكد من أن مادة بدء تشغيل الخلايا التائية ستكون جاهزة.
4. إثراء الخلايا التائية
- عند ظهور شاشة نقل منتج الخلية ، ابدأ في إذابة منتج الخلايا التائية المحفوظة بالتبريد.
ملاحظة: يتراوح الحجم المقبول للخلايا التائية التي يمكن إضافتها إلى مجموعة الأنابيب من 50 إلى 280 مل. والحد الأقصى لعدد الخلايا المستهدفة (مجموع خلايا CD4+ وCD8+) هو 3 × 109، والحد الأقصى لعدد الخلايا عبر الوطنية هو 2 × 1010. - انقل الخلايا المذابة إلى كيس نقل سعة 150 مل. لحام معقم كيس النقل إلى كيس التطبيق لمجموعة الأنابيب.
- قم بإزالة عينة من حقيبة التطبيق باستخدام حقيبة مراقبة الجودة وقم بإجراء عدد الخلايا.
- قم بتوصيل قوارير الكاشف CD4 و CD8.
- ابدأ عملية التحديد (إثراء الخلايا التائية).
- بعد التخصيب ، قم بإزالة عينة من الخلايا المحددة CD4 + / CD8 + من حقيبة مراقبة الجودة الخاصة بحقيبة إعادة التطبيق لعدد الخلايا وقياس التدفق الخلوي وتحليل حجم الخلية.
ملاحظة: هناك حاجة إلى نتيجة عدد الخلايا للمتابعة إلى الخطوة التالية.
5. البديل: بدءا من الخلايا المحددة CD4 + / CD8 +
- قم بإعداد الوسيط كما هو موضح في الخطوة 3.2. ليست هناك حاجة إلى مخزن مؤقت للمعالجة.
- قم بتشغيل المعالج وحدد زراعة الخلايا التائية باستخدام تثبيت TS (3) على شاشة إعداد العملية . اتبع التعليمات والمطالبات التي تظهر على الشاشة.
- باتباع التعليمات التي تظهر على الشاشة ، قم بتجهيز مجموعة الأنابيب بوسيط بدلا من معالجة المخزن المؤقت.
- عندما تظهر شاشة "تحضير منتج خلية توصيل الزراعة" ، ابدأ في إذابة الخلايا التائية المحددة CD4 + / CD8 +.
ملاحظة: الحد الأدنى لعدد الخلايا التائية (مجموع خلايا CD4+ وCD8+ T) للعملية هو 1.0 × 108. - انقل الخلايا إلى كيس نقل سعة 150 مل وخففها بحجم متوسط إلى نهائي قدره 50 مل.
- لحام معقم تعليق الخلية بحقيبة إعادة تطبيق الجهاز.
- قم بإزالة عينة من الخلايا المحددة CD4 + / CD8 + من حقيبة مراقبة الجودة الخاصة بحقيبة إعادة التطبيق لتحليل عدد الخلايا وحجم الخلية.
6. إعداد الثقافة وبرمجة مصفوفة النشاط
- أدخل تركيز الخلية ورقم البدء المطلوب (1-2 × 108 خلايا T).
ملاحظة: ستقوم الأداة تلقائيا بضخ الحجم المناسب من كيس إعادة التطبيق إلى غرفة الثقافة وضبط الحجم النهائي على 70 مل. - قم بتوصيل قارورة من كاشف التنشيط وفقا للتعليمات التي تظهر على الشاشة.
- أدخل 5٪ لتركيز CO2 و 39 درجة مئوية لدرجة حرارة غرفة الاستزراع.
ملاحظة: توصي الشركة المصنعة بإدخال 39 درجة مئوية أو قيمة تمت معايرتها خصيصا للجهاز. - قم بإعداد مصفوفة النشاط. استخدم بروتوكول التغذية المحسن كنقطة انطلاق وقم بتعديل الخطوات الفردية داخل البروتوكول إلى المواصفات المحددة من قبل المستخدم (الشكل 2).
- تأكد من أن وقت نشاط النقل هو 24 ساعة بعد البذر (اليوم 1).
- تأكد من أن وقت نشاط الغسيل الثقافي هو 48 ساعة بعد التحويل (اليوم 3).
- اضبط وقت تنشيط شاكر (نوع الخلط 2) على 30 دقيقة بعد بدء غسل الثقافة.
- احذف أي أنشطة لتبادل الأكياس المتوسطة وتبادل أكياس النفايات .
- المس موافق على الشاشة لبدء الزراعة.
- احتفظ بالتبريد بأي خلايا CD4 + / CD8 + محددة متبقية في حقيبة التطبيق لاستخدامها في المستقبل ، إذا لزم الأمر.
7. اليوم 1: نقل الخلايا التائية
- احسب حجم ناقل الفيروسات العدسية المراد استخدامه بناء على MOI المطلوب.
- استرجع كيس الكاشف سعة 20 مل الذي يحتوي على وسط زراعة سعة 10 مل والذي تم تخزينه عند 4 درجات مئوية طوال الليل (الخطوة 3.2). قم بإذابة القارورة المتجهة وانقل الحجم المحسوب في 7.1 إلى كيس الكاشف سعة 20 مل.
ملاحظة: نوصي بتجميد أي متجه متبقي للاحتفاظ به أو للبحث والتطوير. - قم بتعديل مصفوفة النشاط لضبط وقت التحويل على 2 دقيقة في المستقبل. عند المطالبة ، المس موافق لبدء نشاط التحويل.
- قم بلحام كيس المتجه المعقم بمجموعة الأنابيب باتباع التعليمات التي تظهر على الشاشة.
- تعديل مصفوفة النشاط استنادا إلى الوقت الفعلي لبدء نشاط التحويل.
ملاحظة: نقترح بدء النقل في غضون 20-24 ساعة بعد البذر لضمان تنفيذ الأنشطة العملية خلال ساعات العمل العادية.- تأكد من أن وقت غسل الثقافة هو 48 ساعة بعد النقل (اليوم 3).
- اضبط وقت تنشيط شاكر (نوع الخلط 2) على 30 دقيقة بعد غسل الثقافة (اليوم 3).
- تأكد من أن وقت تبادل الوسائط في فترة ما بعد الظهر (1 مساء) من اليوم 6.
8. اليوم السادس: أول عينة قيد المعالجة
- المس زر العينة واتبع التعليمات التي تظهر على الشاشة للحصول على عينة مراقبة الجودة من الثقافة النشطة.
- إجراء عدد الخلايا وقياس التدفق الخلوي وتحليلات حجم الخلية. أرسل 1 مل من العينة لصبغة جرام.
ملاحظة: يجب تكرار عدد الخلايا كل يوم تقريبا لمراقبة نمو الثقافة. - قم بإعداد 2 لتر آخر من وسط الاستزراع (انظر الخطوة 3.2).
- أضف نشاط تبادل الحقائب المتوسطة إلى مصفوفة النشاط ، وتم توقيته لبدء 2 دقيقة في المستقبل. اضبط نشاط Media Exchange للبدء بعد 20 دقيقة من المستقبل. اتبع التعليمات التي تظهر على الشاشة.
ملاحظة: تبادل الوسائط هو استبدال وسيط الاستزراع في غرفة الزراعة. استبدال الأكياس المتوسطة هو استبدال الحقيبة المتوسطة للثقافة المعلقة على الجهاز.
9. يوم الحصاد (في أي مكان من اليوم 7 إلى 13): الحصاد والحفظ بالتبريد
- المس زر العينة واتبع التعليمات التي تظهر على الشاشة للحصول على عينة مراقبة الجودة من الثقافة النشطة.
- افصل عينة مراقبة الجودة إلى ثلاث حصص سعة كل منها 1 مل. استخدم 1 مل لقياس التدفق الخلوي وعدد الخلايا وتحليلات حجم الخلية. استخدم 1 مل للميكوبلازما ، ورقم نسخة المتجه ، وفيروس lentivirus المختص بالتكرار ، واختبار السموم الداخلية. أرسل آخر 1 مل لصبغة جرام.
- تحضير المخزن المؤقت للتركيبة النهائية (محلول بلوري متساوي التوتر معقم مكمل ب 4٪ HSA في كيس سعة 2 لتر ، انظر جدول المواد). وفر 100 مل من هذا المخزن المؤقت لتحضير محلول الحماية من التبريد في خطوة لاحقة.
- قم بتعديل مصفوفة النشاط لضبط وقت نهاية الثقافة على 2 دقيقة في المستقبل وحذف جميع الأنشطة الأخرى المتبقية. اتبع التعليمات التي تظهر على الشاشة لتوصيل المخزن المؤقت للتركيبة النهائية بمجموعة الأنابيب وبدء الحصاد.
ملاحظة: سيقوم المعالج تلقائيا بنقل الخلايا إلى كيس الخلية المستهدفة. سيكون الحجم 100 مل. - خذ عينة 0.5 مل من كيس مراقبة الجودة لكيس الخلية المستهدفة وقم بإجراء عدد الخلايا.
- أغلق كيس الخلية المستهدفة وقم بإزالته من مجموعة الأنابيب. قسم منتج CAR-T إلى جرعات مناسبة واحفظها بالتبريد في مجمد معدل متحكم فيه. قم بتخزين الخلايا في مرحلة بخار خزان تخزين النيتروجين السائل عند ≤ -150 درجة مئوية.
ملاحظة: الصياغة النهائية واقتباس الجرعات خاصة بالبروتوكول. نقدم هنا مثالا يتم فيه حفظ ثلاث جرعات متساوية من الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية وقوارير مراقبة الجودة. انظر القسم 10 للحصول على التفاصيل. - قم بتنزيل بيانات العملية من الجهاز ، وقم بإزالة مجموعة الأنابيب والتخلص منها ، وقم بإجراء إيقاف التشغيل.
10. الحفظ بالتبريد للخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية
ملاحظة: يفترض هذا البروتوكول أن الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية محفوظة بالتبريد بعد تصنيعها وتخزينها حتى يصبح المريض جاهزا للتسريب. في حين أنه من الممكن ضخ الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية المصنعة حديثا ، فإن هذا يزيد من العبء اللوجستي لأنه يتطلب تنسيق تصنيع الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية مع ضخ الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية. قد يكون هذا مشكلة في حالة فشل التصنيع. خاصة إذا كان البروتوكول السريري يتطلب علاجا كيميائيا مستنفدا لمفاويا قبل ضخ CAR-T ، فإننا نقترح بشدة الحجز بالتبريد ، لأن فشل التصنيع قد يعرض المريض لخطر العلاج الكيميائي غير الضروري. قد يطلب المنظمون من الباحثين إثبات أن المنتج يجتاز جميع اختبارات الإطلاق قبل التسريب ، والذي قد يكون من الصعب تحقيقه دون الحفظ بالتبريد.
- من آخر 100 مل من المنتج المحصود ، حدد وأزل الحجم المطلوب لتلبية جرعات CAR-T المطلوبة وقوارير مراقبة الجودة (QC) لإجراء اختبار إطلاق إضافي (على سبيل المثال ، الجدوى) ، والاحتفاظ ، وعينة العقم.
ملاحظة: من الأهمية بمكان وضع استراتيجية محددة بالكامل لتسعير المنتج النهائي. نقترح تصنيع جرعات متعددة من المنتج للسماح بإعادة الحقن ، نظرا لتوفر مواد كافية. يسمح حجم المنتج من 10-20 مل في كيس بالذوبان السريع والتسريب السهل عن طريق دفع الحقنة. يوصى بملء كل منتج بجرعة الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية المطلوبة (على سبيل المثال ، 5 × 106 خلايا CAR-T لكل كيلوغرام أو 2.5 × 108 خلايا CAR-T) لأن هذا سيتجنب الحاجة إلى حسابات الجرعة في يوم التسريب. ويوصى أيضا بحفظ ما لا يقل عن أربع قوارير لمراقبة الجودة بالتبريد ومراعاة احتمال وجود مواد متبقية؛ نقترح حفظ هذه المواد لأنها يمكن أن تكون مفيدة لأغراض البحث والتطوير. - أجهزة الطرد المركزي الخلايا لتقليل الحجم.
- قم بإحضار المنتج (المنتجات) إلى نصف الحجم النهائي المطلوب باستخدام جزء المخزن المؤقت للصياغة النهائية الذي تم وضعه جانبا في الخطوة 9.3.
- قم بإعداد 2x واقي من البرد عن طريق إنشاء محلول DMSO بنسبة 20٪ في المخزن المؤقت للصياغة النهائية.
ملاحظة: يمكن تعديل تركيبة المادة الواقية من البرودة وتركيز DMSO. - أضف 2x من المواد الواقية بالتبريد إلى الخلايا بحجم متساو للحصول على تركيز DMSO نهائي بنسبة 10٪.
ملاحظة: يجب تقليل مدة تعرض المنتج للواقي من التبريد. - املأ أكياس الجرعة وقوارير مراقبة الجودة. إرسال 1 مل للعقم.
ملاحظة: يطلب المنظمون عادة إجراء فحص عقم لمدة 14 يوما على المنتج النهائي. ومع ذلك ، فإن مقايسات العقم السريع آخذة في الظهور. في هذا الوقت ، تعد طريقة الخلاصة الموجزة لمدة 14 يوما هي الأكثر شيوعا. - منتجات الحفظ بالتبريد باستخدام مجمد معدل التحكم فيه.
ملاحظة: يجب التحقق من صحة برنامج التجميد ذي المعدل المتحكم فيه لإنتاج معدل تبريد من ~ -1 درجة مئوية / دقيقة إلى ~ -45 درجة مئوية ، مع تعويض نقطة الانصهار. - قم بتخزين المنتج في مرحلة بخار فريزر النيتروجين السائل فائق الانخفاض عند ≤ -150 درجة مئوية.
11. فحص أداء الإجراء
ملاحظة: خلال عملية TCT ، يتم سحب العديد من عينات مراقبة الجودة من الثقافة النشطة. يوفر الجدول 2 شبكة يمكن أن تساعد القارئ على تنظيم النتائج كمرجع وحساب مقاييس أداء الإجراء. تشير المصطلحات أدناه التي تتكون من حرف ورقم (على سبيل المثال ، "B4") إلى الخلايا الموجودة في شبكة هذا الجدول. تستخدم القيم التالية في حسابات الأداء: B3 = إجمالي الخلايا النواة (TNC) قبل التخصيب ؛ باء - 4 = مرحلة ما بعد تخصيب الشركات عبر الوطنية؛ E2 = مجموع خلايا CD4+ وCD8+ T كنسبة مئوية من إجمالي خلايا منتج الفصادة الأولي ؛ E4 = مجموع خلايا CD4+ وCD8+ T كنسبة مئوية من إجمالي الخلايا بعد الإخصاء؛ G2 = خلايا CD19 + كنسبة مئوية من إجمالي خلايا المنتج الأولي ؛ G4 = خلايا CD19 + كنسبة مئوية من إجمالي الخلايا بعد إثراء CD4 + / CD8 + ؛ B10 = TNC للثقافة النشطة في يوم الحصاد.
الجدول 2: شبكة أداء الإجراء. نحن نقدم هذه الشبكة للمساعدة في تنظيم عمليات الاختبار أثناء العملية اللازمة لحساب إحصائيات أداء الإجراء. تمثل الصفوف العينات التي تم تحليلها في نقاط زمنية مختلفة أثناء الإجراء ويتم تمييزها بالأرقام من 1 إلى 11. يمكن استخدام الصفوف 6-9 لالتقاط النتائج من العينات المأخوذة بعد اليوم السادس من الزراعة ولكن قبل يوم الحصاد. تمثل الأعمدة المعلمات المقاسة ويتم تسميتها بالأحرف A-H. لا يتم تطبيق الحقول المظللة باللون الرمادي. قد لا تنطبق بعض الحقول الإضافية اعتمادا على ما إذا كان يتم إجراء التخصيب CD4 + / CD8 + كجزء من الإجراء وطول الزراعة. نقترح كتابة "N / A" في تلك الحقول. الاختصارات: TNC = إجمالي عدد الخلايا النواة. مراقبة الجودة = مراقبة الجودة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
- احسب استرداد خلايا CD4 + / CD8 + بعد الاختيار بقسمة العدد الإجمالي لخلايا CD4 + بالإضافة إلى CD8 + T بعد التخصيب على إجمالي عدد خلايا CD4 + بالإضافة إلى CD8 + T قبل التخصيب باستخدام المعادلة (1).
CD4 + / CD8 + استعادة الخلايا التائية =
(1) - احسب استنفاد خلايا CD19+ بعد التخصيب بقسمة العدد الإجمالي لخلايا CD19+ بعد التخصيب CD4+/CD8+ على إجمالي عدد خلايا CD19+ قبل التخصيب. نظرا لأنه من المتوقع أن يكون هذا الرقم صغيرا جدا ، فأبلغ عن لوغاريتم هذا الكسر كما هو موضح في المعادلة (2):
استنفاد خلية السجل CD19 = السجل10
(2) - احسب إجمالي نمو الطية بقسمة إجمالي عدد الخلايا في المستزرع النشط عند الحصاد على عدد الخلايا البذرية باستخدام المعادلة (3):
إجمالي نمو الطيات =
(3) - احسب متوسط النمو اليومي بأخذ جذر النمو الكلي للطية فيما يتعلق بيوم الحصاد باستخدام المعادلة (4):
متوسط النمو اليومي = يوم الحصاد √ (إجمالي نمو الطيات) (4)
(1)
(2)
(3)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وترد أدناه في الجدول 3 نتائج عمليات التشغيل الثلاث الأولى لتصنيع CAR-T في تجربة NCT05480449. تم الحفاظ على المواد الأولية ، والناقل ، والسيتوكينات المستنبتة ، وتركيزات مصل AB متسقة لكل تشغيل. تم حصاد المنتجات في اليوم 7 أو 8. كان متوسط نمو الخلايا اليومي 46٪ (زيادة في إجمالي عدد الخلايا) ، مما يشير إلى أن عملية TCT كانت فعالة في تعزيز توسع الخلايا. تشير هذه النتائج إلى أن المعالج يمكنه إنتاج منتجات خلايا CAR-T متسقة وقابلة للتكرار.
تظهر نتائج اختبار المنتج النهائي ، الملخصة في الجدول 4 ، أن الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية اجتازت معايير مراقبة الجودة. كانت صلاحية الخلية بين 88٪ و 94٪ ، وكانت نقاء الخلايا التائية CD3 89-93٪. الأهم من ذلك ، لم يكن من الممكن اكتشاف السموم الداخلية ، والميكوبلازما ، والعقم ، والفيروس العدسي المختص بالتكرار ، وخلايا اللوكيميا المتبقية. تؤكد هذه النتائج أن عملية TCT تنتج خلايا CAR-T عالية الجودة تلبي المعايير التنظيمية للاستخدام السريري.
تم تطوير ثلاث لوحات لقياس التدفق الخلوي لهذا الإجراء (الشكل 3). وهي تشمل لوحة CD4 / CD8 لاختبار النسبة المئوية لخلايا CD4 + و CD8 + T قبل وبعد التخصيب ، ولوحة CD19 CAR-T لاختبار كفاءة النقل ، ولوحة CD3 / CD19 لتحديد صلاحية ومحتوى خلايا اللوكيميا المتبقية (CD19 +) في المنتج النهائي. تؤكد نتائج هذه الألواح نجاح تصنيع الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية وغياب خلايا اللوكيميا المتبقية في المنتج النهائي.
بشكل عام ، تشير النتائج إلى أن عملية TCT يمكن أن تنتج منتجات خلايا CAR-T متسقة وعالية الجودة مناسبة للاستخدام السريري.
الشكل 3: مقايسات قياس التدفق الخلوي. تم تصوير استراتيجية البوابات المستخدمة لتحليل قياس التدفق الخلوي لكل لوحة. يتم رسم البوابات كصناديق سوداء أو علامات حذف وتصنيفها ، وتشير الأسهم الزرقاء إلى اتجاه البوابة. (أ) لوحة CD4/CD8. تعرف الخلايا البائية بأنها المجموعة الفرعية CD19+ والخلايا التائية على أنها المجموعة الفرعية CD3+ للبوابة الليمفاوية. خلايا CD4+ وCD8+ T هي مجموعات فرعية من بوابة الخلايا التائية. (ب) لوحة CD19 CAR-T. يتم تعريف خلايا CAR+ T على أنها مجموعة فرعية CD19-CAR+ من خلايا CD3+ T. بالإضافة إلى ذلك، يتم تعداد المجموعات الفرعية CD4+ وCD8+ التي هي CD19 CAR+. (ج) لوحة CD3/CD19. هذه اللوحة مطابقة للوحة CD4 / CD8 ، باستثناء أنها تحذف علامات CD4 و CD8. الاختصارات: SSC-A = منطقة التشتت الجانبي; الليمفاوية = الخلايا الليمفاوية. CD19-CAR = مستقبلات مستضد خيمري خاصة ب CD19 ؛ 7AAD = 7-أمينوأكتينومايسين د. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| ركض # | مواد البداية | المتجه | ثقافة السيتوكينات | AB مصل ٪ | TNC النهائي | إجمالي الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية المحصودة | إجمالي نمو الطيات | متوسط النمو اليومي | يوم الحصاد | ||
| 1 | صبور الخلايا التائية ، الفصادة ، محفوظة بالتبريد |
هوكارت19 | IL2 | 5% | 2.75x109 | 2.24x108 | 14 | 45% | 7 | ||
| 2 | صبور الخلايا التائية ، الفصادة ، محفوظة بالتبريد |
هوكارت19 | IL2 | 5% | 4.15x109 | 1.14x108 | 21 | 46% | 8 | ||
| 3 | صبور الخلايا التائية ، الفصادة ، محفوظة بالتبريد |
هوكارت19 | IL2 | 5% | 4.20x109 | 8.40x107 | 21 | 46% | 8 | ||
الجدول 3: المعلمات وخصائص النمو لثلاث عمليات تصنيع CAR-T على نطاق سريري. يتم عرض تفاصيل حول ظروف الاستزراع والنمو ويوم الحصاد لأول ثلاث عمليات تصنيع للمرضى باستخدام المعالج للتجربة السريرية NCT05480449. huCART19 ، ناقل CAR المضاد للفيروسات الموجهة من قبل CD19. لاحظ أن كفاءة النقل وقابلية الصلاحية لهذه المنتجات موضحة في الجدول 4. الاختصارات: خلايا CAR-T = الخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري ؛ TNC = إجمالي الخلايا ذات النواة.
| اختبار الإصدار | ||||||||||
| تحليل | صلاحية الخلية | CD3 ٪ | الذيفان الداخلي | ميكو بلازما | كفاءة النقل | خلايا سرطان الدم المتبقية | يوم العقم 14 | تسلسل الحمض النووي المتجه لكل خلية | تسلسل الحمض النووي المتجه لكل خلية منقولة | النسخ المتماثل فيروس Lentivirus المختصة |
| مواصفات | ≥ 70٪ | ≥ 80٪ | ≤ 3.5 الاتحاد الأوروبي / مل |
سالب | ≥ 2 ٪ | < 1 ٪ | لا نمو | نتيجة التقرير | 0.04-8 نسخ / خلية محولة |
< 50 نسخ / μغرام الحمض النووي |
| النتائج | ||||||||||
| تشغيل 1 | 90 | 89 | <0.4 | سالب | 36 % | لا الكشف عن |
لا نمو |
1.04 | 2.89 | لا الكشف عن |
| تشغيل 2 | 88 | 93 | <0.4 | سالب | 39 % | لا الكشف عن |
لا نمو |
1.16 | 2.97 | لا الكشف عن |
| تشغيل 3 | 94 | 91 | <0.4 | سالب | 18 % | لا الكشف عن |
لا نمو |
0.43 | 2.39 | لا الكشف عن |
الجدول 4: اختبارات المنتج النهائي ومواصفات الإصدار. المواصفات الموضحة في هذا الجدول هي للتجربة السريرية NCT05480449 (IND 28617). تم قياس صلاحية ما بعد الذوبان ، CD3٪ ، وكفاءة النقل ، ومحتوى خلايا اللوكيميا المتبقية عن طريق قياس التدفق الخلوي. تم قياس الذيفان الداخلي باستخدام اختبار كروموجيني قائم على تحلل الخلايا الأميبية مرخص من إدارة الغذاء والدواء. تم إجراء اختبار العقم باستخدام طريقة متوافقة مع USP < 71>. تم قياس الميكوبلازما ، ورقم تسلسل الحمض النووي المتجه لكل خلية ، والفيروس العدسي المختص بالتكرار باستخدام تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (qPCR). تم حساب رقم تسلسل الحمض النووي المتجه لكل خلية محولة بقسمة رقم تسلسل الحمض النووي المتجه على كفاءة النقل. الاختصارات: EU = وحدة السموم الداخلية. IND = دواء جديد بحثي ؛ FDA = إدارة الغذاء والدواء.
الشكل التكميلي S1: الاختبار قبل السريري لخلايا CAR-T المصنعة باستخدام عملية TCT. تم حقن الفئران التي تعاني من نقص المناعة (NSG) بخلايا ابيضاض الدم xenograft المشتقة من المريض في اليوم 0 وعولجت لاحقا بخلايا CAR-T الموجهة ل CD19 المصنعة على المعالج ("التصنيع شبه التلقائي") ، أو خلايا CAR-T الموجهة تقليديا CD19 ("التصنيع القياسي") ، أو المالحة في اليوم 7. (أ، ب) بقاء الفئران المعالجة بخلايا CAR-T شبه الآلية عند مستويين من الجرعة (0.5 × 10 6 أو 2 × 106 خلايا CAR-T) مقارنة بالمحلول الملحي (p < 0.0001 لكلا مستويي الجرعة). (ج) مقارنة الخلايا شبه الأوتوماتيكية مع الخلايا التائية ذات التصنيع القياسي CAR-T عند مستوى جرعة معروف بأنه غير علاجي للخلايا القياسية (0.5 × 106 خلايا CAR-T). كان البقاء على قيد الحياة أفضل بكثير في الفئران المعالجة بالخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية من المعالج (p = 0.001). (د) مقارنة الخلايا شبه الأوتوماتيكية مع الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية القياسية عند مستوى جرعة معروف بأنه علاجي للخلايا التائية CD19 CAR-T القياسية. لم يكن البقاء على قيد الحياة مختلفا بشكل كبير (p = 0.4). ه: مقارنة الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية من المعالج عند مستويي الجرعة. لوحظ تأثير جرعة كبير مع بقاء أفضل في الفئران المعالجة بخلايا 2 × 106 huCART19 (p = 0.007). احتوت كل مجموعة على 5 فئران. الاختصارات: NSG = nعلى مرضى السكري الذين يعانون من السمنة المفرطة severe مجتمعة نقص المناعة زعمة; TCT = نقل الخلايا التائية ؛ CAR-T = الخلايا التائية لمستقبلات المستضد الوهمي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي S2: مقارنة بين النمو والانتقال الفيروسي للخلايا التائية البشرية المزروعة في وسط مكمل بالكثير من مصل AB البشري. (أ) توسع الخلايا التائية البشرية غير المنقولة (UTD) أو المنقولة بناقل الفيروسات العدسية CD19 CAR-T (CAR19) في الثقافات المكملة بثلاث مجموعات مختلفة من مصل AB البشري (7J أو 22A أو 21J). كانت معدلات النمو لإحدى القطع (22A) أكبر بكثير من معدلات النمو في المجموعتين الأخريين. (ب) متوسط النسبة المئوية (3 تكرارات) لخلايا CAR19 + في المجموعات السكانية الفرعية CD3 + و CD3 + / CD4 + أو CD3 + / CD8 + للخلايا التائية الموسعة خارج الجسم الحي المشتقة من متبرعين أصحاء. لاحظ أن الاختلافات في معدلات النمو لا يبدو أنها تؤثر على قدرة الخلايا على تناول فيروس lentivirus كما هو محدد من خلال تحليل التدفق الخلوي للخلايا من الثقافات الموسعة. كانت كفاءة نقل الخلايا التائية والمجموعات السكانية الفرعية CD4 + و CD8 + متسقة من ثقافة إلى أخرى. تمثل أشرطة الخطأ الانحرافات المعيارية ل 3 ثقافات متكررة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
برز العلاج بالخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية كنهج علاجي واعد للخلايا البائية والأورام الخبيثة الأخرى. ومع ذلك ، فإن طرق تصنيع الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية التقليدية لها العديد من القيود ، مثل التكلفة العالية ، والإنتاج كثيف العمالة ، والخطوات المفتوحة التي تزيد من خطر التلوث. في الآونة الأخيرة ، ظهرت العديد من المنصات شبه الآلية ، بما في ذلك Miltenyi CliniMACS Prodigy ("المعالج") ، لمعالجة هذه القيود. تشمل عملية نقل الخلايا التائية (TCT) ، المدمجة في المعالج الموصوف في هذه المخطوطة ، إثراء الخلايا التائية ، والتنشيط ، والنقل الفيروسي ، وتوسيع الثقافة ، والحصاد في نظام مغلق. يتم استخدام منصات معالج الخلايا الآلية المتنافسة على نطاق أقل في هذا الوقت ولكن قد يكون لديها مراقبة أفضل أثناء العملية لمعلمات الثقافة ، أو المعدات المواتية أو تكلفة المواد ، أو بصمة أصغر ، مما قد يسمح باستخدامها في خزانة السلامة البيولوجية بدلا من مساحة غرف الأبحاث المخصصة. من المهم اختيار نظام أساسي مناسب بشكل مثالي لتطبيق وبيئة معينة.
يتمثل أحد القيود الكبيرة على العلاجات الخلوية والجينية مثل العلاج بالخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية في التكلفة العالية للمنتجات التجارية ، مما يحد من الوصول إلى العلاج المنقذ للحياة. هذا هو الحال بشكل خاص في البيئات الفقيرة الموارد والبلدان غير العالم الأول. لقد وجدنا أنه من الممكن تصنيع الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية بتكلفة أقل بشكل كبير من منتج تجاري مماثل عند نشر عملية شبه آلية في إعداد مستشفى أكاديمي يحتوي على مرافق غرف الأبحاث الحالية المتوافقة مع ممارسات التصنيع الجيدة (cGMP) في سياق مختبر الخلايا الجذعية ودعم المختبر السريري الذي يمكنه إجراء بعض الاختبارات قيد المعالجة والإطلاق. في ظل هذه الظروف ، نجد أن التكلفة الحدية لإجراء عملية تصنيع ، بما في ذلك المواد والعمالة للتصنيع وجميع الاختبارات قيد المعالجة والإطلاق (ولكن لا تشمل المعدات والمرافق) تبلغ حوالي 30,000 دولار. وتجدر الإشارة إلى أن التكلفة الرأسمالية للمعدات للمعالج أقل من تكلفة منتج تجاري واحد للخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية.
أحد المخاوف المحتملة مع التحول من الطريقة اليدوية إلى الطريقة الآلية هو انخفاض المرونة. لا تزال عملية TCT ، على الرغم من برمجتها بحواجز حماية قوية ، قابلة للتخصيص على نطاق واسع. وتوفر هذه العملية نقاط انطلاق متعددة، بما في ذلك عملية كاملة مع إثراء الخلايا التائية، وعملية كاملة بدون تخصيب (على سبيل المثال، للاستخدام مع الخلايا سابقة التخصيب CD4+/CD8+، انظر القسم 5 من البروتوكول أعلاه)، واستئناف عملية مجهضة. بالإضافة إلى ذلك ، تسمح ميزة مصفوفة النشاط بتخصيص عملية الزراعة بأكملها. مع الاهتمام المتزايد بالتصنيع السريع لمستقبلات المستضدات الخيمرية ، تجدر الإشارة إلى أنه من الممكن تكوين مصفوفة النشاط لبدء الحصاد في وقت مبكر بعد ساعات قليلة من النقل ، إذا رغبت في ذلك. الإجراء السريع له فائدة مزدوجة محتملة تتمثل في تقليل وقت التصنيع ومنتج أكثر فعالية من خلال تجنب التمايز وفقدان النشاط المضاد لسرطان الدم12. علاوة على ذلك ، تم تصميم نوع مختلف من TCT للنواقل غير الفيروسية باستخدام التثقيب الكهربائي ، مما يزيد من مرونة النظام.
يعتمد وقت الحصاد الأمثل للخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية على عوامل مختلفة ، بما في ذلك الجرعة المستهدفة المطلوبة ، وعدد الجرعات المطلوبة ، والحد الأقصى لكثافة الخلايا التي يمكن أن يدعمها وعاء الاستزراع دون المساس بصلاحية الخلية. توصي الشركة المصنعة بعدم تجاوز 5 مليارات خلية بحجم 250 مل. يجب أن يعتمد تحديد الجرعة المستهدفة المطلوبة على البيانات قبل السريرية في نموذج حيواني. على سبيل المثال ، في هذه الدراسة ، استخدمنا فئران NOD scid gamma knockout (NSG) التي تم حقنها بطعم xenografts المشتق من المريض وعولجت بخلايا CAR-T لتقدير أن الجرعة الفعالة ستكون تقريبا بين 2 و 5 ملايين خلية CAR-T لكل كيلوغرام (الشكل التكميلي S1). يمكن أن تكون مراقبة حجم الخلية مفيدة أيضا في تحديد الوقت الأمثل لحصاد الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية. من خلال النظر بعناية في هذه العوامل ، يمكن للباحثين تحسين وقت حصاد الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية لضمان أن المنتج النهائي ذو جودة وفعالية عالية.
يعد تطوير خطة اختبار الإصدار المناسبة مكونا حاسما للحصول على الموافقة على تطبيق IND. نقدم مجموعة من اختبارات الإصدار بما في ذلك مواصفات IND 28617 ، ونعتقد أن هذه ستكون نقطة انطلاق جيدة للمنتجات المماثلة. ومع ذلك، فإن آراء المنظمين تتطور باستمرار، وقد تؤدي الاختلافات في البروتوكول المقدم إلى طلب المنظمين اختبارات مختلفة أو عتبات مواصفات مختلفة. نوصي بشدة بقراءة وثائق الإرشادات التنظيمية الحالية عن كثب مثل معلومات الكيمياء والتصنيع والتحكم (CMC) الخاصة بإدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) لتطبيقات الأدوية الجديدة التجريبية للعلاج الجيني البشري (INDs)13. المبدأ العام هو أن الاختبارات التي تثبت سلامة المنتج يتم تقييمها بشكل أكثر صرامة من الاختبارات التي تثبت الفاعلية. بشكل عام ، يجب التحقق من صحة اختبارات مثل العقم ، والذيفان الداخلي ، والميكوبلازما ، والفيروس العدسي المختص بالتكرار ، ويجب معرفة معايير أدائها. في المقابل ، يتم تقليل التأكيد نسبيا على اختبارات الفاعلية في تجارب المرحلة المبكرة وقد لا تحتاج إلى التحقق من صحتها بالكامل. ينص مشروع مبدأ توجيهي حديث لإدارة الغذاء والدواء على أن "التعبير الجيني المحول وحده كمقياس للقوة قد يكون كافيا لدعم دراسات IND في المرحلة المبكرة"14. بالإضافة إلى ذلك ، يجب التحقق من صحة الاختبارات المستخدمة لتحديد الجرعة. قد يكون هذا مشكلة بالنسبة لأهداف CAR الجديدة التي قد لا يكون هناك أي مقايسات تدفق موحدة أو مواد مرجعية. في هذه الحالة ، تقترح إدارة الغذاء والدواء الأمريكية أن "المادة المرجعية للفحص قد تكون مجموعة مميزة جيدا من منتج العلاج الجيني نفسه". 13 على سبيل المثال ، أنشأنا تحكما إيجابيا لفحص تدفق CD19 CAR باستخدام خلايا CAR-T من عمليات التشغيل الهندسية المبكرة.
يمكن أن يكون تطوير وتحسين عملية التصنيع للعلاج بالخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية أمرا صعبا ويستغرق وقتا طويلا، كما شهدنا في عملنا. واجهنا العديد من النكسات ، بما في ذلك مشاكل التلوث البكتيري. نحن ندعو بشدة إلى استخدام طريقة الذوبان الجاف لإذابة الخلايا ، لأن الحمامات المائية يمكن أن تزيد من خطر التلوث. بسبب الزراعة ، حتى اللقاح الصغير يمكن أن يؤدي إلى تلوث صريح ، مما يؤدي إلى منتج غير قابل للاستخدام. بالإضافة إلى ذلك ، نوصي بالتخطيط اللوجستي لاختبار الإصدار ، والذي قد يتضمن عمليات تحقق إضافية والتعاقد مع أطراف خارجية لضمان الاختبار الدقيق وفي الوقت المناسب. عنصر آخر مهم عند تطوير عملية تصنيع CAR-T هو تحسين كفاءة النقل. يجب أن يتضمن تطبيق IND بيانات لإثبات قوة الناقل الفيروسي. لتلبية هذا المطلب وفي نفس الوقت الحصول على معلومات لتحسين MOI ، نوصي بشدة بإجراء معايرة صغيرة النطاق للناقل الفيروسي السريري على الخلايا التائية البشرية. من المهم أيضا النظر في استخدام الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية المصنعة تقليديا كعنصر تحكم في تجارب الفئران (كما هو موضح في الشكل التكميلي S1). قد يكون الحصول على هذه الخلايا صعبا ويتطلب تخطيطا دقيقا. عامل آخر يجب مراعاته هو استخدام مصل AB البشري ، وهو كاشف غير محدد بشكل جيد يمكن أن يكون له تأثير كبير على نمو الخلايا والخصائص الأخرى للمنتج. لمعالجة هذا الأمر ، نقترح اختبار مجموعات متعددة من مصل AB وإجراء تجارب صغيرة النطاق لتقييم التأثيرات الخاصة بالكثير على نمو الخلايا (الشكل التكميلي S2). بمجرد تحديد مجموعة مناسبة ، يجب شراء كمية كبيرة بما يكفي لضمان الاتساق عبر مجموعة التجربة وتقليل مخاطر آثار الدفعات في نتائج المرضى التي ترجع إلى التغيرات في مجموعة المصل.
باختصار ، يوفر المعالج وعملية TCT المضمنة طريقة تصنيع يمكنها معالجة العديد من قيود إجراءات تصنيع CAR-T الحالية ، بما في ذلك التكاليف المرتفعة والإنتاج كثيف العمالة وخطوات المعالجة المفتوحة. من خلال توفير نظام مغلق وشبه آلي ، فإن هذا المعالج لديه القدرة على تحسين توافر العلاج بالخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية والقدرة على تحمل تكاليفه. يمكن أن تستوعب التصنيع السريع والنواقل غير الفيروسية ، مما يجعلها بديلا مرنا لطرق التصنيع التقليدية. من خلال النظر بعناية في عوامل مثل الجرعة المستهدفة المطلوبة ، والحد الأقصى لكثافة الخلايا ، وتأثيرات مصل AB البشري على نمو الخلايا ، يمكن للباحثين تحسين وقت حصاد الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية لضمان جودة وفعالية المنتج النهائي. على الرغم من أن العملية يمكن أن تكون معقدة وشاقة ، إلا أن التخطيط اللوجستي لاختبار الإطلاق والقضاء على مصادر التلوث يمكن أن يساعد في تخفيف المخاطر وضمان نجاح تصنيع الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية. بشكل عام ، تقدم عملية TCT وسيلة واعدة للعلاج بالخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية ، مع إمكانية التغلب على القيود الحالية وتحسين إمكانية وصول المرضى ، مما يفيد مرضى السرطان في نهاية المطاف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
تلقى كل من S.K. و S.G. و Y.W. دعما بحثيا من Miltenyi Biotec.
Acknowledgments
يود المؤلفون الاعتراف بمساهمات العديد من الأفراد والمنظمات في هذا العمل. قدم مختبر العلاج بالخلايا والجينات ومختبر بن للدراسات الانتقالية والمترابطة مساعدة قيمة في تطوير العملية والتحضير لتقديم IND. ساهمت ميليسا فارغيز وأماندا دينوفيا في تطوير العملية والتحضير لتقديمات IND التي تقوم عليها هذه المخطوطة. تم دعم هذا العمل من خلال منحة تسريع العلاج بالخلايا والجينات التعاونية لمستشفى الأطفال في فيلادلفيا. يود المؤلفون أيضا أن يشكروا Miltenyi Biotec على دعمهم الفني والبحثي. الشكل 1 مشمول بحقوق الطبع والنشر © 2023 Miltenyi Biotec B.V. &Co. KG ؛ كل الحقوق محفوظة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 x 75 borosilicate tubes | Charles River | TL1000 | |
| 20 mL Reagent Bag | Miltenyi Biotec | 170-076-631 | |
| 50 mL Conical Tube | Fisher | 05-539-10 | |
| 150 mL Transfer Set | Fenwal | 4R2001 | |
| 2,000 mL Transfer Set | Fenwal | 4R2041 | |
| 7AAD | Fisher Scientific | BDB559925 | |
| Alcohol Prep | Tyco/Healthcare | ||
| Bag Access | Medline | 2300E-0500 | |
| CD19 APC-Vio770 REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-113-643 | |
| CD19 CAR Detection Reagent Biotin | Miltenyi Biotec | 130-129-550 | |
| CD19 PE | BD | 555413 | |
| CD3 APC | BD | 340440 | |
| CD4 VioBright FITC REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-113-229 | |
| CD45 VioBlue REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-110-637 | |
| CD8 APC-Vio770 REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-110-681 | |
| Cellometer Reference Beads 10um | Nexcelom | B10-02-020 | |
| Cellometer Reference Beads 15um | Nexcelom | B15-02-010 | |
| Cellometer Reference Beads 5um | Nexcelom | B05-02-050 | |
| Cellometer Slides | Nexcelom | CHT4-SD100-002 | |
| CliniMACS CD4 GMP MicroBeads | Miltenyi Biotec | 276-01 | The CD4 reagent |
| CliniMACS CD8 GMP MicroBeads | Miltenyi Biotec | 275-01 | The CD8 reagent |
| CliniMACS PBS/EDTA Buffer | Miltenyi Biotec | 130-021-201 | The buffer |
| DMSO | Origen | CP-10 | |
| Freezing Bag 50 mL | Miltenyi Biotec | 200-074-400 | |
| Freezing Vial, 1.8 mL | Nunc | 12565171N | |
| Freezing Vial, 4.5 mL | Nunc | 12565161N | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | Sterile filtered, heat inactivated | |
| Human Serum Albumin 25% | Grifols | 68516-5216-1 | |
| Human Serum Albumin 5% | Grifols | 68516-5214-1 | |
| MACS GMP Recombinant Human IL-2 | Miltenyi Biotec | 170-076-148 | The cytokines |
| MACS GMP T Cell TransAct | Miltenyi Biotec | 200-076-202 | The activation reagent |
| MycoSeq Mycoplasma Detection Kit | Life Technologies | 4460623 | |
| Needles, Hypodermic 14G | Medline | SWD200573 | |
| Needles, SlideSafe 18G | BD | B-D305918 | |
| Pipet tips, 2-200 μL, individually wrapped | Eppendorf | 022492209 | |
| Pipet tips, 50-1000 μL, individually wrapped | Eppendorf | 022492225 | |
| Pipets 10 mL | Fisher | 13-678-27F | |
| Pipets 25 mL | Fisher | 13-675-30 | |
| Pipets 5 mL | Fisher | 13-678-27E | |
| Plasmalyte-A | Baxter | 2B2544X | The electrolyte solution |
| Prodigy TS520 Tubing Set | Miltenyi Biotec | 170-076- 600 | The tubing set |
| Sterile Field | Medline | NON21001 | |
| Streptavidin PE-Vio770 | Miltenyi Biotec | 130-106-793 | |
| Syringe 1 mL | BD | 309628 | |
| Syringe 10 mL | BD | 302995 | |
| Syringe 3 mL | BD | 309657 | |
| Syringe 30 mL | BD | 302832 | |
| Syringe 50 mL | BD | 309653 | |
| TexMACS GMP Medium | Miltenyi Biotec | 170-076-306 | The medium |
| Triple Sampling Adapter | Miltenyi Biotec | 170-076-609 | |
| Viral Vector | CHOP Clinical Vector Core | huCART19 | |
| Equipment | |||
| Biological Safety Cabinet | The Baker Co | ||
| Cellometer Auto 2000 | Nexcelom | ||
| CliniMACS Prodigy | Miltenyi Biotec | 200-075-301 | The processor |
| Controlled Rate Freezer | Planer/Kryosave | ||
| Endosafe nexgen-PTS150K | Charles River | ||
| Mettler Balance | Mettler | ||
| Refrigerated Centrifuge | Thermo Fisher | ||
| Refrigerated Centrifuge | Fisher Sci | ||
| SCD Sterile Tubing Welder | Terumo | ||
| Sebra Tube Sealer | Sebra | ||
| Varitherm | Barkey | The dry thaw device | |
| XN-330 Hematology Analyzer | Sysmex |
References
- Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
- Shah, N. N., et al. Bispecific anti-CD20, anti-CD19 CAR T cells for relapsed B cell malignancies: A phase 1 dose escalation and expansion trial. Nature Medicine. 26 (10), 1569-1575 (2020).
- Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
- Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
- Maude, S. L., et al. Efficacy of humanized CD19-targeted chimeric antigen receptor (CAR)-modified T cells in children and young adults with relapsed/refractory acute lymphoblastic leukemia. Blood. 128 (22), 217 (2016).
- Mock, U., et al. Automated manufacturing of CAR-T cells for adoptive immunotherapy using CliniMACS Prodigy. Cytotherapy. 18 (8), 1002-1011 (2016).
- Fernández, L., et al. GMP-compliant manufacturing of NKG2D CAR memory T cells using CliniMACS Prodigy. Frontiers in Immunology. 10 (10), 2361 (2019).
- Zhu, F., et al. Closed-system manufacturing of CD19 and dual-targeted CD20/19 chimeric antigen receptor T Cells using CliniMACS Prodigy device at an academic medical center. Cytotherapy. 20 (3), 394-406 (2018).
- Zhang, W., Jordan, K. R., Schulte, B., Purev, E. Characterization of clinical grade CD19 chimeric antigen receptor T cells produced using automated CliniMACS prodigy system. Drug Design, Development and Therapy. 12 (12), 3343-3356 (2018).
- Abou-El-Enein, M., et al. Scalable manufacturing of CAR T cells for cancer immunotherapy. Blood Cancer Discovery. 2 (5), 408-422 (2021).
- Miltenyi Biotec. CliniMACS Prodigy User Manual. , https://static.miltenyibiotec.com/asset/150655405641/document_h0fd9i4al17q32uhfuf4h7lu25?content-disposition=inline (2021).
- Ghassemi, S., et al. Rapid manufacturing of non-activated potent CAR T cells. Nature Biomedical Engineering. 6 (2), 118-128 (2022).
- U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. Chemistry, manufacturing, and control (CMC) information for human gene therapy investigational new drug applications (INDs) guidance for industry. , https://www.fda.gov/media/113760/download (2020).
- U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. Considerations for the development of chimeric antigen receptor (CAR) T cell products draft guidance for industry. , https://www.fda.gov/media/156896/download (2022).
