Summary
Dieser Artikel beschreibt den Herstellungsprozess für chimäre Antigenrezeptor-T-Zellen für den klinischen Einsatz, insbesondere unter Verwendung eines automatisierten Zellprozessors, der in der Lage ist, virale Transduktion und Kultivierung von T-Zellen durchzuführen. Wir geben Empfehlungen und beschreiben Fallstricke, die bei der Prozessentwicklung und Durchführung einer frühen klinischen Studie berücksichtigt werden sollten.
Abstract
Chimäre Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen stellen einen vielversprechenden immuntherapeutischen Ansatz für die Behandlung verschiedener maligner und nicht-maligner Erkrankungen dar. CAR-T-Zellen sind genetisch veränderte T-Zellen, die ein chimäres Protein exprimieren, das ein Ziel auf der Zelloberfläche erkennt und daran bindet, was zur Abtötung der Zielzelle führt. Herkömmliche Methoden zur Herstellung von CAR-T-Zellen sind arbeitsintensiv, teuer und können das Risiko einer Kontamination bergen. Der CliniMACS Prodigy, ein automatisierter Zellprozessor, ermöglicht die Herstellung von Zelltherapieprodukten im klinischen Maßstab in einem geschlossenen System, wodurch das Risiko einer Kontamination minimiert wird. Die Verarbeitung erfolgt halbautomatisch unter der Steuerung eines Computers und minimiert so die menschliche Beteiligung am Prozess, was Zeit spart und Variabilität und Fehler reduziert.
Dieses Manuskript und Video beschreibt den T-Zell-Transduktionsprozess (TCT) zur Herstellung von CAR-T-Zellen mit diesem Prozessor. Der TCT-Prozess umfasst die Anreicherung, Aktivierung, Transduktion mit einem viralen Vektor, Expansion und Ernte von CD4+/CD8+ T-Zellen. Mit Hilfe der Activity Matrix, einer Funktionalität, die die Reihenfolge und das Timing dieser Schritte ermöglicht, kann der TCT-Prozess umfangreich angepasst werden. Wir bieten einen Überblick über die Herstellung von CAR-T-Zellen in Übereinstimmung mit der aktuellen Good Manufacturing Practice (cGMP) und besprechen die erforderlichen Freisetzungstests und präklinischen Experimente, die einen IND-Antrag (Investigational New Drug) unterstützen. Wir demonstrieren die Machbarkeit und diskutieren die Vor- und Nachteile eines halbautomatischen Prozesses für die klinische Herstellung von CAR-T-Zellen. Abschließend beschreiben wir eine laufende, von Prüfärzten initiierte klinische Studie, die auf pädiatrische B-Zell-Malignome abzielt [NCT05480449] als Beispiel dafür, wie dieses Herstellungsverfahren in einem klinischen Umfeld angewendet werden kann.
Introduction
Der adoptive Transfer von T-Zellen, die einen chimären Antigenrezeptor (CAR) exprimieren, hat eine bemerkenswerte Wirksamkeit bei der Behandlung von Patienten mit refraktären B-Zell-Malignomen gezeigt 1,2,3,4,5. Die traditionellen Herstellungsmethoden für CAR-T-Zellen sind jedoch arbeitsintensiv, zeitaufwändig und erfordern hochqualifizierte Techniker, um hochspezialisierte Schritte durchzuführen. Der traditionelle Herstellungsprozess eines autologen CAR-T-Zellprodukts umfasst beispielsweise Dichtegradientenzentrifugation, Elutriation oder magnetische Trennung zur Anreicherung von T-Zellen, Aktivierung und Transduktion mit einem viralen Vektor in einem sterilen Kolben und Expansion in einem Bioreaktor vor der Ernte und Formulierung. In jüngster Zeit sind verschiedene Systeme entstanden, die darauf abzielen, diesen Prozess teilweise zu automatisieren. Zum Beispiel ist der Miltenyi CliniMACS Prodigy (im Folgenden als "Prozessor" bezeichnet) eine automatisierte Zellverarbeitungsvorrichtung, die viele dieser Schritte in automatisierter Weise ausführen kann 6,7,8,9. Eine ausführliche Erörterung traditioneller und automatisierter CAR-T-Fertigungsmethoden wird in einem kürzlich erschienenen Übersichtsartikel10 vorgestellt.
Der Prozessor baut auf der Funktionalität des CliniMACS Plus auf, einem von der US-amerikanischen Food and Drug Administration (FDA) zugelassenen Medizinprodukt für die Verarbeitung von hämatopoetischen Vorläuferzellen. Der Prozessor enthält eine Zellkultivierungseinheit, die das automatische Waschen, Fraktionieren und Kultivieren von Zellen ermöglicht (Abbildung 1). Der T-Zell-Transduktionsprozess (TCT) ist ein voreingestelltes Programm innerhalb des Prozessorgeräts, das die manuelle Herstellung von CAR-T-Zellen weitgehend nachbildet. TCT ermöglicht eine anpassbare Zellverarbeitung über eine grafische Benutzeroberfläche (die "Aktivitätsmatrix", Abbildung 2). Da der Prozessor viele Schritte automatisiert und die Funktionalität mehrerer Geräte in einem Gerät konsolidiert, erfordert er weniger Schulung und spezielle Fähigkeiten zur Fehlerbehebung von Technologen. Da alle Schritte in einem geschlossenen Einweg-Schlauchsatz durchgeführt werden, kann der Prozessor in Einrichtungen mit einer weniger strengen Luftbehandlungsinfrastruktur betrieben werden, als dies für einen offenen Herstellungsprozess akzeptabel wäre. So betreiben wir den Verarbeiter in einer Anlage, die nach ISO-Klasse 8 (vergleichbar mit EU-Klasse C) zertifiziert ist.
Abbildung 1: Herstellung von CAR-T-Zellen mit dem T-Zell-Transduktionssystem. Abgebildet ist der Prozessor mit dem installierten Schlauchset. Das Schlauchset ermöglicht den Anschluss anderer Komponenten wie Beutel mit Verarbeitungspuffer, Nährmedium und lentiviralem Vektor durch steriles Schweißen. Sobald das Leukaphereseprodukt in den Anwendungsbeutel gegeben wurde, kann es mit T-Zell-Auswahlperlen markiert, durch die Separationsspalte geleitet und dann in den Wiederaufnahmebeutel überführt werden. Die ausgewählten Zellen werden dann zur Kultivierung an die Kultivierungseinheit des Instruments geleitet und mit dem Aktivierungsreagenz aktiviert (siehe Materialtabelle). Das Endprodukt wird im Target-Zellbeutel gesammelt. Während des gesamten Prozesses ist es möglich, Proben zur Qualitätskontrolle aseptisch zu entnehmen. Graue Zahlen innerhalb von Kreisen stellen die nummerierten Ventile am Prozessor dar, die den Flüssigkeitsweg durch den Schlauchsatz leiten. Vervielfältigung mit freundlicher Genehmigung von 11. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Aktivitätsmatrix. Nach der Auswahl und Aktivierung der T-Zellen ist der Rest des Herstellungsprozesses der CAR-T-Zellen vollständig anpassbar. Aktivitäten können hinzugefügt oder gelöscht und für den entsprechenden Tag und die entsprechende Uhrzeit geplant werden, und das Kulturvolumen nach der Aktivität kann angegeben werden (Volumen). Beispielsweise wurde die Transduktionsaktivität so konfiguriert, dass sie an Tag 1 um 10:00 Uhr beginnt, und das Kulturvolumen am Ende der Aktivität wurde auf 100 ml festgelegt. Die Aktivitätsmatrix kann während des gesamten Kultivierungszeitraums bearbeitet werden. Der Status des Prozesses kann auf dem integrierten Bildschirm des Verarbeitungsgeräts überwacht werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Das Ziel dieses Manuskripts ist es, einen detaillierten Überblick über die Herstellung von CAR-T-Zellen mit dem Prozessor zu geben und zusätzlich eine Anleitung zu den In-Prozess- und Produktfreigabetests zu geben, die wahrscheinlich von den Aufsichtsbehörden verlangt werden, um einen Antrag auf Zulassung eines neuen Prüfpräparats (IND) zu genehmigen. Das vorgestellte Protokoll bleibt nahe am empfohlenen Ansatz des Anbieters und ist das zugrunde liegende Protokoll für IND 28617, das derzeit in einer von einem Prüfarzt initiierten klinischen Phase-I/II-Studie evaluiert wird. Diese Studie zielt darauf ab, die Sicherheit und Wirksamkeit der Verwendung dieses Prozessors zur Herstellung humanisierter CD19-gerichteter autologer CAR-T-Zellen für Patienten mit akuter lymphatischer B-Zell-Leukämie (B-ALL) oder lymphoblastischem Lymphom der B-Linie (B-Lly) zu bestimmen [NCT05480449]. Die Studie startete im September 2022 und soll bis zu 89 Patienten im Alter von 0 bis 29 Jahren mit B-ALL oder B-Lly aufnehmen. Wir berichten über einige Herstellungsergebnisse aus dem Versuch im Manuskript.
Wir möchten darauf hinweisen, dass das Manuskript zwar als Protokoll mit zu befolgenden Schritten präsentiert wird, aber als Ausgangspunkt für andere betrachtet werden sollte, um mit der Optimierung ihres eigenen CAR-T-Zellherstellungsprozesses zu beginnen. Eine nicht erschöpfende Liste möglicher Variationen des vorgestellten Protokolls umfasst: Verwendung von frischen anstelle von kryokonservierten T-Zellen als Ausgangsmaterial; Verwendung einer anderen Methode der T-Zell-Anreicherung oder ganz Weglassen; Verwendung verschiedener Medien und Zytokincocktails wie IL7/IL15 anstelle von IL2; Variation der Konzentration des menschlichen AB-Serums oder ganz Weglassen; Zeitpunkt der Transduktion; Verwendung von "Multi-Hit"-Transduktionen; unterschiedliche Rührung, Kulturvolumen und Fütterungsplan; Verwendung verschiedener Methoden des genetischen Transfers, einschließlich der Elektroporation von Nukleinsäuren oder nicht-lentiviralen Vektoren; Verwendung eines anderen endgültigen Formulierungspuffers und/oder Kryoprotektivums; und die Infusion von CAR-T-Zellen frisch anstelle der Kryokonservierung für die Infusion zu einem späteren Zeitpunkt. Diese Schwankungen können einen signifikanten Einfluss auf die zelluläre Zusammensetzung und Wirksamkeit des therapeutischen Arzneimittels haben.
| Gesamter Prozessschritt | Tag des Prozesses | Technische Details | |||
| Anreicherung von Zellen | Tag 0 | Selektion von CD4+/CD8+ T-Zellen | |||
| Zellaktivierung | Aussaat und Aktivierung von T-Zellkulturen | ||||
| Zelltransduktion | Tag 1 | Lentivirale Transduktion (100 ml Kulturvolumen) | |||
| Zellexpansion (gefolgt von der Zellformulierung) | Tag 2 | -- | |||
| Tag 3 | Culture Wash (1 Zyklus); Shaker aktiviert; Das Kulturvolumen erhöht sich auf 200 ml | ||||
| Tag 4 | -- | ||||
| Tag 5 | Futter (50 ml); Das Kulturvolumen erreicht ein Endvolumen von 250 ml | ||||
| Tag 6 | In-Prozess-Probe; Medienaustausch (-125 mL / +125 mL) | ||||
| Tag 7 | Medienwechsel (-150 mL / +150 mL) oder Ernte | ||||
| Tag 8 | In-Prozess-Probe; Medienwechsel (-150 mL / +150 mL) oder Ernte | ||||
| Tag 9 | Medienaustausch (-180 mL / +180 mL) oder Ernte | ||||
| Tag 10 | In-Prozess-Probe; Medienaustausch (-180 mL / +180 mL) oder Ernte | ||||
| Tag 11 | Medienaustausch (-180 mL / +180 mL) oder Ernte | ||||
| Tag 12 | Medienaustausch (-180 mL / +180 mL) oder Ernte | ||||
| Tag 13 | Ernte | ||||
Tabelle 1: Prozesszeitplan und Übersicht. Diese Tabelle fasst die TCT-Prozessschritte zusammen, die in einer aktuellen klinischen Studie eingesetzt werden [NCT05480449]. Der Prozess beginnt mit der Anreicherung der T-Zellen durch CD4+/CD8+-Selektion, Kulturimpfung und Aktivierung an Tag 0, gefolgt von der Transduktion an Tag 1. Die Zellen ruhen 48 Stunden lang, gefolgt von einer Kulturwäsche, einer Erhöhung des Kulturvolumens auf 200 ml und Rühren mit einem Schüttelmechanismus. Am 6. Tag wird die erste In-Prozess-Probe entnommen. Die Zellentnahme erfolgt, sobald genügend Zellen für mindestens drei volle Dosen CAR-T-Zellen (5 × 10 6 CAR-T-Zellen/kg, wenn der Patient <50 kg wiegt, ansonsten 2,5 × 108 CAR-T-Zellen) und Qualitätskontrolltests (~2 × 106 CAR-T-Zellen) zur Verfügung stehen; oder wenn die Kultur insgesamt 4-5 x 109 Zellen erreicht hat. Abkürzungen: TCT = T-Zell-Transduktion; CAR-T = chimäre Antigenrezeptor-T-Zellen; MACS = magnetisch aktivierte Zellsortierung.
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Protocol
Alle Forschungsarbeiten wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien mit Genehmigung durch das Institutional Review Board (IRB) des Krankenhauses durchgeführt, und alle Probanden haben ihre Einwilligung zur Veröffentlichung der im Rahmen der Studie gesammelten Daten gegeben.
ANMERKUNG: Der erste Abschnitt des Protokolls bietet einen allgemeinen Überblick über den CAR-T-Herstellungsprozess. Die restlichen Abschnitte enthalten die Schritt-für-Schritt-Anleitungen. Das Protokoll beschreibt den Arbeitsablauf unter Verwendung der TCT-Softwareversion 1.4, der aktuellen Version zum Zeitpunkt der Erstellung dieses Artikels. Die Benutzeroberfläche anderer Versionen der TCT-Software kann variieren.
1. Prozesszeitplan und -übersicht (Tabelle 1)
- Bereiten Sie sich auf die Prozedur an einem Montag (Tag -1) mit Preflight-Checks vor. Stellen Sie sicher, dass der Prozessor und andere Geräte wie erwartet laufen und dass alle Reagenzien und Verbrauchsmaterialien für den gesamten Produktionslauf verfügbar und auf dem neuesten Stand sind.
- Installieren Sie am Tag 0 das Schlauchset an der Maschine. Zuvor kryokonservierte T-Zellen in einem trockenen Bad auftauen und durch steriles Schweißen mit dem auf dem Gerät installierten Schlauchset verbinden.
HINWEIS: Dieses Protokoll geht davon aus, dass autologe T-Zellen durch Apherese entnommen, kryokonserviert und bis zum Beginn der Herstellung gelagert wurden. Es ist zwar möglich, frisch gesammelte T-Zellen zu verwenden, dies erhöht jedoch den logistischen Aufwand, da die Apheresesammlung mit der Herstellung von CAR-T-Zellen koordiniert werden muss. Wir empfehlen dringend, ein Trocken-Auftau-Verfahren anstelle eines Wasserbades zu verwenden, um das Risiko einer bakteriellen Kontamination zu minimieren. - Markierung von T-Zellen mit CD4- und CD8-Reagenzien (siehe Materialtabelle) und Anreicherung durch magnetische Selektion.
HINWEIS: Es ist möglich, die T-Zell-Anreicherung wegzulassen oder sie vor dem Laden der Zellen auf den Prozessor durchzuführen. Siehe Abschnitt 5 des Protokolls. - Nach der Anreicherung von CD4+/CD8+-Zellen wird eine Probe für eine Zellzählung entnommen. Die Kultur wird mit 1-2 × 108 Zellen in einem Anfangsvolumen von 70 ml Medium (siehe Materialtabelle) besiedelt, ergänzt mit 5 % humanem AB-Serum und rekombinantem humanem IL2 (25 ng/ml).
- Geben Sie ein Fläschchen mit Aktivierungsreagenz (eine kolloidale polymere Nanomatrix, die mit Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern konjugiert ist; siehe Materialtabelle) hinzu, um die T-Zellen zu aktivieren, und inkubieren Sie die Kultur ohne Rühren für 24 Stunden bei 37 ºC in einer 5%igen CO2 -Atmosphäre. Kryokonservieren Sie alle übrig gebliebenen CD4+/CD8+-Zellen als Backup, falls gewünscht.
HINWEIS: Im Falle eines Herstellungsfehlers können übrig gebliebene CD4+/CD8+ ausgewählte Zellen als Ausgangsmaterial verwendet werden. Wenn der Fehler rein technischer Natur ist, wie z. B. Verschmutzung oder Bedienungsfehler, und genügend Zellen übrig bleiben, kann die Verwendung von übrig gebliebenen Zellen für einen zusätzlichen Fertigungslauf in Betracht gezogen werden. Wenn die Qualität des Ausgangsmaterials bedenklich ist, könnte ein neues Aphereseverfahren gerechtfertigt sein. Dies ist jedoch letztlich eine klinische Entscheidung. In beiden Fällen ist ein Herstellungsfehler ein bedeutendes Ereignis, das untersucht und der Sponsor und möglicherweise die Aufsichtsbehörden informiert werden sollten. - Nach 24 h Aktivierung werden T-Zellen mit lentiviralem Vektor bei einer geeigneten Infektionsmultiplizität (MOI) transduziert.
HINWEIS: Es ist wichtig, den lentiviralen Vektortiter zu bestimmen und eine geeignete MOI festzulegen, bevor mit der Herstellung klinischer Produkte begonnen wird. Der Vektortiter sollte durch ein kleines Experiment bestimmt werden, bei dem menschliche primäre T-Zellen in verschiedenen Konzentrationen des Vektors transduziert werden. Zu den Überlegungen für das geeignete MOI gehören die Kosten des Vektors, die gewünschte Transduktionseffizienz und eine akzeptable Vektorkopienzahl. Dieses Protokoll verwendet ein MOI von 30-50%, um die Kosten des Vektors zu minimieren und die durchschnittliche Anzahl der Vektorkopien unter 8 Kopien pro transduzierter Zelle zu halten. - Lösen Sie an Tag 3 die Aktivität "Culture Wash" aus und beginnen Sie mit einer leichten Bewegung. Erhöhen Sie das Kulturvolumen auf 200 ml.
- An Tag 5 fügen Sie der Kultur 50 ml Medium hinzu und erhöhen Sie das Kulturvolumen auf 250 ml.
- Am 6. Tag der Kultivierung wird eine Probe aus der Kultur entnommen und die CAR-T-Zellen mittels Durchflusszytometrie gezählt. Verwenden Sie diese Messung, um die Wachstumsrate der Kultur abzuschätzen und den optimalen Erntezeitpunkt zu bestimmen.
HINWEIS: Jede Probenahme während des Prozesses ergibt 3 ml für die Prüfung und entfernt insgesamt 7 ml Kulturvolumen. - Von Tag 7 bis 13, wenn die Kultur nicht beendet wurde, nehmen Sie an abwechselnden Tagen bis zu zwei zusätzliche In-Process-Proben und führen Sie einen täglichen Medienaustausch durch, um die wachsende Kultur zu füttern. Ernten Sie das Produkt, wenn die Gesamtzahl der kernhaltigen Zellen (TNC) 5 × 109 erreicht und/oder wenn genügend Zellen für die erforderliche Anzahl von Dosen und Freisetzungstests verfügbar sind.
- Entnehmen Sie am Tag der Ernte eine In-Prozess-Probe aus der aktiv wachsenden Kultur. Verwenden Sie diese Probe für Mykoplasmen-, Endotoxin-, replikationskompetente Lentivirus-Tests (RCL), VCN-Tests (Vector Copy Number), Zellzählungen, Zellgrößenanalysen, Durchflusszytometrie und Gram-Färbung.
- Initiieren Sie das endgültige Ernteprogramm, das die Entfernung des Kulturmediums und eine Zellwäsche mit dem endgültigen Formulierungspuffer (eine sterile isotonische kristalloide Lösung, die mit 4 % humanem Serumalbumin ergänzt wird; siehe Materialtabelle) auslöst. Nach Abschluss der Ernte enthält der Zielzellbeutel 100 ml des Zellprodukts im endgültigen Formulierungspuffer. Geben Sie Dimethylsulfoxid (DMSO) in einer Konzentration von 10 % (v/v) hinzu, aliquoten Sie das Produkt in Einzeldosen und konservieren Sie es in einem Gefrierschrank mit kontrollierter Rate.
2. Tag -1: Vorbereitung und Preflight-Checks
- Stellen Sie sicher, dass der CO2 - Gasgehalt und die Druckluft ausreichen, um einen Eingangsdruck von mindestens 20 psi in jeder Leitung zu erzeugen.
- Schalten Sie den Prozessor ein und vergewissern Sie sich, dass beim Start keine Fehler auftreten. Stellen Sie die Uhr bei Bedarf auf die richtige Zeit. Fahren Sie den Prozessor herunter.
- Stellen Sie sicher, dass die Zellzahl, das Zellvolumen und die Gesamt-CD4+- und Gesamt-CD8+-Anzahl des T-Zell-Ausgangsmaterials bekannt sind.
- Stellen Sie sicher, dass ausreichende Mengen des viralen Vektors, der Reagenzien und der Verbrauchsmaterialien für den gesamten Produktionslauf vorhanden sind.
- Stellen Sie eine Flasche menschliches AB-Serum in den Kühlschrank, um sie über Nacht aufzutauen.
3. Tag 0: Installation des Schlauchsets
- Bereiten Sie 3 l Verarbeitungspuffer (0,5 % (w/v) humanes Serumalbumin (HSA) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung / Ethylendiamintetraessigsäure (PBS/EDTA)-Puffer) vor).
- Bereiten Sie 2 l Nährmedium vor (2 l Medium, ergänzt mit 100 ml humanem AB-Serum bis zu einer Endkonzentration von 5 % und zwei Fläschchen rekombinantes humanes IL2 mit 25 μg/Fläschchen; siehe Materialtabelle für weitere Informationen zu diesen Reagenzien). 10 ml Nährmedium in einen 20-ml-Reagenzbeutel überführen und über Nacht bei 4 ºC lagern.
- Schalten Sie das Gerät ein und wählen Sie den T-Zell-Transduktionsprozess (TCT) über die Touchscreen-Oberfläche aus. Klicken Sie auf Ausführen , um den TCT-Prozess zu starten. Lassen Sie das Gerät den Benutzer mithilfe von Anweisungen und Eingabeaufforderungen auf dem Bildschirm durch den Vorgang führen.
- Geben Sie auf dem Bildschirm Parametereingabe die Initialen des Bedieners, die Chargennummer des Schlauchsatzes und das Verfallsdatum ein, wenn Sie dazu aufgefordert werden.
- Auf dem Bildschirm Prozesseinrichtung werden vier verschiedene Prozesse angezeigt. Wählen Sie Vollständiger Prozess (1).
HINWEIS: Andere verfügbare Prozesse umfassen das Starten von CD4+/CD8+-ausgewählten T-Zellen (siehe Abschnitt 5 unten) und das Neustarten eines zuvor abgebrochenen Fertigungslaufs. - Wenn Sie dazu aufgefordert werden, wählen Sie zwei Durchstechflaschen mit dem Auswahlreagenz, um die CD4+/CD8+-Auswahlmethode widerzuspiegeln.
- Installieren Sie das Schlauchset gemäß den Anweisungen auf dem Bildschirm. Stellen Sie sicher, dass alle Luer-Verbindungen fest angezogen sind und dass das Schlauchset keine Defekte aufweist.
- Befolgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm, um die automatisierten oberen und unteren Integritätstests zu starten.
HINWEIS: Eine Integritätsprüfung kann aufgrund eines fehlerhaften Schlauchsatzes, eines falsch installierten Schlauchsatzes oder eines Defekts an der Schlauchpumpe des Geräts fehlschlagen. Wir empfehlen dringend, mindestens einen zusätzlichen Schlauchsatz für Produktionsläufe zur Hand zu haben. Wir empfehlen außerdem, dass ein zweiter Technologe die korrekte Installation des Schlauchsets überprüft. - Befolgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm zum Anbringen des Mediums und zum Verarbeiten von Pufferbeuteln.
- Beginnen Sie mit der automatischen Ansaugung des Schlauchsets.
HINWEIS: Der TCT-Prozess muss innerhalb von 3 Stunden nach dem Ansaugen fortgesetzt werden. Stellen Sie sicher, dass das T-Zell-Ausgangsmaterial bereit ist.
4. Anreicherung von T-Zellen
- Wenn der Bildschirm "Zellprodukt übertragen " angezeigt wird, beginnen Sie mit dem Auftauen des kryokonservierten T-Zellprodukts.
HINWEIS: Das akzeptable Volumen der T-Zellen, die dem Schlauchset hinzugefügt werden können, liegt zwischen 50 und 280 ml. Die maximale Anzahl der Zielzellen (Summe aus CD4+ und CD8+) beträgt 3 × 109, und die maximale TNC-Anzahl beträgt 2 × 1010. - Die aufgetauten Zellen in einen 150-ml-Transferbeutel überführen. Schweißen Sie den Transferbeutel steril mit dem Anwendungsbeutel des Schlauchsets.
- Entnehmen Sie eine Probe mit dem QC-Beutel aus dem Anwendungsbeutel und führen Sie eine Zellzählung durch.
- Schließen Sie die Durchstechflaschen CD4 und CD8 an.
- Starten Sie den Auswahlprozess (T-Zell-Anreicherung).
- Entnehmen Sie nach der Anreicherung eine Probe der CD4+/CD8+-ausgewählten Zellen aus dem QC-Beutel des Wiederaufnahmebeutels, um die Zellzahl, die Durchflusszytometrie und die Zellgrößenanalyse durchzuführen.
HINWEIS: Das Ergebnis der Zellzählung wird benötigt, um mit dem nächsten Schritt fortzufahren.
5. Alternative: Beginnend mit CD4+/CD8+ selektierten Zellen
- Bereiten Sie das Medium wie in Schritt 3.2 beschrieben vor. Es wird kein Verarbeitungspuffer benötigt.
- Schalten Sie den Prozessor ein und wählen Sie T-Zell-Kultivierung mit TS-Installation (3) auf dem Bildschirm Prozess-Setup . Befolgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm.
- Befolgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm und entleeren Sie den Schlauchsatz mit Medium anstelle von Verarbeitungspuffer.
- Wenn der Bildschirm "Kultivierung-Connect-Zellprodukt vorbereiten" angezeigt wird, beginnen Sie mit dem Auftauen der ausgewählten CD4+/CD8+-T-Zellen.
HINWEIS: Die Mindestanzahl von T-Zellen (Summe der CD4+- und CD8+-T-Zellen) für den Prozess beträgt 1,0 × 108. - Die Zellen werden in einen 150-ml-Transferbeutel überführt und mit dem Medium auf ein Endvolumen von 50 ml verdünnt.
- Schweißen Sie die Zellsuspension steril an den Wiederaufnahmebeutel des Instruments.
- Entnehmen Sie eine Probe der CD4+/CD8+-ausgewählten Zellen aus dem QC-Beutel des Wiederholungsbeutels, um die Zellzahl und die Zellgröße zu analysieren.
6. Kultureinrichtung und Programmierung der Activity Matrix
- Geben Sie die Zellkonzentration und die gewünschte Startzahl ein (1-2 × 108 T-Zellen).
HINWEIS: Das Gerät pumpt automatisch das entsprechende Volumen aus dem Wiederaufnahmebeutel in die Kulturkammer und stellt das Endvolumen auf 70 ml ein. - Legen Sie eine Durchstechflasche mit dem Aktivierungsreagenz gemäß den Anweisungen auf dem Bildschirm bei.
- Geben Sie 5 % für die CO2 -Konzentration und 39 °C für die Kulturkammertemperatur ein.
HINWEIS: Der Hersteller empfiehlt, 39 °C oder einen speziell für das Gerät kalibrierten Wert einzugeben. - Richten Sie die Aktivitätsmatrix ein. Verwenden Sie das erweiterte Fütterungsprotokoll als Ausgangspunkt und ändern Sie einzelne Schritte innerhalb des Protokolls nach benutzerdefinierten Spezifikationen (Abbildung 2).
- Stellen Sie sicher, dass der Zeitpunkt der Transduktionsaktivität 24 Stunden nach der Aussaat (Tag 1) liegt.
- Stellen Sie sicher, dass die Zeit der Kulturwaschaktivität 48 Stunden nach der Transduktion (Tag 3) liegt.
- Stellen Sie die Zeit für Activate Shaker (Shaker Typ 2) auf 30 Minuten nach dem Start des Culture Wash ein.
- Löschen Sie alle Aktivitäten für den Austausch mittlerer Säcke und den Austausch von Abfallsäcken .
- Tippen Sie auf OK auf dem Bildschirm, um mit dem Anbau zu beginnen.
- Konservieren Sie alle übrig gebliebenen CD4+/CD8+-Zellen im Anwendungsbeutel für die zukünftige Verwendung, falls erforderlich.
7. Tag 1: T-Zell-Transduktion
- Berechnen Sie das Volumen des zu verwendenden lentiviralen Vektors basierend auf dem gewünschten MOI.
- Entnehmen Sie den 20-ml-Reagenzbeutel mit 10 ml Nährmedium, der über Nacht bei 4 ºC gelagert wurde (Schritt 3.2). Die Durchstechflasche mit dem Vektor wird aufgetaut und das in 7.1 berechnete Volumen in den 20-ml-Reagenzbeutel überführt.
HINWEIS: Wir empfehlen, alle übrig gebliebenen Vektoren zur Aufbewahrung oder für Forschung und Entwicklung einzufrieren. - Ändern Sie die Aktivitätsmatrix, um den Zeitpunkt der Transduktion auf 2 Minuten in der Zukunft festzulegen. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, tippen Sie auf OK , um die Transduktionsaktivität zu starten.
- Schweißen Sie den Vektorbeutel steril an das Schlauchset und befolgen Sie dabei die Anweisungen auf dem Bildschirm.
- Ändern Sie die Aktivitätsmatrix basierend auf dem tatsächlichen Zeitpunkt, zu dem die Transduktionsaktivität gestartet wurde.
HINWEIS: Wir empfehlen, innerhalb von 20-24 Stunden nach der Aussaat mit der Transduktion zu beginnen, um sicherzustellen, dass die praktischen Aktivitäten während der normalen Arbeitszeiten durchgeführt werden.- Stellen Sie sicher, dass die Zeit des Kulturwaschens 48 Stunden nach der Transduktion (Tag 3) liegt.
- Stellen Sie die Zeit für die Aktivierung des Schüttlers (Schüttler Typ 2) auf 30 Minuten nach dem Kulturwaschen (Tag 3) ein.
- Stellen Sie sicher, dass die Zeit des Medienaustauschs am Nachmittag (13 Uhr) von Tag 6 liegt.
8. Tag 6: Erste In-Prozess-Probe
- Tippen Sie auf die Schaltfläche Probe und folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm, um eine QC-Probe aus der aktiven Kultur zu erhalten.
- Führen Sie Zellzählung, Durchflusszytometrie und Zellgrößenanalysen durch. Senden Sie 1 ml der Probe für eine Gram-Färbung.
HINWEIS: Die Zellzählung sollte etwa jeden zweiten Tag wiederholt werden, um das Kulturwachstum zu überwachen. - Bereiten Sie weitere 2 l Nährmedium vor (siehe Schritt 3.2).
- Fügen Sie der Aktivitätsmatrix eine Aktivität für den mittleren Gepäckaustausch hinzu, die zeitlich 2 Minuten in der Zukunft beginnt. Passen Sie die Medienaustauschaktivität so an, dass sie 20 Minuten in der Zukunft beginnt. Folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm.
HINWEIS: Der Medienaustausch ist der Ersatz des Nährmediums in der Kultivierungskammer. Medium Bag Exchange ist der Ersatz des am Instrument aufgehängten Kulturmediumbeutels.
9. Tag der Ernte (zwischen Tag 7 und 13): Ernte und Kryokonservierung
- Tippen Sie auf die Schaltfläche Probe und folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm, um eine QC-Probe aus der aktiven Kultur zu erhalten.
- Trennen Sie die QC-Probe in drei Aliquoten zu je 1 ml. Verwenden Sie 1 ml für Durchflusszytometrie, Zellzahl- und Zellgrößenanalysen. Verwenden Sie 1 ml für Mykoplasmen-, Vektorkopiennummern-, replikationskompetente Lentivirus- und Endotoxintests. Senden Sie die letzten 1 ml für die Gram-Färbung.
- Bereiten Sie den endgültigen Formulierungspuffer vor (eine sterile isotonische kristalloide Lösung, ergänzt mit 4 % HSA in einem 2-Liter-Beutel, siehe Materialtabelle). Bewahren Sie 100 ml dieses Puffers auf, um die Kryoschutzlösung in einem späteren Schritt herzustellen.
- Ändern Sie die Aktivitätsmatrix, um den Zeitpunkt des Kulturendes auf 2 Minuten in die Zukunft zu legen und alle anderen verbleibenden Aktivitäten zu löschen. Befolgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm, um den endgültigen Formulierungspuffer am Schlauchset anzubringen und mit der Ernte zu beginnen.
HINWEIS: Der Prozessor überträgt die Zellen automatisch in den Zielzellenbeutel. Das Volumen beträgt 100 ml. - Entnehmen Sie eine 0,5-ml-Probe aus dem QC-Beutel des Zielzellbeutels und führen Sie eine Zellzählung durch.
- Verschließen Sie den Target-Zellbeutel und entfernen Sie ihn aus dem Schlauchset. Teilen Sie das CAR-T-Produkt in geeignete Dosen auf und konservieren Sie diese in einem Gefrierschrank mit kontrollierter Rate. Lagern Sie die Zellen in der Dampfphase eines Flüssigstickstoff-Lagertanks bei ≤ -150 ºC.
HINWEIS: Die endgültige Formulierung und die Aliquotierung der Dosen sind spezifisch für das Protokoll. Wir stellen hier ein Beispiel vor, in dem drei gleiche Dosen von CAR-T-Zellen und QC-Fläschchen kryokonserviert werden. Weitere Informationen finden Sie in Abschnitt 10. - Laden Sie die Prozessdaten vom Gerät herunter, entfernen und entsorgen Sie den Schlauchsatz und führen Sie eine Abschaltung durch.
10. Kryokonservierung von CAR-T-Zellen
HINWEIS: Dieses Protokoll geht davon aus, dass CAR-T-Zellen nach der Herstellung kryokonserviert und gelagert werden, bis der Patient für die Infusion bereit ist. Es ist zwar möglich, frisch hergestellte CAR-T-Zellen zu infundieren, dies erhöht jedoch den logistischen Aufwand, da die Herstellung von CAR-T-Zellen mit der Infusion von CAR-T-Zellen koordiniert werden muss. Dies kann im Falle eines Herstellungsfehlers problematisch sein. Insbesondere wenn das klinische Protokoll eine lymphodepletierende Chemotherapie vor der CAR-T-Infusion erfordert, empfehlen wir dringend eine Kryokonservierung, da ein Herstellungsfehler den Patienten dem Risiko einer unnötigen Chemotherapie aussetzen kann. Die Aufsichtsbehörden können von den Prüfärzten verlangen, dass sie nachweisen, dass das Produkt alle Freigabetests vor der Infusion besteht, was ohne Kryokonservierung schwierig zu erreichen sein kann.
- Bestimmen und entfernen Sie aus den letzten 100 ml des geernteten Produkts das Volumen, das erforderlich ist, um die gewünschten CAR-T-Dosen und die Fläschchen für die Qualitätskontrolle (QC) zu erfüllen, um zusätzliche Freigabetests (z. B. Viabilität), Retention und eine Sterilitätsprobe durchzuführen.
HINWEIS: Es ist wichtig, eine vollständig definierte Strategie für die Aliquotierung des Endprodukts zu entwickeln. Wir empfehlen, mehrere Dosen des Produkts herzustellen, um Reinfusionen zu ermöglichen, sofern genügend Material zur Verfügung steht. Ein Produktvolumen von 10-20 ml in einem Beutel ermöglicht ein schnelles Auftauen und eine einfache Infusion durch Spritzendrücken. Es wird empfohlen, jedes Produkt mit der gewünschten CAR-T-Zelldosis (z. B. 5 × 106 CAR-T-Zellen pro kg oder 2,5 × 108 CAR-T-Zellen) abzufüllen, da so keine Dosisberechnungen am Tag der Infusion erforderlich sind. Es wird auch empfohlen, mindestens vier QC-Fläschchen kryokonserviert und die Möglichkeit zu berücksichtigen, dass Material übrig bleibt. Wir empfehlen, dieses Material aufzubewahren, da es für Forschungs- und Entwicklungszwecke nützlich sein kann. - Zentrifugieren Sie die Zellen, um das Volumen zu reduzieren.
- Bringen Sie das/die Produkt(e) auf die Hälfte des gewünschten Endvolumens, indem Sie den in Schritt 9.3 beiseite gelegten Teil des endgültigen Formulierungspuffers verwenden.
- Bereiten Sie 2x Kryoprotektivum vor, indem Sie eine 20%ige DMSO-Lösung im endgültigen Formulierungspuffer herstellen.
HINWEIS: Die Formulierung des Kryoprotektivums und die DMSO-Konzentration können modifiziert werden. - Geben Sie 2x Kryoprotektivum in die Zellen mit gleichem Volumen, um eine endgültige DMSO-Konzentration von 10% zu erreichen.
HINWEIS: Die Dauer der Exposition des Produkts gegenüber Kryoprotektiven sollte minimiert werden. - Füllen Sie die Dosierbeutel und QC-Durchstechflaschen. Senden Sie 1 ml zur Sterilität.
HINWEIS: Die Aufsichtsbehörden verlangen in der Regel einen 14-tägigen Sterilitätstest, der am Endprodukt durchgeführt wird. Es gibt jedoch schnelle Sterilitätstests; Zu diesem Zeitpunkt ist die kompendiale 14-Tage-Methode die gebräuchlichste. - Kryokonservierung von Produkten in einem Gefrierschrank mit kontrollierter Rate.
HINWEIS: Das Gefrierprogramm mit kontrollierter Geschwindigkeit sollte validiert werden, um eine Kühlrate von ~ -1 ºC/min bis ~ -45 ºC zu erzeugen, wobei der eutektische Punkt kompensiert wird. - Lagern Sie das Produkt in der Dampfphase eines Flüssigstickstoff-Ultratiefkühlschranks bei ≤ -150 °C.
11. Prüfung der Verfahrensdurchführung
HINWEIS: Während des gesamten TCT-Prozesses werden mehrere QC-Proben aus der aktiven Kultur entnommen. Tabelle 2 enthält ein Raster, das dem Leser helfen kann, die Ergebnisse als Referenz zu organisieren und die Leistungsmetriken des Verfahrens zu berechnen. Die folgenden Begriffe, die aus einem Buchstaben und einer Zahl bestehen (z. B. "B4"), beziehen sich auf Zellen im Raster dieser Tabelle. Die folgenden Werte werden in den Leistungsberechnungen verwendet: B3 = Voranreicherung der gesamten kernhaltigen Zellen (TNC); B4 = TNC-Nachanreicherung; E2 = Die Summe der CD4+- und CD8+-T-Zellen als Prozentsatz der Gesamtzellen des initialen Aphereseprodukts; E4 = Die Summe der CD4+- und CD8+-T-Zellen als Prozentsatz der Gesamtzellen nach der Anreicherung; G2 = CD19+-Zellen in Prozent der Gesamtzellen des Ausgangsprodukts; G4 = CD19+-Zellen als Prozentsatz der Gesamtzellen nach CD4+/CD8+-Anreicherung; B10 = TNC der aktiven Kultur am Tag der Ernte.
Tabelle 2: Leistungsraster des Verfahrens. Wir stellen dieses Raster zur Verfügung, um prozessbegleitende Testergebnisse zu organisieren, die zur Berechnung von Verfahrensleistungsstatistiken erforderlich sind. Die Zeilen stellen Proben dar, die zu verschiedenen Zeitpunkten während des Verfahrens analysiert wurden, und sind mit den Nummern 1-11 gekennzeichnet. Die Reihen 6-9 können verwendet werden, um Ergebnisse von Proben zu erfassen, die nach Tag 6 des Anbaus, aber vor dem Tag der Ernte entnommen wurden. Die Spalten stellen die gemessenen Parameter dar und sind mit den Buchstaben A-H beschriftet. Grau schattierte Felder gelten nicht. Einige zusätzliche Felder können nicht angewendet werden, je nachdem, ob eine CD4+/CD8+-Anreicherung als Teil des Verfahrens durchgeführt wird und wie lange die Kultivierung dauert. Wir empfehlen, "N/A" in diese Felder zu schreiben. Abkürzungen: TNC = Gesamtzahl der kernhaltigen Zellen; QC = Qualitätskontrolle. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
- Berechnen Sie die Wiederfindung von CD4+/CD8+-Zellen nach der Selektion, indem Sie die Gesamtzahl der CD4+ plus CD8+ T-Zellen nach der Anreicherung durch die Gesamtzahl der CD4+ plus CD8+ T-Zellen vor der Anreicherung mit Gleichung (1) dividieren.
CD4+/CD8+ T-Zell-Rückgewinnung =
(1) - Berechnen Sie die Depletion von CD19+-Zellen nach der Anreicherung, indem Sie die Gesamtzahl der CD19+-Zellen nach der CD4+/CD8+-Anreicherung durch die Gesamtzahl der CD19+-Zellen vor der Anreicherung dividieren. Da diese Zahl voraussichtlich sehr klein ist, ist der Logarithmus dieses Bruchs anzugeben, wie in Gleichung (2) gezeigt:
Logarithmische CD19-Zellverarmung = log10
(2) - Berechnen Sie das Gesamtfaltenwachstum, indem Sie die Gesamtzahl der Zellen in aktiver Kultur bei der Ernte durch die Anzahl der ausgesäten Zellen mit Gleichung (3) dividieren:
Gesamtes Faltenwachstum =
(3) - Berechne das durchschnittliche tägliche Wachstum, indem du die Wurzel des gesamten Faltenwachstums in Bezug auf den Tag der Ernte mit Gleichung (4) nimmst:
Durchschnittliches tägliches Wachstum = Tag der Ernte √ (Gesamtfaltungswachstum) (4)
(1)
(2)
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Representative Results
Die Ergebnisse der ersten drei CAR-T-Fertigungsläufe des NCT05480449-Versuchs sind in Tabelle 3 dargestellt. Das Ausgangsmaterial, der Vektor, die Kulturzytokine und die AB-Serumkonzentrationen wurden für jeden Lauf konstant gehalten. Die Produkte wurden am 7. oder 8. Tag geerntet. Das durchschnittliche tägliche Zellwachstum betrug 46 % (Anstieg der Gesamtzellzahl), was darauf hindeutet, dass der TCT-Prozess die Zellexpansion wirksam förderte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Prozessor konsistente und reproduzierbare CAR-T-Zellprodukte herstellen kann.
Die in Tabelle 4 zusammengefassten Testergebnisse des Endprodukts zeigen, dass die CAR-T-Zellen die Qualitätskontrollstandards erfüllt haben. Die Zellviabilität lag zwischen 88% und 94% und die Reinheit der CD3 T-Zellen bei 89-93%. Wichtig ist, dass Endotoxin, Mykoplasmen, Sterilität, replikationskompetente Lentiviren und verbleibende leukämische Zellen nicht nachweisbar waren. Diese Ergebnisse bestätigen, dass der TCT-Prozess qualitativ hochwertige CAR-T-Zellen produziert, die den regulatorischen Standards für den klinischen Einsatz entsprechen.
Für dieses Verfahren wurden drei Durchflusszytometrie-Panels entwickelt (Abbildung 3). Dazu gehören das CD4/CD8-Panel zum Testen des Prozentsatzes von CD4+- und CD8+-T-Zellen vor und nach der Anreicherung, das CD19 CAR-T-Panel zum Testen der Transduktionseffizienz und das CD3/CD19-Panel zur Bestimmung der Lebensfähigkeit und des Gehalts an Restleukämiezellen (CD19+) im Endprodukt. Die Ergebnisse dieser Panels bestätigen die erfolgreiche Herstellung von CAR-T-Zellen und das Fehlen von Leukämiezellen im Endprodukt.
Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass das TCT-Verfahren konsistente und qualitativ hochwertige CAR-T-Zellprodukte herstellen kann, die für den klinischen Einsatz geeignet sind.
Abbildung 3: Durchflusszytometrie-Assays. Die für die Durchflusszytometrie-Analyse verwendete Gating-Strategie ist für jedes Panel dargestellt. Tore werden als schwarze Kästchen oder Ellipsen gezeichnet und beschriftet, und blaue Pfeile zeigen die Richtung des Anschnitts an. (A) CD4/CD8-Platte. B-Zellen werden als CD19+-Untergruppe und T-Zellen als CD3+-Untergruppe des Lymphtors definiert. CD4+ und CD8+ T-Zellen sind Untergruppen des T-Zell-Gates. (B) CD19 CAR-T-Platte. CAR+ T-Zellen sind definiert als die CD19-CAR+-Untergruppe der CD3+ T-Zellen. Darüber hinaus werden CD4+- und CD8+-Teilmengen, die CD19 CAR+ sind, aufgelistet. (C) CD3/CD19-Platte. Dieses Bedienfeld ist identisch mit dem CD4/CD8-Bedienfeld, mit der Ausnahme, dass die CD4- und CD8-Marker weggelassen werden. Abkürzungen: SSC-A = seitliche Streufläche; Lymphe = Lymphozyt; CD19-CAR = CD19-spezifischer chimärer Antigenrezeptor; 7AAD = 7-Aminoactinomycin D. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Laufen # | Ausgangsstoff | Vektor | Kultur Zytokine | AB Serum % | Endgültiger TNC | Geerntete CAR-T-Zellen insgesamt | Gesamtes Faltenwachstum | Durchschnittliches tägliches Wachstum | Tag der Ernte | ||
| 1 | Geduldig T-Zellen, Apherese, Kryokonserviert |
huCART19 | IL2-KARTON | 5% | 2,75x109 | 2,24x108 | 14 | 45% | 7 | ||
| 2 | Geduldig T-Zellen, Apherese, Kryokonserviert |
huCART19 | IL2-KARTON | 5% | 4.15x109 | 1,14x108 | 21 | 46% | 8 | ||
| 3 | Geduldig T-Zellen, Apherese, Kryokonserviert |
huCART19 | IL2-KARTON | 5% | 4.20x109 | 8.40x107 | 21 | 46% | 8 | ||
Tabelle 3: Parameter und Wachstumsmerkmale von drei CAR-T-Produktionsläufen im klinischen Maßstab. Es werden Details zu den Kulturbedingungen, dem Wachstum und dem Erntetag für die ersten drei Patientenherstellungsläufe mit dem Prozessor für die NCT05480449 klinische Studie gezeigt. huCART19, humanisierter CD19-gerichteter lentiviraler CAR-Vektor. Es ist zu beachten, dass die Transduktionseffizienz und die Durchführbarkeit dieser Produkte in Tabelle 4 dargestellt sind. Abkürzungen: CAR-T-Zellen = chimäre Antigenrezeptor-T-Zellen; TNC = Gesamtzahl der kernhaltigen Zellen.
| Release-Tests | ||||||||||
| Probe | Lebensfähigkeit der Zellen | CD3 % | Endotoxin | Myko-Plasma | Transduktions-Effizienz | Leukämische Restzellen | Sterilität Tag 14 | Vektor-DNA-Sequenz pro Zelle | Vektor-DNA-Sequenz pro transduzierter Zelle | Replikationskompetentes Lentivirus |
| Spezifikation | ≥ 70% | ≥ 80% | ≤ 3,5 EU/ml |
Negativ | ≥ 2 % | < 1 % | Kein Wachstum | Ergebnis melden | 0.04-8 Kopien/transduzierte Zelle |
< 50 Kopien/μg DNA |
| Befund | ||||||||||
| Lauf 1 | 90 | 89 | <0,4 | Negativ | 36 % | Nicht Entdeckt |
Nein Wachstum |
1.04 | 2.89 | Nicht Entdeckt |
| Lauf 2 | 88 | 93 | <0,4 | Negativ | 39 % | Nicht Entdeckt |
Nein Wachstum |
1.16 | 2.97 | Nicht Entdeckt |
| Lauf 3 | 94 | 91 | <0,4 | Negativ | 18 % | Nicht Entdeckt |
Nein Wachstum |
0.43 | 2.39 | Nicht Entdeckt |
Tabelle 4: Abschließende Produkttests und Freigabespezifikationen. Die in dieser Tabelle aufgeführten Spezifikationen gelten für die NCT05480449 klinische Studie (IND 28617). Die Lebensfähigkeit nach dem Auftauen, CD3 %, die Transduktionseffizienz und der Restgehalt an leukämischen Zellen wurden mittels Durchflusszytometrie gemessen. Das Endotoxin wurde mit einem von der FDA lizenzierten chromogenen Limulus-Amöbozyten-Lysat-basierten Test gemessen. Die Sterilitätsprüfung wurde mit einer USP<71>-konformen Methode durchgeführt. Mykoplasmen, Vektor-DNA-Sequenzzahl pro Zelle und replikationskompetentes Lentivirus wurden mittels quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) gemessen. Die Vektor-DNA-Sequenznummer pro transduzierter Zelle wurde berechnet, indem die Vektor-DNA-Sequenznummer durch die Transduktionseffizienz dividiert wurde. Abkürzungen: EU = Endotoxin-Einheit; IND = Prüfpräparat für neues Medikament; FDA = Food and Drug Administration.
Ergänzende Abbildung S1: Präklinische Tests von CAR-T-Zellen, die mit dem TCT-Verfahren hergestellt wurden. Immundefizienten (NSG) Mäusen wurden am Tag 0 patienteneigene Xenotransplantat-Leukämiezellen injiziert und anschließend mit CD19-gerichteten CAR-T-Zellen, die auf dem Prozessor hergestellt wurden ("Semi-Automatic Manufacturing"), traditionell hergestellten CD19-gerichteten CAR-T-Zellen ("Standardherstellung") oder Kochsalzlösung an Tag 7 behandelt. (A, B) Überleben von Mäusen, die mit halbautomatisch hergestellten CAR-T-Zellen behandelt wurden, bei zwei Dosisstufen (0,5 × 10 6 oder 2 × 106 CAR-T-Zellen) im Vergleich zu Kochsalzlösung (p < 0,0001 für beide Dosisstufen). (C) Vergleich von halbautomatischen CAR-T-Zellen mit CAR-T-Zellen aus der Standardherstellung bei einer Dosis, von der bekannt ist, dass sie für Standardzellen nicht heilend ist (0,5 ×10 6 CAR-T-Zellen). Das Überleben war signifikant besser bei Mäusen, die mit CAR-T-Zellen aus dem Prozessor behandelt wurden (p = 0,001). (D) Vergleich von halbautomatischen CAR-T-Zellen mit Standard-CAR-T-Zellen bei einer Dosis, von der bekannt ist, dass sie für Standard-CD19-CAR-T-Zellen kurativ ist. Das Überleben unterschied sich nicht signifikant (p = 0,4). (E) Vergleich von CAR-T-Zellen des Verarbeiters bei den beiden Dosisstufen. Bei Mäusen, die mit 2 × 106 huCART19-Zellen behandelt wurden, wurde ein signifikanter Dosiseffekt mit besserem Überleben beobachtet (p = 0,007). Jede Gruppe bestand aus 5 Mäusen. Abkürzungen: NSG = non-adipöse Diabetiker s evere kombinierteImmundefizienz gamma; TCT = T-Zell-Transduktion; CAR-T = chimäre Antigenrezeptor-T-Zellen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S2: Vergleich des Wachstums und der lentiviralen Transduktion von humanen T-Zellen, die in einem Medium kultiviert wurden, das mit verschiedenen Chargen humanen AB-Serums ergänzt wurde. (A) Expansion von humanen T-Zellen, die nicht transduziert (UTD) oder transduziert mit dem lentiviralen CD19-CAR-T-Vektor (CAR19) in Kulturen waren, die mit drei verschiedenen Chargen humanen AB-Serums (7J, 22A oder 21J) ergänzt wurden. Die Zuwachsraten für eine der Lose (22A) waren wesentlich höher als die der beiden anderen. (B) Mittlerer Prozentsatz (3 Replikate) von CAR19+-Zellen in den CD3+- und CD3+/CD4+- oder CD3+/CD8+-Subpopulationen von ex vivo-expandierten T-Zellen, die von gesunden Spendern stammen. Es ist zu beachten, dass Unterschiede in den Wachstumsraten die Fähigkeit der Zellen, das Lentivirus aufzunehmen, nicht zu beeinflussen schienen, wie durch die durchflusszytometrische Analyse der Zellen aus den expandierten Kulturen festgestellt wurde. Die Transduktionseffizienz von T-Zellen und CD4+- und CD8+-Subpopulationen war von Kultur zu Kultur konsistent. Fehlerbalken stellen Standardabweichungen von 3 Wiederholungskulturen dar. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Die CAR-T-Zelltherapie hat sich zu einem vielversprechenden Behandlungsansatz für B-Zell- und andere Malignome entwickelt. Herkömmliche Herstellungsmethoden für CAR-T-Zellen weisen jedoch mehrere Einschränkungen auf, wie z. B. hohe Kosten, arbeitsintensive Produktion und offene Schritte, die das Kontaminationsrisiko erhöhen. In jüngster Zeit sind mehrere halbautomatische Plattformen, darunter der Miltenyi CliniMACS Prodigy (der "Prozessor"), aufgetaucht, um diese Einschränkungen zu beheben. Der T-Zell-Transduktionsprozess (TCT), der in den in diesem Manuskript beschriebenen Prozessor integriert ist, umfasst die Anreicherung, Aktivierung, virale Transduktion, Kulturexpansion und Ernte von T-Zellen in einem geschlossenen System. Konkurrierende automatisierte Zellprozessorplattformen sind derzeit weniger weit verbreitet, verfügen aber möglicherweise über eine bessere In-Prozess-Überwachung von Kulturparametern, günstige Ausrüstungs- oder Materialkosten oder eine kleinere Stellfläche, was den Einsatz in einer Biosicherheitswerkbank anstelle eines speziellen Reinraumraums ermöglichen kann. Es ist wichtig, eine Plattform zu wählen, die für eine bestimmte Anwendung und Umgebung optimal geeignet ist.
Eine wesentliche Einschränkung von Zell- und Gentherapien wie der CAR-T-Zelltherapie sind die hohen Kosten kommerzieller Produkte, die den Zugang zu lebensrettenden Therapien einschränken. Dies ist vor allem in ressourcenarmen Gebieten und Nicht-Erste-Welt-Ländern der Fall. Wir haben festgestellt, dass es möglich ist, CAR-T-Zellen zu drastisch niedrigeren Kosten als ein vergleichbares kommerzielles Produkt herzustellen, wenn ein halbautomatischer Prozess in der Umgebung eines akademischen Krankenhauses eingesetzt wird, das über bestehende cGMP-konforme Reinraumeinrichtungen verfügt, im Rahmen eines Stammzelllabors und der Unterstützung eines klinischen Labors, das einige der In-Prozess- und Freigabetests durchführen kann. Unter diesen Umständen stellen wir fest, dass die Grenzkosten für die Durchführung eines Fertigungslaufs, einschließlich Materialien und Arbeitskräfte für die Herstellung und aller In-Prozess- und Freigabetests (jedoch ohne Ausrüstung und Einrichtungen), etwa 30.000 US-Dollar betragen. Es sollte beachtet werden, dass die Investitionskosten für die Ausrüstung des Prozessors geringer sind als die Kosten für ein einzelnes kommerzielles CAR-T-Zellprodukt.
Eines der potenziellen Probleme beim Wechsel von einer manuellen zu einer automatisierten Methode ist die verringerte Flexibilität. Der TCT-Prozess ist zwar mit starken Leitplanken programmiert, aber dennoch weitgehend anpassbar. Das Verfahren bietet mehrere Ansatzpunkte, einschließlich eines vollständigen Prozesses mit T-Zell-Anreicherung, eines vollständigen Prozesses ohne Anreicherung (z. B. für die Verwendung mit CD4+/CD8+-vorangereicherten Zellen, siehe Abschnitt 5 des Protokolls oben) und einer Wiederaufnahme eines abgebrochenen Prozesses. Darüber hinaus ermöglicht die Aktivitätsmatrix-Funktion die Anpassung des gesamten Anbauprozesses. Angesichts des wachsenden Interesses an der schnellen Herstellung von CAR-T ist zu beachten, dass es möglich ist, die Aktivitätsmatrix so zu konfigurieren, dass die Ernte bereits einige Stunden nach der Transduktion beginnt, wenn dies gewünscht wird. Das schnelle Verfahren hat den potenziellen doppelten Vorteil, dass die Herstellungszeit verkürzt wird und das Produkt wirksamer wird, da eine Differenzierung und ein Verlust der antileukämischen Aktivität vermieden werden12. Darüber hinaus wurde eine Variante des TCT für nicht-virale Vektoren mittels Elektroporation entwickelt, was die Flexibilität des Systems weiter erhöht.
Der optimale Erntezeitpunkt für CAR-T-Zellen hängt von verschiedenen Faktoren ab, darunter die gewünschte Zieldosis, die Anzahl der erforderlichen Dosen und die maximale Zelldichte, die das Kulturgefäß tragen kann, ohne die Lebensfähigkeit der Zellen zu beeinträchtigen. Der Hersteller empfiehlt, 5 Milliarden Zellen in einem Volumen von 250 ml nicht zu überschreiten. Die Bestimmung der gewünschten Zieldosis sollte auf präklinischen Daten in einem Tiermodell basieren. Zum Beispiel haben wir in dieser Studie NOD-Scid-Gamma-Knockout-Mäuse (NSG) verwendet, denen von Patienten stammende leukämische Xenotransplantate injiziert und mit CAR-T-Zellen behandelt wurden, um abzuschätzen, dass eine effektive Dosis ungefähr zwischen 2 und 5 Millionen CAR-T-Zellen pro Kilogramm liegen würde (Ergänzende Abbildung S1). Die Überwachung der Zellgröße kann auch nützlich sein, um den optimalen Zeitpunkt für die Entnahme von CAR-T-Zellen zu bestimmen. Durch die sorgfältige Berücksichtigung dieser Faktoren können Forscher die Erntezeit von CAR-T-Zellen optimieren, um sicherzustellen, dass das Endprodukt von hoher Qualität und Wirksamkeit ist.
Die Entwicklung eines geeigneten Release-Testplans ist eine entscheidende Komponente, um die Genehmigung für einen IND-Antrag zu erhalten. Wir stellen eine Reihe von Freigabetests vor, einschließlich Spezifikationen für unseren IND 28617, und wir glauben, dass dies ein guter Ausgangspunkt für ähnliche Produkte sein wird. Die Meinungen der Regulierungsbehörden entwickeln sich jedoch ständig weiter, und Variationen des vorgelegten Protokolls können dazu führen, dass die Regulierungsbehörden unterschiedliche Tests oder unterschiedliche Spezifikationsschwellen verlangen. Wir empfehlen dringend, die aktuellen regulatorischen Leitfäden wie die Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs)13 der FDA genau zu lesen. Ein allgemeiner Grundsatz ist, dass Tests, die die Sicherheit eines Produkts nachweisen, strenger bewertet werden als Tests, die die Wirksamkeit nachweisen. Im Allgemeinen sollten Tests wie Sterilität, Endotoxin, Mykoplasmen und replikationskompetentes Lentivirus validiert werden, und ihre Leistungskriterien sollten bekannt sein. Im Gegensatz dazu werden Potenztests in Studien in der Frühphase relativ wenig betont und müssen möglicherweise nicht vollständig validiert werden. In einem kürzlich veröffentlichten FDA-Leitlinienentwurf heißt es, dass "die Transgenexpression allein als Maß für die Wirksamkeit ausreichen kann, um IND-Studien in der Frühphase zu unterstützen"14. Darüber hinaus sollten Tests, die zur Dosisbestimmung verwendet werden, validiert werden. Dies kann für neue CAR-Ziele problematisch sein, für die es möglicherweise keine standardisierten Durchflusstests oder Referenzmaterialien gibt. In diesem Fall schlägt die FDA vor, dass "das Referenzmaterial für einen Assay eine gut charakterisierte Partie des Gentherapieprodukts selbst sein kann". 13 Zum Beispiel haben wir eine Positivkontrolle für den CD19 CAR-Durchflusstest unter Verwendung von CAR-T-Zellen aus frühen technischen Läufen etabliert.
Die Entwicklung und Optimierung des Herstellungsprozesses für die CAR-T-Zelltherapie kann herausfordernd und zeitaufwändig sein, wie wir in unserer Arbeit erfahren haben. Wir stießen auf mehrere Rückschläge, darunter Probleme mit bakterieller Kontamination. Wir empfehlen nachdrücklich die Verwendung einer Trockenauftaumethode zum Auftauen von Zellen, da Wasserbäder das Risiko einer Kontamination erhöhen können. Aufgrund der Kultivierung kann selbst ein kleines Inokulum zu einer offenen Kontamination führen, was zu einem unbrauchbaren Produkt führt. Darüber hinaus empfehlen wir, die Logistik für Release-Tests zu planen, die zusätzliche Validierungen und Verträge mit externen Parteien erfordern können, um zeitnahe und genaue Tests zu gewährleisten. Ein weiteres wichtiges Element bei der Entwicklung eines CAR-T-Herstellungsprozesses ist die Optimierung der Transduktionseffizienz. Ein IND-Antrag sollte Daten enthalten, die die Wirksamkeit des viralen Vektors belegen. Um diese Anforderung zu erfüllen und gleichzeitig Informationen zur Optimierung der MOI zu erhalten, empfehlen wir dringend, eine Titration des viralen Vektors in klinischer Qualität an humanen T-Zellen in kleinem Maßstab durchzuführen. Es ist auch wichtig, die Verwendung von traditionell hergestellten CAR-T-Zellen als Kontrolle für Mausexperimente in Betracht zu ziehen (wie in der ergänzenden Abbildung S1 dargestellt). Die Gewinnung dieser Zellen kann schwierig sein und erfordert eine sorgfältige Planung. Ein weiterer zu berücksichtigender Faktor ist die Verwendung von humanem AB-Serum, einem schlecht definierten Reagenz, das einen erheblichen Einfluss auf das Zellwachstum und andere Eigenschaften des Produkts haben kann. Um dieses Problem anzugehen, empfehlen wir, mehrere Chargen von AB-Serum zu testen und Experimente in kleinem Maßstab durchzuführen, um die chargenspezifischen Auswirkungen auf das Zellwachstum zu bewerten (ergänzende Abbildung S2). Sobald eine geeignete Charge identifiziert ist, sollte eine ausreichend große Menge gekauft werden, um die Konsistenz in der gesamten Studienkohorte zu gewährleisten und das Risiko von Chargeneffekten bei den Patientenergebnissen zu minimieren, die auf Änderungen der Serumcharge zurückzuführen sind.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Prozessor und das enthaltene TCT-Verfahren eine Fertigungsmethode bieten, die mehrere Einschränkungen der aktuellen CAR-T-Herstellungsverfahren beheben kann, darunter hohe Kosten, arbeitsintensive Produktion und offene Manipulationsschritte. Durch die Bereitstellung eines geschlossenen und halbautomatischen Systems hat dieser Prozessor das Potenzial, die Verfügbarkeit und Erschwinglichkeit der CAR-T-Zelltherapie zu verbessern. Es kann schnelle Fertigung und nicht-virale Vektoren aufnehmen, was es zu einer flexiblen Alternative zu herkömmlichen Herstellungsmethoden macht. Durch die sorgfältige Berücksichtigung von Faktoren wie der gewünschten Zieldosis, der maximalen Zelldichte und den Auswirkungen von menschlichem AB-Serum auf das Zellwachstum können Forscher die Erntezeit von CAR-T-Zellen optimieren, um die Qualität und Wirksamkeit des Endprodukts sicherzustellen. Obwohl der Prozess komplex und mühsam sein kann, kann die Planung der Logistik für Freigabetests und die Beseitigung von Kontaminationsquellen dazu beitragen, Risiken zu mindern und eine erfolgreiche Herstellung von CAR-T-Zellen sicherzustellen. Insgesamt stellt das TCT-Verfahren einen vielversprechenden Weg für die CAR-T-Zelltherapie dar, der das Potenzial hat, die derzeitigen Einschränkungen zu überwinden und die Zugänglichkeit für Patienten zu verbessern, was letztendlich Krebspatienten zugute kommt.
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Disclosures
S.K., S.G. und Y.W. haben Forschungsunterstützung von Miltenyi Biotec erhalten.
Acknowledgments
Die Autoren möchten die Beiträge mehrerer Personen und Organisationen zu dieser Arbeit würdigen. Das Cell and Gene Therapy Laboratory und das Penn Translational and Correlative Studies Laboratory leisteten wertvolle Unterstützung bei der Prozessentwicklung und Vorbereitung für IND-Einreichungen. Melissa Varghese und Amanda DiNofia trugen zur Prozessentwicklung und Vorbereitung der IND-Einreichungen bei, die diesem Manuskript zugrunde liegen. Diese Arbeit wurde durch einen Acceleration Grant der Cell and Gene Therapy Collaborative des Children's Hospital of Philadelphia unterstützt. Die Autoren bedanken sich auch bei Miltenyi Biotec für die technische und wissenschaftliche Unterstützung. Abbildung 1 unterliegt dem Copyright © 2023 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG; Alle Rechte vorbehalten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 x 75 borosilicate tubes | Charles River | TL1000 | |
| 20 mL Reagent Bag | Miltenyi Biotec | 170-076-631 | |
| 50 mL Conical Tube | Fisher | 05-539-10 | |
| 150 mL Transfer Set | Fenwal | 4R2001 | |
| 2,000 mL Transfer Set | Fenwal | 4R2041 | |
| 7AAD | Fisher Scientific | BDB559925 | |
| Alcohol Prep | Tyco/Healthcare | ||
| Bag Access | Medline | 2300E-0500 | |
| CD19 APC-Vio770 REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-113-643 | |
| CD19 CAR Detection Reagent Biotin | Miltenyi Biotec | 130-129-550 | |
| CD19 PE | BD | 555413 | |
| CD3 APC | BD | 340440 | |
| CD4 VioBright FITC REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-113-229 | |
| CD45 VioBlue REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-110-637 | |
| CD8 APC-Vio770 REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-110-681 | |
| Cellometer Reference Beads 10um | Nexcelom | B10-02-020 | |
| Cellometer Reference Beads 15um | Nexcelom | B15-02-010 | |
| Cellometer Reference Beads 5um | Nexcelom | B05-02-050 | |
| Cellometer Slides | Nexcelom | CHT4-SD100-002 | |
| CliniMACS CD4 GMP MicroBeads | Miltenyi Biotec | 276-01 | The CD4 reagent |
| CliniMACS CD8 GMP MicroBeads | Miltenyi Biotec | 275-01 | The CD8 reagent |
| CliniMACS PBS/EDTA Buffer | Miltenyi Biotec | 130-021-201 | The buffer |
| DMSO | Origen | CP-10 | |
| Freezing Bag 50 mL | Miltenyi Biotec | 200-074-400 | |
| Freezing Vial, 1.8 mL | Nunc | 12565171N | |
| Freezing Vial, 4.5 mL | Nunc | 12565161N | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | Sterile filtered, heat inactivated | |
| Human Serum Albumin 25% | Grifols | 68516-5216-1 | |
| Human Serum Albumin 5% | Grifols | 68516-5214-1 | |
| MACS GMP Recombinant Human IL-2 | Miltenyi Biotec | 170-076-148 | The cytokines |
| MACS GMP T Cell TransAct | Miltenyi Biotec | 200-076-202 | The activation reagent |
| MycoSeq Mycoplasma Detection Kit | Life Technologies | 4460623 | |
| Needles, Hypodermic 14G | Medline | SWD200573 | |
| Needles, SlideSafe 18G | BD | B-D305918 | |
| Pipet tips, 2-200 μL, individually wrapped | Eppendorf | 022492209 | |
| Pipet tips, 50-1000 μL, individually wrapped | Eppendorf | 022492225 | |
| Pipets 10 mL | Fisher | 13-678-27F | |
| Pipets 25 mL | Fisher | 13-675-30 | |
| Pipets 5 mL | Fisher | 13-678-27E | |
| Plasmalyte-A | Baxter | 2B2544X | The electrolyte solution |
| Prodigy TS520 Tubing Set | Miltenyi Biotec | 170-076- 600 | The tubing set |
| Sterile Field | Medline | NON21001 | |
| Streptavidin PE-Vio770 | Miltenyi Biotec | 130-106-793 | |
| Syringe 1 mL | BD | 309628 | |
| Syringe 10 mL | BD | 302995 | |
| Syringe 3 mL | BD | 309657 | |
| Syringe 30 mL | BD | 302832 | |
| Syringe 50 mL | BD | 309653 | |
| TexMACS GMP Medium | Miltenyi Biotec | 170-076-306 | The medium |
| Triple Sampling Adapter | Miltenyi Biotec | 170-076-609 | |
| Viral Vector | CHOP Clinical Vector Core | huCART19 | |
| Equipment | |||
| Biological Safety Cabinet | The Baker Co | ||
| Cellometer Auto 2000 | Nexcelom | ||
| CliniMACS Prodigy | Miltenyi Biotec | 200-075-301 | The processor |
| Controlled Rate Freezer | Planer/Kryosave | ||
| Endosafe nexgen-PTS150K | Charles River | ||
| Mettler Balance | Mettler | ||
| Refrigerated Centrifuge | Thermo Fisher | ||
| Refrigerated Centrifuge | Fisher Sci | ||
| SCD Sterile Tubing Welder | Terumo | ||
| Sebra Tube Sealer | Sebra | ||
| Varitherm | Barkey | The dry thaw device | |
| XN-330 Hematology Analyzer | Sysmex |
References
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- Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
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