Summary
Dit protocol beschrijft de bereiding van het inoculum, de kwantificering van de biofilm op microtiterplaten met behulp van kristalviolette kleurstof, het aantal levensvatbare stoffen in biofilms en de visualisatie van biofilms van Acinetobacter.
Abstract
Acinetobacter veroorzaakt nosocomiale infecties en de vorming van biofilm kan bijdragen aan de overleving op droge oppervlakken zoals ziekenhuisomgevingen. Kwantificering en visualisatie van biofilm zijn dus belangrijke methoden om het potentieel van Acinetobacter-stammen om nosocomiale infecties te veroorzaken te beoordelen. De biofilms die zich op het oppervlak van de microplaat vormen, kunnen worden gekwantificeerd in termen van volume en celaantallen. Biofilmvolumes kunnen worden gekwantificeerd door te kleuren met kristalviolet, te wassen, te kleuren met ethanol en vervolgens de opgeloste kleurstof te meten met behulp van een microplaatlezer. Om het aantal cellen dat in de biofilms is ingebed te kwantificeren, worden de biofilms afgeschraapt met behulp van celschrapers, geoogst in de zoutoplossing, krachtig geroerd in aanwezigheid van glasparels en verspreid op Acinetobacter-agar. Vervolgens worden de platen gedurende 24-42 uur bij 30 °C geïncubeerd. Na incubatie worden de rode kolonies opgesomd om het aantal cellen in biofilms te schatten. Deze haalbare telmethode kan ook nuttig zijn voor het tellen van Acinetobacter-cellen in biofilms van gemengde soorten. Acinetobacter-biofilms kunnen worden gevisualiseerd met behulp van fluorescerende kleurstoffen. Een in de handel verkrijgbare microplaat die is ontworpen voor microscopische analyse wordt gebruikt om biofilms te vormen. Vervolgens worden de aan de onderkant bevestigde biofilms gekleurd met SYTO9- en propidiumjodidekleurstoffen, gewassen en vervolgens gevisualiseerd met confocale laserscanmicroscopie.
Introduction
Van Acinetobacter is bekend dat het nosocomiale infecties veroorzaakt, en de menselijke infectie, vooral in zorginstellingen, wordt steeds vaker gemeld1. Het is wijdverbreid in ziekenhuizen, zorginstellingen en voedselgerelateerde omgevingen 2,3,4. Het kan gedurende een lange periode overleven in omgevingen zoals ziekenhuisoppervlakken zoals bedhekken, nachtkastjes, het oppervlak van ventilatoren en gootstenen4. Een dergelijke persistentie op omgevingsoppervlakken kan een van de belangrijke factoren zijn die bijdragen aan de nosocomiale infecties van Acinetobacter4.
Biofilm is een vorm van microbieel leven en is een microbiële matrix die bestaat uit levende microbiële cellen en extracellulaire polymere stoffen (EPS) uit de cellen5. De microbiële cellen zijn ingebed in de matrix en zijn vaak zeer goed bestand tegen omgevingsinvloeden zoals hitte, zouten, droogte, antibiotica, ontsmettingsmiddelen en schuifkrachten 6,7.
Acinetobacter kan biofilms vormen op oppervlakken, wat suggereert dat het kan bijdragen aan een verlengde overleving op omgevingsoppervlakken, inclusief ziekenhuisoppervlakken, en een verhoogde resistentie tegen antibioticabehandeling 8,9. Bovendien zou de biofilmvorming van Acinetobacter sterk geassocieerd kunnen zijn met klinische resultaten bij de mens. Daarom zou de vervormbaarheid van de biofilm van Acinetobacter-stammen een van de indicatoren kunnen zijn bij het voorspellen van de overleving van het milieu en menselijke infecties 8,10.
De aan het oppervlak bevestigde biofilms kunnen worden gekwantificeerd en gevisualiseerd om de vervormbaarheid van de biofilm te beoordelen. Om aan het oppervlak gehechte biofilms te kwantificeren, worden de biofilms normaal gesproken gekleurd door biofilmkleurende kleurstoffen zoals kristalviolet, en worden de kleurstoffen geëlueerd in oplossing en gemeten op optische dichtheid11. Visualisatie van biofilms is een andere goede benadering om de vormbaarheid van biofilm te beoordelen11. De confocale laserscanmicroscopie (CLSM) visualisatiemethode die gebruik maakt van specificiteit met behulp van fluorescerende kleurstoffen zou nuttiger kunnen zijn om de morfologie van biofilm te karakteriseren in vergelijking met andere technieken zoals SEM12,13.
De levensvatbare cellen in biofilms kunnen worden geteld om het aantal levensvatbare cellen in biofilms te schatten11. De levensvatbare cellen die in biofilms zijn ingebed, worden losgemaakt, verdund, verspreid op agarplaten, geïncubeerd en geïnventariseerd. Omdat het hogere aantal cellen waarschijnlijk aan de infectieuze dosis voldoet, kan het meer gedetailleerde informatie geven over biofilms, zoals infectiepotentialen geassocieerd met het aantal cellen13,14.
Dit artikel presenteert stap-voor-stap protocollen om (1) oppervlaktegebonden biofilms te kwantificeren, (2) levensvatbare cellen in de biofilms te tellen en (3) de biofilms te visualiseren met behulp van CLSM van Acinetobacter. De gepresenteerde protocollen beschrijven de methoden om de biofilmvormbaarheid van Acinetobacter-isolaten te beoordelen en hun biofilms te karakteriseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van bacterieel entmateriaal
- Verwijder de injectieflacon met glycerolbouillon die bij -80 °C is bewaard.
- Verwijder de bacteriestam (2-10 μL) uit de injectieflacon met behulp van een steriele pipetpunt.
OPMERKING: Acinetobacter-stammen , A. bouvetii (13-1-1), A. junii (13-1-2), A. pittii (13-2-5), A. baumannii (13-2-9), A. radioresistens (20-1) en A. ursingii (24-1) worden in dit protocol gebruikt. - Inoculeer een in de handel verkrijgbare bloedagarplaat (tryptische soja-agar aangevuld met 5% schapenbloed, zie Materiaaltabel) met de bacteriën.
OPMERKING: Andere media, zoals voedingsagar of MacConkey-agar, kunnen ook worden gebruikt. - Streep het agaroppervlak met behulp van een steriele lus met intermitterende vlammen om het te verdunnen.
- Plaats de agarplaat ondersteboven in een incubator en incubeer gedurende 20-24 uur een nacht bij 30 °C.
- Kies een enkele kolonie van de bacteriecultuur met een steriele naald en inoculeer 5 ml steriele hersenhartinfusiebouillon (BHI, zie Materiaaltabel) met de kweek.
- Incubeer de geënte bouillon in een schudincubator bij 30 °C gedurende 20-24 uur gedurende ongeveer 150 omw/min.
- Breng 1 ml van de nachtcultuur over in een steriele microcentrifugebuis en centrifugeer de nachtcultuur bij 6.000 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Verwijder het supernatans met een pipet.
- Resuspendeer de pellet met behulp van een draaikolk in 1 ml steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Centrifugeer bij 6.000 × g gedurende 10 minuten bij RT en verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de pellet in steriele tienvoudig verdunde BHI met behulp van vortex tot een optische dichtheid van ongeveer 0,1 bij 600 nm.
OPMERKING: De optische dichtheid van ongeveer 0,1 komt overeen met ongeveer 10,7 kve/ml.
2. Kwantificering van biofilm met behulp van kristalviolet
- Voeg 200 μL inoculum toe aan elk putje van een steriele polystyreenplaat met 96 putjes (zie Materiaaltabel) en voeg 200 μL gedeïoniseerd water toe aan elk van de buitenste putjes om te voorkomen dat de binnenste putjes uitdrogen15.
- Voeg 200 μL tienvoudig verdunde BHI toe aan elk putje van dezelfde plaat als een negatieve controle.
- Incubeer de plaat gedurende 24 uur bij 25 °C.
- Verwijder het supernatans met een pipet.
OPMERKING: Meerkanaalspipet is vaak handiger voor meerdere monsters. - Voeg voorzichtig 300 μL PBS toe aan elk putje en verwijder het supernatans met een pipet.
OPMERKING: Meerkanaalspipet is vaak handiger voor meerdere monsters. - Herhaal stap 2.5 nog twee keer.
- Voeg 200 μL kristalviolette oplossing (1%) (zie materiaaltabel) toe aan elk putje en incubeer gedurende 30 minuten bij RT.
- Herhaal stap 2.4-2.6.
- Voeg 200 μL absolute ethanol toe aan elk putje en incubeer gedurende 15 minuten bij RT. Meng grondig door meerdere keren op en neer te pipetteren.
- Breng 100 μL elutie over van elk putje naar een nieuwe plaat met 96 putjes.
- Meet de extinctie bij 595 nm met behulp van een microplaatlezer (zie Materiaaltabel).
- Wanneer de extinctie hoger is dan 2,0, moet het monster op de juiste wijze worden verdund tot een extinctie van minder dan 2,0 in absolute ethanol en moet worden gemeten zoals in stap 2.11. Bereken vervolgens de absorptie van het monster (eindwaarde) door de waargenomen waarde te vermenigvuldigen met de verdunningsfactor.
- Bereken de werkelijke extinctie van de monsters door de gemiddelde waarde van de negatieve controle af te trekken van de waarde van elk putje van de testmonsters op dezelfde putplaat.
3. Levensvatbaarheid van biofilm
- Voeg 1 ml inoculum (stap 1) toe aan elk putje van een steriel polystyreen 12-wells plaat15. Incubeer de plaat gedurende 24 uur bij 25 °C. Verwijder het supernatans met een pipet.
- Voeg voorzichtig 1,5 ml steriele PBS toe aan elk putje en verwijder het supernatans met een pipet. Voeg 1 ml steriele PBS toe aan elk putje.
- Schraap de bodem- en wandoppervlakken van de put af met behulp van gemonteerde celschrapers.
- Breng de geoogste celsuspensie over in een steriele plastic buis (10-1) met 9 ml zoutoplossing (0,85% NaCl) en 10-20 glasparels (zie materiaaltabel).
NOTITIE: Om achtergebleven biofilmresten op het bodemoppervlak van de put op te vangen, kan het opnieuw worden gesuspendeerd en met een pipet met behulp van zoutoplossing uit de 10-1-buis worden overgebracht. - Draai de 10-1 buis gedurende 60 s op een maximale snelheid.
- Maak een 10-voudige seriële verdunning door 1 ml over te brengen in de volgende steriele buis (10-2) met 9 ml zoutoplossing (0,85 % NaCl) tot 10-7.
- Verdeel 100 μl uit elke verdunning op Acinetobacter-agar (zie materiaaltabel) en incubeer de agarplaten gedurende 24-42 uur bij 30 °C.
- Tel handmatig het aantal typische rode kolonies op elke plaat in het bereik tussen 10 en 250.
- Bereken het aantal levensvatbare cellen in de biofilm van elk putje met behulp van de onderstaande vergelijking:
Levensvatbare cellen = Aantal kolonies × Verdunningsfactoren × 10
4. Biofilmvisualisatie met behulp van confocale laserscanmicroscopie (CLSM)
- Voeg 200 μL inoculum toe aan elk putje van een steriele plaat met 96 putjes die bedoeld is voor microscopische analyse.
- Incubeer de plaat gedurende 24 uur bij 25 °C.
- Verwijder het supernatans met een pipet.
- Voeg voorzichtig 300 μL gefilterd gedeïoniseerd water toe aan elk putje en verwijder het supernatans met een pipet.
- Herhaal stap 4.4.
- Bereid het mengsel van SYTO 9 en propidiumjodide (zie materiaaltabel) verdund in gefilterd gedeïoniseerd water tot een eindconcentratie van respectievelijk 10 μM en 60 μM.
- Voeg het mengsel toe aan elk kuiltje van 200 μL en incubeer de plaat gedurende 20-30 minuten bij RT in het donker.
- Herhaal stap 4.3-4.4
- Visualiseer de aan de onderkant bevestigde biofilms met behulp van CLSM met de excitatiegolflengte van 488 nm en 561 nm en het emissiegolflengtebereik van respectievelijk 499-535 nm en 568-712 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Volgens het protocol werden de biofilms van Acinetobacter-isolaten , oorspronkelijk geïsoleerd uit keukenoppervlakken, gevormd op een polystyreenplaat met 96 putjes, gekleurd met kristalviolet, en de kleurstoffen werden opgelost in ethanol en gemeten op biofilmmassa (Figuur 1). Het aantal biofilms varieerde sterk afhankelijk van de stammen, variërend van OD 0,04 tot 1,69 (figuur 1). Op basis van de criteria die zijn vastgesteld door Stepanović et al.16, vormden alle isolaten behalve A. bouvetii biofilms. A. radioresistens vormden een zwakke biofilm. A. junii en A. baumannii vormden matige biofilms, terwijl A. pittii en A . ursingii sterke biofilms vormden.
Om levensvatbare cellen in biofilms te tellen, werden de biofilms afgeschraapt met behulp van celschrapers, met hoge snelheid gewerveld, verdund en verspreid op de selectieve platen van Acinetobacter . Na incubatie werd het aantal kolonies geteld om het aantal biofilmcellen te schatten (Figuur 2). Alle isolaten, behalve A. bouvetii , hadden cellen die equivalent waren aan 7-8 Log CFU in hun biofilms. In overeenstemming met de niet-vormende eigenschap van de biofilm die wordt aangetoond door de kristalviolette test, had A. bouvetii een veel lager celnummer bij 4,4 Log CFU.
De aan de onderkant bevestigde biofilms werden gevisualiseerd met behulp van CLSM (Figuur 3). Een aanzienlijke hoeveelheid biofilm werd gevonden in A. junii, A. baumannii en A. ursingii met verschillende biofilmmorfologieën. Hoewel A. pittii een sterke biofilmvormer was in een kristalviolette test, vormde het niet veel biofilm op het bodemoppervlak.
Figuur 1: Meting van de biofilmmassa van Acinetobacter gevormd op een polystyreenplaat met 96 putjes met behulp van een kristalviolette test. De foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie van drievoud. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Levensvatbare tellingen van Acinetobacter-biofilms gevormd op een polystyreenplaat met 12 putjes. De foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie van het duplicaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Aan de onderkant gehechte Acinetobacter-biofilms gevormd op een plaat met 96 putjes, gevisualiseerd door CLSM met behulp van SYTO 9 en propidiumjodidekleurstoffen. Schaalbalken: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met behulp van het beschreven protocol werd de biofilmvorming van Acinetobacter-isolaten in verschillende mate gemeten, gevisualiseerd en werden de levensvatbare cellen in de biofilms geschat (Figuur 1, Figuur 2 en Figuur 3).
In dit protocol werden twee verschillende temperaturen gebruikt, 30 °C voor de groei en 25 °C voor de biofilmvorming van Acinetobacter. 30 °C werd gebruikt omdat veel studies meer dan 30 °C gebruikten voor de optimale groei van Acinetobacter, wat geschikt zou zijn om voldoende inoculum 12,13,14,17 te verkrijgen. Deze temperatuur is echter over het algemeen hoger dan de temperaturen van de omgeving waar biofilmvorming zou plaatsvinden, zoals ziekenhuisoppervlakken of voedselverwerkende omgevingen. Daarom werd 25 °C gebruikt voor de vorming van biofilm, waardoor deze omgevingsomstandigheden beter zouden worden gesimuleerd.
Dit protocol gebruikte 10-voudig verdunde BHI in plaats van de oorspronkelijke BHI om biofilms te vormen (stap 1.12). Veel oppervlakken, zoals ziekenhuisoppervlakken of voedselverwerkende omgevingen, bevatten waarschijnlijk een laag voedingsstofgehalte18,19. Bovendien blijven micro-organismen op de verontreinigde oppervlakken na het reinigen op de oppervlakken achter en blijven ze in de voedingsarme omstandighedenaanwezig 20. Daarom zijn omstandigheden met een lage voedingswaarde, zoals een 10-voudige verdunde BHI, wenselijker dan omstandigheden met een hoge voedingswaarde, zoals de oorspronkelijke BHI.
Kristalviolettest is een algemeen aanvaarde en gevestigde methode om de biofilmmassa te meten, en deze studie toonde aan dat de biofilmvormbaarheid van Acinetobacter op verschillende niveaus waarneembaar is door deze methode te gebruiken.
Het aantal levensvatbare cellen in biofilm is ook belangrijk omdat de levensvatbare cellen in biofilms verantwoordelijk zijn voor menselijke infecties die vaker voorkomen door een groter aantal cellen21. Bovendien kan de levensvatbare telling een goed hulpmiddel zijn om slechte biofilmproducenten te onderscheiden, zoals aangetoond in A. bouvetii en A. radioresistens (Figuur 1 en Figuur 2). Het levensvatbare aantal A. radioresistens was veel hoger dan dat van A. bouvetii, terwijl er weinig verschil werd gevonden in de biofilmmassa, wat wijst op een hoger infectiepotentieel door A. radioresistens (Figuur 1 en Figuur 2). Deze methode kan ook worden gebruikt om het aandeel van Acinetobacter in biofilms met meerdere soorten te schatten, dat vaker voorkomt in het milieu.
Acinetobacter vormt biofilm niet alleen op het bodemoppervlak, maar ook op de zijwand, vooral op het grensvlak tussen lucht en vloeistof in buizen17,22. CLSM-analyse met behulp van een microtiterplaat is beperkt tot de aan de onderkant bevestigde biofilms, waardoor het soms moeilijk te vergelijken is met de resultaten door middel van een kristalviolette test, die alle ondergedompelde oppervlakken meet, inclusief de wandoppervlakken. Een aanzienlijke hoeveelheid biofilm op het grensvlak tussen lucht en vloeistof werd ook gevonden in deze isolaten, met name de sterke biofilmproducent, A. pittii. Het vormde een relatief slechte biofilm op het bodemoppervlak in vergelijking met andere isolaten (Figuur 3). Daarom moet een microscopische analysetechniek verder worden ontwikkeld om de biofilms die aan de zijwand worden gevormd in beeld te brengen.
In deze studie werden drie verschillende testen, kristalviolet, levensvatbaar aantal en CLSM, gebruikt om de biofilms van Acinetobacter te karakteriseren. Kristalviolettest is de gevestigde methode om biofilms te kwantificeren, en de criteria om de vervormbaarheid van biofilm te bepalen bestaan16. Het meet echter niet alleen levende cellen en EPS, maar ook dode cellen, die minder betekenisvol zijn in termen van menselijke infectie en virulentie. De levende cellen in biofilms kunnen worden gemeten met behulp van de viable count-methode. De vervormbaarheid van biofilm kan echter niet worden bepaald met de levensvatbare telmethode, omdat deze methode geen EPS meet, een kritische component in de biofilmstructuur. Daarom heeft deze methode niet de criteria of afkapwaarde om de vervormbaarheid van biofilm te bepalen. Bovendien meet de methode van de levensvatbare telling alleen de kweekbaarheid van de cellen en niet de cellen in "levensvatbare maar niet kweekbare toestand"11. De aanwezigheid van biofilms kan worden bevestigd door de CLSM-methode, die biofilms effectief visualiseert. Het meet echter alleen biofilms die aan de onderkant zijn bevestigd, hoewel er vaak ook biofilms op de zijwanden worden gevormd. Daarom wordt aanbevolen om een kristalviolettest te gebruiken om de vervormbaarheid van de biofilm te bepalen. Vervolgens kunnen de levende en kweekbare cellen in biofilms worden gekwantificeerd met behulp van de levensvatbare telmethode en kunnen de aan het bodemoppervlak gehechte biofilms worden bevestigd of gekarakteriseerd door de CLSM-methode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door het Main Research Program (E0210702-03) van het Korea Food Research Institute (KFRI), gefinancierd door het Ministerie van Wetenschap en ICT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well cell culture plate | SPL | 30096 | Polystyrene 96-well plate |
| BHI (Brain Heart Infusion) broth | Merck KGaA | 1.10493.0500 | |
| Blood Agar Base Plate | KisanBio | MB-B1005-P50 | Growth media for Acinetobacter |
| CHROMagar Acinetobacter | CHROMagar | AC092 | Selective plate for Acinetobacter |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | V5265 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit | Invitrogen | L10316 | SYTO9 and propidium iodide |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO NanoQuant | Biofilm measurement |
| RBC Glass Plating Beads | RBC | RG001 | Glass beads |
| μ-Plate 96 Well Black | ibidi | 89621 | Microplate intended for CLSM |
References
- Wong, D., et al. Clinical and pathophysiological overview of Acinetobacter infections: a century of challenges. Clinical Microbiology Reviews. 30 (1), 409-447 (2017).
- Carvalheira, A., Silva, J., Teixeira, P. Acinetobacter spp. in food and drinking water - A review. Food Microbiology. 95, 103675 (2021).
- Towner, K. J. Acinetobacter: an old friend, but a new enemy. Journal of Hospital Infection. 73 (4), 355-363 (2009).
- Weber, D. J., Rutala, W. A., Miller, M. B., Huslage, K., Sickbert-Bennett, E. Role of hospital surfaces in the transmission of emerging health care-associated pathogens: Norovirus, Clostridium difficile, and Acinetobacter species. American Journal of Infection Control. 38 (5), S25-S33 (2010).
- Flemming, H. C., et al. The biofilm matrix: multitasking in a shared space. Nature Reviews Microbiology. 21 (2), 70-86 (2023).
- Flemming, H. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).
- Yin, W., Wang, Y., Liu, L., He, J. Biofilms: the microbial "protective clothing" in extreme environments. International Journal of Molecular Sciences. 20 (14), 3423 (2019).
- Gedefie, A., et al. Acinetobacter baumannii biofilm formation and its role in disease pathogenesis: a review. Infection and drug resistance. 14, 3711-3719 (2021).
- Whiteway, C., Breine, A., Philippe, C., Van der Henst, C.
- Longo, F., Vuotto, C., Donelli, G.
- Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
- Jia, J., Xue, X., Guan, Y., Fan, X., Wang, Z. Biofilm characteristics and transcriptomic profiling of Acinetobacter johnsonii defines signatures for planktonic and biofilm cells. Environmental Research. 213, 113714 (2022).
- Yang, C., Su, P., Moi, S., Chuang, L. Biofilm formation in Acinetobacter baumannii: genotype-phenotype correlation. Molecules. 24 (10), 1849 (2019).
- Alamri, A. M., Alsultan, A. A., Ansari, M. A., Alnimr, A. M. Biofilm-formation in clonally unrelated multidrug-resistant Acinetobacter baumannii isolates. Pathogens. 9 (8), 630 (2020).
- Lim, E. S., Nam, S. J., Koo, O. K., Kim, J. S. Protective role of Acinetobacter and Bacillus for Escherichia coli O157:H7 in biofilms against sodium hypochlorite and extracellular matrix-degrading enzymes. Food Microbiology. 109, 104125 (2023).
- Stepanović, S., Ćirković, I., Ranin, L., Svabić-Vlahović, M. Biofilm formation by Salmonella spp. and Listeria monocytogenes on plastic surface. Letters in Applied Microbiology. 38 (5), 428-432 (2004).
- Boone, R. L., et al. Analysis of virulence phenotypes and antibiotic resistance in clinical strains of Acinetobacter baumannii isolated in Nashville, Tennessee. BMC Microbiology. 21 (1), 21 (2021).
- Otter, J. A., et al. Surface-attached cells, biofilms and biocide susceptibility: implications for hospital cleaning and disinfection. Journal of Hospital Infection. 89 (1), 16-27 (2015).
- Ravishankar, S., Juneja, V. K. Adaptation or resistance responses of microorganisms to stresses in the food processing environment. Microbial Stress Adaptation and Food Safety. Yousef, A. E., Juneja, V. K. , (2003).
- Dewanti, R., Wong, A. C. L. Influence of culture conditions on biofilm formation by Escherichia coli O157:H7. International Journal of Food Microbiology. 26 (2), 147-164 (1995).
- McConnell, M. J., Actis, L., Pachón, J. Acinetobacter baumannii: human infections, factors contributing to pathogenesis and animal models. FEMS Microbiology Reviews. 37 (2), 130-155 (2013).
- McQueary, C. N., Actis, L. A. Acinetobacter baumannii biofilms: variations among strains and correlations with other cell properties. The Journal of Microbiology. 49 (2), 243-250 (2011).
