Chemistry

基于溶剂辅助风味蒸发富集的茶香分析

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65522

Zhihui Feng¹, Xiaogen Yang², Chun Zou¹, Junfeng Yin¹

¹Tea Research Institute Chinese Academy of Agricultural Sciences, ²State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization, Anhui Agricultural University

Summary

这里介绍的是一种利用溶剂辅助风味蒸发和溶剂萃取，然后气相色谱-质谱法富集和分析茶提取物挥发性成分的方法，该方法可应用于所有类型的茶叶样品。

Abstract

茶香是影响茶叶品质的重要因素，但由于茶叶提取物挥发性成分的复杂性、低浓度、多样性和不稳定性，分析起来具有挑战性。本研究提出了一种利用溶剂辅助风味蒸发（SAFE）和溶剂萃取后气相色谱-质谱（GC-MS）来获取和分析茶叶提取物挥发性成分并保持气味的方法。SAFE是一种高真空蒸馏技术，可以从复杂的食品基质中分离挥发性化合物，而不会产生任何非挥发性干扰。本文介绍了茶叶香气分析的完整分步程序，包括茶叶输液制备、溶剂萃取、SAFE蒸馏、提取物浓缩和GC-MS分析。将该程序应用于两个茶样（绿茶和红茶），并获得茶样挥发性成分的定性和定量结果。该方法不仅可以用于各类茶样的香气分析，还可以用于茶样的分子感官研究。

Introduction

茶是全世界许多人的首选饮料^1,2。茶的香气是茶叶的质量标准和价格决定因素^3,4。因此，分析茶叶的香气组成和含量对茶叶的分子感官研究和质量控制具有重要意义。因此，香气成分分析已成为近年来茶叶研究中的一个重要课题^5,6,7。

茶叶中香气成分的含量很低，一般只占^茶叶干重的0.01%-0.05%8。此外，样品基质中的大量非挥发性组分会显著干扰气相色谱^法^9,10的分析。因此，样品制备程序对于分离茶中的挥发性化合物至关重要。分离和富集方法的关键考虑因素是最大限度地减少基质干扰，同时最大限度地保留样品的原始气味特征。

溶剂辅助风味蒸发（SAFE）最初由Engel，Bahr和Schieberle开发，是一种改进的高真空蒸馏技术，用于从复杂的食品基质中分离挥发性化合物^11,12。连接到高真空泵的紧凑型玻璃组件（在 5 x 10⁻³ Pa 的典型工作压力下）可以有效地从溶剂提取物、油性食品和水性样品中收集挥发性化合物。

本文介绍了一种将SAFE技术与溶剂萃取相结合的方法，以从红茶输液中分离挥发性物质，然后使用GC-MS进行分析。

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Protocol

1.内标的制备和茶叶浸泡液

储备溶液：将10.0mg对二甲苯-d10（见 材料表）溶解在10.0 mL无水乙醇中，制备内标的1,000 ppm储备溶液。
工作溶液：用纯水将1 mL储备溶液（步骤1.1）稀释至100 mL，制成10 ppm的内标工作溶液。
注意：工作溶液必须在分析的同一天制备。
将3克茶叶（绿茶和红茶，见 材料表）放入锥形瓶中，并加入150毫升沸水。用玻璃塞盖住烧瓶。
5分钟后，通过300目筛快速过滤出茶汁。
用30毫升水清洗用过的茶叶两次，并将洗涤溶液与茶叶浸泡液混合。
在冰水浴中将茶浸泡液快速冷却至室温。
在茶叶输液中加入1.00mL工作溶液（步骤1.2），并充分混合。

2. 通过SAFE蒸馏茶叶输液和馏出物的液-液萃取

按照以下步骤准备 SAFE 程序集。
1. 安装SAFE组件（图1），连接左下角的蒸馏瓶（图1[3]）和右下角的收集瓶（图1[4]）。连接 SAFE 玻璃组件后部的循环水管。安装冷阱（图1[5]），并将管子连接到玻璃组件右上角的真空泵（见材料表）。
  注意：检查循环水管的连接;确保入口进入顶部，出口从底部退出。使用去离子水进行循环，以防止秤堵塞SAFE组件中的白管，从而导致循环水循环不良并最终导致SAFE组件爆炸。蒸馏底部（图1[3]）可以通过搅拌棒搅拌，以促进样品的蒸发。
2. 将循环水的温度设置为50°C，将样品瓶的水浴温度设置为40°C。关闭真空阀（图1[2]）。
执行真空泵操作。
1. 打开真空泵的电源。
2. 逐渐将速度提高到100%的最高速度。
  注：如果速度未达到100%，请检查系统是否密闭以及系统内部是否有溶剂残留。
3. 达到高真空（最好是^10-3 Pa）后
  注意：将液氮添加到冷阱中时，真空度将提高。
进行样品蒸馏。
1. 开始水循环。
2. 向冷阱中加入液氮以覆盖收集瓶的外部。
3. 将茶输液倒入左上角的样品漏斗中（图1[1]），然后用玻璃塞盖住。
4. 将样品滴加引入蒸馏瓶中。控制样品滴速，使真空保持在10⁻³ Pa左右的适当范围内。
  注意：在此过程中添加液氮，以确保正确的收集瓶始终浸没在液氮中。尽量避免在冷阱中形成冷凝水。
蒸馏完成后关闭真空泵。
1. 按下电源开关。当“停止”闪烁时，按回车键进行确认。
2. 当分子泵的速度降低到“0”时，拔下电源线。
  注意：仅当速度降低到“0”时重新启动。
将系统恢复到大气压。
1. 取下取样瓶上方的研磨塞。
2. 慢慢拧下真空阀的旋钮，使系统恢复到大气压。
取下装有样品的收集瓶。
1. 将系统恢复到大气压后，取出收集瓶外的液氮。
2. 慢慢拧开收集瓶。小心地取下装有样品的收集瓶。
3. 关闭循环水。
对安全馏出物进行液-液萃取。
1. 让瓶中的 SAFE 馏出物加热至室温。
2. 用 50 mL 二氯甲烷提取 SAFE 馏出物三次（参见 材料表）。
3. 合并二氯甲烷层。用无水硫酸钠干燥提取物（见 材料表）。
  注意：溶剂中的无水硫酸钠在不再胶结并且可以自由流动时被认为足够干燥。
4. 使用温和的氮气流将提取物浓缩至约 2 mL。
5. 转移到 1-2 mL 的样品瓶中，并使用温和的氮气流进一步浓缩至 200 μL。

3. 气相色谱-质谱分析与数据处理

使用配备熔融石英毛细管柱的GC-MS系统（图2）分析方案第2部分中制备的香气浓缩物（参见 材料表）。
使用氦气作为载气，线速度为 40 cm/s。
以不分流进样模式进样 3 μL 浓缩物。
设置GC炉温度程序：（1）在40°C下保持5分钟;（2）以5°C/min升至200°C;（3）以10°C/min的速度升至280°C;（4）在280°C下保持10分钟。
在正EI模式¹³ 下操作质量选择检测器，在70 eV下的质量扫描范围为30 m/z至350 m/z。
使用自动质谱反卷积和识别系统（AMDIS，参见 材料表）对GC-MS数据进行反卷积。
使用NIST（美国国家标准与技术研究院）17质谱仪搜索程序³对反卷积后的数据进行匹配和鉴定。
在相同的GC条件下，根据一组正构烷烃（C5-C25，参见材料表）的结果计算化合物¹⁴的保留指数。
使用NIST质谱库和保留指数数据库，基于质量和保留指数的同时匹配来鉴定GC峰。
使用TIC（总离子色谱）峰面积计算SAFE样品中每种挥发性组分相对于内标的浓度。
重复分析三次，从茶叶输液准备开始。

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Representative Results

本节使用红茶和绿茶样品的香气分析示例来说明上述分析程序。

代表性的GC-MS色谱图如图3所示。图3A显示了一组正构烷烃，图3B显示了内标的概况。绿茶和红茶样品提取物的评估结果分别显示在图3C和图3D中。通过分析内标，可以检测到一个具有稳定基线的确定峰（图3B）。GC色谱图显示了总离子计数后从绿茶和红茶输液提取物中获得的完整GC谱图。

通过质谱匹配结合保留指数鉴定出绿茶和红茶样品中的104种香气化合物。相对定量由化合物相对于内标的峰面积计算。根据定性和定量结果绘制的热图显示了相对于绿茶和红茶样品内标的香气化合物含量（图4）。

图 1：SAFE 系统的示意图。（1）样品瓶用于样品收集。（2）真空阀;添加样品前必须保持系统关闭，并应适当调整样品的滴流量。（3）蒸馏瓶用于样品蒸馏。（4）收集瓶，用于收集蒸馏样品。（5）冷阱，用于回收收集瓶未收集的样品，并防止溶剂进入真空泵。请点击此处查看此图的大图。

图 2：GC-MSD 系统的示意图。 GC/MS 系统配备（1）多模式进样口，（2）控制氦气载体流量的流量控制模块（PCM），（3） 60 m x 0.25 m x 0.25 m 5 ms 毛细管柱，以及（4）气相色谱柱烘箱。进样样品中的茶提取物在GC柱中分离，载气流过GC柱，烘箱温度升高。组分通过EI离子源电离，然后在质量分析仪中进行分析。请点击此处查看此图的大图。

图3：成功GC-MS分析的典型总离子色谱图。（A）正烷烃的色谱图。所有正烷烃峰都分配给相应的碳数。（B）内标（对二甲苯-d10）的色谱图。（C）绿茶输液的代表性香气特征。（D）红茶输液的代表性香气特征。请点击此处查看此图的大图。

图 4：在红茶（BT）和绿茶（GT）样品中鉴定的 104 种香气化合物的热图。热图右侧颜色注释旁边的数字表示化合物的含量（相对于内标）。颜色深度表示物质含量的水平;颜色越深，相对含量越高。请点击此处查看此图的大图。

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Discussion

本文介绍了一种使用SAFE和GC-MS分析分析茶叶输液中挥发性化合物的有效方法。

茶叶输液具有复杂的基质，具有高含量的非挥发性成分。文献中已经描述了几种从茶叶输液中分离挥发性成分的方法。一种常用的方法是同时蒸馏萃取（SDE）^15,16。然而，它不适合分析茶香气，因为在整个蒸馏/提取过程中必须用水煮茶叶，这会导致茶叶成分发生化学反应，从而产生与原始样品非常不同的气味特征¹⁷。SAFE在高真空下低温蒸馏茶叶输液，从而最大限度地减少分析物的变化，并保留原始香气成分。

固相微萃取（SPME）是另一种常用于茶叶香气分析的方法^18,19。其优点在于程序简单且无溶剂。然而，纤维吸附香气组分的选择性使得难以获得反映样品香气特征的定量曲线，这限制了该方法在茶香气分析中的应用²⁰。

高真空转移（HVT）技术的开发是为了减少在香气分析中形成伪影的机会²¹。然而，HVT对高沸点和强极性的物质的提取收率较低，限制了其使用范围。

与上述定制方法不同，茶叶输液的SAFE馏出物不含任何非挥发性成分^22,23,24。馏出物中的香气可以使用有机溶剂定量提取，这意味着可以获得气味特征接近原始样品的提取物。Engel等人¹¹使用HVT或SAFE蒸馏蒸馏蒸馏正烷烃的混合物以检查效率。发现使用SAFE系统的馏出物产量明显高于每种烷烃的HVT。此外，沸点低于285°C的烷烃可以通过SAFE完全回收。

需要密切关注实验细节，以便进一步成功分析。（1）SAFE蒸馏过程中的真空压力会影响挥发性成分的回收，必须保持在较高水平，例如通过减慢样品添加速度。（2）在系统返回大气压之前，必须确保收集瓶浸入液氮中，以避免溶剂挥发物被右上方的冷阱冷凝或进入真空泵。（3）应确保循环水先开，后关。只有在去除液氮后才能关闭循环水;否则，它将冻结设备。（4）水浴应用磁铁搅拌，以辅助传热。

在这项研究中，在溶剂萃取之前进行了SAFE蒸馏。反向程序也是可行的，如果首先提取大量茶叶输液，然后通过SAFE蒸馏获得的提取物，这将特别有利。使用有机溶剂进行输液萃取的挑战是可能形成乳液。在这种情况下，需要额外的步骤来回收有机层，例如离心或选择不同的溶剂。实验后，必须清洁SAFE玻璃组件。乙醇或丙酮可用作清洗溶剂。部件应在使用前干燥。

总之，该协议提出了一种方法，使用SAFE蒸馏然后进行溶剂萃取来获得气味特征接近原始茶样品的香气浓缩物。该方法可应用于所有类型的茶样品，包括速溶茶粉和茶浓缩物，非常适合茶的分子感官研究。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项研究得到了中国国家自然科学基金（32002094,32102444），财政部和MARA的中国农业研究系统（CARS-19）以及中国农业科学院创新项目（CAAS-ASTIP-TRI）的支持。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alkane mix (C10-C25)	ANPEL	CDAA-M-690035
Alkane mix (C5-C10)	ANPEL	CDAA-M-690037
AMDIS	National Institute of Standards and Technology	version 2.72	Gaithersburg, MD
Analytical balance	OHAUS	EX125DH
Anhydrous ethanol	Sinopharm
Anhydrous sodium sulfate	aladdin
Black tea	Qianhe Tea		Huangshan, Anhui province, China
Concentrator	Biotage	TurboVap
Data processor	Agilent	MassHunter
Dichloromethane	TEDIA
GC	Agilent	7890B
GC column	Agilent	DB-5MS
Green tea	Qianhe Tea		Huangshan, Anhui province, China
MS	Agilent	5977B
p-Xylene-d10	Sigma-Aldrich
SAFE	Glasbläserei Bahr
Ultra-pure deionized water	Milipore	Milli-Q
Vacuum pump	Edwards	T-Station 85H