Summary
Este artigo descreve um procedimento passo a passo para o estabelecimento de um modelo de camundongos com fístula oronasal. A fístula oronasal foi criada empregando-se cautério oftalmológico aquecido para lesar a porção da linha média do palato duro, resultando na formação de uma abertura entre as cavidades oral e nasal.
Abstract
Este estudo apresenta um método utilizando o cautério oftalmológico aquecido para desenvolver um modelo viável para a investigação de fístulas oronasais. Camundongos C57BL/6 foram utilizados para estabelecer o modelo de fístula oronasal (ONF). Para a confecção da ONF, os camundongos foram anestesiados, imobilizados e seus palatos duros expostos. Durante o procedimento cirúrgico, uma lesão mucosa de 2,0 x 1,5 mm de espessura total foi induzida na linha média do palato duro com o uso de cátero oftalmológico. Foi fundamental controlar o tamanho da ONF e minimizar o sangramento para garantir o sucesso do experimento. A verificação da efetividade do modelo de ONF foi realizada no 7º dia de pós-operatório, englobando avaliações anatômicas e funcionais. A presença do septo nasal dentro da cavidade oral e a saída de água estéril das narinas à injeção na cavidade oral confirmaram o estabelecimento bem-sucedido do modelo de ONF. O modelo demonstrou uma fístula oronasal prática e bem-sucedida, caracterizada por baixa taxa de mortalidade, alterações significativas de peso e mínima variação no tamanho da ONF. Estudos futuros poderão considerar a adoção desta metodologia para elucidar os mecanismos de cicatrização de feridas no palato e explorar novos tratamentos para fístulas oronasais.
Introduction
A fístula oronasal (ONF), uma abertura anormal entre as cavidades oral e nasal, manifesta-se clinicamente como um defeito em uma área estrutural desde o processo alveolar até a úvula, que comumente ocorre como complicação após o reparo da fissurapalatina1. Pacientes com FON, apresentam refluxo alimentar, distúrbios articulatórios e comprometimento da função velofaríngea, afetando significativamente sua qualidade devida2,3,4. A taxa de FON pós-operatória varia de 2,4% a 55% devido a fatores como largura da fissura, tipo de Veau e método cirúrgico5,6,7,8. Além disso, a taxa de recorrência após o reparo da ONF é alta, variando de 0% a 43%9.
Vários novos tratamentos têm se mostrado promissores recentemente no campo da ONF, incluindo diferentes materiais, drogas e novas técnicas 10,11,12,13,14,15,16,17. A avaliação precisa dos efeitos terapêuticos é essencial, pois fornece a base para a seleção e o desenvolvimento de tratamentos com ONF. No entanto, a obtenção de uma avaliação válida em curto prazo para outros efeitos terapêuticos que não a cirurgia é um desafio, uma vez que as características das ONFs variam entre os diferentes pacientes. Portanto, o estabelecimento de um modelo de doença ONF é necessário para verificar a efetividade desses métodos de tratamento.
Há várias décadas, pesquisadores têm gerado o modelo de fístula oronasal (FON) em várias espécies animais, incluindoratos18,19, leitões20,21, miniporcos22 e cães23, uma vez que essas espécies possuem um substancial palato duro adequado para manipulação cirúrgica. No entanto, camundongos possuem uma sequência genética e genoma completo semelhantes aos humanos, tornando-os um importante modelo para pesquisa e desenvolvimento de novas drogas24,25,26. Além disso, os camundongos oferecem pouca variação de lote para lote, tornando-os uma escolha favorável para o estabelecimento do modelo ONF12,13,27.
No entanto, os passos detalhados para a criação da ONF não foram descritos, e a estabilidade do tamanho da ONF não foi levada em consideração. Além disso, a verificação da formação de ONF baseou-se apenas naobservação28, sem garantir comunicação direta entre as cavidades oral e nasal. Não foi demonstrada por outros meios, como a perda de peso corporal do camundongo devido às dificuldades alimentares causadas pela ONF. Além disso, não foi considerada a variação normal do tamanho da ferida, o que é crucial para estudos sobre drogas ou materiais que promovam ou inibam a cicatrização de feridas. Portanto, há uma forte necessidade de estabelecer um modelo de ONF estável e validado.
O objetivo deste estudo foi desenvolver um modelo prático de ONF que aborde as questões acima mencionadas, com a esperança de que este protocolo sirva de base para futuras pesquisas sobre os mecanismos de cicatrização de feridas palatinas e novos tratamentos para ONF.
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Protocol
Todos os procedimentos em animais neste estudo foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética da Escola de Estomatologia da China Ocidental, Universidade de Sichuan. Camundongos C57BL/6 adultos (fêmeas) foram utilizados para o presente estudo.
1. Preparo cirúrgico
- Reunir os instrumentos cirúrgicos necessários para o procedimento: germinador, cautério oftalmológico, tesoura microcirúrgica, pinça microcirúrgica, seringas e agulhas (26 g x 0,63 polegadas) (Figura 1A,B) (ver Tabela de Materiais).
OBS: Antes do procedimento cirúrgico, autoclave os instrumentais cirúrgicos, incluindo cautério oftalmológico, pinça microcirúrgica e tesoura microcirúrgica, a 102,9 kPa (1,05 kg/cm2) e 121 °C por 20 min. - Recolher os materiais cirúrgicos necessários: campos cirúrgicos, luvas de látex, algodão estéril, folhas estéreis, papel alumínio estéril, placa de espuma como plataforma cirúrgica, elásticos (que podem ser obtidos rasgando uma luva médica de látex) e fita adesiva (Figura 1C) (ver Tabela de Materiais).
NOTA: Use um conjunto separado de suprimentos para cada mouse, incluindo seringas e folhas estéreis para o campo cirúrgico. - Limpe a área cirúrgica e o aparelho (fonte de luz, placa de espuma e dispositivo de manutenção de temperatura, consulte Tabela de Materiais) usando lenços umedecidos com álcool. Cubra os botões e alças dos instrumentos que possam ser necessários durante o procedimento com papel alumínio estéril de metal.
- Abra assepticamente os instrumentais individuais e posicione-os cuidadosamente na área cirúrgica. Acione o germinador (ver Tabela de Materiais) e as luzes para uso durante o procedimento. Coloque o cautério oftalmológico no germinador e aqueça-o a 250 °C por 20 min.
2. Procedimento cirúrgico
- Realizar a fixação do mouse e abrir a cavidade oral seguindo os passos abaixo.
- Selecione um camundongo fêmea C57BL/6J pesando 20-25 g e com idade entre 8-12 semanas. Deixe o mouse por 7 dias antes de realizar qualquer procedimento.
- Anestesiar o rato por injeção intraperitoneal de Zoletil50 (80 mg/kg) e Xilazina (5 mg/kg) (ver Tabela de Materiais). Aplique pomada oftálmica ocular no olho do rato. Aguarde até que não haja resposta de pinça dos dedos.
Observação : O mouse está pronto para o procedimento quando ele não é possível virar independentemente. - Fixe o mouse em uma placa de espuma forrada com folhas estéreis. Utilizar fita adesiva para amarrar o mouse à plataforma cirúrgica em decúbito dorsal (Figura 2A).
- Abra a cavidade oral do rato. Posicione duas agulhas (26 g x 0,63 polegada) à frente do plano orbital da orelha e mais duas atrás dele. Coloque um elástico ao redor das agulhas e atravesse os incisivos para manter a boca aberta. Utilizar pinça microcirúrgica para escorar a abertura dos cantos da boca (Figura 2B).
NOTA: Certifique-se de que o palato duro está claramente exposto. Fixe a língua sob o elástico para evitar obstrução do campo de visão e queimadura durante os experimentos subsequentes.
- Criar a fístula oronasal (ONF) no palato duro (Figura 3A-F).
- Recuperar o cautério oftalmológico, que foi aquecido a 250 °C por 20 min. Colocar a ponta do cautério a 1 mm de distância da intersecção da linha média do palato com a linha do primeiro pré-molar, criando uma lesão mucosa de espessura total do palato duro na linha média.
NOTA: Evite escaldar a língua do rato. - Após alguns segundos, retirar o cautério oftalmológico quando a mucosa ao redor da ponta do cautério ficar branca.
- Colocar o cautério oftalmológico no germinador e continuar a aquecê-lo a 250 °C por 10 min. Repita o passo anterior para ampliar a ferida ao redor das bordas até atingir um comprimento de 2,0 mm e uma largura de 1,5 mm.
NOTA: Cada extensão deve seguir a borda da última lesão. Use um paquímetro vernier para medir o comprimento e a largura da lesão. A lesão deve cobrir 10% do palato. - Use uma tesoura microcirúrgica para remover qualquer excesso de tecido mole desnaturado ao redor da ferida. Use algodão estéril para parar o sangramento e evitar a asfixia por inalação do rato. Meça a ferida para garantir que ela forme uma lesão mucosa do palato duro de espessura total medindo 2,0 x 1,5 mm na linha média.
- Recuperar o cautério oftalmológico, que foi aquecido a 250 °C por 20 min. Colocar a ponta do cautério a 1 mm de distância da intersecção da linha média do palato com a linha do primeiro pré-molar, criando uma lesão mucosa de espessura total do palato duro na linha média.
3. Cuidados pós-operatórios
- Administrar Meloxicam em camundongos no momento do despertar pós-operatório, na dose de 5 mg/kg/d por 3 dias, por via subcutânea29.
- Coloque o mouse em um dispositivo de manutenção de temperatura até que ele recupere totalmente a consciência.
NOTA: Certifique-se de que o rato está posicionado de forma a facilitar a respiração. Gire os ratos a cada 10-15 minutos para evitar o acúmulo de sangue ou colapso dos lobos pulmonares. Depois que o rato aquecer, devolva-o à sua gaiola. Forneça geleia estéril e ração irradiada no fundo da gaiola para os ratos consumirem.
4. Verificação da confecção da fístula oronasal
OBS: O sucesso da confecção da fístula oronasal (ONF) é avaliado no 7º dia após o procedimento cirúrgico.
- Prepare os materiais cirúrgicos necessários: elástico, fita, seringas, campos cirúrgicos, luvas de látex, folhas estéreis, papel alumínio estéril e placa de espuma.
- Use campos cirúrgicos e luvas estéreis para manter as condições assépticas. Desinfete a placa de espuma, a fonte de luz e o dispositivo de manutenção de temperatura com álcool.
- Induzir anestesia geral por injeção intraperitoneal de Zoletil50 (80 mg/kg). Aguarde até que não haja resposta de pinça dos dedos. Utilizar o mesmo método descrito nos passos 2.1.3 e 2.1.4 para imobilizar o rato e expor o palato duro.
- Realizar verificação anatômica estrutural, assegurando que o septo ainda esteja visível no local da ferida, indicando sucesso na confecção de FON (Figura 4A,B).
- Realizar verificação funcional: feche a cavidade oral do camundongo e injete água estéril em sua cavidade oral usando uma seringa estéril. A criação bem-sucedida de ONF é confirmada quando o fluido flui das narinas do camundongo.
- Coloque o rato no dispositivo de manutenção da temperatura (37 °C) até recuperar totalmente a consciência. Gire os ratos a cada 10-15 minutos para evitar o acúmulo de sangue ou colapso dos lobos pulmonares.
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Representative Results
Para avaliar a viabilidade e estabilidade desse método experimental, o mesmo procedimento foi realizado em dez camundongos, e foram feitas observações quanto à mortalidade, mudanças no tamanho da ferida, peso corporal e análise histológica. Os camundongos foram eutanasiados no dia 7.
O procedimento apresentou baixa taxa de mortalidade. O cautério oftalmológico e o germinador, representados na Figura 1A-C, foram os principais instrumentos utilizados neste experimento. O modelo ONF foi criado de acordo com o protocolo fornecido. Entre os dez camundongos operados, apenas um expirou no 7º dia pós-operatório. A taxa de mortalidade geral ao longo do experimento foi de aproximadamente 10%.
Os resultados revelaram notável variabilidade no tamanho da ONF gerada pelo método descrito. No dia da cirurgia, todos os camundongos exibiram feridas ovais medindo 2,0 mm de comprimento e 1,5 mm de largura. Ao avaliar a formação de ONF no 7º dia de pós-operatório, observou-se variação significativa no tamanho da ONF (P = 0,0085) (Figura 5A,B).
A presença de ONF pode resultar em complicações como refluxo alimentar e dificuldades alimentares, podendo levar a alterações de peso. Portanto, o peso corporal dos camundongos também foi levado em consideração. Os camundongos foram pesados no dia da cirurgia (dia 1) e no 7º dia (dia 7) quando a formação de ONF foi examinada. Observou-se redução significativa do peso no 7º dia em relação ao 1º dia (P < 0,001) (Figura 6A,B). A perda de peso corporal foi de 25,16%.
Para análise histológica, tanto a ferida quanto o tecido normal foram retirados dos camundongos no 7º dia. Palatais isolados foram utilizados como amostras para o corte histológico. Foram colocados em caixas de embutimento de tecidos e fixados com paraformaldeído a 4% e reagente de descalcificação de ácido fórmico a 10%. Os tecidos foram então incluídos em parafina, seccionados em cortes de 7 μm ao longo dos planos coronais e corados com hematoxilina e eosina (H&E). A análise histológica da ONF revelou perda da mucosa do palato duro, osso desnudado e formação de ONF (Figura 7). Foi realizada histologia dos pulmões e não foram detectadas anormalidades entre camundongos normais e ONF.
Figura 1: Instrumentais e materiais cirúrgicos . (A) O germinador utilizado para aquecimento do cautério oftalmológico. (B) Instrumental cirúrgico: cautério oftalmológico, tesoura microcirúrgica, pinça microcirúrgica, seringas e agulhas (26 g x 0,63 polegada). (C) Material cirúrgico: campos cirúrgicos, luvas estéreis, algodão estéril, lençóis estéreis, papel alumínio estéril, placa de espuma, elásticos e fita adesiva. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Fixação do mouse e abertura da cavidade oral . (A) Os membros anteriores do camundongo foram colados para prendê-lo. (B) Agulhas de seringa foram inseridas na placa de espuma e um elástico foi colocado sobre as agulhas. A cavidade oral do camundongo foi aberta com elástico e pinça microcirúrgica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Confecção da fístula oronasal . (A) Exposição da cavidade oral. (B) Colocação da ponta do cautério oftalmológico na porção da linha média do palato duro. (C) Retirada do cautério oftalmológico. (D) Remoção do excesso de tecido mole ao redor da ferida com tesoura microcirúrgica. (E) Parar o sangramento usando algodão estéril. (F) Ferida palatina final formada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Exame da ferida palatina no 7º dia de pós-operatório . (A) Ferida palatina no dia 1. (B) Ferida palatina no 7º dia. Setas brancas indicam fístula oronasal (FAON). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Tamanho da ferida palatina no Dia 1 e Dia 7. (A) Valores médios para camundongos nos dias 1 e 7. (B) Diferença significativa verificada pelo teste t para amostras pareadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Peso dos camundongos no dia 1 e no dia 7. (A) Valores médios para camundongos no dia 1 e dia 7. (B) Diferença significativa verificada pelo teste t para amostras pareadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Observação histológica. A análise histológica da ONF mostra perda da mucosa do palato duro, osso desnudado e formação de ONF. (A) Fístula oronasal no 7º dia, aumento: 4x. (B) Fístula oronasal no 7º dia, aumento: 10x. (C) Controle sem lesão, aumento: 4x. (D) Controle sem lesão, aumento: 10x. A seta preta mostra a localização da ONF. Barras de escala: A,C = 200 μm; B,D = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Pesquisadores têm explorado vários materiais, fármacos e novas técnicas para o tratamento da ONF 10,11,12,13,14,15,16,17. Com os avanços nos procedimentos cirúrgicos, a incidência e a recorrência da ONF têm sido reduzidas. No entanto, devido às características únicas da doença, o número de pacientes com ONF na clínica é limitado, necessitando de um modelo padronizado para o estudo de potenciais tratamentos. Embora vários métodos para a criação de modelos de ONF tenham sido descritos 18,19,20,21,22,23, eles foram frequentemente breves e careciam de discussão detalhada do método experimental. A formação de ONF tem sido verificada através de estudos microscópicos e histológicos que descrevem as características histopatológicas12,13,27. Este protocolo teve como objetivo estabelecer um modelo reprodutível de FONA em camundongos para facilitar a pesquisa.
Alcançar a criação uniforme de ONF representava um desafio. Para garantir a reprodutibilidade, foi crucial danificar uniformemente os palatos dos camundongos. Controlar o diâmetro da ONF, minimizar a cicatrização de feridas e parar efetivamente o sangramento foram passos fundamentais na criação da ONF. A tesoura microcirúrgica foi utilizada para remover o excesso de partes moles ao redor da ferida após o uso do cautério oftalmológico, minimizando as alterações no diâmetro da ferida durante a fase de cicatrização. Entretanto, o uso de tesoura microcirúrgica para remoção do excesso de tecido acarretava o risco de sangramento significativo e até morte dos camundongos, contribuindo para maiores taxas de mortalidade observadas em outros experimentos12,13,27. Nesse protocolo, a combinação de tesoura microcirúrgica e cautério oftálmico hemostático foi empregada para desnaturar e remover o excesso de tecido, enquanto algodão estéril foi usado para controlar o sangramento. Este método reduziu significativamente o sangramento ou mesmo alcançou hemostasia completa devido ao efeito cauterizante do cautério oftálmico aquecido.
Um método alternativo para a criação do modelo de ONF em camundongos tem sido relatado, envolvendo o uso de um punch de biópsia13,27. Embora esse método tenha proporcionado melhor controle sobre o diâmetro da ferida devido ao tamanho consistente do punch, ele teve uma alta taxa de falha e representou desafios no gerenciamento da força necessária, potencialmente levando à morte dos camundongos. Controlar a profundidade e a força de confecção da FON, com esse método, foi difícil, e determinar se o septo nasal havia sido atingido foi um desafio. Além disso, o controle do sangramento foi problemático, e os camundongos estavam em risco de sufocamento devido ao sangramento grave durante o experimento.
No entanto, existem limitações para este método experimental. Em primeiro lugar, o tamanho da ferida não pode ser controlado pelo mesmo tamanho de fístula em cada camundongo em comparação com um punch de biópsia com um tamanho de diâmetro fixo. E instrumentos de medição devem ser usados para maximizar o tamanho de cada fístula. O tamanho da ferida palatina é fundamental para o experimento, pois o atraso na cicatrização da ferida é fundamental para a formação da ONF. Portanto, a determinação de um tamanho adequado para a ferida palatina é importante. Se a ferida for muito pequena, ela pode cicatrizar rapidamente, não atendendo aos requisitos de tempo para experimentos subsequentes. Por outro lado, se for muito grande, os ratos podem morrer de perda excessiva de sangue durante a cirurgia ou sentir dificuldade para comer após a cirurgia, levando à fome. Assim, é necessário explorar o tamanho ideal da ferida palatina. No entanto, o tamanho (2,0 mm x 1,5 mm) utilizado no experimento atual foi considerado adequado. Neste protocolo, usamos apenas camundongos fêmeas, mas camundongos fêmeas ou machos podem ser escolhidos de acordo com o desenho do estudo.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa e Desenvolvimento, Hospital de Estomatologia da China Ocidental, Universidade de Sichuan (RD-02-202107), Programa de Apoio à Ciência e Tecnologia da Província de Sichuan (2022NSFSC0743) e concessão da Fundação de Ciência Pós-doutoral de Sichuan (TB2022005) a H. Huang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Germinator | Electron Microscopy Sciences | 66118-20 | Heating and disinfection equipment |
| Latex gloves | Allmed | or similar | |
| Lights | Olympus | A1813 | |
| Meloxicam | MedChemExpress | HY-B0261 | crushed; 5 mg/kg |
| Microsurgical instruments (scissors and tweezers) | Jiangsu Tonghui Medical Devices Co. | M-Y-0087 | Surgical instrument |
| Ophthalmologic cautery | Suqian Wenchong Medical Equipment Co. | 1.00234E+13 | Surgical instrument |
| Sterile cotton, | Yancheng Begu Technology Co. | or similar | |
| Sterile metal foil | Biosharp | or similar | |
| Sterile sheets | 3M | XH003801129 | or similar |
| Surgical drapes | Yancheng Begu Technology Co. | or similar | |
| Syringes | Yancheng Begu Technology Co. | S-015301 | or similar |
| Tape | Bkmamlab | or similar | |
| Temperature maintenance device | Harvard Apparatus | LE-13-2104 | |
| Zoletil50 | Virbac | 80 mg/kg |
References
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