Summary
Denne protokollen beskriver metoder for å forberede perifere, modne og kjernefysiske øyelinsefiberceller for immunfluorescensfarging for å studere komplekse celle-til-celle-interdigitasjoner og membranarkitekturen.
Abstract
Linsen er et gjennomsiktig og ellipsoid organ i øyets fremre kammer som endrer form for å finfokusere lyset på netthinnen for å danne et klart bilde. Hovedtyngden av dette vevet består av spesialiserte, differensierte fiberceller som har et sekskantet tverrsnitt og strekker seg fra fremre til bakre poler av linsen. Disse lange og tynne cellene er tett motsatt naboceller og har komplekse interdigitasjoner langs cellens lengde. De spesialiserte sammenlåsingsstrukturene er nødvendige for objektivets normale biomekaniske egenskaper og har blitt omfattende beskrevet ved hjelp av elektronmikroskopiteknikker. Denne protokollen demonstrerer den første metoden for å bevare og immunflekke singulære samt bunter av muselinsefiberceller for å tillate detaljert lokalisering av proteiner i disse komplekst formede cellene. De representative dataene viser farging av perifere, differensierende, modne og nukleære fiberceller over alle regioner av linsen. Denne metoden kan potensielt brukes på fiberceller isolert fra linser av andre arter.
Introduction
Linsen er et klart og ovoid vev i øyets fremre kammer som består av to celletyper, epitel- og fiberceller 1 (figur 1). Det er et monolag av epitelceller som dekker linsens fremre halvkule. Fiberceller er differensiert fra epitelceller og utgjør hoveddelen av linsen. De høyt spesialiserte fibercellene gjennomgår en forlengelses-, differensierings- og modningsprogrammering, preget av tydelige endringer i cellemembranmorfologi fra linsens periferi til linsesenteret 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 , også kjent som linsekjernen. Linsens funksjon til finfokuslys som kommer fra forskjellige avstander på netthinnen, avhenger av dets biomekaniske egenskaper, inkludert stivhet og elastisitet 13,14,15,16,17,18,19. De komplekse intersifrasjonene av linsefibre har blitt antatt 20,21 og nylig vist seg å være viktige for linsestivhet 22,23.
Figur 1: Linseanatomidiagrammer og representative skanningselektronmikroskopibilder (SEM) fra linsefibre. Tegneserien viser en langsgående (fremre til bakre fra topp til bunn) visning av det fremre monolaget av epitelceller (skyggelagt i lyseblått) og en bulkmasse av linsefiberceller (hvit). Midten av linsen (skyggelagt i rosa) er kjent som kjernen og består av svært komprimerte fiberceller. Til høyre avslører en tverrsnitt tegneserie den langstrakte sekskantcelleformen til linsefibre som er pakket inn i et bikakemønster. Fiberceller har to brede sider og fire korte sider. Representative SEM-bilder langs bunnen viser de komplekse membraninterdigitasjonene mellom linsefiberceller på forskjellige dybder av linsen. Fra høyre har nydannede linsefibre i linsens periferi små fremspring langs kortsidene og kuler og stikkontakter langs bredsiden (røde bokser). Under modning utvikler linsefibre store padledomener som er dekorert av små fremspring langs kortsidene (blå bokser). Modne fiberceller har store padledomener illustrert av små fremspring. Disse sammenlåsende domenene er viktige for linsens biomekaniske egenskaper. Fiberceller i linsekjernen har færre små fremspring langs kortsidene og har komplekse tunge-og-spor-interdigitasjoner (lilla bokser). De brede sidene av cellen viser en kuleformet membranmorfologi. Tegneserien ble modifisert fra22,32 og ikke tegnet i målestokk. Skala bar = 3 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Linsen vokser ved å legge skall av nye fiberceller overlaid på toppen av tidligere generasjoner av fibre24,25. Fiberceller har en langstrakt, sekskantet tverrsnittsform med to brede sider og fire korte sider. Disse cellene strekker seg fra den fremre til bakre polen av linsen, og avhengig av arten kan linsefibrene være flere millimeter lange. For å støtte strukturen til disse langstrakte og tynne cellene, skaper spesialiserte interdigitasjoner langs de brede og korte sidene sammenlåsende strukturer for å opprettholde linseformen og biomekaniske egenskaper. Endringer i cellemembranform under fibercelledifferensiering og modning er grundig dokumentert ved elektronmikroskopi (EM) studier 2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,26,27,28,29 . Nydannede fiberceller har kuler og stikkontakter langs sine brede sider med svært små fremspring langs kortsidene, mens modne fibre har sammenlåsende fremspring og padleårer langs kortsidene. Kjernefibre viser tunge-og-spor-interdigitasjoner og kulemembranmorfologi. Lite er kjent om proteinene som kreves for disse komplekse sammenlåsende membranene. Tidligere studier på proteinlokalisering i fiberceller har stått på linsevevseksjoner, som ikke tillater klar visualisering av den komplekse cellearkitekturen.
Dette arbeidet har skapt og perfeksjonert en ny metode for å fikse enkelt- og bunter av linsefiberceller for å bevare den komplekse morfologien og for å tillate immunfarging for proteiner i cellemembranen og i cytoplasma. Denne metoden bevarer trofast cellemembranarkitektur, sammenlignbar med data fra EM-studier, og tillater farging med primære antistoffer for spesifikke proteiner. Vi har tidligere immunfarget kortikale linsefibre som gjennomgår differensiering og modning22,23. I denne protokollen er det også en ny metode for å farge fiberceller fra linsekjernen. Denne protokollen åpner døren for å forstå mekanismene for dannelse og endringer i membraninterdigitasjoner under fibercellemodning og linsekjernekomprimering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mus har blitt tatt vare på basert på en dyreprotokoll godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Indiana University Bloomington. Musene som ble brukt til å generere representative data var kontrolldyr (villtype) i C57BL6/J-bakgrunnen, hunner og 8-12 uker gamle. Både mannlige og kvinnelige mus kan brukes til dette eksperimentet, siden musens kjønn er svært lite sannsynlig å påvirke eksperimentets utfall.
1. Linsedisseksjon og innkapsling
- Euthanize mus etter National Institutes of Healths "Guide for omsorg og bruk av laboratoriedyr", samt dyrebruksprotokoller godkjent av institusjonen.
MERK: For denne studien ble mus euthanized av CO2 overdose etterfulgt av cervical dislokasjon i samsvar med en godkjent dyreprotokoll (Indiana University). - Enucleate øynene fra musene ved hjelp av buede tang ved å trykke vevet rundt øynene med den ene siden av tangen for å forskyve øyet ut av kontakten. Deretter lukker du tangen under øyet og løfter for å fjerne øyet fra stikkontakten. Overfør øynene til frisk 1x fosfatbufret saltvann (PBS) i et disseksjonsbrett.
- Klipp optisk nerve med ultrafin saks så nært som mulig til øyebollet. Sett forsiktig finspiss, rett pinsett inn i øyebollet gjennom optisk nerves utgang på øyets bakre side.
- Sett saks forsiktig inn på samme sted som pinsetten i trinn 1.3 og begynn å kutte et snitt fra bakre mot hornhinnen-skleralovergangen.
MERK: Gnagerlinser opptar ~ 30% av øynene. Utilsiktet skade vil oppstå hvis pinsetten eller saksen settes for dypt inn i øyet. - Fortsett å kutte langs hornhinnen-skleralkrysset til minst halvparten av krysset er skilt.
- Bruk pinsett til å skyve forsiktig på hornhinnen slik at linsen kan gå ut gjennom snittet laget med trinn 1.4 og 1.5.
- Fjern forsiktig store biter av vev fra linsen ved hjelp av finspiss, rett pinsett. Inspiser linsen for å finne ekvatorialområdet.
- Stikk hull i linsen med en rett pinsett med finspiss, og fjern deretter linsekapselen. Massen av linsefiberceller vil forbli intakt, og linseepitelmonolaget vil forbli festet til linsekapselen. Kast linsekapselen.
2. Linse enkeltfibercellefarging
- Overfør linsens fibercellemasse til en brønnplate med 500 μL nylaget 1% paraformaldehyd (PFA; i 1x PBS) løsning og inkuber prøvene ved 4 ° C over natten med mild mutasjon (figur 2A).
MERK: Volumene for de oppgitte løsningene er optimalisert for 48-brønnsplater. Hvis det brukes en annen størrelse brønnplate eller rør, juster volumene på løsningene tilsvarende. Fiksering, blokkering og vasking (1x PTX, 0,1% Triton X-100 i 1x PBS) løsninger ble laget med 10x PBS og dobbeltdestillert vann (ddH2O) til en endelig konsentrasjon på 1x PBS. - Overfør linsefibercellene til en 60 mm tallerken med 1% PFA. Bruk en skarp skalpell til å dele ballen av fiberceller i to langs dens fremre-bakre akse (figur 2B). Klipp halvdelene i to igjen langs samme akse for å produsere kvartaler.
MERK: Den fremre-bakre aksen gjenkjennes lett av retningen av fibercellene i vevsmassen. - Bruk rett pinsett for å fjerne kjerneområdet fra linsens fibercellekvarter (figur 2C).
MERK: Linsekjerneområdet er stivt i gnagerlinser, og midten av linsen vil enkelt skille seg fra de mykere kortikale fibrene. - Etterfest kvartalene i linsebarkregionen i 200 μL med 1% PFA i 15 minutter ved romtemperatur (RT) med forsiktig risting (300 rpm på en platerister).
- Vask vevskvarteret to ganger i 750 μL 1x PBS i 5 min hver med forsiktig risting ved RT.
- Blokker prøvene med 200 μL blokkeringsløsning (5% serum, 0,3% Triton X-100, 1x PBS) i 1 time ved RT med forsiktig risting.
MERK: For de representative dataene i denne protokollen ble prøvene ikke farget med primære eller sekundære antistoffer. Etter blokkeringstrinnet ble prøvene inkubert med hvetekimagglutinin (WGA; 1:100) og falloidin (1:100) (se materialtabell) i 3 timer ved RT med forsiktig risting og beskyttelse mot lys. Primær antistofffarging er vist i tidligere publikasjoner22,23. - Inkuber med 100 mikrol primær antistoffoppløsning over natten ved 4 °C med lett risting.
MERK: Antistoffene fortynnes i blokkerende oppløsning. Sammenlignet med lysbilder med vevseksjoner, er det flere celler i denne typen preparater. Primære antistoffkonsentrasjoner bør økes for å gi rikelig med antistoffer for å farge flere celler. Det anbefales å doble antistoffkonsentrasjonen fra det som brukes på vevssnitt. Det samme gjelder sekundære antistoffer. - Vask vevskvarteret tre ganger med 1x PTX (0,1% Triton X-100, 1x PBS) i 5 min hver ved RT med forsiktig risting.
- Inkuber fibercellene med 100 μL sekundær antistoff / fargestoffoppløsning i 3 timer ved RT med forsiktig risting. Beskytt prøvene mot lys under dette og påfølgende trinn.
MERK: WGA, phalloidin og andre fluorescerende fargestoffer kan tilsettes til den sekundære antistoffløsningen for samtidig merking av cellemembranen, cytoskjelettet eller andre organeller samtidig som det primære antistoffet merkes. - Vask fibercellene fire ganger med 1x PTX i 5 min hver ved RT med forsiktig risting.
- Legg til en dråpe eller 50 μL monteringsmedier på et plussladet mikroskopglass før du overfører vevskvarterene til lysbildet.
- Bruk pinsett til å forsiktig skille fibercellene fra hverandre og prøv å begrense overlapping av cellebunter.
- Påfør forsiktig en # 1.5 coverslip på toppen av prøven i monteringsmedier. Monteringsmediet skal spre seg til kanten av dekselet; Hvis dette ikke skjer, legger du til noen ekstra monteringsmedier på kanten av dekselet. Aspirer bort overflødige monteringsmedier rundt kanten av dekselet og bruk neglelakk for å forsegle kantene på dekselet på lysbildet.
MERK: Enhver type monteringsmedium som er formulert for konfokalmikroskopi, kan brukes til disse eksperimentene.
3. Linsekjerne enkeltfibercellefarging
- Fullfør disseksjonen som er skissert i avsnitt 1.
- Fjern mekanisk kortikale fibre fra ballen av linsefibercellene, forlater linsekjernen, ved forsiktig å overføre fibercellemassen til våte, hanskede fingertuppene og forsiktig rulle vevsmassen.
MERK: I muselinser er rulling av ballen av linsefiberceller mellom hanskede fingertupper en effektiv metode for fjerning av kortikale fiberceller fra den harde linsekjernen 28,30. For linser hvor denne mekaniske metoden ikke er effektiv, kan forsiktig disseksjon eller en virvelmetode29 brukes til å fjerne kortikale fiberceller. - Overfør linsekjernen til nylaget 1 % PFA-oppløsning i en brønnplate og inkuber over natten ved 4 °C med forsiktig risting.
- Overfør prøven til en 60 mm tallerken med 1% PFA og bruk en skarp skalpell for å dele linsekjernen langs den fremre-bakre aksen. Halver vevsprøvene igjen for å produsere kjernekvarter.
- Følg prosessen som er beskrevet i trinn 2.4-2.13 for immunfarging og prøvemontering.
Figur 2: Grafisk sammendrag som beskriver fremstilling og immunfarging av linsefiberceller . (A) Denne 48-brønnsplaten har blitt fargekodet etter kolonne for å demonstrere et prøveplateoppsett for de beskrevne metodene, noe som muliggjør enkel overføring av prøver mellom de forskjellige immunfargingstrinnene ved skånsom håndtering ved hjelp av tang. Mens de representative dataene for denne protokollen ikke inkuberes med et primært antistoff, inneholder diagrammet en kolonne for primær antistoffinkubasjon, og brønnene for vask kan gjenbrukes etter fjerning av brukte vaskebuffere ved aspirasjon. (B) Etter fiksering av linsens fibercellemasse splittes vevet langs den fremre-bakre akse (røde stiplede linjer) for å bevare cellens opprinnelige struktur. Når vevsmassen er halvert, roteres prøvene og halvdelene deles i kvartaler langs fremre bakre akse (røde stiplede linjer). (C) Fjerning av linsekjerneområdet (i rosa) gjøres enkelt ved hjelp av pinsett for å grave ut det tette sentrale vevet fra kortikale fiberceller (i blått). Tegneseriediagrammer ble delvis opprettet ved hjelp av BioRender.com og ikke tegnet i skala. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Linsefiberceller fremstilles fra linsebarken (differensierende fibre og modne fibre) og kjernen, og cellene er farget med falloidin for F-aktin og WGA for cellemembranen. En blanding av bunter av celler eller enkeltlinsefibre (figur 3) observeres og avbildes. Fra linsebarken finner man to typer celler (figur 3A). Differensierende fiberceller i linsens periferi er rette, med svært små fremspring langs kortsidene. Når cellen differensierer, blir fibercellene bølgete med små sammenlåsende fremspring. Videre, langs modningsprosessen, utvikler fiberceller store padler dekorert med små sammenlåsende fremspring. Linsekjernen er svært kompakt og stiv i muselinser, og isoleres via mekanisk fjerning av den mykere linsebarken før fiksering og farging av kjernelinsefibrene. Fra linsekjernen finnes bunter av linsefibre som er mindre i diameter og har fine membranstrukturer som ikke lett kan ses på et bilde med lav forstørrelse.
I 3D-rekonstruksjoner med høy forstørrelse av linsefiberceller fra forskjellige områder av linsen (figur 3B), er det funnet at F-aktin og WGA er sterkt kolokalisert ved cellemembranen i differensierende og modne fiberceller. F-aktin er anriket i de sammenlåsende fremspringene langs cellemembranen i differensierende og modne fibre (figur 3B, pilspisser). Modne fiberceller utvikler store sammenlåsende padler (figur 3B, stjerner). WGA-fargingen er ikke fullstendig samlokalisert med F-aktinsignalet, spesielt i den modne fibercellen, noe som tyder på at det kortikale aktinnettverket ikke støtter alle de mindre strukturene langs cellemembranen. Uventet er det funnet at F-aktinnettverket er innenfor cytoplasma av kjernefysiske fiberceller. Mens F-aktinsignalet strekker seg inn i fremspringene (figur 3B, piler) langs kjernefibercellemembranen, er aktinnettverket ikke lenger anriket nær cellemembranen eller i fremspringene. Morfologien til kjernefibercellen mangler padler, i tillegg til en reduksjon i organisasjonen og frekvensen av fremspring.
Figur 3: Konfokale bilder av bunter (lav forstørrelse) og enkeltbilder (høy forstørrelse) av fiberceller fra forskjellige områder av linsen. Cellene er farget med WGA (cellemembraner, grønn), phalloidin (F-aktin, rød) og DAPI (kjerner, blå). (A) I disse preparatene finnes bunter av linsefiberceller ofte fra forskjellige regioner. I de kortikale preparatene er det differensierende og modne fiberceller. Disse forskjellige cellene har forskjellige morfologier, noe som muliggjør enkel identifisering. I prøvene fra linsekjernen finnes fibercellebunter samt dissosierte fibre. Skala bar = 50 μm. (B) Z-stabler gjennom enkelt differensierende, modne og kjernefysiske fiberceller samles inn, og 3D-gjengivelse brukes til å rekonstruere bildene som vises. De differensierende og modne fibrene har mange små fremspring langs kortsidene (pilspissene markerer utvalgte). Disse små fremspringene er beriket for F-aktin. Den modne fiberen har også store sammenlåsende padledomener (stjerner). Kjernefibrene har små membranlommer og divots farget av WGA og beholder noen fremspring langs kortsidene (pilene). Overraskende nok distribueres F-aktinnettverket nå i cellecytoplasma uten berikede signaler ved cellemembranen. F-aktinnettverket strekker seg inn i små fremspring. Skala bar = 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Når fibercellene undersøkes, er det viktig å merke seg orienteringen av cellene for å unngå forvirring om hvilken type celle som blir observert. Z-stacks samles gjennom cellene, og deretter brukes 3D-rekonstruksjon til å se på de ortogonale 2D-projeksjonene i XY-, XZ- og YZ-planene. På grunn av den tilfeldige orienteringen av celler i dette preparatet, er det mulig å ha celler som ikke ligger helt flatt på glassglasset (figur 4). Alle cellene i dette representative bildet er modne linsefibre, men hver celle har et drastisk forskjellig utseende i XY-planet. Cellen pseudofarget i grønt er orientert med bred side opp med synlige padleårer og fremspring, mens cellen pseudofarget i rosa ligger med kortsiden opp. Dette visualiseres lettere i XZ-planet, og viser vinkelrett orientering av de to cellene vist i XY-planet. Undersøkelse av YZ-flyet viser tydelig padlene til den modne fiberen som er farget rosa fra XY-planet.
Figur 4: Ortogonale 2D-projeksjoner (XY-, XZ- og YZ-plan) av 3D-konfokale z-stakker gjennom en gruppe enkeltmodne linsefiberceller farget med falloidin for F-aktin. To celler er pseudofarget i rosa eller grønt for identifikasjon på hvert plan. I XY-planet ligger den rosa cellen med kortsiden vendt opp, mens den grønne cellen ligger flatt med den brede siden vendt opp. I XZ-planet observeres det at den rosa cellen er vippet i orientering, mens den grønne cellen er parallell med glassglasset. I YZ-planet observeres padlene og fremspringene til de rosa cellene, og bekrefter at denne cellen er en moden fibercelle. Skala bar = 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Siden fibrene er ca.2-4 μm i tykkelse 25,31, er det mulig gjennom samlingen av z-stabler å se celleoverflaten eller et plan gjennom cytoplasma (figur 5). Dette fungerer best på celler som er nesten parallelle med dekselet, med den brede siden av cellen vendt oppover. Celleoverflaten i denne modne fibercellen kan bli verdsatt ved å observere WGA-signalet (figur 5A). XZ-planet viser tydelig at dette XY-planet er langs den brede siden av cellen. Liten WGA+ puncta langs membranen antyder en grov celleoverflatemorfologi. De små fremspringene langs kortsiden på bilder med lav eksponering viser et sterkt beriket F-aktinsignal. Ved høyere eksponering, hvor F-aktinsignalet i fremspringene er mettet, observeres et fint retikulert F-aktinnettverk over cellemembranen (stjerner). Når et XY-plan vurderes gjennom cytoplasmaet til den modne fiberen (figur 5B), observeres WGA-farging hovedsakelig langs cellemembranen. I likhet med det man ser på celleoverflaten, er F-aktin anriket i fremspringene langs kortsidene, med et retikulert cytoplasmatisk F-aktinnettverk synlig ved høyere eksponering (stjerner). Vårt tidligere arbeid har vist farging for membranproteiner i XY-plan gjennom cellecytoplasma22,23, men med denne metoden er det også mulig å lokalisere proteiner langs den brede sidecelleoverflaten.
Figur 5: Ortogonale 2D-projeksjoner (XY- og XZ-plan) av 3D-konfokale z-stabler gjennom en enkelt moden fibercelle farget med WGA (grønn) og falloidin (F-aktin, rød). (A) Projeksjoner fra celleoverflaten langs den brede siden viser WGA langs cellemembranen, og punctaen til WGA antyder at membranen ikke er helt glatt. F-aktin er anriket i fremspringene langs kortsidene, og et høyeksponeringsbilde av F-aktinfargingen avslører et retikulert nettverk langs cellemembranen (stjerner). (B) Et annet plan gjennom cytoplasmaet til den samme cellen viser WGA langs cellemembranen, som rammer inn cellen. F-aktin danner et retikulert nettverk gjennom cytoplasma (stjerner) og er sterkt beriket i fremspringene langs cellemembranen. Skalastenger = 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Deretter sammenlignes bilder av linsefibre fra skanning EM (SEM) og fargeeksperimenter. SEM-eksperimenter utføres som tidligere beskrevet29, og bilder tas sekvensielt fra midten av prøven til periferien. Først undersøkes differensierende linsefibre med små fremspring (figur 6, piler) langs kortsidene og en kule-og-sokkel (pilspisser) langs de brede sidene. I likhet med SEM-bildet (figur 6A), i en bunt av differensierende fibre orientert langs kortsidene, er kule-og-sokkel-interdigitasjonene store fremspring og spor som strekker seg langs den brede siden av cellene (figur 6B, pilspisser). En sokkel blir funnet (figur 6C, pilspisser) når cellen i XY og XZ ortogonale 2D-projeksjoner ses i enkeltdifferensierende linsefibre. Små sammenlåsende fremspring langs kortsidene er også trofast bevart i disse fargede linsefibercellene sammenlignet med de i SEM-bildet (piler). Deretter undersøkes morfologien til modne fiberceller (figur 7). I SEM-bildet og den fargede cellen er det små divots langs den brede siden av cellene (figur 7A,B, pilspisser). Antagelig er dette restene av ball-og-socket-interdigitasjonene som krymper under modningsprosessen. De store padlene (stjernene) dekorert av små sammenlåsende fremspring (piler) er sammenlignbare mellom cellene i SEM og den fargede modne fiberen. Cellene i SEM-bildet har også tydelige spor der et sammenlåsende fremspring dokker i cellemembranen (figur 7C, pilspisser). Disse sporene kan også sees i disse fargede cellene og fylles av WGA-signalet (figur 7D, pilspisser). Sporene kan se ut som fremspring som går innover mot cellecytoplasma i stedet for å projisere utover fra cellemembranen, og ofte er bare WGA-farging synlig i sporene som har svært lite, om noen, F-aktinfargesignal.
Figur 6: SEM- og konfokalmikroskopbilder av differensierende fiberceller fra linsebarken. Fiberceller for konfokalmikroskopi er farget med WGA (grønn) og falloidin (F-aktin, rød). (A) SEM av en bunt differensierende linsefibre viser kule-og-socket-interdigitasjoner (pilspisser) langs den brede siden av cellene med små sammenlåsende fremspring (piler) langs kortsidene av cellene. (B) Konfokale bilder av en bunt differensierende fibre avbildet fra kortsidene viser store kule-og-socket-interdigitasjoner langs de brede sidene av cellene (pilspisser). (C) Ortogonale 2D-projeksjoner (XY- og XZ-plan) gjennom en enkelt differensierende linsefiber viser en kule-og-socket-interdigitasjon (pilspisser) langs bredsiden og små sammenlåsende fremspring langs kortsiden (piler). Skalastenger = 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: SEM- og konfokalmikroskopbilder av modne fiberceller fra linsebarken. Fiberceller for konfokalmikroskopi er farget med WGA (grønn) og falloidin (F-aktin, rød). (A) SEM-bildet har to sammenlåsende modne fibre med padler (stjerner) dekorert av små fremspring (piler) langs kortsidene av cellene. Det er også små innrykk (pilspisser) langs den brede siden av cellen. Dette er muligens de krympende restene av kule-og-sokkel-fremspring. Skala bar = 5 μm. (B) Ortogonale 2D-projeksjoner (XY og XZ plan) gjennom en enkelt moden linsefiber har sammenlåsende store padler (stjerner) og små fremspring (piler) langs kortsidene av cellene. Små WGA+-ringer (pilspisser), som ligner på innrykkene i SEM-bildet, ses langs den brede siden av cellen. Disse WGA + -strukturene har ikke F-aktinfarging. F-aktin er for det meste anriket i cellemembranen i de små fremspringene og har et svakt retikulert fargemønster i cytoplasma. Skala bar = 5 μm. (C) SEM-bilde av de modne fibrene som viser mange spor i cellemembranen (pilspisser), hvor fremspring fra nabocellene hviler og låser seg. Skalastang = 2 μm. (D) Et par modne fibre som bare er separert og viser spor (pilspisser) farget av WGA. Sporene har ikke anrikning av F-aktinfarging og ser ut som fremspring som strekker seg innover mot cytosolen, i stedet for å strekke seg utover som en sammenlåsende struktur. Skala bar = 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Til slutt sammenlignes de fargede kjernelinsefibrene med bilder fra SEM-preparater. Denne nye metoden for å fikse og flekke kjernelinsefibre bevarer trofast morfologien til kjernefysiske linsefibre gjennom forskjellige områder av linsen (figur 8). Kjernefiberceller har sjeldne og større sammenlåsende fremspring langs kortsidene (piler). De ytterste kjernefysiske linsefibrene har en grov cellemembrantekstur, som sett i både SEM og fargede cellebilder. Når cellene gjennomgår ytterligere komprimering mot sentrum av kjernen, vises tunge-og-spor-interdigitasjoner langs cellemembranen (stjerner), og de innerste kjernefibrene har en kuleformet membranmorfologi som kan verdsettes på SEM-bildet og med WGA-farging. F-aktin er ikke lenger anriket i cellemembranen, men danner et nettverk som fyller cytoplasma og strekker seg svakt inn i fremspringene.
Figur 8: SEM- og konfokalmikroskopbilder av kjernefysiske linsefiberceller. Fiberceller for konfokalmikroskopi er farget med WGA (grønn) og falloidin (F-aktin, rød). (A) SEM-bilder av kjernefibre fra de ytterste lagene mot linsesenteret avslører sjeldne og større sammenlåsende fremspring på kortsidene av cellene (piler). Cellemembranen er grov i disse cellene, med tunge-og-spor interdigitasjoner (stjerner) og kulemembranmorfologi i de innerste cellene. (B) 3D-rekonstruksjoner av konfokale z-stakker gjennom enkle kjernefysiske linsefibre har sammenlignbare egenskaper som SEM-bildene, inkludert fremspring langs kortsidene (piler), tunge-og-spor-interdigitasjoner (stjerner) og den grove membranmorfologien som er tydelig med WGA-farging. F-aktin danner et nettverk som fyller cellecytoplasma og strekker seg svakt inn i fremspringene. Skalastenger = 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen har demonstrert fikserings-, bevarings- og immunfargingsmetodene som trofast bevarer 3D-membranmorfologien til bunter eller singulære linsefiberceller fra forskjellige dybder i linsen. De fargede linsefibrene sammenlignes med SEM-preparater som lenge har vært brukt til å studere linsefibercellemorfologi. Resultatene viser sammenlignbare membranstrukturer mellom begge preparatene. EM er fortsatt gullstandarden for å studere cellemorfologi, men immunmerking er mer utfordrende i SEM-prøver for lokalisering av proteiner33,34,35 og krever at et elektronmikroskop skal avbildes. Denne immunfargingsmetodens fordel er at flere mål kan merkes samtidig, og bilder samles på et konfokalmikroskop.
Mens metoden bevarer den komplekse cellemorfologien, er SEM fortsatt nødvendig for å sammenligne interdigitasjoner mellom kontroll og endrede linsefibre på grunn av genetisk mutasjon, aldring, farmasøytiske behandlinger, etc. Immunfargingspreparatet skaper en blanding av celler fra linsen, cortex eller kjerne som er tilfeldig fordelt på lysbildet. Således, hvis morfologien til cellene endres, kan det være vanskeligere å skille dybden der celler var plassert i linsen før dissosiasjon for farging. I disse tilfellene kan det være nødvendig å dissekere linsen ytterligere i områder av interesse etter fiksering og farging av mindre bunter av linsefibre for høyere romlig nøyaktighet. Fargeresultatene bør også sammenlignes med SEM-bilder for å sikre at de immunfargede fibrene bevarer morfologien til de endrede cellene.
Det har for første gang blitt vist at kjernefysiske fiberceller også kan bevares for farging ved hjelp av denne nyopprettede metoden. Det er viktig å fjerne linsebarken før fiksering av kjernen fordi fiksativ penetrasjon ikke når linsekjernen når du fester hele linsen27. Denne protokollens metode for å isolere linsekjernen beskriver mekanisk fjerning av mykere kortikale linsefibre. Dette er mulig i gnagerlinser på grunn av den svært harde og kompakte linsekjernen 28,30,36. I andre arter er linsekjernen mykere og kan kreve andre metoder for å isolere disse cellene for farging. Tidligere ble en vortexing-metode brukt til å fjerne kortikale fiberceller fra en knockout-muselinje med en mykere linsekjerne som ikke kunne isoleres pålitelig ved mekanisk fjerning29.
Selv om vi ikke påviste primær antistofffarging i disse representative dataene, har vi tidligere utført samme type farging med primære antistoffer og passende sekundære antistoffer22,23. Etter vår erfaring har mange av membranproteinene et punktsignal, og derfor anbefales bruk av WGA eller F-aktin i kortikale fibre eller WGA i nukleære fibre for å tydelig avgrense cellemembranen for bedre å lokalisere cellemembranproteiner og gjenkjenne hvert trinn av celledifferensiering og modning. WGA- eller F-aktinfargingen skal være i en synlig kanal (rød, grønn eller blå) slik at observatøren enkelt kan finne de riktige cellene for avbildning ved hjelp av okularet. Denne typen membranfarging kan også bidra til å identifisere eventuelle skader på cellene fra fikserings-, farge- og monteringsprosessen for å utelukke mekanisk skadede celler. I dette og tidligere arbeider22,23 observeres sjelden mekanisk skadede celler.
Denne metoden krever pasient og systematisk undersøkelse av celler for avbildning. Den tilfeldige blandingen av celler kan være ganske skremmende ved første øyekast, men celler som ligger i optimal orientering kan vanligvis bli funnet. Denne metoden kan tilpasses linsefibre isolert fra andre arter. I større linser kan det være mulig å bruke forsiktig disseksjon for å skille de forskjellige lagene av celler før immunfarging. Oppsummert har denne studien skapt en robust og pålitelig metode for å bevare bunter av fibre eller enkeltfiberceller for å studere deres komplekse morfologi og lokalisere proteiner i 3D i disse spesialiserte cellene. Denne unike protokollen for kjernefysisk fiberfarging åpner et nytt studieområde i de mindre godt studerte sentrale fibrene i linsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd R01 EY032056 (til CC) fra National Eye Institute. Forfatterne takker Dr. Theresa Fassel og Kimberly Vanderpool ved Scripps Research Core Microscopy Facility for deres hjelp med elektronmikroskopbildene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Triton X-100 | FisherScientific | BP151-500 | |
| 60mm plate | FisherScientific | FB0875713A | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 10X phosphate buffered saline | ThermoFisher | 70011-044 | |
| 1X phosphate buffered saline | ThermoFisher | 14190136 | |
| 48-well plate | CytoOne | CC7672-7548 | |
| Cover slips (22 x 40 mm) | FisherScientific | 12-553-467 | |
| Curved tweezers | World Precision Instruments | 501981 | |
| Dissection microscope | Carl Zeiss | Stereo Discovery V8 | |
| Fine tip straight tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72707-01 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | FisherScientific | 12-550-15 | |
| LSM 800 confocal microscope with Airyscan (63X) and Zen 3.5 Software | Carl Zeiss | ||
| Nail polish | |||
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Phalloidin (rhodamine) | ThermoFisher | R415 | |
| Primary antibody | |||
| Scalpel Feather Disposable, steril, No. 11 | VWR | 76241-186 | |
| Secondary antibody | |||
| Straight forceps | World Precision Instruments | 11252-40 | |
| Thermo Scientific Nunc MicroWell MiniTrays (dissection tray) | FisherScientific | 12-565-154 | |
| Ultra-fine scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Wheat germ agglutinin (fluorescein) | Vector Laboratories | FL-1021-5 |
References
- Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. Growth factor regulation of lens development. Developmental Biology. 280 (1), 1-14 (2005).
- Kuszak, J., Alcala, J., Maisel, H. The surface morphology of embryonic and adult chick lens-fiber cells. The American Journal of Anatomy. 159 (4), 395-410 (1980).
- Kuszak, J. R. The ultrastructure of epithelial and fiber cells in the crystalline lens. International Review of Cytology. 163, 305-350 (1995).
- Kuszak, J. R., Macsai, M. S., Rae, J. L. Stereo scanning electron microscopy of the crystalline lens. Scanning Electron Microscopy. , 1415-1426 (1983).
- Lo, W. K., Harding, C. V. Square arrays and their role in ridge formation in human lens fibers. Journal of Ultrastructure Research. 86 (3), 228-245 (1984).
- Taylor, V. L., et al.
- Vrensen, G. F. Aging of the human eye lens-a morphological point of view. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Physiology. 111 (4), 519-532 (1995).
- Vrensen, G. F., Duindam, H. J. Maturation of fiber membranes in the human eye lens. Ultrastructural and Raman microspectroscopic observations. Ophthalmic Research. 27, 78-85 (1995).
- Willekens, B., Vrensen, G. The three-dimensional organization of lens fibers in the rabbit. A scanning electron microscopic reinvestigation. Albrecht von Graefe's Archive for Clinical and Experimental Opthalmology. 216 (4), 275-289 (1981).
- Willekens, B., Vrensen, G. The three-dimensional organization of lens fibers in the rhesus monkey. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 219 (3), 112-120 (1982).
- Zhou, C. J., Lo, W. K. Association of clathrin, AP-2 adaptor and actin cytoskeleton with developing interlocking membrane domains of lens fibre cells. Experimental Eye Research. 77 (4), 423-432 (2003).
- Kuwabara, T. The maturation of the lens cell: a morphologic study. Experimental Eye Research. 20 (5), 427-443 (1975).
- Weeber, H. A., Eckert, G., Pechhold, W., vander Heijde, R. G.
- Weeber, H. A., et al. Dynamic mechanical properties of human lenses. Experimental Eye Research. 80 (3), 425-434 (2005).
- Weeber, H. A., vander Heijde, R. G. On the relationship between lens stiffness and accommodative amplitude. Experimental Eye Research. 85 (5), 602-607 (2007).
- Heys, K. R., Cram, S. L., Truscott, R. J. Massive increase in the stiffness of the human lens nucleus with age: the basis for presbyopia. Molecular Vision. 10, 956-963 (2004).
- Heys, K. R., Friedrich, M. G., Truscott, R. J. Presbyopia and heat: changes associated with aging of the human lens suggest a functional role for the small heat shock protein, alpha-crystallin, in maintaining lens flexibility. Aging Cell. 6 (6), 807-815 (2007).
- Glasser, A., Campbell, M. C. Biometric, optical and physical changes in the isolated human crystalline lens with age in relation to presbyopia. Vision Research. 39 (11), 1991-2015 (1999).
- Pierscionek, B. K. Age-related response of human lenses to stretching forces. Experimental Eye Research. 60 (3), 325-332 (1995).
- Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens. Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).
- Lo, W. K., et al. Aquaporin-0 targets interlocking domains to control the integrity and transparency of the eye lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1202-1212 (2014).
- Cheng, C., et al. Tropomyosin 3.5 protects the F-actin networks required for tissue biomechanical properties. Journal of Cell Science. 131 (23), (2018).
- Cheng, C., et al. Tropomodulin 1 regulation of actin is required for the formation of large paddle protrusions between mature lens fiber cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (10), 4084-4099 (2016).
- Kuszak, J. R.
- Bassnett, S., Costello, M. J. The cause and consequence of fiber cell compaction in the vertebrate lens. Experimental Eye Research. 156, 50-57 (2017).
- Biswas, S., Son, A., Yu, Q., Zhou, R., Lo, W. K. Breakdown of interlocking domains may contribute to formation of membranous globules and lens opacity in ephrin-A5(-/-) mice. Experimental Eye Research. 145, 130-139 (2016).
- Blankenship, T., Bradshaw, L., Shibata, B., Fitzgerald, P. Structural specializations emerging late in mouse lens fiber cell differentiation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (7), 3269-3276 (2007).
- Cheng, C., et al. Age-related changes in eye lens biomechanics, morphology, refractive index and transparency. Aging. 11 (24), 12497-12531 (2019).
- Cheng, C., et al. EphA2 affects development of the eye lens nucleus and the gradient of refractive index. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (1), 2 (2022).
- Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: strain and morphometric analyses. Journal of Visualized Experiments. (111), e53986 (2016).
- Forrester, J. V., Dick, A. D., McMenamin, P. G., Roberts, F., Pearlman, E. Anatomy of the eye and orbit. The Eye (Fourth Edition). Saunders, W. B. , 1 (2016).
- Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The lens actin filament cytoskeleton: Diverse structures for complex functions. Experimental Eye Research. 156, 58-71 (2017).
- Goldberg, M. W., Fiserova, J. Immunogold labeling for scanning electron microscopy. Methods in Molecular Biology. 1474, 309-325 (2016).
- Goldberg, M. W. High-resolution scanning electron microscopy and immuno-gold labeling of the nuclear lamina and nuclear pore complex. Methods in Molecular Biology. 1411, 441-459 (2016).
- Hermann, R., Walther, P., Muller, M. Immunogold labeling in scanning electron microscopy. Histochemistry and Cell Biology. 106 (1), 31-39 (1996).
- Gokhin, D. S., et al. Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens. PLoS One. 7 (11), e48734 (2012).
