Summary
यह प्रोटोकॉल ईवी की जमावट क्षमता के संकेतक के रूप में बाह्य पुटिका (ईवी) -समृद्ध प्लाज्मा के उपयोग की जांच करता है। ईवी-समृद्ध प्लाज्मा अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन और बाद में पुनर्गणना की प्रक्रिया के माध्यम से प्राप्त किया जाता है।
Abstract
विभिन्न रोगों में बाह्य पुटिकाओं (ईवी) की भूमिका पर अधिक ध्यान दिया जा रहा है, विशेष रूप से उनकी शक्तिशाली प्रोकोआगुलेंट गतिविधि के कारण। हालांकि, नैदानिक सेटिंग्स में ईवी की प्रोकोआगुलेंट गतिविधि का आकलन करने के लिए बेडसाइड परीक्षण की तत्काल आवश्यकता है। यह अध्ययन ईवी की प्रोकोआगुलेंट गतिविधि के उपाय के रूप में ईवी-समृद्ध प्लाज्मा के थ्रोम्बिन सक्रियण समय के उपयोग का प्रस्ताव करता है। सोडियम-साइट्रेटेड पूरे रक्त को प्राप्त करने के लिए मानकीकृत प्रक्रियाओं को नियोजित किया गया था, इसके बाद ईवी-समृद्ध प्लाज्मा प्राप्त करने के लिए अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन किया गया था। ईवी-समृद्ध प्लाज्मा और कैल्शियम क्लोराइड को परीक्षण कप में जोड़ा गया था, और एक विश्लेषक का उपयोग करके वास्तविक समय में चिपचिपाहट में परिवर्तन की निगरानी की गई थी। ईवी-समृद्ध प्लाज्मा का प्राकृतिक जमावट समय, जिसे ईवी-एसीटी कहा जाता है, निर्धारित किया गया था। परिणामों से ईवी-एसीटी में उल्लेखनीय वृद्धि का पता चला जब ईवी को स्वस्थ स्वयंसेवकों से प्राप्त प्लाज्मा से हटा दिया गया था, जबकि ईवी को समृद्ध करने पर यह काफी कम हो गया था। इसके अलावा, ईवी-एसीटी को प्रीक्लेम्पसिया, हिप फ्रैक्चर और फेफड़ों के कैंसर से मानव नमूनों में काफी छोटा किया गया था, जो प्लाज्मा ईवी के ऊंचे स्तर और रक्त हाइपरकोआग्यूलेशन को बढ़ावा देने का संकेत देता है। अपनी सरल और तेज़ प्रक्रिया के साथ, EV-ACT उच्च प्लाज्मा EV स्तरों वाले रोगियों में जमावट फ़ंक्शन के मूल्यांकन के लिए बेडसाइड परीक्षण के रूप में वादा दिखाता है।
Introduction
थ्रोम्बिसिस, जो हाइपरकोगुलेबिलिटी के कारण होता है, मस्तिष्क आघात1, प्री-एक्लेमप्सिया2, ट्यूमर3 और फ्रैक्चररोगियों सहित विभिन्न बीमारियों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। हाइपरकोगुलेबिलिटी अंतर्निहित तंत्र जटिल है, और हाल ही में जमावट विकारों में बाह्य पुटिकाओं (ईवी) की भूमिका पर जोर दिया गया है। ईवीएस एक द्विपरत संरचना के साथ पुटिका जैसे शरीर होते हैं जो कोशिका झिल्ली से अलग होते हैं, व्यास में 10 एनएम से 1000 एनएम तक होते हैं। वे रोग प्रक्रियाओं की एक किस्म के साथ जुड़े रहे हैं, विशेष रूप से जमावट विकारों5. कई अध्ययनों ने ईवीएस को घनास्त्रता जोखिम 6,7 के एक आशाजनक भविष्यवक्ता के रूप में पहचाना है। ईवीएस की प्रोकोआगुलेंट गतिविधि जमावट कारकों की अभिव्यक्ति पर निर्भर करती है, मुख्य रूप से ऊतक कारक (टीएफ) और फॉस्फेटिडाइलेरिन (पीएस)। मजबूत प्रोकोआगुलेंट गतिविधि वाले ईवीएस टेनेज और प्रोथ्रोम्बिन कॉम्प्लेक्स की उत्प्रेरक दक्षता में काफी वृद्धि करते हैं, जिससे थ्रोम्बिन-मध्यस्थता फाइब्रिनोजेन और स्थानीय घनास्त्रताको बढ़ावा मिलता है। ईवीएस के ऊंचे स्तर और हाइपरकोगुलेबिलिटी के साथ उनके कारण संबंधकई बीमारियों में देखे गए हैं। नतीजतन, ईवीएस का पता लगाने और उनके प्रोकोआगुलेंट गतिविधि की रिपोर्ट करना जांच का एक महत्वपूर्ण क्षेत्रहै।
आज तक, ईवीएस की प्रोकोआगुलेंट गतिविधि का पता लगाने के लिए केवल कुछ वाणिज्यिक किट उपलब्ध हैं। एक वाणिज्यिक कंपनी द्वारा उत्पादित एमपी-गतिविधि परख और एमपी-टीएफ परख, प्लाज्मा11 में ईवी की प्रोकोआगुलेंट गतिविधि को मापने के लिए उपयोग किए जाने वाले कार्यात्मक परख हैं। ये परखें ईवीएस पर पीएस और टीएफ का पता लगाने के लिए एंजाइम से जुड़े इम्युनोसॉरबेंट परख के समान सिद्धांत को नियोजित करती हैं। हालांकि, ये किट महंगे हैं और कुछ उच्च-स्तरीय अनुसंधान संस्थानों तक सीमित हैं। प्रक्रिया जटिल और समय लेने वाली है, जिससे उन्हें नैदानिक सेटिंग्स में लागू करना चुनौतीपूर्ण हो जाता है। इसके अतिरिक्त, एक व्यावसायिक रूप से विकसित प्रोकोआगुलेंट फॉस्फोलिपिड (पीपीएल) परख पीएस-पॉजिटिव ईवीएस12 के मात्रात्मक स्तर का पता लगाने के लिए थक्के के समय को मापने के लिए परीक्षण प्लाज्मा के साथ पीएस मुक्त प्लाज्मा को मिलाता है। हालांकि, ये परख मुख्य रूप से ईवीएस पर पीएस और टीएफ पर ध्यान केंद्रित करते हैं, अन्य थक्के मार्गों की अनदेखी करते हैं जो ईवीएस को प्रसारित करते हुए12 में शामिल हो सकते हैं।
प्लाज्मा जमावट प्रणाली जटिल है और इसमें "अदृश्य" और "दृश्यमान" दोनों घटक शामिल हैं, जिनमें कोगुलेंट, थक्कारोधी, फाइब्रिनोलिटिक सिस्टम और प्लाज्मा में निलंबित ईवीएस शामिल हैं। शारीरिक रूप से, ये घटक एक गतिशील संतुलन बनाए रखते हैं। रोग स्थितियों में, परिसंचरण में काफी वृद्धि हुई ईवीएस हाइपरकोगुलेबिलिटी में योगदान करती है, विशेष रूप से मस्तिष्क आघात, प्रीक्लेम्पसिया, फ्रैक्चर और विभिन्न प्रकार के कैंसर13 वाले रोगियों में। वर्तमान में, नैदानिक प्रयोगशालाओं में जमावट की स्थिति के मूल्यांकन में मुख्य रूप से जमावट प्रणाली, एंटीकोआग्यूलेशन सिस्टम और फाइब्रिनोलिसिस 14,15,16,17का आकलन करना शामिल है। प्रोथ्रोम्बिन समय, सक्रिय आंशिक थ्रोम्बोप्लास्टिन समय, थ्रोम्बिन समय, और अंतरराष्ट्रीय सामान्यीकृत अनुपात आमतौर पर जमावट प्रणाली18 में जमावट कारक के स्तर का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया जाता है। हालांकि, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि इन परीक्षणों पूरी तरह से कुछ रोगों19 की hypercoagulability को प्रतिबिंबित नहीं करते. थ्रोम्बोइलास्टोमेट्री (टीईजी), घूर्णी टीईजी, और सोनोक्लोट विश्लेषण जैसे अन्य परख विधियों, पूरे रक्त विस्कोलेस्टिक परिवर्तन20,21 को मापते हैं। चूंकि पूरे रक्त के नमूनों में कई रक्त कोशिकाएं और प्लेटलेट्स होते हैं, इसलिए इन परीक्षणों में नमूने की थक्के की स्थिति को इंगित करने की अधिक संभावना होती है। कुछ शोधकर्ताओं ने प्रोकोआगुलेंट गतिविधि22,23 में रक्त कोशिकाओं और प्लेटलेट्स की भूमिका पर रिपोर्ट की है। एक हालिया अध्ययन में यह भी पता चला है कि पिछले जमावट समारोह परीक्षण microparticles' procoagulant गतिविधि24 में परिवर्तन का पता लगाने में कठिनाइयों का सामना. इसलिए, एक परिकल्पना प्रस्तावित की गई है कि ईवीएस के प्रोकोआगुलेंट फ़ंक्शन का मूल्यांकन ईवी-समृद्ध प्लाज्मा में सक्रिय थक्के समय (एसीटी) के विस्कोलेस्टिक माप द्वारा किया जा सकता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
मानव नमूनों के संग्रह को टियांजिन मेडिकल यूनिवर्सिटी जनरल अस्पताल की मेडिकल एथिक्स कमेटी द्वारा अनुमोदित किया गया था। मानव शिरापरक रक्त का संग्रह चीन के राष्ट्रीय स्वास्थ्य आयोग द्वारा जारी दिशानिर्देश का सख्ती से पालन करता है, अर्थात् शिरापरक रक्त नमूनों के संग्रह के लिए WS/T 661-2020 दिशानिर्देश। संक्षेप में, पूर्वकाल ब्रेकियल क्षेत्र शिरा से सूचित सहमति के साथ स्वस्थ व्यक्तियों से रक्त एकत्र किया गया था, और नमूनों को 1: 9 के अनुपात में 3.2% सोडियम साइट्रेट थक्कारोधी का उपयोग करके मिश्रित किया गया था। जब केवल सोडियम साइट्रेट थक्कारोधी नमूने एकत्र किए गए थे, तो पहला संग्रह पोत त्याग दिया गया था। प्रसंस्करण प्रवाह नमूना संग्रह के 0.5 घंटे के भीतर शुरू किया गया था। सूचित सहमति प्राप्त करने के बाद नमूना संग्रह के लिए वयस्क स्वस्थ विषयों की भर्ती की गई थी। रोगी बहिष्करण मानदंड थे: (1) हाल ही में इंट्रावास्कुलर थ्रोम्बिसिस, (2) यकृत और गुर्दे की कार्यक्षमता हानि, (3) उच्च रक्तचाप, हाइपरलिपिडिमिया, मधुमेह, और अन्य पुरानी बीमारियां, (4) एस्पिरिन या थक्कारोधी उपचार, (5) मासिक धर्म और गर्भावस्था।
1. ईवी-समृद्ध प्लाज्मा का अलगाव
- रक्त कोशिकाओं को हटाने के लिए कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 120 x ग्राम पर नमूने अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला प्लेटलेट युक्त प्लाज्मा है। फिर, सतह पर तैरनेवाला के ऊपरी 1/2 को एक विंदुक के साथ एक नई अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें।
- प्लेटलेट्स को हटाने के लिए कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 1500 x ग्राम पर प्लेटलेट समृद्ध प्लाज्मा अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला प्लेटलेट-गरीब प्लाज्मा है। फिर सतह पर तैरनेवाला के ऊपरी 1/2 को एक नई अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें।
- सेल मलबे को हटाने के लिए कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 13000 x ग्राम पर प्लेटलेट-गरीब प्लाज्मा अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला ईवी युक्त प्लाज्मा है। फिर, बाद के परीक्षण के लिए एक नया अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए सतह पर तैरनेवाला के ऊपरी 1/2 हस्तांतरण.
2. विश्लेषक द्वारा नमूने के EV-ACT का पता लगाना
- क्लॉट एनालाइजर को चालू करें ( सामग्री की तालिकादेखें) और इंस्ट्रूमेंट को 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रीहीट करें। डिस्पोजेबल जांच और परीक्षण कप स्थापित करें, फिर मशीन की गुणवत्ता नियंत्रण प्रक्रिया शुरू करें।
नोट: जब स्क्रीन पर चिपचिपा प्रतिरोध संकेत मान एक सीधी रेखा के रूप में प्रदर्शित होता है, तो इसका मतलब है कि पता लगाने में हस्तक्षेप नहीं किया जाता है और विश्लेषक स्थिति का गुणवत्ता नियंत्रण योग्य है। स्व-परीक्षण योग्य होने के बाद परीक्षण प्रक्रिया शुरू की जा सकती है। - सिस्टम में नमूना जानकारी दर्ज करें। फिर, ईवी-समृद्ध प्लाज्मा के 200 माइक्रोन को टेस्ट कप में स्थानांतरित करें, इसके बाद कैल्शियम क्लोराइड के 20 एमएम 170 माइक्रोन स्थानांतरित करें। स्टार्ट बटन पर क्लिक करें। टेस्ट कप में चुंबकीय सरगर्मी रॉड नमूना और कैल्शियम क्लोराइड को पूरी तरह से मिलाएगी। कवर बंद करें, और नमूना प्रतिरोध में परिवर्तन का पता लगाने के लिए जांच शुरू हो जाएगी।
नोट: परीक्षण समाप्त होने के बाद, विश्लेषक स्वचालित रूप से "परीक्षण पूर्ण" का संकेत देगा। EV-ACT का समय सिस्टम द्वारा प्रदर्शित और रिकॉर्ड किया जाता है। परिणाम समय "सेकंड" की इकाई में व्यक्त किया जाता है। जांच को त्यागें और कप का परीक्षण करें।
3. ईवी-समृद्ध प्लाज्मा नमूने का प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित गुणवत्ता नियंत्रण
- ईवीएस को पहली बार उनके आकार (0.1-1 माइक्रोन) द्वारा पहचाना गया था। प्रवाह साइटोमीटर के मापदंडों को पहले से समायोजित करें और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पॉलीस्टायर्न मोतियों (0.5, 0.9, और 3.0 माइक्रोन) ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके ईवी के "गेट" को सेट करें।
नोट: मनका मिश्रण microvesicles (0.5 और 0.9 माइक्रोन) और प्लेटलेट्स (0.9 माइक्रोन और 3 माइक्रोन) के आकार सीमा को कवर विभिन्न व्यास के फ्लोरोसेंट क्षेत्रों के होते हैं. - फॉरवर्ड स्कैटर और साइड स्कैटर के वोल्टेज को समायोजित करें, और सुनिश्चित करें कि 0.9 माइक्रोन माइक्रोसेफर्स उपयुक्त क्षेत्र में आते हैं। ईवी क्षेत्र को माइक्रोस्फीयर के व्यास के अनुसार खींचा जा सकता है।
- ईवी-समृद्ध प्लाज्मा के 50 माइक्रोन को प्रवाह ट्यूब में स्थानांतरित करें, इसके बाद फ़िल्टर्ड फॉस्फेट बफर खारा के 450 माइक्रोन करें। अच्छी तरह से प्रवाह ट्यूब में तरल मिश्रण. अंत में, प्रवाह साइटोमेट्री25 का उपयोग करके नमूनों का पता लगाएं।
- EVs.In संक्षिप्त की संख्या निर्धारित करने के लिए अल्ट्रा इंद्रधनुष फ्लोरोसेंट कणों ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें, प्रवाह का पता लगाने से पहले नमूने में कणों के 10 माइक्रोन जोड़ें, और नमूना पहचान पूरा होने के बाद निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके ईवी एकाग्रता की गणना करें: 10,120 * ईवी (#) / (माइक्रोबीड्स * वॉल्यूम) * कमजोर पड़ने का कारक26।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ईवी-समृद्ध प्लाज्मा के थ्रोम्बिन सक्रियण समय को प्लाज्मा जमावट समय माप के लिए एक विस्कोलेस्टिक विधि विश्लेषक का उपयोग करके मापा गया था। मशीन में चार मुख्य घटक होते हैं: एक इलेक्ट्रॉनिक सिग्नल कनवर्टर, एक जांच, एक डिटेक्शन टैंक, और एक हीटिंग तत्व(चित्रा 1ए,बी)। प्लाज्मा चिपचिपाहट में परिवर्तन का पता लगाने के लिए जांच उच्च आवृत्ति और कम आयाम दोलनों का उपयोग करती है। दैनिक गुणवत्ता नियंत्रण में मुख्य रूप से परीक्षण मंच की स्थिरता का आकलन करने और जांच के लिए किसी भी भौतिक गड़बड़ी की पहचान करने के लिए वायु गुणवत्ता नियंत्रण शामिल है। प्रदर्शन गुणवत्ता नियंत्रण में मानक चिपचिपापन तेल के साथ परीक्षण शामिल है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि जांच द्वारा पता लगाया गया प्रतिरोध मूल्य निर्धारित सीमा के भीतर आता है।
ईवी-समृद्ध प्लाज्मा प्राप्त करने के बाद, नमूना गुणवत्ता नियंत्रण के लिए प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके ईवीएस को मापा गया। अयोग्य नमूने ईवी(चित्रा 2ए)के "गेट" के पास थोड़ा बड़ा कण आकार के साथ एक अलग क्लस्टर प्रदर्शित करते हैं। इसके विपरीत, योग्य ईवी-समृद्ध नमूने बताते हैं कि अधिकांश सिग्नल ईवी के "गेट" के भीतर एक समूह (चित्रा 2बी) के रूप में आते हैं।
स्वस्थ स्वयंसेवकों से ईवी-समृद्ध प्लाज्मा नमूनों में ईवी एकाग्रता का मूल्यांकन करने के लिए, सुपरस्पीड सेंट्रीफ्यूजेशन (1,00,000 x ग्राम, 70 मिनट) का प्रदर्शन किया गया था। परिणामों से पता चला कि ईवी एकाग्रता में वृद्धि ने ईवी-एसीटी को छोटा कर दिया, जबकि ईवी एकाग्रता में कमी ने ईवी-एसीटी(चित्रा 3ए)को लंबे समय तक बढ़ा दिया। EV-ACT समय EV स्तरों के साथ नकारात्मक सहसंबंध प्रदर्शित कर सकता है। नैदानिक रोगियों के कई नमूनों की जांच की गई, और निष्कर्षों से पता चला कि प्रीक्लेम्पसिया, हिप फ्रैक्चर और फेफड़ों के कैंसर (बाएं से दाएं) वाले रोगियों से ईवी-समृद्ध प्लाज्मा नमूने स्वस्थ स्वयंसेवकों (चित्रा 3बी) की तुलना में काफी कम ईवी-एसीटी समय थे।
अंत में, ईवी प्रोकोआगुलेंट गतिविधि का पता लगाने के लिए एक तेजी से और लागत प्रभावी प्रयोगात्मक विधि प्रारंभिक रूप से स्थापित की गई थी, जिसमें बेडसाइड परीक्षाओं में नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए वादा किया गया था।
चित्रा 1: योजनाबद्ध आरेख और थक्का विश्लेषक की भौतिक छवि। (ए) और (बी) क्रमशः विश्लेषक के मुख्य घटकों और ऑपरेशन सेटिंग्स का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: ईवी-समृद्ध प्लाज्मा में ईवी का प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री। (ए) अयोग्य ईवी-समृद्ध प्लाज्मा नमूने। (बी) योग्य ईवी-समृद्ध प्लाज्मा नमूने। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: नमूने के ईवी-अधिनियम के प्रतिनिधि परिणाम। (ए) ईवी हटाने और स्वस्थ स्वयंसेवकों से ईवी-समृद्ध नमूनों में ईवी एकाग्रता के बाद ईवी-एसीटी परिणाम (बाएं से दाएं, सुपरसेंट्रीफ्यूजेशन, ईवी-समृद्ध प्लाज्मा, और अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के बाद सतह पर तैरनेवाला)। (बी) स्वस्थ स्वयंसेवकों और रोगियों (बाएं से दाएं, प्रीक्लेम्पसिया, हिप फ्रैक्चर, फेफड़ों के कैंसर, और स्वस्थ स्वयंसेवक) से ईवी-समृद्ध नमूनों के ईवी-एसीटी परिणाम। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
इस अध्ययन में, ईवी-समृद्ध प्लाज्मा की तैयारी का वर्णन किया गया था, और प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके विधि की तर्कसंगतता को सत्यापित किया गया था। इसके बाद, recalcified प्लाज्मा नमूने चिपचिपाहट सिद्धांतों24 के आधार पर एक थक्का विश्लेषक का उपयोग कर अधिनियम समय के लिए विश्लेषण किया गया. जैसा कि चित्र 3A में दिखाया गया है, अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के माध्यम से प्राप्त EVs की सांद्रता EV-ACT समय को छोटा करने के लिए पाई गई थी, जबकि अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के बाद सतह पर तैरनेवाला, जिसने EV के स्तर को कम कर दिया था, ने लंबे समय तक EV-ACT समय का प्रदर्शन किया। ये निष्कर्ष ईवी-एसीटी परिणामों और ईवी स्तरों के बीच घनिष्ठ संबंध का सुझाव देते हैं। चित्रा 3 बी में, प्रीक्लेम्पसिया, हिप फ्रैक्चर और फेफड़ों के कैंसर वाले रोगियों से प्लाज्मा नमूनों के ईवी-एसीटी की तुलना स्वस्थ स्वयंसेवकों से की गई थी, जो रोग समूहों में काफी कम ईवी-एसीटी समय का खुलासा करते थे। पिछली रिपोर्टों ने इन बीमारियों के लिए प्लाज्मा में जमावट को बढ़ावा देने वाले ईवीएस के ऊंचे स्तर का संकेत दिया है 27,28,29. हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि प्लाज्मा में मौजूद अन्य कारक ईवी-एसीटी परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं, और इन प्रभावित करने वाले कारकों की आगे की खोज की आवश्यकता है। यह परख कुछ बीमारियों के हाइपरकोएग्युलेबल राज्य में ईवीएस की महत्वपूर्ण भूमिका को पहचानने का प्रस्ताव करता है और ईवी प्रोकोआगुलेंट गतिविधि के लिए कम लागत वाली और तेजी से पहचान विधि की कमी को संबोधित करता है।
पृथक रक्त नमूना प्रणाली के भीतर, जमावट से संबंधित पदार्थों को रक्त कोशिकाओं, प्लेटलेट्स, सेल मेटाबोलाइट्स (मुख्य रूप से ईवीएस), और अन्य "अदृश्य" घटकों (जैसे जमावट कारक और थक्कारोधी कारक)30,31,32में विभाजित किया जा सकता है। जमावट तंत्र की जटिलता को देखते हुए, अन्य कारकों से हस्तक्षेप को कम करने के लिए ईवी-समृद्ध प्लाज्मा के लिए पहचान प्रणाली को सरल बनाया गया था। इस प्रक्रिया में प्रमुख कदमों में नमूना प्रसंस्करण के दौरान कृत्रिम ईवी की पीढ़ी को रोकना और प्लेटलेट संदूषण को कम करना शामिल है। इसलिए, 0.5 घंटे के भीतर अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन प्रक्रिया शुरू करना और नमूना संग्रह के बाद 2 घंटे के भीतर पता लगाना पूरा करना आवश्यक है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि पर्याप्त उच्च केन्द्रापसारक बल का उपयोग कर और सतह पर तैरनेवाला के ऊपरी एक आधे को बनाए रखने प्रभावी ढंग से प्लेटलेट संदूषण33 को कम कर सकते हैं. ईवी-समृद्ध प्लाज्मा में अवशिष्ट प्लेटलेट्स का पता लगाने के लिए फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग किया गया था, जो उनकी बहुत कम उपस्थिति की पुष्टि करता है। अयोग्य नमूने मुख्य रूप से प्लेटलेट संदूषण और हैंडलिंग प्रक्रिया के कारण सेल विखंडन के परिणामस्वरूप होते हैं। प्लेटलेट संदूषण को ईवीएस के "गेट" के बाहर कणों की उपस्थिति की विशेषता है, जबकि सेल विखंडन ईवीएस के "गेट" के भीतर एक अलग क्लस्टर के रूप में दिखाई देता है।
हाल के अध्ययनों ने कुछ बीमारियों34,35 में प्लाज्मा ईवीएस के काफी ऊंचे स्तर की पुष्टि की है। ये ईवी मुख्य रूप से अपनी सतह पर फॉस्फेटिडाइलेरिन (पीएस) और ऊतक कारक (टीएफ) की उपस्थिति के माध्यम से जमावट को बढ़ावा देते हैं। इसलिए, ईवी-समृद्ध प्लाज्मा का एसीटी समय काफी हद तक कौयगुलांट ईवी के स्तर पर निर्भर करता है। इस परीक्षण की एक सीमा यह सुनिश्चित करने की आवश्यकता है कि थक्के कारकों के स्तर इस हद तक महत्वपूर्ण रूप से नहीं बदलते हैं कि वे ईवी-एसीटी विश्लेषण के दौरान थक्के के समय को प्रभावित करते हैं। हालांकि, बीमारी की शुरुआत के बाद थक्के कारक के स्तर में परिवर्तन पर अध्ययन अपेक्षाकृत दुर्लभ हैं, और ईवी-एसीटी पर उनके प्रभाव का मूल्यांकन आगे के शोध में किया जाना चाहिए। इसके अलावा, थक्कारोधी दवाओं का अत्यधिक उपयोग ईवी-एसीटी परिणामों को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित कर सकता है, इसलिए इस तरह के उपचार के दौरान इस पद्धति को नियोजित नहीं किया जाना चाहिए।
प्रोकोआगुलेंट ईवीएस निर्धारित करने के लिए कई तरीके मौजूद हैं, जिनमें से प्रत्येक के अपने फायदे और नुकसान हैं। Piwkham एट अल सामान्य प्लाज्मा के साथ EV निलंबन मिश्रण और 37 डिग्री सेल्सियस36 पर एक पानी के स्नान में रक्त के थक्के गठन के समय अवलोकन द्वारा EV procoagulant गतिविधि का मूल्यांकन किया. यद्यपि यह विधि सरल है, थक्का गठन समय के व्यक्तिपरक अवलोकन से विभिन्न पर्यवेक्षकों के बीच परिणाम भिन्नताएं हो सकती हैं। पाटिल एट अल एक अर्द्ध स्वचालित कोगुलोमीटर37 पर रसेल वाइपर जहर का उपयोग कर procoagulant microparticle परीक्षण के लिए एक घर में मानकीकृत थक्के परख नियोजित. यह पता लगाने की विधि अर्ध-स्वचालित उपकरणों का उपयोग करती है, जो उच्च दक्षता और सरलता प्रदान करती है। हालांकि, कारक एक्स को सक्रिय करने के लिए रसेल वाइपर जहर के अलावा प्लाज्मा में अन्य एंटीकोआगुलंट्स की उपस्थिति को नजरअंदाज करता है, जैसे कि लैक्टाडरिन प्रोटीन। यह विधि प्लाज्मा में प्रोकोआगुलेंट ईवीएस और थक्कारोधी घटकों के बीच संतुलन के आधार पर परिणामों का आकलन करती है, जो प्लाज्मा नमूने के थक्के समारोह का अधिक सटीक प्रतिबिंब प्रदान करती है।
मौजूदा जमावट समारोह परीक्षण मुख्य रूप से पूरे रक्त या प्लेटलेट युक्त रक्त में थ्रोम्बिन सक्रियण समय पर ध्यान केंद्रित, या जमावट कारकों24 में कमियों का पता लगाने. ईवी प्रोकोआगुलेंट गतिविधि के लिए एक परीक्षण विधि विकसित करने से रोग और भविष्य के उपचार में ईवीएस की भूमिका को स्पष्ट करने में मदद मिलेगी। सरल नमूना तैयार करने की प्रक्रिया, जिसमें केवल CaCl2 के अतिरिक्त शामिल है, चिकित्सकों के लिए परख को रोगियों के जमावट समारोह की स्थिति को जल्दी से निर्धारित करने के लिए सुविधाजनक बनाता है। EV-ACT परीक्षण करना आसान है, जिसके परिणाम 10-15 मिनट के भीतर उपलब्ध होते हैं, जिससे यह बेडसाइड परीक्षण के रूप में विकास के लिए उपयुक्त हो जाता है। पिछले अध्ययनों ने प्रीक्लेम्पसिया, ट्यूमर और फ्रैक्चर में ईवी-एसीटी के अनुप्रयोगों की अस्थायी रूप से पहचान की है। भविष्य के अनुसंधान ईवी-एसीटी की नैदानिक अनुप्रयोग संभावनाओं का पता लगाने के लिए जारी रहेंगे।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
सभी लेखकों ने घोषणा की कि ब्याज की कोई संभावित टकराव नहीं है।
Acknowledgments
इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन, अनुदान संख्या 81930031, 81901525 से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। इसके अलावा, हम मशीनों और तकनीकी मार्गदर्शन के साथ हमें प्रदान करने के लिए टियांजिन सेंचुरी यिकांग मेडिकल टेक्नोलॉजी डेवलपमेंट कं, लिमिटेड को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AccuCount Ultra Rainbow Fluorescent Particles | 3.8 microm; Spherotech, Lake Forest, IL, USA | For quantitative detection of MP | |
| Calcium chloride | Werfen (china) | 0020006800 | 20 mM |
| Century Clot analyzer | Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd | The principle is to measure plasma viscosity by viscoelastic method | |
| Disposable probe and test cup | Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd | ||
| LSR Fortessa flow cytometer | BD, USA | Used to detect MP | |
| Megamix polystyrene beads | Biocytex, Marseille, France | 7801 | The Megamix consists of a mixture of microbeads of selected diameters: 0.5 µm, 0.9 µm and 3 µm. |
References
- Zhang, J., Zhang, F., Dong, J. F. Coagulopathy induced by traumatic brain injury: systemic manifestation of a localized injury. Blood. 131 (18), 2001-2006 (2018).
- Han, C., Chen, Y. Y., Dong, J. F. Prothrombotic state associated with preeclampsia. Current Opinion in Hematology. 28 (5), 323-330 (2021).
- Campello, E., Bosch, F., Simion, C., Spiezia, L., Simioni, P. Mechanisms of thrombosis in pancreatic ductal adenocarcinoma. Best Practice & Research Clinical Haematology. 35 (1), 101346 (2022).
- You, D., et al. Identification of hypercoagulability with thrombelastography in patients with hip fracture receiving thromboprophylaxis. Canadian Journal of Surgery. 64 (3), E324-E329 (2021).
- Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. Circulating extracellular vesicles in human disease. The New England Journal of Medicine. 379 (10), 958-966 (2018).
- Zang, X., et al. Hepatocyte-derived microparticles as novel biomarkers for the diagnosis of deep venous thrombosis in trauma patients. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 29, 10760296231153400 (2023).
- Chen, Y., et al. Annexin V(-) and tissue factor(+) microparticles as biomarkers for predicting deep vein thrombosis in patients after joint arthroplasty. Clinica Chimica Acta. 536, 169-179 (2022).
- Wang, C., Yu, C., Novakovic, V. A., Xie, R., Shi, J. Circulating microparticles in the pathogenesis and early anticoagulation of thrombosis in COVID-19 with kidney injury. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 784505 (2021).
- Lacroix, R., Dubois, C., Leroyer, A. S., Sabatier, F., Dignat-George, F. Revisited role of microparticles in arterial and venous thrombosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (Suppl 1), 24-35 (2013).
- Cointe, S., et al. Standardization of microparticle enumeration across different flow cytometry platforms: results of a multicenter collaborative workshop. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 15 (1), 187-193 (2017).
- Ayers, L., Harrison, P., Kohler, M., Ferry, B. Procoagulant and platelet-derived microvesicle absolute counts determined by flow cytometry correlates with a measurement of their functional capacity. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25348 (2014).
- Mooberry, M. J., et al. Procoagulant microparticles promote coagulation in a factor XI-dependent manner in human endotoxemia. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (5), 1031-1042 (2016).
- Zhao, Z., et al. Cellular microparticles and pathophysiology of traumatic brain injury. Protein & Cell. 8 (11), 801-810 (2017).
- Bolliger, D., Tanaka, K. A. Point-of-care coagulation testing in cardiac surgery. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 43 (4), 386-396 (2017).
- Ganter, M. T., Hofer, C. K. Coagulation monitoring: current techniques and clinical use of viscoelastic point-of-care coagulation devices. Anesthesia & Analgesia. 106 (5), 1366-1375 (2008).
- Samuelson, B. T., Cuker, A., Siegal, D. M., Crowther, M., Garcia, D. A. Laboratory assessment of the anticoagulant activity of direct oral anticoagulants: a systematic review. Chest. 151 (1), 127-138 (2017).
- Maier, C. L., Sniecinski, R. M. Anticoagulation monitoring for perioperative physicians. Anesthesiology. 135 (4), 738-748 (2021).
- Tuktamyshov, R., Zhdanov, R. The method of in vivo evaluation of hemostasis: Spatial thrombodynamics. Hematology. 20 (10), 584-586 (2015).
- Tsantes, A. G., et al. Higher coagulation activity in hip fracture patients: A case-control study using rotational thromboelastometry. International Journal of Laboratory Hematology. 43 (3), 477-484 (2021).
- Premkumar, M., et al. COVID-19-related dynamic coagulation disturbances and anticoagulation strategies using conventional D-dimer and point-of-care Sonoclot tests: a prospective cohort study. BMJ Open. 12 (5), e051971 (2022).
- Sakai, T. Comparison between thromboelastography and thromboelastometry. Minerva Anestesiologica. 85 (12), 1346-1356 (2019).
- Yan, M., et al. TMEM16F mediated phosphatidylserine exposure and microparticle release on erythrocyte contribute to hypercoagulable state in hyperuricemia. Blood Cells, Molecules and Diseases. 96, 102666 (2022).
- Yu, H., et al. Hyperuricemia enhances procoagulant activity of vascular endothelial cells through TMEM16F regulated phosphatidylserine exposure and microparticle release. The FASEB Journal. 35 (9), e21808 (2021).
- Gao, Y., et al. MPs-ACT, an assay to evaluate the procoagulant activity of microparticles. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 29, 10760296231159374 (2023).
- Wang, J., et al. Brain-derived extracellular vesicles induce vasoconstriction and reduce cerebral blood flow in mice. Journal of Neurotrauma. 39 (11-12), 879-890 (2022).
- Tan, J., et al. Analysis of circulating microvesicles levels and effects of associated factors in elderly patients with obstructive sleep apnea. Frontiers in Aging Neuroscience. 13, 609282 (2021).
- Kubo, H.
- Gilani, S. I., Weissgerber, T. L., Garovic, V. D., Jayachandran, M.
- Pourakbari, R., Khodadadi, M., Aghebati-Maleki, A., Aghebati-Maleki, L., Yousefi, M. The potential of exosomes in the therapy of the cartilage and bone complications; emphasis on osteoarthritis. Life Science. 236, 116861 (2019).
- Shi, J., Gilbert, G. E. Lactadherin inhibits enzyme complexes of blood coagulation by competing for phospholipid-binding sites. Blood. 101 (7), 2628-2636 (2003).
- Dasgupta, S. K., Le, A., Chavakis, T., Rumbaut, R. E., Thiagarajan, P. Developmental endothelial locus-1 (Del-1) mediates clearance of platelet microparticles by the endothelium. Circulation. 125 (13), 1664-1672 (2012).
- Frey, B., Gaipl, U. S. The immune functions of phosphatidylserine in membranes of dying cells and microvesicles. Seminars in Immunopathology. 33 (5), 497-516 (2011).
- Rikkert, L. G., Coumans, F. A. W., Hau, C. M., Terstappen, L., Nieuwland, R. Platelet removal by single-step centrifugation. Platelets. 32 (4), 440-443 (2021).
- Chen, Y., et al. Association of placenta-derived extracellular vesicles with pre-eclampsia and associated hypercoagulability: a clinical observational study. BJOG. 128 (6), 1037-1046 (2021).
- Liu, Y., et al. The potential applications of microparticles in the diagnosis, treatment, and prognosis of lung cancer. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 404 (2022).
- Piwkham, D., et al. The in vitro red blood cell microvesiculation exerts procoagulant activity of blood cell storage in Southeast Asian ovalocytosis. Heliyon. 9 (1), e12714 (2023).
- Patil, R., Ghosh, K., Shetty, S. A simple clot based assay for detection of procoagulant cell-derived microparticles. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 54 (5), 799-803 (2016).
