Summary
Burada, FAM83A yıkım prosedürlerini gösteriyoruz; rahim ağzı kanseri hücrelerinin çoğalması, göçü ve istilası üzerindeki etkilerini tespit etmek için yapılan tahliller; ve bu hücrelerin sisplatine duyarlılığı. Bu çalışma, rahim ağzı kanseri için umut verici bir hedef gen ve daha ileri ilaç araştırmaları için bir referans sağlar.
Abstract
Tümör hedef genlerinin araştırılması, rahim ağzı kanserinin önlenmesi ve tedavisi için büyük önem taşımaktadır. Bu çalışmada, rahim ağzı kanserinde bir tümör hedef geni FAM83A'nın tanımlanmasında yer alan adımları özetledik. İlk olarak, kadınlarda FAM83A'nın ekspresyonunu ve prognostik önemini doğrulamak için Kanser Genom Atlası veri seti kullanıldı. HeLa ve C33a hücrelerinde FAM83A geninin yıkılması için küçük bir enterferans yapan RNA (siRNA) kullanıldı. Daha sonra, tümör hücrelerinin proliferasyon yetenekleri üzerindeki etkilerini belirlemek için 5-etinil-2'-deoksiüridin (EdU) boyaması yapıldı. Tümör hücre göçü ve invazyon yeteneklerini değerlendirmek için yara iyileşmesi ve gözenekli membran insert testleri yapıldı.
Apoptozla ilişkili protein seviyelerini ölçmek için Western blotlama kullanıldı. Mitokondriyal fonksiyon değişikliklerini değerlendirmek için JC-1 boyaması kullanıldı. Ayrıca, hedef genin terapötik potansiyelini değerlendirmek için sisplatin (diamindikloroplatin, DDP) müdahalesi kullanıldı. Genin antikanser özelliklerini daha fazla doğrulamak için akış sitometrisi ve koloni oluşumu testleri yapıldı. Sonuç olarak, FAM83A yıkımının rahim ağzı kanseri hücrelerinin çoğalmasını, göçünü ve istilasını inhibe ettiği ve bu hücreleri sisplatine duyarlı hale getirdiği gösterilmiştir. Bu kapsamlı metodolojiler, FAM83A'yı tümörle ilişkili bir hedef gen olarak toplu olarak doğrular ve rahim ağzı kanserinin önlenmesi ve tedavisinde potansiyel bir terapötik hedef olarak umut vaat eder.
Introduction
Rahim ağzı kanseri, dünya çapında jinekolojik malignitelerin önde gelen türlerinden biri olduğu ve kadınlarda kansere bağlı ölümlerin başlıca nedeni olduğu için küresel bir sorundur1. Radikal cerrahi ve kemoradyoterapi, birincil aşamada yüksek kür oranları ile ilişkilidir. Bununla birlikte, rahim ağzı kanserinin ileri evresinde metastatik hastalık gelişen hastalar için tedavi sonuçları çok elverişsizdir2. Bu nedenle, rahim ağzı kanseri hücrelerinin göçünün ve istilasının altında yatan biyolojik mekanizmaları daha iyi anlamak ve bu hastalığın önlenmesi ve tedavisi için potansiyel terapötik hedefleri belirlemek çok önemlidir.
Kanserin ilerlemesinde rol oynayan hedef genlerin belirlenmesi ve ekspresyonlarını veya etkilerini engellemenin yollarını bulmak umut verici tedavi seçenekleri sunar. Bu çalışmada, FAM83'ü kansere neden olan bir gen olarak tanımladık ve C33a ve HeLa hücreleri üzerindeki inhibitör etkilerini daha fazla araştırdık. FAM83 ailesi onkogenleri (FAM83A-H) insan kanserlerinde yaygın olarak bildirilmiştir 3,4. Son zamanlarda, FAM83A'nın akciğer5, meme6, yumurtalık7 ve pankreas8 kanserlerinde yukarı regüle olduğu bildirildi, bu da FAM83A'nın tümör hücrelerinde proliferasyon, invazyon, kök hücre benzeri özellikler ve ilaç direncini teşvik ederek kanserin ilerlemesinde önemli bir rol oynadığını gösteriyor. Önemli olarak, FAM83A, servikal lezyon progresyonu ve karsinogenez9 ile ilişkili yeni aday genlerden biri olarak tanımlanmıştır. İnsan rahim ağzı kanseri hücrelerinde artmış FAM83A ekspresyonunun doğrulanmasına rağmen, FAM83A'nın rahim ağzı kanserindeki spesifik etkisi ve altta yatan mekanizmaları belirsizliğini korumaktadır.
Bu çalışmada, rahim ağzı kanserinde FAM83A'nın bir tümör hedef geni olarak tanımlanmasında yer alan protokolleri özetledik ve HeLa ve C33a hücrelerinde FAM83A geninin yıkılması için küçük bir enterferans yapan RNA (siRNA) kullandık. Tümör hücresi proliferasyonu üzerindeki etkilerini belirlemek için 5-Etinil-2'-deoksiüridin (EdU) boyaması yapılırken, yara iyileşmesi ve gözenekli membran ekleme testleri tümör hücresi göçü ve invazyon yeteneklerinin değerlendirilmesine yardımcı oldu.
Apoptozla ilişkili proteinlerin seviyelerini belirlemek için Western blotlama yapıldı ve mitokondriyal fonksiyon değişikliklerini değerlendirmek için JC-1 boyaması kullanıldı. Bu nedenle, FAM83A'nın serviks kanserinde hücre proliferasyonu, metastaz ve invazyonunda kritik bir rol oynadığını bildirdik. PI3K / AKT yolu ile ilişkili mitokondriyal disfonksiyon ve apoptoz yoluyla, FAM83A nakavt rahim ağzı kanseri hücrelerini sisplatine (diamindikloroplatin, DDP) duyarlı hale getirdi. Bu çalışma, rahim ağzı kanseri ve muhtemelen diğer kanserler için yeni bir hedef ve kanser hücrelerinin belirli kemoterapötik ilaçlara karşı direncinin üstesinden gelmek için stratejilerin geliştirilmesi için bir referans sunmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Çalışma, TCGA (https://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines) tarafından sağlanan yayın kılavuzlarına tamamen uygundur. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler ve aletlerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.
1. Veri kaynağı ve biyoinformatik analizi
- Küme analizi için Kanser Genom Atlası (TCGA) veritabanından (https://cancergenome.nih.gov) RNA dizileme verilerini alın. Standart bir işleme boru hattı ile aday kanser ilacı hedeflerini taramak için TCGA projelerinden alınan örneklerin ham RNA-Seq verilerini yeniden hesaplamak için web tabanlı bir araç olan GEPIA'yı (http://gepia.cancer-pku.cn/) kullanın.
NOT: GEPIA web sitesi tüm kullanıcılar tarafından ücretsiz olarak kullanılabilir. - GEPIA web sitesi ana sayfasına erişin ve Kanser Tipi Analizi'ne tıklayın, Diferansiyel gen analizi seçeneğini seçin ve aşağıdaki parametreleri ayarlayın: Kanser adı = CESE (bu web sayfasında Servikal skuamöz hücreli karsinom ve endoservikal adenokarsinom olarak tanımlanmıştır), |Günlük2FC| Kesme = 1, q-değeri Kesme = 0.01, Diferansiyel Yöntemler = ANOVA ve Kromozomal Dağılım = her ikisi. Ardından, tümör ve normal gruplar arasındaki diferansiyel ifadeyi gösteren bir gen listesi elde etmek için Liste'ye tıklayın.
NOT: Diferansiyel olarak ifade edilen aday genleri tanımlamak için kapsamlı bir literatür taraması gerektirir. Bu çalışmada, mevcut literatür ışığında, ilgilenilen tümör geni olan FAM83A'ya odaklandık. - Ardından, web sitesindeki Expression DIY seçeneğine ilerleyerek GEPIA kullanarak rahim ağzı kanseri ve normal dokularda FAM83A ekspresyonunu inceleyin ve grafik türü olarak Boxplot'u seçin. Gen parametresi alanına FAM83A girin ve aşağıdaki parametreleri ayarlayın: |Günlük2FC| Kesme değeri = 1; q-değeri Kesme = 0.01. Kanser adı olarak CESE'yi seçin ve Eşleşen Normal veri alanı için TCGA normal verilerini eşleştir'i seçin ve diğer tüm ayarları varsayılan olarak bırakın. Plot'a tıklayın ve web sitesinin FAM83A geninin diferansiyel ekspresyonunu temsil eden bir kutu grafiği oluşturmasına izin verin; Kutu grafiğini ileride başvurmak ve analiz etmek üzere kaydedin.
- Son olarak, rahim ağzı kanserinde farklı seviyelerde FAM83A ekspresyonu olan tümörleri taşıyan hastaların genel sağkalımını analiz edin. Web sitesindeki Hayatta Kalma Grafikleri seçeneğine gidin, Gen'i FAM83A olarak ayarlayın ve analiz türü olarak Genel Hayatta Kalma'yı seçin. Tümör adı CESE'yi ekleyin, Eksen Birimleri için Aylar'ı seçin ve diğer tüm parametreleri varsayılan ayarlarında bırakın. Çizim'e tıklayın ve web sitesinin bir hayatta kalma eğrisi grafiği oluşturmasına izin verin; Bu tabloyu ileride başvurmak ve analiz etmek üzere saklayın.
- FAM83A'yı rahim ağzı kanserinde potansiyel bir terapötik hedef gen olarak tanımlamak için hem tümörlerde FAM83A'nın diferansiyel ekspresyonunu hem de hasta sağkalım analizi ile korelasyonunu dikkate alın.
2. Hücre tabanlı deneyler
- Hücre kültürü
- Modifiye edilmiş ortamda insan tümör hücre hatlarını 37 °C'de nemlendirilmiş% 5 CO2 atmosferinde kültürleyin.
NOT: Hücre hattı bilgileri ve kültür ortamı bileşenleri için Malzeme Tablosuna bakın.
- Modifiye edilmiş ortamda insan tümör hücre hatlarını 37 °C'de nemlendirilmiş% 5 CO2 atmosferinde kültürleyin.
- Hücre transfeksiyonu
- Hücrelerdeki FAM83A ekspresyonunu yıkmak için siRNA kullanın.
NOT: Spesifik siRNA dizisi için Tablo 1'e bakın. - 6 oyuklu plakalardaki tohum hücreleri ve 50 nM si-FAM83A veya siRNA-NC ve 8 μL transfeksiyon ajanı veya sadece 8 μL transfeksiyon ajanı karışımı ile %50-70 birleşme elde ettikten sonra 4-6 saat inkübe edin. Negatif kontrole sadece serumsuz DMEM ekleyin.
- İnkübasyondan sonra, transfeksiyon ajanını içeren besiyerini DMEM +% 10 fetal buzağı serumu ile değiştirin. Ayrıca, transfeksiyondan 48 saat sonra, amaçlandığı gibi 24 saat boyunca 5 μM sisplatin (DDP) ile muamele edin ve toplam RNA ekstraksiyonu ve qRT-PCR analizi için tüm hücreleri toplayın.
- Hücrelerdeki FAM83A ekspresyonunu yıkmak için siRNA kullanın.
3. Hücre proliferasyon testi için EdU tespiti
NOT: Hücre proliferasyonunu üreticinin talimatlarına göre in vitro olarak değerlendirmek için EdU Hücre Proliferasyon Kitini kullanın.
- Hücreleri 6 oyuklu plakalara tohumlayın ve 2 saat boyunca 10 μM EdU çözeltisi ile inkübe edin. Hücreleri oda sıcaklığında (RT) 15 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin ve RT'de 10 dakika boyunca PBS'de% 0.3 Triton X-100 ile geçirgenleştirin.
- Geçirgenleştirme tamponunu çıkarın ve 500 μL 1x reaksiyon çözeltisi ekleyin. Ardından, nükleer boyama için karanlıkta RT'de 30 dakika inkübe edin.
- Hücreleri 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile boyayın ve 200x büyütmede bir floresan mikroskobu altında görselleştirin. Çoğalan hücrelerin çekirdeklerini EdU ile boyayın ve kırmızı floresan açısından inceleyin.
- Son olarak, en az 10 rastgele alan sayarak sonuçları ölçmek için yazılım kullanın ve floresan pozitif hücrelerin toplam hücrelere oranını kullanarak çoğalma oranlarını hesaplayın.
4. Yara iyileşme testi
- Oyuk başına 2 × 105 hücre yoğunluğunda 6 oyuklu plakalardaki tohum hücreleri.
- Hücreler %90 birleşime ulaştığında, hücre tek tabakasında nazikçe doğrusal bir çizik oluşturmak için steril bir 10 μL mikropipet ucu kullanın. Çizilmenin neden olduğu ayrılmış hücreleri ve kalıntıları temizlemek için kuyucukları steril PBS ile nazikçe durulayın.
- Ayrıca, hücreleri% 1 FBS içeren ortamda inkübe edin. Daha sonra 12, 24 ve 48 saatte yaralı bölgenin iyileşmesi için ters mikroskopla gözlemleyin ve görüntü alın.
5. Gözenekli membran ekleme testi
- Transfekte edilmiş veya kontrol C33a hücreleri ve HeLa dahil olmak üzere istenen hücre konsantrasyonunda (4 × 104 hücre içeren) hücre kültürü ortamında bir hücre süspansiyonu hazırlayın. Hücre süspansiyonunu membran eklerinin üst bölmesine ekleyerek eşit dağılım sağlayın. Alt hazneye tam ortam ekleyin.
- 24 saat inkübasyondan sonra, alt odalara göç eden hücrelerin sabitlenmesi ve boyanması için sırasıyla metil alkol ve% 0.1 kristal viyole kullanın.
- Görüntü almak için ters çevrilmiş bir mikroskop kullanın ve ardından ImageJ ile en az 10 rastgele alan sayarak göç eden hücrelerin sayısını analiz edin.
- ImageJ ile sayı analizi için, görüntüyü ImageJ yazılımında açın, araç menüsünde Görüntü sekmesine gidin, Ayarla'yı seçin ve ardından Eşik'e tıklayın. Gerekirse, beyaz bir arka planda yalnızca hücreler görünene kadar eşik ayarlarını yapın.
- Bu ayarları görüntüye uygulamak için Eşik penceresinde Uygula'ya tıklayın. Şimdi, araç çubuğundan (pencerenin üst kısmında bulunur) Değnek (izleme) aracını seçin.
- Eşikli görüntüdeki tüm hücreleri seçmek için hücrelerin bulunduğu görüntü alanına tıklayın. Hücreler vurgulandıktan sonra, Araç menüsünde Analiz Et'e gidin ve ardından Parçacıkları Analiz Et'e tıklayın. Parçacıkları Analiz Et penceresinde, sayıma tüm hücreleri dahil etmek için deneysel gereksinimlere göre istenen boyutu (örneğin, 0 - sonsuz) ve dairesellik değerlerini (örneğin, 0,00 - 1,00) girin.
- Tamam'a tıklayın ve yazılımın hücreleri saymasını ve analiz sonuçlarını içeren yeni bir pencerenin görünmesini bekleyin.
6. Koloni oluşumu deneyi
- 24 saat boyunca 5 μM sisplatin (DDP) muamelesi olan veya olmayan 6 oyuklu bir plakada Si-NC ve Si-FAM83A gruplarının oyuklu başına 2 × 105 hücreli tohum.
- 24 saatlik bir ilaç tedavisinin ardından,% 0.25 tripsin kullanarak hücreleri ayırın ve% 10 FBS içeren Dulbecco'nun modifiye Eagle besiyerinde (DMEM) yeniden süspanse edin. Yeniden süspanse edilmiş hücreleri, oyuk başına 1 × 103 hücre yoğunluğunda 6 oyuklu bir plakaya tohumlayın ve daha sonra 37 ° C sıcaklıkta% 5 CO2 inkübatörde inkübe edin.
- Kolonilerin görülebildiği ~ 7-10 gün inkübasyonun ardından, hücreleri% 4 Polioksimetilen ile sabitleyin ve 20 dakika boyunca Giemsa boyama solüsyonu ile boyayın.
- Hücreleri hafifçe yıkayın ve plakaların kurumasını bekleyin. Mikroskopla koloni kümelerinin görüntülerini alın ve 50'den fazla hücre içeren kolonilerin sayısını sayın.
7. JC-1 boyası kullanılarak mitokondriyal membran depolarizasyonu (MMP) analizi
- Tohum 1.2 × 10 Si-FAM83A'dan 6 tümör hücresi gruplarını altı oyuklu bir plakaya ve 5 μM sisplatin (DDP) tedavisi ile veya olmadan 24 saat boyunca kültüre alın.
- Üreticinin talimatlarına göre bir Mitokondriyal membran potansiyel test kiti kullanarak 37 ° C'de% 5 CO2 altında% 15-20 dakika boyunca 1x JC-1 boyama solüsyonu ile inkübe edin.
- Hücreleri yıkayın ve sırasıyla ~ 490 nm ve 590 nm'de JC-1 için uyarma ve emisyon dalga boylarını kullanarak 200x büyütmede floresan mikroskop altında inceleyin. JC-1 floresansını görselleştirmek için, yayılan floresan sinyalini seçici olarak yakalamak için mavi uyarma filtresi (450-490 nm) ve kırmızı emisyon filtresi (uzun geçiren > 590 nm) gibi uygun filtreler kullanın.
8. mPTP'nin akış sitometrik analizi
- Tohum 1.2 × 10 Si-FAM83A'dan 6 tümör hücresi gruplarını altı oyuklu bir plakaya ve 5 μM sisplatin (DDP) tedavisi ile veya olmadan 24 saat boyunca kültüre alın.
- Kültür ortamını hücrelerden çıkarın, hücreleri PBS'de yeniden süspanse edin ve hücreleri eşit şekilde kaplamak için her biri 300 μL (1x hacim) Calcein boyama solüsyonu ve floresan söndürme çalışma solüsyonu ekleyin. Hücreleri 37 ° C'de ışıktan korunan bir ortamda 30-45 dakika inkübe edin ve ortamı 37 ° C'de taze önceden ısıtılmış kültür ortamı ile değiştirin. Calcein'nin hücre içi esterazlar tarafından tam hidrolizini sağlamak için hücreleri 37 ° C'de ışık korumalı bir ortamda 30 dakika daha inkübe edin, bu da hücre içi yeşil floresan Calcein oluşumuna neden olur.
- Kültür ortamını çıkarın, hücreleri PBS ile 2-3 kez yıkayın ve algılama tamponu ekleyin. Akış sitometrisi ve 488 nm'lik bir uyarma dalga boyu kullanarak hücre mPTP'sini tespit edin.
9. Akış sitometrisi
- Tohum 1.2 × 10 Si-FAM83A'dan 6 tümör hücresi gruplarını altı oyuklu bir plakaya ve 5 μM sisplatin (DDP) tedavisi ile veya olmadan 24 saat boyunca kültüre alın.
- 24 saatlik ilaç tedavisinden sonra, hücreleri 200 μL bağlayıcı tampon çözeltisinde yeniden süspanse edin ve 10 μL Annexin V-FITC ve 5 μL propidyum iyodürü (PI) hücre süspansiyonuna hafifçe karıştırın. Karışımı ışıktan kaçınarak 15 dakika inkübe edin ve hücrelere 300 μL bağlayıcı tampon çözeltisi ekleyin. 488 nm'lik bir uyarma dalga boyunda akış sitometrisi kullanarak hücre apoptozunu tespit edin.
10. RT-PCR analizi
- Tohum 1.2 × 10 Si-FAM83A'dan 6 tümör hücresi gruplarını altı oyuklu bir plakaya ve 5 μM sisplatin (DDP) tedavisi ile veya olmadan 24 saat boyunca kültüre alın.
- RNA ekstraksiyon reaktifini kullanarak tümör hücrelerinden toplam RNA'yı çıkarın ve ekstrakte edilen RNA'yı 42 °C'de 45 dakika ve ardından 95 °C'de 5 dakika inkübe ederek cDNA Sentez Karışımı ile tamamlayıcı DNA'ya (cDNA) dönüştürün.
- DNA polimeraz, nükleotidler, tampon ve tasarlanan gene özgü primerleri içeren PCR reaksiyon karışımını hazırlayın. Gerçek zamanlı PCR reaksiyonu için cDNA şablonunu reaksiyon karışımına ekleyin ve aşağıdaki termodöngü koşullarıyla gerçek zamanlı kantitatif PCR cihazında PCR gerçekleştirin: 30 saniye boyunca 95 °C'de denatürasyon, ardından 5 saniye boyunca 95 °C ve 30 saniye boyunca 60 °C'lik 40 döngü ve 15 saniye boyunca 95 °C'de erime eğrisi aşaması, 60 °C boyunca 1 dakika ve 95 °C boyunca 15 sn. Dahili kontrol olarak GAPDH kullanarak 2−ΔΔCq yöntemini kullanarak mRNA seviyelerini ölçün.
NOT: RT-PCR reaksiyon sistemi Tablo 1'de gösterilmiştir ve primer dizileri Tablo 1'de gösterilmiştir.- 2−ΔΔCq değerini hesaplamak için, örneklerdeki hedef gen ve referans gen (GAPDH) için Cq değerlerini ölçün. Her örnek için referans genin Cq değerini hedef genin Cq değerinden çıkararak ΔCq'yu hesaplayın. Bir kontrol numunesinin ΔCq'sini her bir deney numunesinin ΔCq'sinden çıkararak ΔΔCq'yi hesaplayın. Son olarak, 2'yi ΔΔCq değerinin kuvvetine yükselterek 2−ΔΔCq değerini hesaplayın.
NOT: Cq değeri, floresan sinyalinin ayarlanan eşiğe ulaştığı döngü numarasını temsil eder.
- 2−ΔΔCq değerini hesaplamak için, örneklerdeki hedef gen ve referans gen (GAPDH) için Cq değerlerini ölçün. Her örnek için referans genin Cq değerini hedef genin Cq değerinden çıkararak ΔCq'yu hesaplayın. Bir kontrol numunesinin ΔCq'sini her bir deney numunesinin ΔCq'sinden çıkararak ΔΔCq'yi hesaplayın. Son olarak, 2'yi ΔΔCq değerinin kuvvetine yükselterek 2−ΔΔCq değerini hesaplayın.
11. Batı lekesi analizi
- Tohum 1.2 × 10 Si-FAM83A'dan 6 tümör hücresi gruplarını altı oyuklu bir plakaya ve 5 μM sisplatin (DDP) tedavisi ile veya olmadan 24 saat boyunca kültüre alın.
- Kültürlenmiş hücreleri toplayın ve kalan büyüme ortamını veya serumu çıkarmak için buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. Hücresel proteinleri serbest bırakmak için fenilmetil sülfonil florür (PMSF) içeren RIPA Lizis Tamponu kullanarak hücreleri parçalayın. Tam lizizi sağlamak için hücreleri buz üzerinde birkaç dakika inkübe edin ve 4 ° C, 12.000 × g'da 15 dakika santrifüjleyin. Protein konsantrasyonunu belirlemek için süpernatanı toplayın.
- Üreticinin talimatlarına göre bir BCA Protein Test Kiti kullanarak hücre lizatındaki protein konsantrasyonunu belirleyin. Hücre lizatını bir yükleme tamponu ile karıştırın ve proteinleri denatüre etmek ve jel üzerinde homojen bir şekilde ayrılmayı sağlamak için karışımı 95-100 °C'de 5-10 dakika ısıtın.
- Her numuneden, bir SDS-PAGE jeli üzerine 30 μg toplam protein yükleyin ve SDS-PAGE'yi 80 V'luk sabit bir voltaj altında çalıştırın.
- Ayrılan proteinleri, 1.5 saat boyunca 200 mA akımlı bir buz banyosunda ıslak bir transfer sistemi kullanarak jelden ayrılan proteinleri bir polivinildiflorür membranına aktarın.
- RT'de 1 saat boyunca %0.05 Tween-20 tamponu (TBST) ile Tris tamponlu salin içinde membranı %5 yağsız sütle bloke edin ve Malzeme Tablosunda verilen ilgili antikorlarla gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
- Membranı TBST ile birden çok kez yıkayın ve RT'de 1 saat boyunca ikincil antikorlarla (Malzeme Tablosu) inkübe edin, ardından TBST ile yıkayın. Gelişmiş bir kemilüminesans algılama kiti ve görüntüleyici sistemi kullanarak protein bantlarını görselleştirin.
12. İstatistiksel analiz
- Tüm deneysel veri noktaları bağımsız olacağından, verileri ortalama ± SD olarak sunun. İstatistiksel analiz yapın.
- Çoklu karşılaştırmalar için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve her grubu kontrol grubuyla karşılaştırmak için Dunnett testini kullanın. İki grubu karşılaştırmak için Student'ın t-testini (eşleştirilmemiş iki kuyruklu) kullanın; P < 0.05'in anlamlı olduğunu düşünün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
TCGA veri tabanı analizi ve PCR doğrulaması
TCGA veri tabanı analizinden, FAM83A'nın diferansiyel ekspresyonunu araştırmak için 306 rahim ağzı kanseri hücresi örneğinde ve 13 normal hücre örneğinde mRNA ekspresyon seviyelerinin karşılaştırmalı bir analizini gerçekleştirdik. FAM83A serviks kanserinde yukarı regüle iken, normal servikal dokuda ekspresyonu ihmal edilebilir düzeydeydi (Şekil 1A). FAM83A ekspresyonunun prognostik etkileri hakkında daha fazla bilgi edinmek için bir Kaplan-Meier eğrisi analizi gerçekleştirdik. Çarpıcı bir şekilde, daha yüksek FAM83A ekspresyonu olan hastalar belirgin şekilde daha kötü bir genel sağkalım sergiledi (Şekil 1B). FAM83A'nın rahim ağzı kanserindeki rolünü belirlemek için, iki rahim ağzı kanseri hücre hattında, HeLa ve C33a'da ve ayrıca ölümsüzleştirilmiş bir servikal hücre dizisi olan End1 / E6E7'de FAM83A ekspresyon seviyelerini inceledik. qRT-PCR kullanarak, End1/E6E7 hücre hattına kıyasla HeLa ve C33a hücre hatlarında FAM83A'nın önemli bir aşırı ekspresyonunu gözlemledik (Şekil 1C). Bu bulgular rahim ağzı kanseri bağlamında FAM83A'nın önemini vurgulamaktadır.
Rahim ağzı kanserinde FAM83A'nın biyolojik fonksiyonunu doğrulamak için proliferasyon ve apoptoz deneyleri
FAM83A'nın serviks kanserindeki fonksiyonel rolünü araştırmak için, C33a ve HeLa hücrelerinde FAM83A'nın siRNA aracılı yıkımını kullandık (Şekil 2A,B). Daha sonra FAM83A baskılanmasının hücre proliferasyonu üzerindeki etkisini değerlendirdik. EdU boyama, FAM83A ekspresyonunun azalmasının hem C33a hem de HeLa hücrelerinde hücre proliferasyonunu önemli ölçüde inhibe ettiğini ortaya koydu (Şekil 2C-F). Ölümsüz malign hücreler son derece düşük apoptoz oranlarıile ilişkilidir 10. Bu nedenle, kontrol ve si-FAM83A ile tedavi edilen servikal kanser hücrelerinde anti- ve proapoptotik proteinlerin seviyeleri değerlendirildi. Western blot analizleri, FAM83A'nın baskılanmış ekspresyonunun Bax ve parçalanmış kaspaz3 proteinlerinin (proapoptotik proteinler) ekspresyonunu arttırdığını, Bcl-2'nin (antiapoptotik protein) ekspresyonunu azalttığını ve Cytc salınımını arttırdığını ortaya koymuştur (Şekil 2C-E), bu da antiapoptotik proteinlerin Cytc'nin mitokondriyal salınımını bloke ederek apoptozu düzenlediği gözlemiyle tutarlıdır (Şekil 2G-J)10. Toplu olarak, bu veriler FAM83A'nın rahim ağzı kanseri hücre proliferasyonunu ve apoptozunu düzenlemede önemli bir rol oynadığını göstermiştir.
Rahim ağzı kanserinde FAM83A'nın biyolojik işlevini doğrulamak için yara iyileştirici ve gözenekli membran ekleme testleri
FAM83A baskılanmasının rahim ağzı kanseri hücrelerinin göçü ve invazyonu üzerindeki etkilerini araştırmak için yara iyileşmesi ve membran ekleme testleri yapıldı. Sonuçlar, baskılanmış FAM83A ekspresyonuna sahip rahim ağzı kanseri hücrelerinin, kontrol hücrelerinden daha az verimli bir şekilde göç ettiğini (Şekil 3A-D) ve invaze ettiğini (Şekil 3E-H) ortaya koydu.
Mitokondriyal fonksiyon ve PI3K/AKT sinyal yolu üzerindeki etkiler
Hücre apoptozunun indüksiyonunda PI3K/AKT'nin rolü göz önüne alındığında, FAM83A ekspresyonunun baskılanmasının rahim ağzı kanserinde PI3K/Akt/mTOR yolunun yapısal fosforilasyonunu inhibe edip etmeyeceğini belirlemeyi amaçladık. FAM83A'nın baskılanması, c333a ve HeLa hücrelerinde p-PI3K, p-Akt ve p-mTOR dahil olmak üzere PI3K/Akt/mTOR yolundaki anahtar fosforile protein seviyelerini önemli ölçüde inhibe etti (Şekil 4A-D). Mitokondri, hücresel metabolizma ve hücre apoptoz indüksiyonundan sorumlu organellerdir. Biriken kanıtlar, kanser hücresi apoptozunun, gelişmiş mitokondriyal geçirgenlik ve Cytc gibi proapoptotik moleküllerin sitoplazmayasalınması nedeniyle içsel mitokondriyal yol yoluyla mitokondriyal disfonksiyonu içerdiğini göstermektedir 10. PI3K / AKT yolu, Bax'ın mitokondriye translokasyonunu düzenleyebilir ve apoptotik uyaranlara yanıt olarak Cytc salınımını indükleyebilir. Bu nedenle, PI3K-AKT sinyal yolunun onkojenik bileşenlerinin, mitokondriyal davranışı etkileyerek hücre apoptozunu doğrudan düzenlediği düşünülebilir. Bu nedenle, mitokondriyal durumu belirlemek için canlı hücreli mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneği (mPTP) testi yapıldı. mPTP açılması apoptotik ve nekrotik hücre ölümü ile ilişkilidir11. Bu tahlilde, mPTP kapatıldığında sitoplazmada ve mitokondride yeşil bir floresan boya (kalsein) tutulurken, sitoplazmadaki boya CoCl2 ile söndürülür ve mitokondride sadece yoğun floresan kalır. Sonuçlar, mitokondride yoğun yeşil floresan olan hücre popülasyonlarının, FAM83A baskılanmasından sonra önemli ölçüde azaldığını ve bunun da açık bir mPTP'yi gösterdiğini ortaya koydu (Şekil 4E, F). Ayrıca, JC-1 boyaması kullanarak mitokondriyal membran potansiyelindeki (ΔΨm) değişiklikleri inceledik. JC-1, yüksek membran potansiyeline sahip bozulmamış mitokondri ve apoptotik hücrelerde düşük MMP altında monomerler (yeşil floresan) içeren canlı hücrelerde agregalar (kırmızı floresan) oluşturur. FAM83A supresyonu MMP'yi kademeli olarak azalttı (Şekil 4G).
Proliferasyon ve invazyon için ilaç duyarlılık analizi
Sisplatin (DDP) bazlı kemoterapi, rahim ağzı kanseri için standart bir tedavi stratejisidir. Bununla birlikte, kemorezistans bir zorluk olmaya devam etmektedir. Sisplatin kullanarak rahim ağzı kanseri tedavisinde FAM83A'nın rolünü araştırdık. Kontrol, si-NC ile muamele edilen ve si-FAM83A ile muamele edilen HeLa hücreleri, 5 μM sisplatin12 ile veya 5 μM sisplatin olmadan muamele edildi. Ayrıca, FAM83A baskılanmasının hücre canlılığı üzerindeki etkileri değerlendirildi. DDP, sadece DDP tedavisine kıyasla, FAM83A supresyonundan sonra HeLa hücrelerinin proliferasyonu üzerinde daha önemli bir inhibitör etkiye neden olmuştur (Şekil 5A ve Şekil 5C). Rahim ağzı kanseri hücrelerini 5 μM sisplatin ile tedavi ettikten sonra, FAM83A supresyonu da hücre invazyonunu inhibe etti (Şekil 5B ve Şekil 5D).
Mitokondriyal fonksiyon için ilaç duyarlılık analizi
Si-NC ile tedavi edilen ve si-FAM83A ile tedavi edilen HeLa hücrelerini 5 μM sisplatin (DDP) ile veya 5 μM sisplatin (DDP) olmadan tedavi ederek, mitokondriyal membran potansiyelini (MMP) değerlendirdik ve JC-1 boyaması kullanarak hücre ölümünün neden olduğu mitokondriyal hasarı değerlendirdik. DDP, sadece DDP tedavisine kıyasla, FAM83A yıkımından sonra JC-1 monomer yüzdesindeki bir azalma ile ortaya çıktığı gibi daha fazla mitokondriyal hasara neden olmuştur (Şekil 6A ve Şekil 6D). Rahim ağzı kanseri hücrelerini 5 μM sisplatin ile tedavi ettikten sonra, FAM83A yıkımı ayrıca koloni oluşumunu (Şekil 6B ve Şekil 6E) ve gelişmiş hücre apoptozunu (Şekil 6C ve Şekil 6F) inhibe etti. Ek olarak, DDP varlığında FAM83A yıkımı, proapoptotik proteinlerin, Bax ve bölünmüş kaspazın ekspresyonunu belirgin şekilde arttırdı3, Cytc salınımını teşvik etti ve Bcl-2 ekspresyonunu azalttı (Şekil 6G, H). Bu sonuçlar, FAM83A yıkımının rahim ağzı kanseri hücrelerini apoptoz indüksiyonu yoluyla DDP'ye duyarlı hale getirdiğini gösterdi.
Şekil 1: Rahim ağzı kanseri hücrelerinde FAM83A aşırı ekspresyonu ve daha kötü prognoz ile korelasyonu. (A) Rahim ağzı kanseri örneklerinde FAM83A'nın mRNA seviyelerinin Boxplot analizi. (B) Rahim ağzı kanserli hastalarda genel sağkalımın belirlenmesi için FAM83A ekspresyonunun Kaplan-Meier analizi. (C) Rahim ağzı kanseri hücre hatları HeLa ve C33a'da ve insan ölümsüzleştirilmiş servikal hücre hattı End1/E6E7'de FAM83A'nın nispi mRNA seviyeleri. Veriler, üç bağımsız deney için ortalama ± SD olarak sunulmuştur. *P < 0,05, tek yönlü ANOVA kullanan End1/E6E7 hücreleriyle karşılaştırılmıştır. Kısaltmalar: CESE = Servikal skuamöz hücreli karsinom ve endoservikal adenokarsinom; HR = tehlike oranı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: FAM83A'nın baskılanmasının rahim ağzı kanserinin proliferasyonu ve apoptozu üzerindeki etkileri. C33a ve HeLa hücreleri, FAM83A'ya özgü siRNA'lar ile transfekte edildi. Rahim ağzı kanseri hücre hatlarında FAM83A'nın (A,B) mRNA düzeyleri qRT-PCR kullanılarak değerlendirildi.(C) C33a ve (D) HeLa hücrelerinde hücre proliferasyonu EdU testi kullanılarak belirlendi. (E,F) C33a ve Hela hücrelerinin EDU floresan görüntüleri. (G-J) Cytc, Bcl-2, Bax, kaspaz3 ve bölünmüş-kaspaz-3 dahil olmak üzere apoptozla ilişkili proteinlerin seviyelerini incelemek için Western blot analizi; Yükleme kontrolü olarak GAPDH kullanıldı. Veriler, üç bağımsız deney için ortalama ± SD olarak sunulmuştur. *P < 0,05; **P < 0,01; **P < 0,001, tek yönlü ANOVA kullanan kontrol hücreleriyle karşılaştırılmıştır. Kısaltmalar: NC = negatif kontrol; EdU = 5-etinil-2'-deoksiüridin; CytC = sitokrom C. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: FAM83A'nın in vitro rahim ağzı kanseri hücrelerinin göçü ve istilası üzerindeki etkisi. (A-D) Hücre göçünü değerlendirmek için yara iyileşme testi yapıldı. Görüntüler 0, 24 ve 48 saatte alındı. (EH) Hücre invazyonunu incelemek için Transwell testleri yapıldı. Ölçek çubukları = 100 μm (E,F). Veriler, üç bağımsız deney için ortalama ± SD olarak sunulmuştur. *P < 0,05; **P < 0,01; **P < 0,001, tek yönlü ANOVA kullanan kontrol hücreleriyle karşılaştırılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: FAM83A baskılanmasının PI3K/AKT/mTOR yolu ve mitokondriyal fonksiyon üzerindeki etkisi.(A-D) FAM83A supresyonundan sonra C33a ve HeLa hücrelerinde PI3K/AKT/mTOR yolundan protein seviyelerini belirlemek için Western blot analizi. (E-H) JC-1 boyama kullanılarak mitokondriyal membran potansiyel analizi. JC-1 agregaları kırmızı renkte boyandı ve JC-1 monomerleri daha düşük bir MMP'yi gösteren yeşil renkte boyandı. (I,J) Mitokondriyal geçirgenlik, bir mPTP kiti ve akış sitometrisi kullanılarak değerlendirildi. Ölçek çubukları = 50 μm (E, F). Veriler, üç bağımsız deney için ortalama ± SD olarak sunulmuştur. *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0.001, tek yönlü ANOVA kullanan kontrol hücreleriyle karşılaştırılmıştır. Kısaltmalar: MMP = mitokondriyal membran potansiyeli; mPTP = mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: FAM83A baskılanmasının DDP tarafından inhibisyon üzerindeki hücre proliferasyonu ve rahim ağzı kanseri hücrelerinin invazyonu üzerindeki etkileri. HeLa hücreleri si-NC veya si-FAM83A ile transfekte edildi ve 5 μM DDP ile veya DDP olmadan tedavi edildi. (A,C) DDP'nin kontrol, si-NC ile tedavi edilen ve si-FAM83 ile tedavi edilen HeLa hücrelerinde hücre proliferasyonu üzerindeki etkisi. (B,D) DDP'nin kontrol, si-NC ile tedavi edilen ve si-FAM83 ile tedavi edilen HeLa hücrelerinde hücre invazyonu üzerindeki etkisi. Veriler, üç bağımsız deney için ortalama ± SD olarak sunulmuştur. *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0.001, kontrol hücreleri ile karşılaştırıldığında. &&P < 0.01; &&&P < 0,001, tek yönlü ANOVA kullanan DDP ile karşılaştırıldığında. Kısaltmalar: DDP = diamindikloroplatin; EdU = 5-etinil-2'-deoksiüridin; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: FAM83A supresyonunun rahim ağzı kanseri hücrelerinde DDP'nin apoptoz üzerindeki etkileri üzerindeki etkileri. HeLa hücreleri si-NC veya si-FAM83A ile transfekte edildi ve 5 μM DDP ile veya DDP olmadan tedavi edildi. (A,D) JC-1 boyama kullanılarak MMP analizi. (B,E) Plaka klonlama sonuçları. (C,F) Farklı tedavi gruplarında apoptoz oranlarını tespit eden akış sitometrisi. (G,H) Bcl-2, Bax, Cytc ve aşağı akış parçalanmış kaspaz-3 dahil olmak üzere mitokondri ile ilişkili apoptotik proteinlerin Western blot analizi. Yükleme kontrolü olarak GAPDH kullanıldı. Veriler, üç bağımsız deney için ortalama ± SD olarak sunulmuştur. *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0.001, kontrol hücreleri ile karşılaştırıldığında. &P < 0.05; &&&P < 0.01; &&&P < 0.001, tek yönlü ANOVA kullanan DDP ile karşılaştırıldığında. Kısaltmalar: DDP = diamindikloroplatin; EdU = 5-etinil-2'-deoksiüridin; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: siRNA, qRTPCR primerleri ve bu çalışmada kullanılan qRT-PCR reaksiyon kurulumu. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tümör hedef genlerinin araştırılması, rahim ağzı kanserinin hem önlenmesi hem de tedavisi için son derece önemlidir. Rahim ağzı kanseri gelişiminde ve ilerlemesinde önemli bir rol oynayan spesifik genlerin anlaşılması, hastalığın altında yatan moleküler mekanizmalar hakkında değerli bilgiler sağlar. Ayrıca, bu hedef genlerin belirlenmesi, yeni terapötik stratejilerin ve hedefe yönelik tedavilerin geliştirilmesine yol açabilir. Bu çalışmada, FAM83A'yı hedef gen olarak tanımlamak ve serviks kanserinde mekanik rollerini araştırmak için TCGA veri seti analizinin kullanımını açıklıyoruz. Rahim ağzı kanseri hücrelerinde, rahim ağzı kanserli hastaların kötü prognozu ile ilişkili olan FAM83A'nın önemli ölçüde yüksek ekspresyonunu gözlemliyoruz. Bir dizi hücre bazlı deney, rahim ağzı kanseri hücrelerinde, hücre proliferasyonunu, göçünü ve istilasını düzenlemede kritik bir rol oynayan yüksek FAM83A ekspresyonunu ortaya çıkardı. FAM83A ekspresyonunun baskılanması, proliferasyonu ve göçü inhibe etti ve rahim ağzı kanseri hücrelerinde apoptozu teşvik etti.
FAM83A-knockdown rahim ağzı kanseri hücre hatlarının oluşturulması bu çalışmadaki en kritik adımdır. siRNA'lar, etkinliklerini sağlamak için hedef gen dizilerine göre tasarlanır ve doğrulanır. Ayrıca, rahim ağzı kanseri hücre hatları siRNA kullanılarak transfekte edilir. Plazmit transfeksiyonunun başarı oranı, hücre yoğunluğunun ve plazmit yoğunluğunun sıkı kontrolünü gerektiren sonraki deneyler için çok önemlidir. Ayrıca, sonraki deneylerin yapılabilmesini sağlamak için transfeksiyon verimliliği bir floresan mikroskobu altında gözlemlenir. Western blotlama ve qRT-PCR sonuçları, FAM83A'nın inhibisyonunun PI3K/AKT yolunu baskıladığını ve mitokondriyal disfonksiyonu indüklediğini doğrulamaktadır. Mekanizmanın, hücre sağkalımını destekleyen PI3K/AKT tarafından Bax'ın sitoplazmadan mitokondriye translokasyonunun inhibisyonunu içerdiğini varsayıyoruz13.
Rahim ağzı kanserinin tedavisindeki gelişmeler, yeni hedef moleküllerin geliştirilmesini mümkün kılmıştır. Yeni bir onkogenin tanımlanması, servikal malignitelerin klinik prognozunu iyileştirmek için terapötik olarak uygulanabilir14,15. Bu çalışmada, HeLa ve C33a hücrelerinde başarılı bir şekilde FAM83A yıkım sistemi oluşturduk ve FAM83A yıkımının rahim ağzı kanseri hücreleri üzerindeki etkilerini hücresel düzeyde doğruladık. FAM83A'nın inhibisyonunun rahim ağzı kanserini tedavi etmek için kullanılabileceğini öneriyoruz.
Ancak, bu çalışmanın bazı sınırlılıkları vardır. İlk olarak, bu çalışma sadece veri tabanı üzerinden gen taraması yapmaktadır ve klinik hastaların patolojik verilerinden yoksundur. İkincisi, bu çalışma sadece in vitro etkiyi doğrulamıştır ve sonuçları doğrulamak için daha fazla in vivo çalışmalara ihtiyaç duyulmuştur. Bununla birlikte, bu çalışmada detaylandırılan hedeflenen terapötik lokusları tanımlamak için hedef gen tanımlama, gen nakavt etme ve hücresel doğrulama yöntemleri, diğer hastalıklar için hedef genlerin keşfi ve doğrulanması için araştırma fikirleri sağlayabilir.
Özetle, FAM83A aşırı eksprese edildi ve serviks kanserinde daha kötü bir prognoz ile korelasyon gösterdi. FAM83A , rahim ağzı kanseri hücrelerinin çoğalmasını, göçünü ve istilasını düzenler. FAM83A'nın neden olduğu mitokondriyal disfonksiyon ve apoptozun baskılanması, rahim ağzı kanseri hücrelerini sisplatine duyarlı hale getirir. Bu sonuçlar, FAM83A'nın rahim ağzı kanseri tedavisi için uygun bir araştırma hedefi olduğunu göstermiştir. Bu çalışma, serviks kanserli hastaların prognozunu iyileştirmeyi amaçlayan adjuvan kemoterapideki gelişmelere katkıda bulunmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar bu çalışmada herhangi bir çıkar çatışması olmadığını bildirmektedir.
Acknowledgments
Bu çalışma Jingzhou Bilim ve Teknoloji Bürosu Vakfı (no. 2020HC06) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells and Medium Formulation | |||
| C33a | American Type Culture Collection | ||
| Hela | American Type Culture Collection | ||
| Modified medium | 10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin) | ||
| Antibody Information | |||
| AKT | 4691, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| Bcl2 | 26593-1-AP, Proteintech Group, Inc | ‘1:1,000 | |
| Caspase 3 | 19677-1-AP, Proteintech Group, Inc | ‘1:2,000 | |
| cleaved-caspase3 | abs132005; Absin Bioscience Inc. | ‘1:1,000 | |
| Cytc | 10993-1-AP; Proteintech Group | ‘1:1,000 | |
| GAPDH | 10494-1-AP, Proteintech Group, Inc. | ‘1:8,000 | |
| mTOR | 2983, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| PI3K | 4292, Cell Signaling Technology Inc | ‘1:1,000 | |
| p-AKT | 4060, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| p-mTOR (Ser2448) | #5536, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| p-PI3K p85 subunit | 17366, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| Secondary antibodies | GB23303, Servicebio | ‘1:2,000 | |
| Materials | |||
| 6-well plate | Corning, NPY | ||
| Alexa Fluor 555 | Beyotime | ||
| BCA Protein assay kit | Beyotime, China | P0011 | |
| ChemiDoc XRS Imager System | BioRad | ||
| Enhanced chemiluminescence detection kit | Servicebio, Inc.,China | cat. no. G2014 | |
| Fluorescence microscope | Olympus Corporation, Tokyo, Japan | ||
| Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix | 11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China | ||
| Inverted microscope | Olympus, Tokyo, Japan; | ||
| Millicell transwell inserts | Millipore,Bedford, MA, USA | ||
| Mitochondrial membrane potential assay kit | Beyotime, China | ||
| PMSF | ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China | #ST506 | |
| Real-time quantitative PCR instrument | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China. | ||
| RIPA Lysis Buffer | Beyotime Biotech, Jiangsu, China | ||
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| TRIzol reagent | Takara Bio Inc., Otsu, Japan | ||
| Software | |||
| Image-Pro | plus 6.0 |
References
- Arbyn, M., et al. Estimates of incidence and mortality of cervical cancer in 2018: a worldwide analysis. Lancet Global Health. 8 (2), e191-e203 (2020).
- Cohen, P. A., Jhingran, A., Oaknin, A., Denny, L.
- Cipriano, R., et al. Conserved oncogenic behavior of the fam83 family regulates mapk signaling in human cancer. Molecular Cancer Research. 12 (8), 1156-1165 (2014).
- Snijders, A. M., et al. FAM83 family oncogenes are broadly involved in human cancers: an integrative multi-omics approach. Molecular Oncology. 11 (2), 167-179 (2017).
- Gan, J., Meng, Q., Li, Y. Corrigendum: systematic analysis of expression profiles and prognostic significance for fam83 family in non-small-cell lung cancer. Frontiers In Molecular Biosciences. 8, 653454 (2021).
- Jin, Y., et al. Comprehensive analysis of the expression, prognostic significance, and function of fam83 family members in breast cancer. World Journal of Surgical Oncology. 20 (1), 172 (2022).
- Lin, S., et al. Identification of prognostic biomarkers among fam83 family genes in human ovarian cancer through bioinformatic analysis and experimental verification. Cancer Management and Research. 13, 8611-8627 (2021).
- Ma, Z., et al. Identification of prognostic and therapeutic biomarkers among fam83 family members for pancreatic ductal adenocarcinoma. Disease Markers. 2021, 6682697 (2021).
- Xu, J., et al. Genome-wide profiling of cervical RNA-binding proteins identifies human papillomavirus regulation of rnaseh2a expression by viral e7 and e2f1. mBio. 10 (1), e02687-e02618 (2019).
- Wong, R. S. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment. Journal Of Experimental & Clinical Cancer Research. 30 (1), 87 (2011).
- Bonora, M., Pinton, P. The mitochondrial permeability transition pore and cancer: molecular mechanisms involved in cell death. Frontiers In Oncology. 4, 302 (2014).
- Wang, N., Hou, M. S., Zhan, Y., Shen, X. B., Xue, H. Y. MALAT1 promotes cisplatin resistance in cervical cancer by activating the pi3k/akt pathway. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 22 (22), 7653-7659 (2018).
- Tsuruta, F., Masuyama, N., Gotoh, Y. The phosphatidylinositol 3-kinase (pi3k)-akt pathway suppresses bax translocation to mitochondria. Journal Of Biological Chemistry. 277 (16), 14040-14047 (2002).
- Guerra, F., Arbini, A. A., Moro, L.
- Pustylnikov, S., Costabile, F., Beghi, S., Facciabene, A. Targeting mitochondria in cancer: current concepts and immunotherapy approaches. Translational Research. 202, 35-51 (2018).
