Summary
Her presenterer vi en protokoll for et automatisert cellekultursystem. Dette automatiserte kultursystemet reduserer arbeidskraft og fordeler brukerne, inkludert forskere som ikke er kjent med håndtering av induserte pluripotente stamceller (iPS), fra vedlikehold av iPS-celler til differensiering i forskjellige typer celler.
Abstract
Humane induserte pluripotente stamceller (hiPSCs) med uendelig selvprolifererende evne har blitt forventet å ha applikasjoner på mange felt, inkludert belysning av sjeldne sykdomspatologier, utvikling av nye medisiner og regenerativ medisin med sikte på å gjenopprette skadede organer. Til tross for dette er den sosiale implementeringen av hiPSCs fortsatt begrenset. Dette er delvis på grunn av vanskeligheten med å reprodusere differensiering i kultur, selv med avansert kunnskap og sofistikerte tekniske ferdigheter, på grunn av den høye følsomheten til iPSCs for små miljøendringer. Anvendelsen av et automatisert kultursystem kan løse dette problemet. Eksperimenter med høy reproduserbarhet uavhengig av forskerens dyktighet kan forventes i henhold til en felles prosedyre på tvers av ulike institutter. Selv om flere automatiserte kultursystemer som kan opprettholde iPSC-kulturer og indusere differensiering har blitt utviklet tidligere, er disse systemene tunge, store og kostbare fordi de bruker humaniserte, flerartikulerte robotarmer. For å forbedre de ovennevnte problemene, utviklet vi et nytt system ved hjelp av et enkelt x-y-z axis slide rail-system, slik at det kan være mer kompakt, lettere og billigere. Videre kan brukeren enkelt endre parametere i det nye systemet for å utvikle nye håndteringsoppgaver. Når en oppgave er etablert, er alt brukeren trenger å gjøre å forberede iPSC, levere reagensene og forbruksvarer som trengs for ønsket oppgave på forhånd, velge oppgavenummeret og angi tiden. Vi bekreftet at systemet kunne opprettholde iPSCs i en udifferensiert tilstand gjennom flere passasjer uten materceller og differensiere i forskjellige celletyper, inkludert kardiomyocytter, hepatocytter, nevrale progenitorer og keratinocytter. Systemet vil muliggjøre svært reproduserbare eksperimenter på tvers av institusjoner uten behov for dyktige forskere, og vil legge til rette for sosial implementering av hiPSCer i et bredere spekter av forskningsfelt ved å redusere hindringene for nye oppføringer.
Introduction
Denne artikkelen tar sikte på å gi faktiske og detaljerte håndteringsprosedyrer for et automatisert kultursystem for humaninduserte pluripotente stamceller (iPSC), som vi produserte ved å samarbeide med et selskap, og å vise representative resultater.
Siden publiseringen av artikkelen i 2007 har iPSC vakt oppmerksomhet over hele verden1. På grunn av sin største egenskap ved å kunne differensiere til en hvilken som helst type somatisk celle, forventes den å bli brukt på forskjellige felt som regenerativ medisin, belyse årsakene til ugjennomtrengelige sykdommer og utvikle nye terapeutiske legemidler 2,3. I tillegg kan bruk av humane iPSC-avledede somatiske celler redusere dyreforsøk, som er underlagt betydelige etiske begrensninger. Selv om det stadig kreves mange homogene iPSCer for å forske på nye metoder med iPSC-er, er det for arbeidskrevende å administrere dem. Videre er håndtering av iPSC vanskelig på grunn av sin høye følsomhet, selv for subtile kulturelle og miljømessige endringer.
For å løse dette problemet forventes automatiserte kultursystemer å utføre oppgaver i stedet for mennesker. Noen grupper har utviklet noen automatiserte humane pluripotente stamcellekultursystemer for cellevedlikehold og differensiering og publisert sine prestasjoner 4,5,6. Disse systemene utstyrer multiartikulerte robotarm(er). Robotarmer har ikke bare fortjeneste ved at de i stor grad etterligner menneskelige armbevegelser, men også demerit ved at de krever høyere kostnad (er) for armen (e), større og tyngre systememballasje og tidkrevende utdanningsinnsats fra ingeniørene for å oppnå de målrettede bevegelsene 7,8. For å gjøre det lettere å introdusere apparatet til flere forskningsfasiliteter på punktene økonomisk, plass og menneskelig ressursforbruk, har vi utviklet et nytt automatisert kultursystem for vedlikehold og differensiering av iPSC i forskjellige celletyper9.
Vår begrunnelse for det nye systemet var å ta i bruk et X-Y-Z-akseskinnesystem i stedet for multiartikulerte robotarmer9. For å erstatte de komplekse håndlignende funksjonene til robotarmer, brukte vi en ny idé til dette systemet, som automatisk kan endre tre typer spesifikke funksjonelle armspisser. Her viser vi også hvordan brukere enkelt kan lage oppgaveplaner med enkle bestillinger på programvare på grunn av manglende krav til ingeniørers bidrag gjennom hele prosessen.
Et av robotkultursystemene har demonstrert fremstillingen av embryoidlegemer ved hjelp av 96-brønnplater som 3D-celleaggregater for differensiering4. Systemet som er rapportert her, kan ikke håndtere 96-brønnsplater. Man oppnådde dagens god produksjonspraksis (cGMP) klasse ved hjelp av en cellelinje, selv om det ikke var en human pluripotent stamcelle5. Det automatiserte dyrkningssystemet som er beskrevet her, er nå utviklet med det spesifikke målet å hjelpe laboratorieeksperimenter (figur 1). Imidlertid har den nok systemer til å holde rene nivåer tilsvarende et nivå IV sikkerhetsskap.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den etiske komiteen ved Kansai Medical University godkjente generering og bruk av de sunne frivillige avledede iPSCene kalt KMUR001 (godkjenning nr. 2020197). Donoren, som ble åpent rekruttert, ga formelt informert samtykke og var enig i den vitenskapelige bruken av cellene.
MERK: Det gjeldende grensesnittet (den spesielle programvaren kalt "ccssHMI" som kjører under operativsystemet Windows XP) er den grunnleggende operasjonsskjermen. Under det nevnte grensesnittet arrangeres en serie faner, slik at brukerne kan starte forskjellige operasjoner.
1. Laster inn operasjoner
- Klikk på Laster inn-knappen på programvarens øverste skjerm. Klikk på Start-knappen Loading Preparation Start .
- Plasser tallerkenen(e) eller platen(e) som skal føres inn i apparatet på plass i apparatet.
MERK: Nødvendig informasjon for parabolidentifikasjon skal skrives på hvert lokk. - Lukk skyvevinduet foran manuelt og trykk på knappen for mekanisk sikkerhetsbekreftelse.
- Velg type og mengde tallerken(er) eller tallerken(er) i programvaren.
- Klikk på knappen Loading Preparation Completed (Lasting forberedelse fullført ). Klikk på Loading Start-knappen .
- Etter at en tallerken er lastet opp i systemet, velger du informasjonen på parabolen, for eksempel med iPS-celler eller uten iPS-celler, i programvaren. Registrer notater om hver tallerken i programvaren.
- Klikk på Registrering-knappen på slutten for å fullføre lastingen.
2. Lossing
- Klikk på Loss-knappen på programvarens toppskjerm. Velg parabolen(e) som skal fjernes i programvaren.
- Når du har valgt retten(e), klikker du på Start-knappen Lossing Preparation Start . Klikk på Lossing Start-knappen .
- Etter at parabolen(e) er overført fra inkubatoren til arbeidsbenken i systemet, trykker du på knappen Dish Removal (Oppvaskfjerning ).
- Åpne skyvevinduet foran manuelt og ta ut parabolen(e). Lukk skyvevinduet foran manuelt og trykk på knappen for mekanisk sikkerhetsbekreftelse.
3. Tillegg av forbruksvarer: pipetter, rør og medium
- Hvis du vil etterfylle forbruksvarer som pipetter, rør og medium, klikker du på Forbruksvarer-knappen på programvarens øverste skjerm, og deretter velger du varen som skal etterfylles.
- pipetter
- Klikk på Pipette-knappen . Velg Påfyll-knappen .
- Velg et rack som brukeren vil fylle på programvaren. Klikk på knappen Replenish Start .
- Etter å ha bekreftet at lokket på pipettelagringsområdet på arbeidsbenken er åpnet, åpner du skyvevinduet foran manuelt og fyller på pipettene etter behov.
- Lukk skyvevinduet foran manuelt og trykk på knappen for mekanisk sikkerhetsbekreftelse. Klikk på knappen Replenish Completed .
- Klikk knappen Etterfyllingsoppsett , angi informasjonen for etterfyllingen, og klikk deretter Registrering-knappen .
- Klikk på knappen Replenish Completed .
- Rør
- Klikk på Tube-knappen . Velg Påfyll-knappen .
- Velg et rack som brukeren vil fylle på programvaren. Klikk på knappen Replenish Start .
- Etter å ha bekreftet at stativet er flyttet til toppen, klikker du på Replenish Tube-knappen .
- Åpne skyvevinduet manuelt og fyll på rørene etter behov.
- Lukk skyvevinduet foran manuelt og trykk på knappen for mekanisk sikkerhetsbekreftelse.
- Klikk på knappen Replenish Completed .
- Klikk knappen Etterfyllingsoppsett , angi informasjonen for etterfyllingen, og klikk deretter Registrering-knappen . Klikk på Lukk-knappen .
- Middels
- Klikk på Medium-knappen . Velg Replenish-knappen i programvaren.
- Velg ett stativ fra tre som brukerne vil etterfylle. Klikk på knappen Replenish Start .
- Etter å ha bekreftet at lokket på mediumlagringsområdet er åpnet, åpner du skyvevinduet manuelt og fyller på mediet.
- Lukk skyvevinduet foran manuelt og trykk på knappen for mekanisk sikkerhetsbekreftelse.
- Klikk på knappen Replenish Completed .
- Klikk på Replenish-knappen og skriv inn informasjonen for mediet, inkludert navnet og mengden av mediet. Skriv inn ytterligere kommentarer om nødvendig.
- Klikk på Registrering-knappen .
- Klikk på Lukk-knappen .
- pipetter
4. Valg av oppgave
- Klikk på Oppgave-knappen på programvarens øverste skjerm.
- Velg Oppgaveinnstilling-knappen . Velg ønsket oppgave fra oppgavelisten og klikk på Neste trinn-knappen .
- Angi dato og klokkeslett for å utføre oppgaven, og klikk deretter Registrering-knappen . Velg en tallerken eller tallerken for å utføre oppgaven, og klikk deretter Registrering-knappen .
- Når du har bekreftet den valgte oppgaven på nytt, klikker du på Registrering-knappen . Bekreft at oppgaven er registrert på neste skjermbilde.
- Angi om nødvendig neste oppgave på samme måte.
- Klikk på Start-knappen på slutten. Deretter starter oppgaven automatisk på den angitte datoen og klokkeslettet.
NOTAT: Umiddelbart etter at hver oppgave er fullført, slås UV-lys (plassert på to sider av hetten) automatisk på, og etter 5-30 minutter, i samsvar med tilleggsinnstillingen, slås de av for å holde hetten i aseptisk tilstand. For å stoppe, kan brukerne klikke på Start-knappen . - Hvis brukerne vil avbryte en planlagt oppgave på forhånd, klikker du på Stopp-knappen .
- Når du har valgt oppgaven som skal avbrytes, klikker du på Rediger oppgave-knappen .
- Klikk Avbryt oppgave-knappen . Bekreft at oppgaven er slettet på neste skjermbilde.
5. Sjekk cellebilder
- Hver oppgave inkluderer mikroskopiske observasjoner (ta bilder) før og etter oppgavearbeidet. Observer fremdriften av cellekultur fotografisk ved å innlemme en mikroskopisk fotograferingsoppgave før eller etter hver oppgave.
- Velg forhåndsinnstilte oppgaveprogrammer, inkludert å velge flere spesifikke steder av parabolen eller brønnplaten på forhånd for observasjon av fast punkt for å overvåke samme sted over tid.
6. Passasje og differensiering
- Følg trinnene i avsnitt 1-5 og sett det automatiserte cellekultursystemet til å utføre passaging og differensiering. Instrumentinnstillingene for passasje, kardiomyocyttdifferensiering, hepatocyttdifferensiering, nevrale forløpercelledifferensiering og keratinocyttdifferensiering er vist i henholdsvis tabell 1, tabell 2, tabell 3, tabell 4 og tabell 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vedlikehold av menneskeskapte pluripotente stamceller
Vi brukte tre hPSC-linjer (RIKEN-2F, 253G1 og KMUR001). Vi har optimalisert vedlikeholdsprotokollen gjennom daglige manuelt utførte eksperimenter og ytterligere optimalisert de detaljerte programmene gjennom de syv foreløpige eksperimentene utført av systemet. For eksempel er skjærspenninger forårsaket av væskehastighetene til spyttestrømmen fra forskjellige pipeter som håndteres av mennesker og systemet, ganske forskjellige; Derfor optimaliserte vi tidslengden på den enzymatiske fordøyelsen og antall pipetteringer for celledispersjon av systemet.
Humaninduserte pluripotente stamceller ble opprettholdt på en 10 cm tallerken belagt med 0,5 μg/cm2 cellekulturmatrise med hiPSC dyrkningsmedium (f.eks. Neutristem eller StemFit AK02N). For passasje ble systemet programmert til å vaske hiPSC tre ganger med 5 ml fosfatbuffersaltvann uten kalsium (PBS[-]), og deretter behandle med 3 ml TrypLE ekspressenzym supplert med 10 μM av Rho-kinasehemmeren (Y-27632) i 15 minutter ved 37 °C. Deretter tilsatte systemet 9 ml PBS (-) med 0,15% bovin serumalbuminfraksjon V (BSA) til platen og utførte to sett med bevegelse som aspirerte 10 ml celleholdig væske og dispenserte væsken fra pipettespissen i en sikksakkbevegelse over toppen av platen, som ble vippet 20 ° nærmere plateoverflaten, og gjentok operasjonssekvensen ovenfor med platen vippet 20° på motsatt side. Deretter samlet systemet det celleholdige mediet i et 15 ml rør og kappet det, hvoretter det ble sentrifugert ved 115 x g i 5 minutter for å deponere cellene. Deretter aspirerte systemet supernatanten og dispergerte cellepelleten i enkeltceller ved hjelp av 10 ml kulturmedium med 10 μM Y-27632 ved pipettering 10 ganger. Systemet overførte 1 ml trypanblå oppløsning til et nytt 15 ml rør, tilsatte deretter 1 ml av cellesuspensjonen og blandet dem ved pipettering fem ganger. Deretter ble 100 μL av Trypan-blåfarget celleoppløsning aspirert og dispensert i innløpsvinduet til engangshemocytometeret i holderen. Systemet flyttet hemocytometerholderen til det mikroskopiske observasjonsområdet, og fanget et bilde, som umiddelbart ble analysert av programvare, og cellekonsentrasjonen som ble oppnådd, ble påført til neste trinn. For iPSC-vedlikehold sådde systemet cellene med en celletetthet på 15 000 celler / cm2 i nye 10 cm diameter plastplater belagt med 0,5 μg / cm2 cellekulturmatrise. For differensieringseksperimenter sådde systemet cellene ved den nødvendige celletettheten i mediet fremstilt for hver somatisk celletype i 6-brønnsplater belagt med en cellekulturmatrise fortynnet til 1/100. Til slutt utførte systemet krysslåsing fem ganger før platene ble overført til inkubatoren. Tre nye 10 cm plater inneholdende iPSCs og tre cellekulturmatrise-forhåndsbelagte plater ble lastet inn i systemet, og andre nødvendige elementer ble også fremstilt i henhold til de respektive prosedyrene nevnt ovenfor. En syklus med vedlikeholdskultur består av en passasjeoppgave på dag 1 etterfulgt av en kulturmiddelendring en gang om dagen i 3 dager. Gjennom hele eksperimentet ble denne syklusen satt opp i fem sykluser. I tillegg ble forbruksvarer etterfylt i sin tur.
I henhold til den bestilte tidsplanen ble fem sykluser med vedlikeholdskultur vellykket utført som planlagt av systemet. Fra cellefotografiene som ble tatt automatisk under hver oppgave, ble det bekreftet at cellene spredte seg jevnt over tid. Celleekspansjonen (n = 3) ble beregnet og vist i figur 2. For å bekrefte om den udifferensierte tilstanden til iPSC forblir uendret selv etter vedlikeholdsdyrkning i det automatiserte dyrkningssystemet, ble det utført immunocytometorisk analyse (Oct3/4 og SSEA4) med de resterende prøvene ved hver passering (figur 3A). Videre, etter fem sykluser, ble de tre rettene losset fra systemet, og immunhistokjemisk analyse (Oct3/4, SSEA4 og Tra1-81) ble også utført (figur 3B). Begge analysene med fluorescerende immunfarging viste at den udifferensierte tilstanden til iPS-celler ble bevart. Karyotyping av iPSC ble også utført før og etter vedlikeholdskultur i et automatisert kultursystem. Selv om det ble observert en abnormitet i et allel av kromosom 17 før start av vedlikeholdskulturen, ble det ikke observert noen spesiell endring i systemet etter 5 vedlikeholdskulturer, inkludert avviket (figur 3C). Innstillingene som brukes til vedlikehold av iPSC-er er oppsummert i tabell 1.
Differensiering
Kardiomyocytter
Differensieringsprotokollen fra en tidligere publikasjon ble fulgt her10. Systemet sådde udifferensierte hiPSCer (KMUR001) med en tetthet på 30 000 celler/cm2 på cellekulturmatrisebelagte 6-brønnsplater i hiPSC kulturmedium supplert med 10 μM Y-27632. Systemet endret medium til humant pluripotent stamcellemedium med 6 μM av GSK-3ß-hemmeren CHIR-99021, 20 ng/ml Activin A og 10 ng/ml BMP4 etter 3 dager (differensieringsdag 1). På differensieringsdag 3 endret systemet til CDM3-medium: RPMI 1640, 500 μg/ml rekombinant humant albumin og 213 μg/ml L-askorbinsyre-2-fosfat med 2 μM Wnt-C59. På differensieringsdag 5 endret systemet til ferskt CDM3-medium; Deretter gjentas skiftet til ferskt CDM3-medium annenhver dag. Innstillingene som brukes for kardiomyocyttdifferensiering av iPSCs er oppsummert i tabell 2.
Hepatocytter
Differensieringsprotokollen fra en tidligere publikasjon ble fulgt her11. Systemet sådde udifferensierte hiPSCs (RIKEN2F) med en tetthet på 25 000 celler/cm2 på cellekulturmatrisebelagte 6-brønnsplater i hiPSC kulturmedium supplert med 10 μM Y-27632. Etter 2 dager (differensieringsdag 1) endret systemet mediet til RPMI-1640 pluss 2 % B27 minus insulin (RPMI-B27) inneholdende 100 ng/ml Activin A, 6 μM CHIR-99021 og 1 % glutamintilskudd (f.eks. GlutaMAX) i 24 timer. På differensieringsdag 2 endret vi medium til RPMI-B27 med 50 ng/ml Activin A. På differensieringsdag 5 endret systemet mediet til RPMI-B27, som inneholdt 1% glutamintilskudd og 10 ng / ml BMP-4. På differensieringsdag 9 endret systemet medium til hepatocyttmodningsmedium: Leibovitz' L-15-medium inneholdende 8,3 % tryptosefosfatbuljong, 10 μM hydrokortison 21-hemisuccinat, 50 μg/ml natrium L-askorbat, 100 nM deksametason, 0,58 % insulin-transferrin-selen, 2 mM glutamintilskudd, 8,3 % føtal bovint serum og 100 nM rac-1,2-dihexadecylglycerol. Deretter gjentok systemet å endre mediet til et nytt medium annenhver dag. Innstillingene som brukes for hepatocyttdifferensiering av iPSCs er oppsummert i tabell 3.
Neuronale forløperceller
Differensieringsprotokollen fra en tidligere publikasjon ble fulgt her12. Systemet sådde udifferensierte hiPSCer (RIKEN2F) med en tetthet på 25 000 celler/cm2 på kjellermembranmatrisebelagte 6-brønnsplater i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM)/F12 og nevrobasalmedium (1:1) supplert med 10 % Knockout serumerstatning, 0,1 mM ikke-essensielle aminosyrer, 1 mM glutamintilskudd med 10 μM TGF-beta-reseptorhemmer (SB431542), 10 μM BMP-signalhemmer (dorsomorfin), og 10 μM Y-27632 (differensieringsdag 1). På differensieringsdag 5 endret systemet mediet til DMEM/F12 og Neurobasal medium 1:1 supplert med 0,1 mM ikke-essensielle aminosyrer, 1 mM glutamintilskudd, 1 % N-2-tilskudd, 1 % B-27-tilskudd, 50 μg/ml askorbinsyre 2-fosfat, 10 μM SB431542 og 10 μM dorsomorfin. På differensieringsdag 9 endret systemet mediet til DMEM/F12 og nevrobasalt medium 1:1 supplert med 0,1 mM ikke-essensielle aminosyrer, 1 mM glutamintilskudd, 1 % N-2-tilskudd, 1 % B-27-tilskudd, 50 μg/ml askorbinsyre 2-fosfat og 1 μM all-trans retinsyre. På differensieringsdag 13-16 endret systemet mediet hver dag med DMEM/F12 og nevrobasalt medium 1:1 supplert med 0,1 mM ikke-essensielle aminosyrer, 1 mM glutamintilskudd, 1% N-2-tilskudd, 1% B-27-tilskudd, 50 μg/ml askorbinsyre 2-fosfat og 10 ng/ml bFGF og 10 ng/ml EGF. Innstillingene som brukes for nevrale forløpercelledifferensiering av iPSCs er oppsummert i tabell 4.
Keratinocytter
Differensieringsprotokollen fra en tidligere publikasjon ble fulgt her13. Systemet sådde udifferensierte hiPSCer (253G1) med en tetthet på 15 000 celler/cm2 i cellekulturmatrisebelagte 6-brønnsplater i hiPSC kulturmedium med 10 μM Y-27632. Etter 2 dager senere (differensieringsdag 1) endret systemet medium til Dulbeccos modifiserte Eaglemedium (DMEM)/F12 og Neurobasalmedium (1:1) med 0,1 mM ikke-essensielle aminosyrer, 1 mM glutamin, 55 μM 2-merkaptoetanol, 1% N-2-supplement, 2% B-27-supplement, 50 μg/ml askorbinsyre-2-fosfat, 0,05% bovint serumalbumin og 100 ng/ml FGF-basiske. På differensieringsdag 3 og deretter ble mediet endret til humant keratinocyttmedium (uten tilskudd for dag 3 og med tilskudd på/etter dag 5) med tillegg av 0,5 μg/ml hydrokortison, 1 μM all-trans retinsyre, 25 ng/ml hBMP-4, 2,4 μg/ml adenin, 1,37 ng/ml trijodtyronin, 0,3 mM askorbinsyre 2-fosfat, og 2 μM forskolin, hver 2. dag av systemet. Innstillingene som brukes for keratinocyttdifferensiering av iPSCs er oppsummert i tabell 5.
Som nevnt ovenfor ble hele prosessen utført ved bruk av kun automatisert kulturutstyr, fra såing av iPS-celler til den påfølgende serien av differensieringsprotokoller. Uttrykket av karakteristiske markører i hver celle ble evaluert (figur 4). Det ble vist at differensiering kunne induseres ved bruk av bare et automatisert kultursystem.
Figur 1: Sammendrag av det automatiserte kultursystemet. (A) Bilde av systemet som viser størrelse og layoutskisse 1. (B) Bilde av arbeidsbenken og layoutskisse 2. (C) Håndverktøy: tallerken, rør og pipette. Denne figuren er modifisert med tillatelse fra Bando et al.9. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Passasjeoppgave og cellevekst. (A) Kvadratet illustrerer hver prosess. (B) iPSC-utvidelse beregnet ved hjelp av hver automatiserte celletelling i de tre uavhengige eksperimentene. (C) Representative bilder tatt automatisk fra passasje til passasje. Skalastenger = 400 μm og 100 μm (innsats). Denne figuren er modifisert med tillatelse fra Bando et al.9. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Automatisert langtidsvedlikehold av iPSC. (A) Alle immuncytometoriske analyser av de tre uavhengige eksperimentene for Oct-3/4 og SSEA-4. Hvert blått histogram indikerer ingen primær antistoffkontroll. Hvert rødt histogram representerer det angitte antigenspesifikke signalet. (B) Representative bilder av immunhistokjemisk fargede celler for Oct-3/4, SSEA-4 og Tra 1-81. Skalastenger = 50 μm. (C) Karyotype av RIKEN2F-iPSC etter femte passasje. Denne figuren er modifisert med tillatelse fra Bando et al.9. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 Immunhistokjemisk farging. Immunhistokjemiske bilder av hepatocytter (skalastenger = 100 μm), kardiomyocytter (skalastenger = 100 μm), nevrale stamceller (skalastenger = 100 μm) og keratinocytter (skalastenger = 200 μm). Denne figuren er modifisert med tillatelse fra Bando et al.9. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Passasjeforberedelser og systeminnstillinger. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 2: Kardiomyocyttdifferensieringspreparater og systeminnstillinger. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 3: Hepatocyttdifferensieringspreparater og systeminnstillinger. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 4: Nevrale forløpercelledifferensieringspreparater og systeminnstillinger. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 5: Keratinocyttdifferensieringspreparater og systeminnstillinger. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et kritisk trinn i protokollen er at hvis en bruker finner feil, klikker du på avbryt, stopp eller tilbakestill-knappen når som helst og starter på nytt fra det første trinnet. Programvaren kan unngå menneskelige feil, inkludert dobbeltbooking, åpning av dører mens systemoppgavene er aktive og mangel på påfylling. Et annet kritisk punkt for vellykket og effektiv differensiering til ønsket somatisk celle er riktig valg av pluripotente stamcellelinjer fordi hver pluripotente stamcelle har en ukontrollerbar skjevhet i sine differensieringsegenskaper14,15.
Dette automatiserte kultursystemet for induserte pluripotente stamceller kan opprettholde og differensiere dem i forskjellige somatiske celletyper. Størrelsen på dette systemet er 200 cm (bredde), 110 cm (dybde) og 233 cm (høyde), med en totalvekt på 1,2 tonn. Inkubatoren innebygd i enheten kan samtidig holde trettiseks 10 cm retter og ni multiwellplater.
Forbedringer i forhold til tidligere modeller er at for det første, som en håndteringsarm, ble X-Y-Z-akseskinnesystemet nylig konvertert fra en 6-akset leddarm, som fungerer ved å endre spissverktøyet på armen til tre forskjellige deler for servise, rør og pipetter. Armen er suspendert fra taket på systemet og beveger seg langs X-Y-Z-aksen. For det andre ble det innført et celletellingssystem for materfrie vedlikeholdskulturer og differensieringsinduksjonsprotokoller som utføres kontinuerlig fra passasjen. Etter blanding av enkeltcellesuspensjonsløsningen med trypanblå-løsningen ble den overført til et engangshemocytometer for mikroskopisk observasjon og avbildning. Programvaren analyserer automatisk det oppnådde bildet for å telle antall levende celler og beregne volumet som kreves for å frø det nødvendige antall celler. Nøyaktigheten av celletall oppnådd ved denne bildeanalysen var i samsvar med det som ble oppnådd manuelt.
X-Y-Z-akseskinnesystemet ble brukt for å håndtere hver oppgave raskere enn den forrige versjonen (flerakset leddarm). Med dette automatiserte dyrkningssystemet ble fem kontinuerlige passeringer utført i 16 dager, og iPSCs ble utvidet 625 ± 93 ganger. Selv om beviset på utholdenhet for tiden for cellevedlikehold uten materceller var kortere enn vår forrige demonstrasjon med materceller, var celleutvidelsen mer effektiv sammenlignet med forrige demonstrasjon6. Den forkortede oppgavetiden så ut til å bidra til å forhindre celleskader fra å tørke under oppgavene.
Videre ble differensieringsoppgaver fra vedlikeholdskultur til differensiering i kardiomyocytter, hepatocytter, nevronale forløperceller og keratinocytter utført uten human intervensjon. Etter en serie av disse kursene ble det bekreftet ved fluorescensimmunfarging at cellene oppnådd i det automatiserte kultursystemet alene hadde differensiert til de ønskede cellene. Derfor, ved å dele et oppgaveprogram og bruke dette systemet, kan forskere som ikke er kjent med iPS-celleadministrasjon få iPSC-avledede somatiske celler til egen forskning. Videre kan forskjeller i reproduserbarhet mellom forskere eller anlegg elimineres så mye som mulig, og det kan sikre at celler av homogen kvalitet oppnås hver gang.
Ved å ta i bruk et nytt skinnesystem kunne utstyret reduseres og reduseres i vekt til 1,2 tonn, ~ 200 kg lettere enn før. Videre kan deler og programinnstillingskostnader reduseres med omtrent $ 10.000 amerikanske dollar. Vedlikeholds- og programmeringskostnadene ble estimert til å falle med 13%. For å motivere flere forskere til enkelt å gå inn i iPS-cellerelatert forskning, er det også viktig å holde utstyrskostnadene lave6. Vi håper at nåværende og neste generasjons automatiske kultursystemer vil være et av bidragene til å bidra til å gi iPSCs og iPSC-avledede differensierte celler av mer ensartet kvalitet.
Dette systemets største begrensninger er kjøleskapets begrensede kapasitet for tentativ oppbevaring av kulturer og dets svakhet ved håndtering av små mengder (<100 μL) væske. Videre deaktiverer mangelen på sofistikert kunstig intelligens automatisk optimalisering i henhold til celletilstanden i tide. Den mindre begrensningen er kravet om spesielle pipettespisser levert av systemprodusentene 4,5. Vi utvikler neste generasjons kultursystemer som vil være i stand til å håndtere små mengder væske for middels forberedelser og inkluderer et tilbakemeldingsoptimaliseringssystem basert på kunstig intelligens med høy ytelse (systemlæring). Vår samarbeidende produsent9 har nok kunnskap til å bygge skreddersydde systemer i henhold til brukernes spesielle behov. I tillegg til dette vil neste generasjons systemer utstyrt med mer generelle og bredere funksjoner snart være på markedet. Vi vurderer også et abonnementsbasert utleiesystem for å levere oppdaterte systemer til alle brukere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av et tilskudd fra New Business Promotion Center, Panasonic Production Engineering Co., Ltd., Osaka, Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.15% bovine serum albumin fraction V | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 9048-46-8 | |
| 1% GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| 10 cm plastic plates | Corning Inc., NY, United States | 430167 | |
| 253G1 | RKEN Bioresource Research Center | HPS0002 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Actinin mouse | Abcam | ab9465 | |
| Activin A | Nacali Tesque | 18585-81 | |
| Adenine | Thermo Fisher Scientific | A14906.30 | |
| Albumin rabbit | Dako | A0001 | |
| All-trans retinoic acid | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 186-01114 | |
| Automated culture system | Panasonic | ||
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| bFGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 062-06661 | |
| BMP4 | Thermo Fisher Scientific | PHC9531 | |
| Bovine serum albumin | Merck | 810037 | |
| CHIR-99021 | MCE, NJ, United States #HY-10182 | 252917-06-9 | |
| Defined Keratinocyte-SFM | Thermo Fisher Scientific | 10744019 | Human keratinocyte medium |
| Dexamethasone | Merck | 266785 | |
| Dihexa | TRC, Ontario, Canada | 13071-60-8 | rac-1,2-Dihexadecylglycerol |
| Disposable hemocytometer | CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Dorsomorphin | Thermo Fisher Scientific | 1219168-18-9 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium/F12 | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 12634010 | |
| EGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 053-07751 | |
| Essential 8 | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Human pluripotent stem cell medium |
| Fetal bovine serum | Biowest, FL, United States | S140T | |
| FGF-basic | Nacalai Tesque Inc. | 19155-07 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | J63292.MF | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Glutamine supplement |
| Goat IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A11056 | |
| HNF-4A goat | Santacruz | 6556 | |
| Hydrocortisone | Thermo Fisher Scientific | A16292.06 | |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate | Merck | H2882 | |
| iMatrix511 Silk | Nippi Inc., Tokyo, Japan | 892 021 | Cell culture matrix |
| Insulin-transferrin-selenium | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| Keratin 1 mouse | Santacruz | 376224 | |
| Keratin 10 rabbit | BioLegend | 19054 | |
| KMUR001 | Kansai Medical University | Patient-derived iPSCs | |
| Knockout serum replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | A8960, Merck | A8960 | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 128-06075 | |
| Matrigel | Corning Inc. | 354277 | |
| Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21202 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin mouse | Santacruz | 23927 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament rabbit | Chemicon | AB1987 | |
| Neutristem | Sartrius AG, Göttingen, Germany | 05-100-1A | cell culture medium |
| Oct 3/4 mouse | BD | 611202 | |
| PBS(-) | Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan | 14249-24 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21206 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A10040 | |
| Recombinant human albumin | A0237, Merck, Darmstadt, Germany | A9731 | |
| Rho kinase inhibitor, Y-27632 | Sellec Inc., Tokyo, Japan | 129830-38-2 | |
| RIKEN 2F | RKEN Bioresource Research Center | HPS0014 | undifferentiated hiPSCs |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific #11875 | 12633020 | |
| SB431542 | Thermo Fisher Scientific | 301836-41-9 | |
| Sodium L-ascorbate | Merck | A4034-100G | |
| SSEA-4 mouse | Millipore | MAB4304 | |
| StemFit AK02N | Ajinomoto, Tokyo, Japan | AK02 | cell culture medium |
| TnT rabbit | Abcam | ab92546 | |
| TRA 1-81 mouse | Millipore | MAB4381 | |
| Triiodothyronine | Thermo Fisher Scientific | H34068.06 | |
| TripLETM express enzyme | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States | 12604013 | |
| Trypan blue solution | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 20577-34 | |
| Tryptose phosphate broth | Merck | T8782-500G | |
| Wnt-C59 | Bio-techne, NB, United Kingdom | 5148 | |
β  Tublin mouse |
Promega | G712A |
References
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Tanaka, T., et al. In vitro pharmacologic testing using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 385 (4), 497-502 (2009).
- Egashira, T., et al. Disease characterization using LQTS-specific induced pluripotent stem cells. Cardiovascular Research. 95 (4), 419-429 (2012).
- Sasamata, M., et al. Establishment of a robust platform for induced pluripotent stem cell research using Maholo LabDroid. SLAS technology. 26 (5), 441-453 (2021).
- Tristan, C. A., et al. Robotic high-throughput biomanufacturing and functional differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 16 (12), 3076-3092 (2021).
- Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system. Scientific Reports. 5, 16647 (2015).
- McClymont, D. W., Freemont, P. S. With all due respect to Maholo, lab automation isn't anthropomorphic. Nature Biotechnology. 35 (4), 312-314 (2017).
- Gonzalez, F., Zalewski, J. Teaching joint-level robot programming with a new robotics software tool. Robotics. 6 (4), 41 (2017).
- Bando, K., Yamashita, H., Tsumori, M., Minoura, H., Okumura, K., Hattori, F. Compact automated culture system for human induced pluripotent stem cell maintenance and differentiation. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 1074990 (2022).
- Tohyama, S., et al. Glutamine oxidation is indispensable for survival of human pluripotent stem cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
- Yamashita, H., Fukuda, K., Hattori, F. Hepatocyte-like cells derived from human pluripotent stem cells can be enriched by a combination of mitochondrial content and activated leukocyte cell adhesion molecule. JMA journal. 2 (2), 174-183 (2019).
- Shimojo, D., et al. Rapid, efficient and simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells. Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).
- Nishimoto, R., Kodama, C., Yamashita, H., Hattori, F. Human induced pluripotent stem cell-derived keratinocyte-like cells for research on Protease-Activated Receptor 2 in nonhistaminergic cascades of atopic dermatitis. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 384 (2), 248-253 (2023).
- International Stem Cell Initiative. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).
- Keller, A., et al. Genetic and epigenetic factors which modulate differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Human Reproduction Update. 24 (2), 162-175 (2018).
