Summary
Il successo della trascrittomica e della multiomica a singola cellula/singolo nucleo dipende in gran parte dalla qualità delle cellule/nuclei. Pertanto, l'isolamento di cellule/nuclei dai tessuti e la loro purificazione devono essere altamente standardizzati. Questo protocollo descrive la preparazione di nuclei dal cervello e dal midollo osseo per il test multioma a singolo nucleo a valle.
Abstract
L'analisi a singola cellula è diventata l'approccio di scelta per svelare la complessità dei processi biologici che richiedono la valutazione della variabilità delle risposte cellulari individuali al trattamento o all'infezione con risoluzione a singola cellula.
Negli ultimi 10 anni sono state sviluppate molte tecniche per la profilazione molecolare di singole cellule e sono state commercializzate diverse tecnologie dedicate. La profilazione a singola cellula basata su goccioline 10X Genomics è una tecnologia diffusa che offre reagenti pronti all'uso per la profilazione trascrittomica e multiomica di singole cellule. La tecnologia include flussi di lavoro per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula e a singolo nucleo (scRNA-Seq e snRNA-Seq, rispettivamente), scATAC-Seq, profilazione immunitaria a singola cellula (sequenziamento BCR/TCR) e multioma. Quest'ultimo combina informazioni trascrizionali (scRNA-Seq) ed epigenetiche (scATAC-Seq) provenienti dalla stessa cellula.
La qualità (vitalità, integrità, purezza) delle sospensioni unicellulari o mononucleose isolate dai tessuti e analizzate con uno qualsiasi di questi approcci è fondamentale per generare dati di alta qualità. Pertanto, i protocolli di preparazione dei campioni devono essere adattati alle particolarità di ciascun tessuto biologico e garantire la generazione di sospensioni cellulari e nucleiche di alta qualità.
Questo articolo descrive due protocolli per la preparazione di campioni di cervello e midollo osseo per la pipeline 10X Genomics del multioma a valle. I protocolli vengono eseguiti gradualmente e riguardano la dissociazione tissutale, lo smistamento cellulare, l'isolamento dei nuclei e il controllo di qualità della sospensione di nuclei preparata che viene utilizzata come materiale di partenza per il partizionamento cellulare e la codifica a barre, la preparazione della libreria e il sequenziamento. Questi protocolli standardizzati producono librerie di nuclei di alta qualità e dati robusti e affidabili.
Introduction
Per molti anni, le tecniche a singola cellula sono state il gold standard per l'analisi dei processi biologici. Inizialmente erano limitati alla fenotipizzazione di singole cellule attraverso microscopia, citometria a flusso e saggi simili. Una svolta nell'analisi di singole cellule è arrivata con lo sviluppo di approcci per la profilazione molecolare di singole cellule, in particolare il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-Seq) che ha permesso di caratterizzare l'intero trascrittoma delle singole cellule. Molto potente, scRNA-Seq genera informazioni sullo stato trascrizionale di una cellula in una condizione e in un punto temporale specifici. Tuttavia, non fornisce visibilità sulla regolazione genica che guida la trascrizione, o sulle modificazioni molecolari che si verificano nel tempo. Per superare questa limitazione, molti sforzi sono stati investiti nello sviluppo di saggi multi-omici a singola cellula che consentono l'analisi di più fattori e processi dalla stessa cellula 1,2,3,4. La prima misurazione di successo di due modalità all'interno di singole cellule è avvenuta collegando i modelli di espressione delle proteine di superficie multiplex con il trascrittoma completo delle singole cellule nell'approccio CITE-Seq5. Evoluzioni più recenti combinano l'espressione genica con l'accessibilità della cromatina (Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing, ATAC-Seq), catturando così simultaneamente le modalità trascrittomiche ed epigenomiche nelle stesse cellule (ad esempio, sci-CAR)6. Le prime soluzioni commerciali che permettevano di associare la trascrittomica al fenotipo cellulare o a modificazioni epigenetiche della stessa cellula provenivano dalla 10X Genomics.
Gli esperimenti per la profilazione molecolare a singola cellula contengono le seguenti fasi: (1) dissociazione tissutale o preparazione di sospensioni unicellulari; (2) purificazione cellulare e/o isolamento dei nuclei; (3) partizionamento e codifica a barre; (4) costruzione di biblioteche e controllo di qualità; (5) sequenziamento di nuova generazione; (6) analisi dei dati. Mentre le fasi (3)-(6) possono variare in modo significativo a seconda della tecnologia impiegata, le fasi iniziali sono generalmente comuni a tutte. La qualità della sospensione di cellule/nuclei preparata determinerà l'esito complessivo dell'esperimento. A seconda del tipo di tessuto, può essere difficile ottenere sospensioni unicellulari/nucleiche di alta qualità. Le particolarità di alcuni tessuti, come il cuore, il muscolo, il cervello, il polmone, l'intestino e altri, richiedono metodi di disgregazione tissutale e di isolamento dei nuclei adattati a ciascun tipo di campione al fine di garantire la produzione di nuclei di alta qualità per l'analisi molecolare 7,8,9,10 . I metodi di disgregazione tissutale e i protocolli di dissociazione possono essere meccanici, enzimatici (ad esempio, un mix di collagenasi e DNasi) o una combinazione dei due, e possono essere eseguiti manualmente o con strumenti (ad esempio, Qiagen DSC-400, gentleMACS).
Le tecniche unicellulari sono diventate uno strumento privilegiato per la ricerca biomedica. In neurobiologia, la diversità cellulare nel cervello e la complessità delle loro funzioni richiedono analisi ad alta risoluzione e ad alto rendimento per la visualizzazione di popolazioni cellulari rare e per la valutazione della loro eterogeneità 11,12,13,14. Il collegamento tra l'identità cellulare e i meccanismi di regolazione genica delle singole cellule fornisce informazioni sullo sviluppo e sulla fisiologia del cervello. Un altro esempio sono gli studi sulla risposta immunitaria nel contesto di malattie infettive, autoimmuni o tumorali, che si basano fortemente su analisi di singole cellule. L'eterogeneità dei sottoinsiemi di cellule immunitarie e la complessità della loro attività e delle interazioni con altri tipi di cellule richiedono una risoluzione a singola cellula per decifrare i meccanismi alla base della risposta immunitaria. Le cellule immunitarie hanno origine dal midollo osseo, dove i progenitori ematopoietici sono composti da cellule che si differenziano gradualmente e che acquisiscono e perdono marcatori di superficie cellulare durante un processo graduale prima di uscire dal midollo osseo per tornare a casa in periferia. L'analisi di singole cellule consente una caratterizzazione minuziosa delle fasi di sviluppo cellulare. Può essere ottenuto attraverso la fenotipizzazione di una singola cellula, convenzionalmente eseguita mediante citometria a flusso multiparametrica. Tuttavia, è stato dimostrato che le firme trascrittomiche a singola cellula rivelano un'identificazione più precisa dei sottotipi di cellule progenitrici, poiché queste cellule sono distribuite in cluster che cadono l'una nell'altra e possono quindi essere erroneamente identificate quando si utilizza un approccio con marcatori di superficie cellulare grossolani15. Un numero crescente di studi scopre le modificazioni epigenetiche che le cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) possono acquisire dall'esposizione a vari agenti, portando a un impatto significativo sulla risposta a lungo termine del sistema immunitario 16,17,18,19. Le nuove tecnologie multi-omiche consentono di studiare questi processi con risoluzione a singola cellula.
Molti protocolli per l'isolamento di cellule e nuclei sono stati descritti per i campioni di cervello 11,20,21,22 e midollo osseo 23,24. Per ridurre al minimo le distorsioni dovute alla variabilità sperimentale, è necessario convalidare protocolli di preparazione ottimizzati per il sequenziamento trascrittomico ed epigenomico congiunto a singola cellula, garantendo così la riproducibilità dei saggi multiomici a singola cellula.
Qui, vengono descritti due protocolli robusti per la preparazione dei nuclei da (1) tessuto cerebrale fresco-congelato e (2) HSPC di midollo osseo fresco per l'analisi del multioma a singola cellula a valle (Figura 1).
Figura 1: Rappresentazione schematica dei protocolli per l'isolamento dei nuclei da tessuti cerebrali e midollari freschi congelati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Protocol
Le procedure sperimentali sono state condotte nel rigoroso rispetto dei protocolli approvati dal Comitato per l'Etica nella Sperimentazione Animale (CETEA). Per l'isolamento dei nuclei cerebrali sono stati utilizzati topi C57BL/6 di 3 mesi. Per l'isolamento del midollo osseo sono stati utilizzati topi femmina C57BL/6J di 8 settimane del peso di 18 g.
1. Purificazione dei nuclei dal cervello di topo
NOTA: Indossare sempre guanti in lattice o nitrile durante la procedura. Si consiglia vivamente di avere due persone che eseguono l'esperimento, che le fasi da 1 a 3 (cioè la preparazione della sospensione dei singoli nuclei) vengano eseguite da una persona e la fase 4 (cioè la preparazione del selezionatore) eseguita in parallelo da un'altra persona. Poiché il protocollo è altamente sensibile al fattore tempo, è fondamentale ridurre al minimo i tempi di elaborazione del campione avendo il selezionatore pronto non appena viene preparata la sospensione dei singoli nuclei.
- Preparazione di reagenti e materiali
- Sterilizzare accuratamente gli strumenti di dissezione in autoclave (a 121 °C per 20 min) e lavarli con etanolo al 70% poco prima dell'uso. Preparare una capsula di Petri per campione, riempita con 2-3 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS) ghiacciata 1x Dulbecco.
- Raffreddare la microcentrifuga a 4 °C, riempire un secchio di ghiaccio e mettere l'omogeneizzatore in vetro sul ghiaccio.
- Preparare il tampone di lisi dei nuclei aggiungendo digitonina per una concentrazione finale dello 0,01%, 10 mL per campione.
- Preparare il tampone di colorazione aggiungendo inibitori della RNasi al tampone di colorazione cellulare per una concentrazione finale di 0,2 U/μL, 20 mL per campione.
- Preparare DPBS 0,04% BSA aggiungendo inibitori della RNasi per una concentrazione finale di 0,2 U/μL, 2 mL per campione.
- Preparare 1 mL di tampone nuclei diluiti secondo il protocollo Multiome25.
- Conservare tutti i reagenti e i campioni sul ghiaccio.
- Dissezione tissutale
- Sacrificare i topi utilizzando protocolli approvati dall'istituzione. In questo protocollo, i topi sono stati decapitati dopo un'overdose di ketamina/xilazina.
- Taglia la testa del topo con le forbici e rimuovi il cervello dal cranio come descritto in Meyerhoff et al.26. Trasferire immediatamente il cervello in una capsula di Petri preparata con il DPBS ghiacciato 1x sotto uno stereomicroscopio illuminato a diodo emettitore di luce (LED).
- Tagliare il tessuto cerebrale con un bisturi per separare le aree cerebrali di interesse (ad esempio, corteccia entorinale, ippocampo, corteccia prefrontale) e trasferire ciascuna regione in una capsula di Petri separata contenente 1x DPBS ghiacciato. Tieniti sul ghiaccio.
- Con un bisturi, tritare il tessuto in pezzi di <0,5 cm per facilitare l'omogeneizzazione nella fase successiva.
- Con una micropipetta P1000, trasferire il tessuto tritato e il DPBS 1x dalla piastra di Petri a una provetta da 1,5 mL. Assicurati di utilizzare provette in plastica a basso legame proteico. Lasciare che i pezzi di tessuto si separino per gravità. Rimuovere con cautela l'eccesso di 1x DPBS utilizzando una micropipetta P1000.
NOTA: Dopo questo passaggio, è possibile congelare a scatto il tessuto macinato trasferendo le provette a basso legame proteico nel ghiaccio secco e quindi conservandole a -80 °C fino a quando non si procede con l'isolamento dei nuclei.
- Isolamento dei nuclei
- Riempire la bomba di vetro con 2 ml di tampone di lisi dei nuclei ghiacciato con lo 0,01% di digitonina. Aggiungere i pezzi di fazzoletto nella dounce.
NOTA: se si lavora con tessuto fresco-congelato, aggiungere il tessuto congelato tritato direttamente al tampone di lisi dei nuclei 0,01% digitonina; Non lasciare che il tessuto si scongeli prima. - Omogeneizzare con un omogeneizzatore di carta di vetro 25 volte con il pestello A e poi 25 volte con il pestello B. Trasferire l'omogenato in una provetta da 15 ml.
- Aggiungere altri 2 mL di tampone di lisi dei nuclei ghiacciati con lo 0,01% di digitonina e incubare su ghiaccio per 5 minuti. Centrifugare i nuclei a 500 x g per 5 min a 4 °C.
- Rimuovere il surnatante con una micropipetta e aggiungere 4 mL di tampone di lisi dei nuclei ghiacciati con lo 0,01% di digitonina. Incubare su ghiaccio per 5 minuti e filtrare attraverso un colino cellulare da 40 μm.
- Centrifugare i nuclei a 500 x g per 5 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante con una micropipetta.
- Aggiungere 4 mL di tampone colorante per lavare i nuclei e centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante con una micropipetta e risospendere il pellet in 4 mL di tampone colorante.
- Filtrare attraverso un colino cellulare da 40 μm e centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Risospendere in 1 mL di PBS con BSA allo 0,04%.
- Contare i nuclei per garantire l'uniformità della preparazione dei tessuti/nuclei su campioni diversi. Ci si aspetta di ottenere conteggi di nuclei simili dalle stesse regioni cerebrali:
- Aggiungere 10 μL di blu tripano allo 0,4% in una provetta vuota da 0,5 mL. Aggiungere 10 μL di nuclei e miscelare 5 volte mediante pipettaggio.
- Conta i nuclei utilizzando un contatore di cellule automatizzato seguendo le raccomandazioni del fornitore. Tenere i nuclei sul ghiaccio.
- Preparare i nuclei per l'ordinamento.
NOTA: I nuclei estratti incorporano 7-AAD e questa colorazione viene utilizzata per la loro purificazione mediante selezionatore cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS).- Trasferire 100 μL di nuclei in una provetta FACS per il controllo non colorato. Aggiungere 10 μL di 7-AAD ai nuclei rimanenti e mantenere 5 minuti a 4 °C.
- Ordinare un minimo di 0,5 x 106 nuclei con FACS per eliminare doppiette e detriti.
- Riempire la bomba di vetro con 2 ml di tampone di lisi dei nuclei ghiacciato con lo 0,01% di digitonina. Aggiungere i pezzi di fazzoletto nella dounce.
- Smistamento dei nuclei mediante FACS
NOTA: Sebbene lo smistamento dei nuclei possa essere eseguito su un'ampia varietà di selezionatori cellulari, la procedura per l'utilizzo degli strumenti BD FACSAria Fusion o BD FACSAria III è descritta qui. Si consiglia vivamente di eseguire la calibrazione e la configurazione del selezionatore di celle sotto la supervisione o da un utente esperto dello strumento. Per ridurre i tempi di elaborazione del campione, è fondamentale avere il selezionatore pronto non appena viene preparata la sospensione dei singoli nuclei.- Taratura dello strumento FACS
- Accendere il selezionatore di celle e il computer. Una volta collegato il software allo strumento, avviare la procedura di avvio fluidico. Selezionare Citometro > Avvio fluidico nel menu principale e seguire i quattro passaggi. Fai clic su Fine dopo averli completati.
- Inserire l'ugello da 70 μm, accendere il getto e lasciare stabilizzare il getto per 15 minuti. Regola l'ampiezza per ottenere la formazione della goccia e fai clic su Sweet Spot.
- Posizionare il filtro a densità neutra (N.D) 1.0 e aprire l'interfaccia di configurazione e tracciamento del citometro (CST).
- Controllo qualità giornaliero: Diluire le perle CST in un terreno FACS (vedere le raccomandazioni del fornitore) ed eseguire il controllo CST. Una volta completato, sostituire l'N.D 1.0 con l'N.D 2.0.
- Diluire Accudrops nel terreno FACS (vedere le raccomandazioni del fornitore) ed eseguire il ritardo di caduta come descritto nei passaggi da 6 a 10.
- Nel modello di esperimento, selezionare l'esperimento Accudrop Drop Delay e aprire il layout di ordinamento per la provetta.
- All'interno della finestra inferiore della telecamera, fare clic su Tensione e poi su Filtro ottico per abilitare l'applicazione della carica sulle piastre di deflessione e l'utilizzo di un filtro ottico specifico davanti alla telecamera. Assicurarsi che il quadrante sul lato destro indichi 100. Se necessario, regolare la vite del laser rosso per ottimizzare l'impatto del laser.
- Regolare la portata per raggiungere la velocità da 1.000 a 3.000 eventi al secondo.
- Fare clic su Ordina e annulla. Assicurarsi che il quadrante sinistro sia uguale a 100 e che il quadrante destro sia 0. Se il quadrante sinistro è inferiore a 95, eseguire Ritardo automatico.
- Fare clic su Tensione, quindi su Ordinamento test. Controllare la qualità del deposito dei flussi laterali nelle provette di raccolta. Se necessario, regolare la posizione dei flussi laterali spostando i cursori.
- Messa a punto dello strumento FACS per lo smistamento dei nuclei.
- Avviare l'acquisizione dei nuclei non colorati. Questi vengono utilizzati per definire le dispersioni dirette e laterali e la tensione del rivelatore per il parametro 7-ADD. Impostare i parametri in modo che il segnale 7-AAD del campione non colorato rientri nella prima decade della scala logaritmica sul grafico a punti.
- Iniziare ad acquisire la provetta di nuclei colorati con 7-AAD e definire le popolazioni di nuclei utilizzando una strategia di gating basata su (1) FSC-A/SCC-A e poi FSC-H/SSC-H per dimensioni e granularità, (2) FSC-H/FSC-A per la discriminazione dei doppietti e (3) SSC-A/7-AAD per nuclei positivi con 7-AAD (vedere Figura 2A).
- Assicurarsi che il flusso e la deflessione siano stabili.
- Nella telecamera a flusso laterale, accendere l'ordinamento del test, la tensione ON e confermare l'accurato smistamento delle gocce in una provetta da 1,5 mL montata sul lato sinistro.
- Nella finestra Layout di ordinamento , selezionare la popolazione di interesse, come definito nel passaggio 2 (sopra). In Eventi target, selezionare la soglia in Continuo per ottenere un minimo di 0,5 x 106 nuclei per campione. In Precisione (Precision), selezionate Purezza a 4 vie.
- Una volta pronto, fare clic su Ordina e OK per iniziare con l'ordinamento dei nuclei.
- Taratura dello strumento FACS
- Controllo qualità e conteggio dei nuclei purificati
NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito solo durante l'esperimento pilota per l'ottimizzazione delle fasi di preparazione del campione, con l'obiettivo di testare la purezza dei nuclei ordinati che devono essere caricati sul chip di cromo 10X. Una volta che il protocollo è completamente ottimizzato, non è consigliabile eseguire questa fase di controllo di qualità negli esperimenti di follow-up per evitare inutili sprechi di nuclei raccolti che potrebbero essere disponibili in numero ridotto.- Controllo della purezza mediante citometria a flusso
- Trasferire 10 μL dei nuclei selezionati in una nuova provetta FACS contenente 90 μL di DPBS con il 2% di siero fetale bovino inattivato dal calore (HI-FBS).
- Acquisire e registrare i dati post-smistamento per verificare la purezza e la fattibilità dello smistamento. Assicurarsi che almeno il 98% dei nuclei appaia nella porta di interesse, come definito al punto 4.2 (vedere la Figura 2B).
- Conteggio dei nuclei purificati
- Centrifugare i nuclei selezionati per 5 minuti a 500 x g e a 4 °C e rimuovere con cautela il surnatante utilizzando una micropipetta. Risospendere in 100 μL di tampone nuclei diluiti.
- Aggiungere 10 μL di blu tripano allo 0,4% in una provetta vuota da 0,5 mL. Aggiungere 10 μL dei nuclei selezionati e miscelare 5 volte mediante pipettaggio.
- Conta i nuclei utilizzando un contatore di cellule automatizzato seguendo le raccomandazioni del fornitore. Regolare la concentrazione di nuclei a 3,5 x 106/mL, ovvero 16.000 nuclei per 5 μL.
- Controllo di qualità dei nuclei purificati mediante microscopia
NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito solo durante l'esperimento pilota per l'ottimizzazione delle fasi di preparazione del campione per testare la qualità dei nuclei che devono essere caricati sul chip di cromo 10X. Una volta che il protocollo è completamente ottimizzato, non è consigliabile eseguire questa fase di controllo di qualità negli esperimenti di follow-up per evitare inutili sprechi di nuclei raccolti che potrebbero essere disponibili in numero ridotto.- Assicurarsi che i vetrini per microscopio e i vetrini coprioggetto siano puliti e privi di polvere. Se necessario, lavare e risciacquare i vetrini coprioggetti con etanolo assoluto e asciugarli con salviette prive di lanugine.
- Distribuire 25 μL di poli-l-lisina nei pozzetti dei vetrini che verranno utilizzati e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente (RT), al riparo dalla polvere.
- Rimuovere la poli-l-lisina in eccesso e aggiungere 10 μL della sospensione di nuclei purificati. Incubare per 5 minuti a RT, al riparo dalla polvere.
- Aggiungere una goccia di terreno di montaggio a ciascun pozzetto, evitando la formazione di bolle.
- Posiziona un vetrino coprioggetti sopra i pozzetti seminati. Coprire con salviette di carta e premere con decisione il vetrino coprioggetto per rimuovere il mezzo di montaggio in eccesso. Fare attenzione a non spostare il vetrino coprioggetti e non pulire il mezzo di montaggio in eccesso.
- Scatta diverse immagini con un microscopio invertito con luce in campo chiaro e un ingrandimento minimo di 40x.
- Controllo della purezza mediante citometria a flusso
- Eseguire il test del multioma.
- Passare immediatamente alla Guida per l'utente di Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression (CG000338 - Rev F)25.
2. Purificazione di nuclei da cellule staminali e progenitrici ematopoietiche del midollo osseo di topo (HSPCs)
NOTA Questo protocollo descrive la purificazione dei nuclei di tre sottogruppi delle HSPC del midollo osseo: lignaggio-c-Kit+Sca-1+ cellule staminali ematopoietiche (HSC), lignaggio-c-Kit+Sca-1-CD34+FcγR- progenitori mieloidi comuni (CMP) e lignaggio- c-Kit+Sca-1-CD34+FcγR+ progenitori granulociti-monociti (GMP). Indossare sempre guanti in lattice o nitrile durante la procedura. Questo protocollo è un adattamento del 10X Genomics Demonstration Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX sequencing (CG000365 - Rev C)27. Sono state introdotte modifiche al protocollo originale per massimizzare il recupero dei nuclei. Si consiglia vivamente di avere due persone che eseguono l'esperimento, per avere i passaggi 1. fino a 3. (cioè la preparazione della soluzione unicellulare) eseguita da una persona e la fase 4 (cioè la preparazione del selezionatore) eseguita in parallelo da un'altra persona. Poiché il protocollo è altamente sensibile al fattore tempo, è fondamentale ridurre al minimo il tempo di elaborazione del campione tenendo il selezionatore pronto non appena viene preparata la sospensione a cellula singola.
- Preparazione di reagenti e materiali
- Riempi un secchio di ghiaccio.
- Preparare il tampone FACS: DPBS con soluzione HI-FBS al 2% (circa 500 mL per 6 campioni) e filtrare attraverso un filtro da 0,2 μm.
- Preparare il terreno di raccolta: DPBS con soluzione HI-FBS al 10% (500 μL per campione) e filtrare attraverso un filtro da 0,2 μm.
- Isolamento di cellule del midollo osseo
- Sacrificare i topi utilizzando protocolli approvati dall'istituzione. In questo esperimento, i topi sono stati sacrificati per lussazione cervicale dopo un'overdose di ketamina/xilazina.
- Spruzzare l'addome e le zampe posteriori dei topi con etanolo al 70%.
- Utilizzare una pinza sterile e delle forbici per praticare una piccola incisione al centro del basso addome e aprire il peritoneo dalla base delle zampe posteriori al diaframma (Figura supplementare 1).
- Fai un taglio aggiuntivo per ciascuna zampa posteriore perpendicolare al peritoneo aperto, quindi afferra entrambi i lati di uno di questi tagli aggiuntivi e separalo per staccare la pelle da entrambe le zampe posteriori oltre l'articolazione della caviglia per esporre i muscoli di entrambe le zampe posteriori (Figura supplementare 1A).
- Allineare le forbici lungo la colonna vertebrale in corrispondenza dell'articolazione dell'anca di una zampa posteriore per tagliare la gamba senza tagliare il femore (Figura supplementare 1B, C). Ripeti lo stesso per l'altra gamba.
- Per isolare il femore, tagliare la maggior parte del tessuto muscolare, quindi tenere il femore e la tibia in ciascuna mano con la punta delle dita all'articolazione (Figura supplementare 1D, E). Piegare delicatamente la gamba contro la piega naturale per dislocare la tibia dal femore (Figura supplementare 1E) e poi tagliare con cura il tessuto connettivo con le forbici per separare il femore e la tibia.
- Utilizzare le forbici con leggeri movimenti di torsione per dislocare la punta della spina dorsale dall'estremità superiore del femore (Figura supplementare 1E).
- Pulire il femore isolato con carta velina per rimuovere il muscolo e il tessuto connettivo rimanenti.
- Conservare freddo su ghiaccio in una piastra da 12 pozzetti ben riempita con 2 ml di DMEM (1x) + GlutaMAX-I.
- Una volta raccolti tutti i femori, assicurarsi che i tessuti muscolari e fibrosi siano completamente rimossi dall'osso. Non tagliare l'osso per (a) mantenere sterile il midollo all'interno e (b) evitare di perdere cellule nel pozzetto. Utilizzare i seguenti passaggi per risciacquare le cellule da due femori di un topo, adattati da Haag e Murthy28.
- Preparare una provetta da 1,5 mL e una da 0,5 mL. Aggiungere 150 μL del tampone FACS alla provetta da 1,5 mL, quindi praticare un foro sul fondo della provetta da 0,5 mL utilizzando un ago da 18 G e inserire la provetta da 0,5 mL nella provetta da 1,5 mL.
- Aprire la parte distale di ciascun femore utilizzando le forbici chirurgiche di topo (Figura supplementare 1F): bloccare l'epifisi distale tra le lame e applicare una leggera pressione mentre si girano le forbici per staccare dolcemente l'epifisi distale senza tagliare bruscamente l'osso. In caso di esito positivo, dovrebbero essere visibili 4 sporgenze all'estremità della fisi ora esposta (Figura supplementare 1G).
- Inserire i due femori con l'estremità aperta rivolta verso il basso nella provetta preparata da 0,5 mL posta all'interno di una provetta da 1,5 mL contenente tampone FACS (Figura supplementare 1H).
- Posizionare un colino cellulare da 70 μm su una provetta da 50 mL e pre-bagnare il filtro con 2 mL di tampone FACS.
- Per lavare il midollo osseo, centrifugare le provette (tappi aperti) a 12.000 x g fino a quando la centrifuga raggiunge il valore di 12.000 x g , quindi arrestare immediatamente la centrifuga.
- Verificare che le cellule del midollo osseo siano pellettate nella provetta da 1,5 mL e che i femori siano bianchi (prima del lavaggio cellulare, sono rossi) (Figura supplementare 1I). Scartare le provette da 0,5 mL con i 2 femori.
- Eliminare il surnatante da 150 μL utilizzando una pipetta.
- Risospendere il pellet con una micropipetta in 1 mL di tampone lisante ammonio-cloruro-potassio (ACK) per 1-2 minuti a RT per lisare i globuli rossi. Evitare tempi di incubazione più lunghi in quanto potrebbero comportare una ridotta vitalità delle cellule nucleate.
- Trasferire nella provetta da 50 mL attraverso il filtro per celle da 70 μm pre-bagnato.
- Aggiungere 10 mL di tampone FACS per diluire il tampone lisante ACK e quindi interrompere la lisi.
- Centrifugare a 400 x g per 5 minuti a 4 °C. Risospendere in 10 mL di tampone FACS risospendendo prima in 1 mL e poi rabboccando con 9 mL.
- Preparare le celle per il conteggio come descritto al punto 1.3.8.
- Conta le celle utilizzando un contatore di cellule automatizzato seguendo le raccomandazioni del fornitore. Si prevede che raccoglierà circa 40 milioni di cellule da 2 femori.
- Colorazione del midollo osseo HSPC
- Centrifugare le cellule a 400 x g per 5 minuti a 4 °C e risospendere il pellet con una micropipetta in tampone FACS fino a una concentrazione finale di 1 x 107 cellule/mL.
- Con una micropipetta P1000, trasferire la sospensione in una provetta FACS, filtrando attraverso un tappo di filtro cellulare da 35 μm.
- Preparare campioni in provetta a colorante singolo per ciascun anticorpo elencato nella Tabella 1 per impostare i compensatori di fluorocromi sul selezionatore cellulare:
- Preparare una provetta FACS per anticorpo e riempire le provette con 200 μL di PBS.
- Aggiungere 15 μL di microsfere di compensazione del fluorocromo in ciascuna provetta FACS di anticorpo coniugato con fluorocromo. Nelle provette FACS per le cellule non colorate e per le singole cellule colorate vive/morte, aggiungere 500.000 cellule invece delle perline.
- Aggiungere 1 μL di ciascun anticorpo coniugato con fluorocromo (vedere Tabella 1) nella provetta FACS corrispondente. Aggiungere 0,5 μL di colorante vivo/morto nella provetta FACS di colorante singolo vivo/morto.
- Tenere sul ghiaccio per 15 minuti al riparo dalla luce.
- Preparare le Miscele 1 e 2 come indicato nella Tabella 2.
NOTA: I volumi di anticorpi indicati nella Tabella 2 sono validi per gli anticorpi a cui si fa riferimento nella Tabella dei materiali. Devono essere ottimizzati per qualsiasi nuovo riferimento di anticorpi o per un lotto diverso dello stesso riferimento di anticorpi. - Aggiungere 300 μL di Mix 1 nella provetta, risospendere e conservare per 15 minuti su ghiaccio al riparo dalla luce.
- Aggiungere 300 μL di Mix 2 nella provetta del campione, risospendere e conservare per 20 minuti su ghiaccio al riparo dalla luce.
- Aggiungere 3 mL di tampone FACS alle provette monocolorate e alle provette colorate con miscela. Centrifugare a 400 x g per 5 minuti a 4°C.
- Scartare con cautela il surnatante utilizzando una micropipetta e risospendere il pellet in 500 μL del tampone FACS.
- Preparare una provetta da 1,5 mL preriempita con 500 μL di terreno di raccolta.
NOTA: La miscela 1 è preparata in DPBS poiché contiene la macchia Live/Dead significativamente influenzata da HI-FBS. Una volta che le cellule sono state colorate da Vivo/Morto, viene aggiunta la Miscela 2, che contiene gli anticorpi coniugati al fluorocromo risospesi in tampone FACS contenente HI-FBS. L'unica eccezione è l'anticorpo anti-CD16/32 che è incluso in Antibody Mix 1 per fungere da bloccante del recettore Fc che impedisce il legame non specifico degli altri anticorpi aggiunti nel passaggio successivo.
- Smistamento delle cellule con un FACS
NOTA: Sebbene il selezionatore cellulare possa essere eseguito su un'ampia varietà di selezionatori cellulari, qui viene descritta la procedura per l'utilizzo degli strumenti BD FACSAria Fusion o BD FACSAria III. Si consiglia vivamente di eseguire la calibrazione e la configurazione del selezionatore di celle sotto supervisione o da un utente esperto dello strumento.- Calibrazione dello strumento FACS: Fare riferimento al passaggio 4.1 del Protocollo 1.
- Messa a punto dello strumento FACS per la selezione delle cellule:
- Avviare l'acquisizione delle cellule non colorate. Questi vengono utilizzati per definire le dispersioni dirette e laterali e la tensione del rivelatore per ciascun fluoroforo. Impostare i parametri in modo che il segnale fluorescente di ciascun fluoroforo rientri nella prima decade della scala logaritmica sul grafico a punti.
- Acquisisci controlli a colore singolo per impostare le compensazioni manualmente (la mediana delle popolazioni positive e negative deve essere allineata) o utilizza il software di calcolo automatico (misurazioni della pendenza). Assicurarsi che i controlli di compensazione corrispondano alle impostazioni sperimentali dei fluorocromi e del rivelatore. Registra 10.000 eventi per le celle e 5.000 eventi per le perline.
- Utilizzare la provetta del campione (cioè le cellule multi-colorate) per definire le popolazioni cellulari di interesse utilizzando la strategia di gating mostrata nella Figura 3A. Segui i passaggi da 4 a 6 (di seguito).
- Per identificare le tre HSPC del midollo osseo di interesse (HSC, CMP e GMP), iniziare il gating utilizzando la dimensione (FSC-A) e la granularità (SSC-A) per il gate sui leucociti, quindi FSC-H/FSC-A per discriminare i doppietti.
- Basato su SSC-A/marcatore a cellule morte, cellule vive gate. Utilizzare Lineage/c-Kit per selezionare le cellule che sono negative al lignaggio ed esprimono livelli intermedi o alti di c-Kit. Attraverso c-Kit/Sca-1, gate sulle HSC di lineage-c-Kit+ Sca-1+ (LKS+), una delle tre popolazioni di interesse.
- Tra i progenitori mieloidi (lignaggio-c-Kit+Sca-1-), utilizzare FcγR/CD34 per escludere i progenitori megacariocitari ed eritroidi CD34-FcγR- e gli eritroidi (MEP), includendo CD34+ FcγR- CMP, così come CD34+FcγR+ GMP nelle popolazioni cellulari da selezionare.
- Assicurarsi che il flusso e la deflessione siano stabili.
- Nella telecamera sidestream, accendere il selezionatore di prova, accendere la tensione e confermare l'accurato smistamento delle gocce in una provetta da 1,5 mL montata sul lato sinistro.
- Nella finestra Layout di ordinamento , selezionare le popolazioni di interesse (ad esempio, "LKS+" e "Progenitori mieloidi CD34+ " mostrati in questo esempio). In Dispositivo, seleziona 2 tubi. In Precisione selezionare Purezza. In Eventi di destinazione, selezionare Continuo per ordinare tra 160.000 e 200.000 progenitori mieloidi LKS+ e CD34+ .
- Aggiungere 500 μL di tampone FACS alla sospensione cellulare e trasferire 1 mL del campione filtrando in una nuova provetta FACS da 35 μm per garantire che tutte le cellule siano in un'unica sospensione appena prima dell'acquisizione. In questo modo si eliminano i grumi di cellule che potrebbero intasare lo strumento.
- Una volta pronto, fai clic su Ordina e OK per avviare l'ordinamento. Regolare la portata per mantenere la velocità al di sotto di 10.000 eventi al secondo.
NOTA: Il rapporto atteso tra i progenitori mieloidi LKS+ e CD34+ è di 1:3 per un topo femmina adulto (8-12 settimane) C57BL/6J allo stato stazionario. I numeri di cellule ordinati mirati vengono solitamente raggiunti entro 30 minuti dall'ordinamento.
- Controllo qualità e conteggio delle cellule selezionate
NOTA: Questa fase deve essere eseguita solo durante l'esperimento pilota per l'ottimizzazione delle fasi di preparazione del campione, con l'obiettivo di testare la purezza delle cellule selezionate che devono essere utilizzate per l'isolamento dei nuclei. Una volta che il protocollo è completamente ottimizzato, non è consigliabile eseguire questa fase di controllo di qualità negli esperimenti di follow-up per evitare inutili sprechi di materiale di partenza che potrebbe essere disponibile in piccole quantità per l'isolamento dei nuclei.- Controllo della purezza mediante citometria a flusso
- Trasferire 10 μL delle cellule selezionate in una nuova provetta FACS contenente 90 μL di tampone FACS.
- Acquisire e registrare i dati post-smistamento per verificare la purezza e la fattibilità dello smistamento. Assicurarsi che almeno il 95% delle celle appaia nel gate di interesse, come definito in 3 - 6 e illustrato nella Figura 3B.
- Controllo della purezza mediante citometria a flusso
- Isolamento di nuclei da HSPC di midollo osseo selezionati
- Utilizzare il protocollo "Low Cell Input Nuclei Isolation" dell'Appendice del 10X Genomics Demonstration Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX sequencing (CG000365 - Rev C)27, con le seguenti modifiche apportate per ottimizzare il recupero dei nuclei:
- Tempo di lisi: eseguire un esperimento pilota per questo protocollo per identificare il miglior tempo di lisi per l'isolamento dei nuclei. Assicurarsi di ottenere una lisi cellulare completa mantenendo intatti i nuclei.
NOTA: La fase f del protocollo 10X Genomics27 sopra menzionato indica di "incubare [nel tampone di lisi] per 3-5 minuti sul ghiaccio". Durante l'esperimento pilota, eseguire il test per almeno 3 minuti, 4 minuti e 5 minuti e valutare la quantità di nuclei recuperati contando e la qualità mediante citometria a flusso e imaging al microscopio per scegliere la durata ottimale della lisi (vedere la descrizione di questi controlli di qualità di seguito). Per risparmiare i reagenti, sostituire il tampone dei nuclei diluiti con PBS 0,04% BSA nell'esperimento pilota. Per le HSPC del midollo osseo, 3 minuti sono stati identificati come la durata ottimale della lisi. - Centrifugazioni cellulari: Per tutte le centrifugazioni in sospensione cellulare, centrifugare a 300 x g per 7 min (invece dei 5 min in CG000365 - Rev C)27 a 4 °C.
- Centrifugazione dei nuclei: Eseguire tutte le centrifugazioni in sospensione di nuclei a 500 x g per 5 min come da CG000365 - Rev C27.
- Raccolta dei nuclei: nella fase b, dopo aver risospeso in 50 μL di PBS 0,04% BSA e trasferito in una provetta da 0,2 mL, aggiungere 50 μL di PBS 0,04% BSA alla provetta originale e alla pipetta miscelare per raccogliere eventuali cellule rimanenti. Trasferire nella provetta da 0,2 mL per raggiungere un volume totale di 100 μL.
- D'ora in poi, il volume totale sarà di 100 μL invece dei 50 μL del protocollo. Regolare di conseguenza le fasi a valle (ad esempio, per la fase d, rimuovere 90 μL invece di 45 μL; per la fase e, aggiungere 90 μL di tampone di lisi invece di 45 μL).
- Per la fase m, risospendere il pellet di nuclei in 12 μL di tampone di nuclei diluiti invece di 7 μL.
- Contare i nuclei isolati. In una provetta vuota da 0,5 mL, aggiungere 10 μL di blu di tripano allo 0,4% e 8 μL di PBS 0,04% BSA.
- Aggiungere 2 μL di nuclei alla provetta e contare i nuclei come descritto al punto 1.3.8. Utilizzare un contatore di cellule automatizzato seguendo le raccomandazioni del fornitore.
- Tempo di lisi: eseguire un esperimento pilota per questo protocollo per identificare il miglior tempo di lisi per l'isolamento dei nuclei. Assicurarsi di ottenere una lisi cellulare completa mantenendo intatti i nuclei.
- Utilizzare il protocollo "Low Cell Input Nuclei Isolation" dell'Appendice del 10X Genomics Demonstration Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX sequencing (CG000365 - Rev C)27, con le seguenti modifiche apportate per ottimizzare il recupero dei nuclei:
- Controllo della purezza mediante citometria a flusso
NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito solo durante l'esperimento pilota per l'ottimizzazione delle fasi di preparazione del campione per testare la purezza dei nuclei che devono essere caricati sul chip di cromo 10X. Una volta che il protocollo è completamente ottimizzato, non è consigliabile eseguire questa fase di controllo di qualità negli esperimenti di follow-up per evitare inutili sprechi di nuclei raccolti che potrebbero essere disponibili in numero ridotto.- Dopo aver completato l'isolamento dei nuclei, trasferire 6 μL di risospensione dei nuclei in una nuova provetta FACS preriempita con 150 μL di tampone FACS. Aggiungere 3 μL di 7-AAD e incubare per 5 minuti su ghiaccio.
- Acquisire e registrare i dati post-smistamento per verificare la purezza e la fattibilità dello smistamento. Assicurarsi che almeno il 95% dei nuclei appaia nel gate di interesse, come definito nel passaggio 4.2 del Protocollo 1 (vedere la Figura 4).
- Controllo di qualità dei nuclei purificati mediante microscopia:
NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito solo durante l'esperimento pilota per l'ottimizzazione delle fasi di preparazione del campione per testare la qualità dei nuclei che devono essere caricati sul chip 10X Chromium. Una volta che il protocollo è completamente ottimizzato, non è consigliabile eseguire questa fase di controllo di qualità negli esperimenti di follow-up per evitare inutili sprechi di nuclei raccolti che potrebbero essere disponibili in numero ridotto.- Procedere come descritto al punto 1.5.3.
- Eseguire il test del multioma
- Passare immediatamente alla Guida per l'utente di Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression (CG000338 - Rev F)25.
Representative Results
I due protocolli sopra descritti descrivono in dettaglio l'isolamento dei nuclei a partire da due diversi tipi di tessuto. Le differenze e le somiglianze tra i due protocolli sono schematicamente rappresentate nella Figura 1.
Purificazione di nuclei dal cervello di topo
Nel protocollo qui descritto, proponiamo un metodo delicato per la preparazione dei nuclei da campioni cerebrali. Si inizia con una dissociazione meccanica del tessuto cerebrale in un tampone di lisi, seguita da fasi di lavaggio e filtraggio del filtro che rimuovono il tessuto rimanente dalla sospensione. La successiva rimozione di detriti, cellule non lisate e piccole particelle viene eseguita da FACS per garantire che solo i nuclei purificati vengano caricati per il protocollo Multiome a valle. La Figura 2 mostra il profilo dei nuclei prima e dopo l'ordinamento. Dopo il filtraggio e prima della cernita dei nuclei, il campione contiene un'elevata quantità di detriti, con oltre il 99% dei "singoletti" positivi per la colorazione nucleare (7-AAD), indicando una lisi cellulare ottimale (Figura 2A). I nuclei sono ordinati in base alla porta positiva 7-AAD. Viene acquisita una frazione di materiale selezionato per verificare la purezza dei nuclei preparati. La Figura 2B mostra il profilo dei nuclei cerebrali dopo l'ordinamento. Lo smistamento dei nuclei ha permesso un aumento della purezza dei nuclei dall'iniziale 36% (Figura 2A) a quasi il 100% (Figura 2B).
Figura 2: Strategia di gating per lo smistamento dei nuclei e il test di purezza dopo lo smistamento. I nuclei sono stati colorati con 7-AAD e acquisiti dal selezionatore cellulare. (A) I nuclei vengono prima controllati in base alle loro dimensioni e granularità (FSC-A e SSC-A, rispettivamente). Le singole particelle vengono quindi selezionate in base alle loro proprietà FSC-A/FSC-H e alla colorazione 7-AAD. (B) Dopo la cernita cellulare, una frazione dei nuclei prelevati dalla provetta di raccolta viene testata per verificarne la purezza utilizzando la stessa strategia di gating di cui al punto A. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Purificazione dei progenitori delle cellule staminali ematopoietiche del midollo osseo di topo (HSPC)
Dopo l'isolamento dal midollo osseo, fino a 2 x 105 HSPC vengono ordinati mediante FACS, secondo la strategia di gating mostrata nella Figura 3A. Vengono valutate l'efficacia della cernita e la purezza del campione (Figura 3B).
Figura 3: Strategia di gating per lo smistamento delle HSPC del midollo osseo. (A) Una strategia rappresentativa di GATING FACS per l'ordinamento di cellule staminali ematopoietiche LKS+ vitali e progenitori mieloidi CD34+ per l'isolamento dei nuclei. (B) Grafici FACS rappresentativi utilizzati per la verifica della purezza della popolazione cellulare selezionata. Sono mostrate le proporzioni dei diversi sottoinsiemi di cellule rispetto alla popolazione geniale. *Le due popolazioni ordinate. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Il protocollo "Low Cell Input Nuclei Isolation" consente l'isolamento dei nuclei da campioni con un massimo di 10-5 cellule. Include un basso numero di fasi di centrifugazione, riducendo così al minimo la perdita di cellule/nuclei. Abbiamo regolato il volume dei tamponi di lisi e lavaggio proporzionalmente all'input cellulare e aumentato il tempo di centrifugazione per il massimo recupero dei nuclei. Abbiamo eseguito un esperimento pilota per valutare la quantità di nuclei recuperati mediante conteggio e la loro qualità mediante citometria a flusso e imaging al microscopio. La Figura 4 mostra il campione di HSPC dopo la lisi cellulare. Questo protocollo ha generato nuclei di alta qualità, come osservato nella Figura 5A, senza detriti che potrebbero avere un impatto sul protocollo multioma a valle.
Figura 4: Selezione del test di purezza dei nuclei HSPC isolati del midollo osseo. I nuclei sono stati colorati con 7-AAD e acquisiti dal selezionatore cellulare. I nuclei sono stati prima controllati in base alle loro dimensioni e granularità (FSC-A e SSC-A, rispettivamente) per valutare la purezza del campione. La proporzione dei nuclei è indicata rispetto alla popolazione parentale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Numero del tubo | Nome del tubo | Entità macchiata | Quantità di entità macchiata | Anticorpo/colorante (μL) | Tampone di raccolta (μL) |
| 1 | Innocente | Cellule | 5,00,000 | N/A | 200 |
| 2 | VIVO/MORTO Macchia di cellule morte dell'acqua riparabile | Cellule | 5,00,000 | 0.5 | |
| 3 | APC/Cianina 7 anti-topo CD16/32 (FcγR) | OneComp eBeads | 15 μL | 1 | |
| 4 | Cocktail di lignaggio anti-topo blu del Pacifico | OneComp eBeads | 15 μL | 1 | |
| 5 | PE anti-topo Ly-6A/E (Sca-1) | OneComp eBeads | 15 μL | 1 | |
| 6 | APC anti-mouse CD117 (c-Kit) | OneComp eBeads | 15 μL | 1 | |
| 7 | FITC anti-mouse CD34 | OneComp eBeads | 15 μL | 1 |
Tabella 1: Controlli di colorazione singola per le impostazioni di compensazione sul citometro a flusso. Sono indicati i controlli della singola colorazione richiesti, il numero di cellule o perline da colorare e le quantità di anticorpi.
| Mix Maestro | Reagente | Diluizione finale | Anticorpo/colorante (μL) | Tipo di buffer | Tampone (μL) |
| Miscela 1 | APC/Cianina 7 anti-topo CD16/32 (FcγR) | 1/500 | 1.2 | DPBS (DPBS) | 300 |
| VIVO/MORTO Macchia di cellule morte dell'acqua riparabile | 1/250 | 2.4 | |||
| Miscela 2 | Cocktail di lignaggio anti-topo blu del Pacifico | 1/20 | 30 | Tampone FACS | 300 |
| PE anti-topo Ly-6A/E (Sca-1) | 1/200 | 3 | |||
| APC anti-mouse CD117 (c-Kit) | 1/200 | 3 | |||
| FITC anti-mouse CD34 | 1/50 | 12 | |||
| Volume totale di colorazione | 600 |
Tabella 2: Composizione della miscela colorante per HSPC del midollo osseo. Sono mostrati i volumi di reagenti necessari per la colorazione di un campione contenente 40 milioni di cellule. Per colorare un numero maggiore di campioni, moltiplicare il volume indicato per il numero di campioni richiesto e aggiungere metà di un volume di campione extra per garantire un volume sufficiente della miscela principale.
Figura 1 supplementare: Protocollo di isolamento delle cellule del midollo osseo. (A) Aprire il peritoneo. Le linee tratteggiate bianche indicano la linea da tagliare. (B) Dopo aver staccato la pelle dalla zampa posteriore, allineare le forbici lungo la colonna vertebrale in corrispondenza dell'articolazione dell'anca per tagliare la gamba senza tagliare il femore. (C) L'aspetto della gamba separata dal corpo prima della rimozione del muscolo. (D) L'aspetto della gamba dopo la rimozione del muscolo. (E) La procedura per separare il femore all'articolazione del ginocchio, quindi all'articolazione dell'anca, facendo attenzione a non aprire il femore. Le frecce curve bianche mostrano il movimento richiesto. Le frecce bianche tratteggiate indicano l'area da separare delicatamente usando le forbici per pizzicare. (F) Procedura per aprire la parte distale del femore (cioè la parte precedentemente attaccata alla tibia all'articolazione del ginocchio) afferrando saldamente la cartilagine e l'epifisi distale con le forbici e capovolgendola all'indietro per esporre il midollo osseo. (G) Quattro sporgenze, indicate da frecce nere, devono essere visibili all'estremità della fisi esposta. (H) L'aspetto di un femore con l'estremità aperta rivolta verso il basso nella provetta da 0,5 mL preparata posta all'interno di una provetta da 1,5 mL contenente 150 μL di tampone FACS. (I) L'aspetto delle cellule del midollo osseo pellettate e del femore ora bianco dopo una rapida centrifugazione a 12.000 x g. Fare clic qui per scaricare il file.
Discussion
La preparazione di sospensioni cellulari o nucleiche di alta qualità è di fondamentale importanza per il successo delle analisi RNA-Seq a singola cellula o a singolo nucleo e multi-omiche a singola cellula 29,30,31. Qui, abbiamo descritto i protocolli per la preparazione del campione e l'isolamento dei nuclei per saggi multiomi da due tipi di tessuto: cervello e midollo osseo.
Il protocollo cerebrale descritto in questo articolo consente il recupero di nuclei di alta qualità da tessuto cerebrale appena congelato. Comprende le seguenti fasi: rottura del tessuto congelato, isolamento dei nuclei, purificazione dei nuclei e controllo di qualità del materiale preparato. Il tessuto cerebrale è composto da molti tipi di cellule diverse e la procedura di dissociazione dei tessuti e l'isolamento dei nuclei dovrebbe preservare le proporzioni delle popolazioni cellulari presenti nel tessuto iniziale. In questo caso, la composizione del tampone di lisi e il tempo di incubazione sono stati ottimizzati per consentire una lisi completa e delicata di tutte le popolazioni cellulari che compongono il tessuto.
Il protocollo HSPCs del midollo osseo è un po' diverso poiché richiede un passaggio aggiuntivo all'inizio dell'esperimento per isolare la popolazione cellulare di interesse da una sospensione cellulare eterogenea. Dopo la raccolta del tessuto fresco, i globuli rossi vengono lisati e il campione viene arricchito per il sottogruppo di cellule di interesse. Le cellule bersaglio vengono lisate, i nuclei vengono isolati e la qualità del materiale preparato viene controllata.
10X Genomics fornisce diversi protocolli validati per l'isolamento dei nuclei in numerosi tessuti diversi32,33. L'azienda commercializza anche un kit di isolamento dei nuclei con una pipeline semplice per isolare i nuclei dai tessuti convalidati34. Tuttavia, questi protocolli necessitano di un'ulteriore ottimizzazione per personalizzare le particolarità di determinati campioni. Un esempio sono gli esempi che richiedono di lavorare con un input di celle basso. Per questi campioni, le fasi più impegnative sono le centrifugazioni che devono essere sufficientemente rigorose per pulire il campione e abbastanza delicate da evitare la perdita di cellule/nuclei. Con il protocollo qui descritto, abbiamo adattato il 10X Genomics Demonstration Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX Sequencing (CG000365 - Rev C)27 per trovare un buon equilibrio tra questi due requisiti. Come dimostrato nell'esempio della preparazione di nuclei da HSPC selezionati, abbiamo migliorato il recupero dei nuclei senza alcun impatto sulla qualità del campione.
Un'ulteriore sfida è la fase di lisi delle cellule purificate per l'isolamento dei nuclei. Condizioni di lisi più dure e tempi di incubazione più lunghi possono danneggiare i nuclei e quindi influire sulla qualità dei dati di sequenziamento. La Figura 5 mostra l'imaging rappresentativo dei nuclei da campioni di midollo osseo con diversi tempi di incubazione con tampone di lisi e illustra quanto possa essere diverso lo stato dei nuclei a seconda della lisi cellulare. Nell'esempio delle HSPC, abbiamo identificato la lisi di 3 minuti come la condizione che si traduce nella più alta percentuale di nuclei dall'aspetto sano e intatto e nella più bassa percentuale di nuclei danneggiati. I tempi di incubazione della lisi devono essere ottimizzati per ogni nuovo tipo di campione.
Figura 5: Controllo di qualità dei nuclei al microscopio. Sono mostrate immagini rappresentative in campo chiaro di nuclei isolati dal midollo osseo di topo con (A) nuclei intatti e (B) danneggiati. Barra graduata 5 μm. Le immagini sono state scattate con un microscopio invertito utilizzando un obiettivo ELWD NA 0,60 40x e uno zoom digitale 1,5x. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Entrambi i protocolli descritti in questo lavoro si basano sulla purificazione di cellule o nuclei mirati mediante strumenti FACS ad alto rendimento. Questo passaggio è di fondamentale importanza per i protocolli di preparazione di singole cellule/nuclei in cui sottoinsiemi rari di cellule devono essere isolati da sospensioni eterogenee. In questi casi, come nell'esempio mostrato qui per lo smistamento delle HSPC, può essere necessario un pannello di citometria a flusso ad alta dimensione per abilitare il "gating" sulla popolazione cellulare di interesse. Lo smistamento è estremamente veloce e accurato, portando a una purezza superiore al 95% dei sottoinsiemi di cellule selezionate. Questo approccio espone la sospensione cellulare a una pressione fino a 70 psi e può quindi essere limitante per lo smistamento di cellule fragili (ad esempio, cellule dendritiche, neutrofili) poiché può causare la rottura della loro membrana cellulare. In questi casi, dovrebbero essere selezionate soluzioni alternative per la purificazione cellulare, incluso il sorting magnetico, l'applicazione di strumenti di nuova generazione (ad esempio, CellenOne, Cellenion; MACSQuant Tyto, Miltenyi)35,36 o sistemi basati su goccioline (ad esempio, ODIN, Sensific)37. Ciononostante, la bassa velocità di smistamento di queste tecnologie, con lo smistamento cellulare che dura ore anziché minuti, è un forte fattore limitante per l'applicazione di questi approcci nella preparazione di cellule vitali per Multiome e altre applicazioni a cella singola basate sull'analisi di un grande numero di cellule.
Per la purificazione dei nuclei isolati dal tessuto, FACS è il metodo di scelta per la sua produttività e la purezza del materiale isolato. I nuclei non sono sensibili alla pressione e gli isolati di tessuto filtrato possono essere facilmente purificati attraverso il selezionatore di cellule. Se il laboratorio non è dotato di uno strumento FACS, esistono altre alternative, un po' meno efficienti ma sufficientemente buone. Ne sono un esempio l'ultracentrifugazione o l'utilizzo di piccole apparecchiature come MARS (Applied Cell) che separa le particelle in base alla loro differenza di dimensione, utilizzando onde acustiche; Rondella laminare CURIOX che sfrutta le proprietà idrofobiche delle sospensioni cellule/nuclei; o LEVITAS bio che si basa sulle proprietà fisiche delle cellule (levitazione) per separarle dai detriti.
Qui descriviamo i protocolli per ottenere un numero elevato di nuclei e la migliore purezza per il protocollo Multiome a valle. La cernita FACS e le ripetute fasi di centrifugazione comportano una sostanziale perdita del materiale iniziale. Per questo motivo, nel protocollo per la preparazione dei nuclei dal cervello che descriviamo qui è necessario materiale di partenza sufficientemente abbondante per portare alla raccolta di almeno 500.000 nuclei dopo lo smistamento FACS. Se questo criterio non può essere soddisfatto, devono essere applicati protocolli alternativi. Quando si lavora con popolazioni cellulari rare o piccole sezioni di tessuto, la quantità disponibile di materiale iniziale può essere un fattore limitante. Per affrontare questo problema, è possibile migliorare il recupero dei nuclei (a) riducendo il volume di lisi, (b) riducendo il volume di lavaggio, (c) utilizzando un singolo lavaggio con un tempo di centrifugazione prolungato per cercare di migliorare il recupero come indicato nei protocolli di genomica 10X per l'isolamento dei nuclei a basso input cellulare. Per l'analisi multiomica di materiale a basso contenuto, vale la pena prendere in considerazione applicazioni basate su piastre come scNMT, SNARE-seq e Paired-seq38 che richiedono un numero molto inferiore di campioni in ingresso.
In sintesi, abbiamo descritto due protocolli robusti per la preparazione di nuclei dal cervello e dal midollo osseo HSPC per l'analisi del multioma a valle. Questi protocolli sono applicabili in qualsiasi progetto scientifico che richieda sospensioni di singoli nuclei di alta qualità da questi due tipi di tessuto, indipendentemente dal quesito scientifico posto. Il nostro gruppo ha applicato il protocollo di isolamento dei nuclei cerebrali in studi sullo sviluppo cerebrale in seguito all'inattivazione di vari geni bersaglio e in studi sulla risposta immunitaria nel contesto di malattie neurologiche. Stiamo utilizzando il protocollo di isolamento dei nuclei del midollo osseo per decifrare la partecipazione di varie sottopopolazioni ematopoietiche nella costituzione del sistema immunitario.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ana Jeemin Choi è stata sostenuta da una borsa di studio del programma di dottorato internazionale dell'Università Pasteur di Parigi (PPU).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G x 1 ½ (1.2 mm x 38 mm) Agani needles | Terumo | AN*1838S1 | |
| 15 mL tubes | Falcon | 352097 | |
| 5 mL round bottom FACS tube with cell strainer cap 35 µm | falcon | 352235 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352070 | |
| 7-AAD | BD pharmagen | 559925 | |
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| APC anti-mouse CD117 (c-Kit) | BioLegend | 105812 | Clone: 2B8 |
| APC/Cyanine 7 anti-mouse CD16/32 (FcγR) | BioLegend | 101328 | Clone: 93 |
| BD FACSAria III | BD Biosciences | non-applicable | |
| BD FACSDiva Software v8.0.1 | BD Biosciences | non-applicable | |
| Bovine Serum Albumin stock solution 10% | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| Cell staining buffer | Biolegend | 420201 | |
| CFI Suprplan Fluor ELWD 40XC ON 0.6 | Nikon | non-applicable | |
| CMOS camera Prime 95B 25 mm | Photometrix | non-applicable | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| Countess cell counting chamber slide | Invitrogen | C10283 | |
| Coverglass 24 mm x 24 mm 0.13-0.17 mm | Brand | BR470819 | |
| Digitonine 5% | Invitrogen | BN2006 | |
| Disposable Scalpels | Swann-Morton | 0508 | |
| DMEM (1x) + GlutaMAX-I | Gibco | 31966-021 | |
| DPBS (10x) | Gibco | 14200-067 | |
| DTT | Sigma aldrich | 646563 | |
| Epifluorescence inverted microscope Nikon Ti2 -E | Nikon | non-applicable | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 0.5 mL | Eppendorf | 30123603 | |
| Ethanol 70% | VWR | 83801.290 | |
| FITC anti-mouse CD34 | Invitrogen | 11-0341-85 | Clone: RAM34 |
| Forceps for dissection | FST | 11152-10 | |
| Heat-inactivated Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 11533387 | |
| Dounce Homogeniser 2 mL | Bellco glass | 1984-10002 | Pestle “A” Large Clearance: .0030-.0050″ and Pestle “B” Small Clearance: .0005-.0025″ |
| LIVE/DEAD fixable aqua dead cell stain kit | Invitrogen | L34957 | |
| Magnesium chloride solution 1 M | Sigma aldrich | M1028 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Mounting medium Fluoromount-G | invitrogen | 00-4958-02 | |
| Nonidet P40 substitute | Sigma aldrich | 74385 | |
| Nuclease free water | ThermoFischer | AM9932 | |
| Nuclei buffer 20x | 10X Genomics | 2000153/2000207 | |
| Nuclei isolation kit EZ prep | Sigma Aldrich | NUC-101 | |
| OneComp eBeads compensation beads | Invitrogen | 01-1111-41 | |
| Pacific Blue anti-mouse lineage cocktail (including anti-mouse CD3, Ly-6G/Ly-6C, CD11b, CD45R/B220, TER-119) |
BioLegend | 133310 | Clones (in the same order as the antibodies listed): 17A2, RB6-8C5, M1/70, RA3-6B2, Ter-119 |
| PCR Tube Strips 0.2 mL | Eppendorf | 951010022 | |
| PE anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BioLegend | 122507 | Clone: E13-161.7 |
| Petri dish 100 mm x 20 mm OPTILUX | Falcon | 353003 | |
| Ply-L-lysine 0.01% sterile-filtered suitable for cell culture | Sigma | P4707 | |
| Printed microscope slides 8 well 6 mm numbered | Epredia | ER-301B-CE24 | |
| Protein LoBind Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 30108116 | |
| Recombinant Rnase inhibitor 5000 U | Takara | 2313A | |
| Scissors for dissection | FST | 14090-09 | |
| Sodium chloride solution 5 M | Sigma aldrich | 59222C | |
| Syringe filters, PES, 0.2 µm | Fisher Scientific | 15206869 | |
| Transparent nail polish | any | non-applicable | |
| Trizma Hydrochloride solution pH 7.4 | Sigma aldrich | T2194 | |
| Trypan Blue 0.4% | gibco | 15250061 | |
| Tween 20 | Biorad | 1662404 | |
| UltraPure Distilated Water Dnase/Rnase Free | Invitrogen | 10977-035 |
References
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