Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Разработка мультиплексных ОТ-кПЦР-анализов в режиме реального времени для выявления SARS-CoV-2, гриппа A/B и БВРС-КоВ

Published: November 10, 2023 doi: 10.3791/65822
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

Summary

Мы представляем два собственных одноэтапных набора для ОТ-кПЦР на основе зондов для распространенных респираторных вирусов. Первый анализ проводится на SARS-CoV-2 (N), грипп A (H1N1 и H3N2) и грипп B. Второй — для SARS-Cov-2 (N) и MERS (UpE и ORF1a). Эти анализы могут быть успешно реализованы в любой специализированной лаборатории.

Abstract

Коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2), вызывающий коронавирусную болезнь 2019 года (COVID-19), представляет серьезную угрозу для здоровья населения в целом. Во время сезонов гриппа распространение SARS-CoV-2 и других респираторных вирусов может привести к тяжелому бремени респираторных заболеваний в масштабах всего населения, с которым трудно справиться. Для этого в предстоящие осенние и зимние сезоны необходимо будет тщательно следить за респираторными вирусами SARS-CoV-2, гриппа А, гриппа В и ближневосточного респираторного синдрома (БВРС-КоВ), особенно в случае SARS-CoV-2, гриппа А и гриппа В, которые имеют схожие эпидемиологические факторы, такие как восприимчивые популяции, способ передачи и клинические синдромы. Без таргетно-специфических анализов может быть сложно дифференцировать случаи этих вирусов из-за их сходства. Соответственно, чувствительный и таргетный мультиплексный анализ, который может легко дифференцировать эти вирусные мишени, будет полезен для практикующих врачей. В этом исследовании мы разработали анализ на основе ПЦР с обратной транскриптазой в режиме реального времени с использованием разработанного нами одноэтапного набора R3T RT-qPCR для одновременного выявления SARS-CoV-2, гриппа A, гриппа B и SARS-CoV-2, MERS-CoV. Имея всего 10 копий их синтетических РНК, мы можем успешно идентифицировать мишени SARS-CoV-2, гриппа A, гриппа B и MERS-CoV одновременно со 100% специфичностью. Этот анализ признан точным, надежным, простым, чувствительным и специфичным. Разработанный метод может быть использован в качестве оптимизированного диагностического анализа SARS-CoV-2, гриппа А, гриппа В и SARS-CoV-2, MERS-CoV в больницах, медицинских центрах и диагностических лабораториях, а также в исследовательских целях.

Introduction

Пандемия продолжающейся коронавирусной инфекции 2019 года (COVID-19) вызвана новым коронавирусом, известным как коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2)1. Из-за высокой заразности и способности SAR-CoV-2 к быстрой передаче пандемия COVID-19 возникла в городе Ухань (Китай) и быстро распространилась по всему миру. Это в конечном итоге привело к появлению респираторных дистресс-признаков и даже смерти 2,3,4. COVID-19 был объявлен пандемией более чем в 213 странах, ожидая резкого увеличения числа подтвержденных случаев, о чем свидетельствуют статьи, опубликованные различными научными исследованиями 3,5. COVID-19 передается в основном мелкими респираторными каплями, которые инфицированные люди выделяют в окружающую среду, а затем подвергаются воздействию уязвимых лиц при вдыхании или тесном контакте с зараженными поверхностями. При попадании этих капель на слизистую оболочку глаз, рта или носа человек может заразиться6. Статистические данные, опубликованные Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ), показывают, что во всем мире зарегистрировано более 76 миллионов подтвержденных случаев пандемии, из которых 7миллионов закончились смертельным исходом7. Таким образом, Организация Объединенных Наций классифицировала пандемию, вызванную COVID-19, как бедствие из-за ее прямого воздействия на жизнь миллиардов людей во всем мире и имеющего далеко идущие экономические, экологические и социальные последствия.

Инициативы в области общественного здравоохранения, включая тщательное тестирование, раннее выявление, отслеживание контактов и изоляцию заболевших, сыграли решающую роль в удержании этой пандемии под контролем 8,9,10,11. В зимние месяцы циркуляция других респираторных вирусов, таких как грипп А и В, с симптомами, похожими на COVID-19, затруднит выявление, отслеживание и изоляцию случаев COVID-19 на ранних стадиях. Каждый год вспышка гриппа А и В начинается поздней осенью или в начале января с предсказуемой сезонностью12. Вирусы SARS-CoV-2 и гриппа имеют множество общих эпидемиологических признаков. Кроме того, сходство между восприимчивыми популяциями, к которым относятся дети, пожилые люди, люди с ослабленным иммунитетом и лица с хроническими сопутствующими заболеваниями, такими как астма, хроническая обструктивная болезнь легких, сердечная и почечная недостаточность или диабет12,13. Эти вирусы не только являются общими для уязвимых групп населения, но и имеют пути передачи контактным и воздушно-капельнымпутем14. Ожидается, что пациенты, вероятно, могут заразиться более чем одним из этих респираторных вирусов по мере приближения сезона гриппа к14 годам. Для этого необходимо провести скрининг на SARS-CoV-2 и вирусы гриппа у пациентов с симптомами, прежде чем они будут изолированы. Проведение отдельных тестов на три вируса (SARS-CoV-2, грипп А и грипп В) невозможно из-за глобальной нехватки ресурсов для экстракции и диагностики нуклеиновых кислот. Для того, чтобы отсеять их все в одной реакции, необходимо разработать метод или тест.

Ближневосточный респираторный синдром (БВРС)-КоВ является членом семейства коронавирусов человека (CoV). Первые изоляты вируса БВРС-КоВ были получены от госпитализированного пациента в Саудовской Аравии, который умер в сентябре 2012 г. из-за острых респираторныхзаболеваний15. Имеются данные, свидетельствующие о том, что основным резервуарным хозяином БВРС-КоВ являются одногорбые верблюды. Было доказано, что вирусы инфицированных одногорбых верблюдов являются зоонозными и, таким образом, могут инфицировать человека16,17. Люди, инфицированные этим вирусом, могут передавать его другим людям при тесном контакте18. По состоянию на 26 января 2018 г. в мире зарегистрировано 2143 лабораторно подтвержденных случая инфицирования БВРС-КоВ, из которых 750 закончились смертельным исходом19. Наиболее типичными симптомами БВРС-КоВ являются кашель, лихорадка и одышка. Сообщалось также, что у инфицированных БВРС-КоВ проявляются симптомы пневмонии, диареи и желудочно-кишечного недуга20. В настоящее время не существует ни коммерческой вакцины, ни специфического лечения БВРС-КоВ. Поэтому оперативная и точная диагностика имеет важнейшее значение для предотвращения широкомасштабных вспышек БВРС-КоВ и дифференциации БВРС-КоВ от SARS-CoV-2.

На сегодняшний день предложено множество подходов к выявлению этих вирусов, таких как мультиплексная ОТ-ПЦР 21,22,23,24,25, CRISPR/Cas1226,27, CRISPR/Cas928 и CRISPR/Cas329, иммуноферментный анализбокового потока 30, бумажные биомолекулярные сенсоры31, тестирование SHERLOCK в одном котле32, ДНК-аптамер 33, петлево-опосредованный изотермический усиление (LAMP)19,34 и т.д. Каждый из вышеупомянутых методов имеет уникальные преимущества и недостатки с точки зрения чувствительности и специфичности. Среди этих методов наиболее распространенным является тест на основе амплификации нуклеиновых кислот: мультиплексная кОТ-ПЦР, который считается золотым стандартом диагностики SARS-CoV-2, гриппа A, гриппа B и MERS-CoV.

В этом исследовании мы разработали и оценили различные комбинации праймеров и зондов для эффективного, точного и одновременного обнаружения SARS-CoV-2, гриппа A, гриппа B и SARS-CoV-2, MERS-CoV с использованием стандартных синтетических вирусных РНК. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) рекомендует мультиплексные анализы, разработанные для генов-мишеней БВРС-КоВ или SARS-CoV-2. Эти гены, как правило, кодируют белки и комплексы, которые способствуют образованию комплекса репликации/транскрипции (RTC)35, такого как область в открытой рамке считывания 1a (ORF1a), которая используется для анализа на БВРС-КоВ. Кроме того, структурные белки кодируются генами, используемыми в диагностических анализах, такими как восходящая область гена оболочки (upE) и ген нуклеокапсида (N), которые используются для анализов на MERS-CoV и SARS-Cov-2 соответственно35,36. Мы использовали собственный одноэтапный набор RT-qPCR R3T для создания RT-qPCR для обнаружения вирусов37. Обнаружение вирусов, чувствительность, специфичность и динамический диапазон нашего набора для одноэтапной ОТ-кПЦР R3T и наборов праймеров были протестированы и оценены с использованием 10-кратных серийных разведений стандартных скрутенных синтетических РНК. Самый низкий практический предел обнаружения составлял примерно 10 копий расшифровки на реакцию. В результате для рутинной одновременной диагностики SARS-CoV-2, гриппа А, гриппа В и SARS-CoV-2, SARS-CoV-2, SARS-CoV-2, SARS-CoV-2, БВРС-КоВ можно успешно использовать и внедрять собственный одноэтапный набор для ОТ-кПЦР R3T.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Экспрессия и очистка Taq-полимеразы

  1. Сконструировать плазмиду с расщепляемой гекса-гистидиновой меткой на С-конце фермента.
  2. Трансформируют 50 нг вектора экспрессии в штамм E. coli BL21-(DE3) в соответствии со стандартным протоколом38.
  3. Высевать трансформированные клетки в четыре колбы по 6 л, каждая из которых содержит 2 л бульона из среды 2YT при 37 °C, встряхивая при 170 об/мин до достижения наружного диаметра 600 0,8 или номера ячейки 6,4 x 108 .
  4. Индуцируют экспрессию Taq-полимеразы 0,5 мМ изопропил-β-d-тиогалактопиранозида (IPTG) и далее инкубируют при 16 °C в течение 18 ч при встряхивании.
  5. Соберите клетки, отжимая их при 4 °C при 7808 x g в течение 10 минут. Ресуспендируйте гранулы в 200 мл ледяного буфера для лизиса Taq-полимеразы (Таблица 1) в 5 мл/г клеточной гранулы.
  6. Инкубируют клетки с лизоцимом (2 мг/мл лизисного буфера) и ингибиторами протеазы в течение 45 мин, а затем пропускают лизат через клеточный разрушитель при 30 кПси, и центрифугу при 22 040 x g в течение 30 мин при 4 °C, чтобы отделить клеточный мусор.
  7. Нагрейте надосадочную жидкость в течение 15 мин при 85 °C. Отжим при 95 834 x g в течение 1 ч при 4 °C. Соберите надосадочную жидкость и отфильтруйте ее на льду с помощью фильтра 0,45 мкм.
  8. Очистите белок с помощью быстрой белковой жидкостной хроматографии (FPLC), предварительно пропустив образец через колонку Ni-NTA HP объемом 5 мл со скоростью потока 4 мл/мин с использованием Taq-полимеразного буфера A (Таблица 2; Рисунок 1А).
  9. Промывку 10 колонками (CV) Taq-полимеразного буфера А и 4% Taq-полимеразного буфера B (табл. 2). Элюируют связанный белок с помощью линейного градиента с помощью Taq-полимеразы Buffer B более 20 CV во флаконе объемом 100 мл.
  10. Элюент во флаконе объемом 100 мл пропускают через катионообменную колонку объемом 5 мл со скоростью 4 мл/мин с использованием Taq-полимеразного буфера C (табл. 2; Рисунок 1А).
  11. Промывают 20 CV 100%-ным Taq-полимеразным буфером C и 5%-ным Taq-полимеразным буфером D (табл. 2).
  12. Элюирование с линейным градиентом с использованием Taq-полимеразного буфера D (табл. 2) от 5% до 100%.
  13. Проверяют элюированные фракции, выполняя гель-электрофорез SDS-PAGE 39 с последующим окрашиванием гелем 40 , как описано ранее. Вкратце, возьмите по 10 мкл каждой фракции и добавьте равный объем 2-кратного красителя SDS. Денатурируют образец при 90°С в течение 10 мин. Загрузите образцы на 10% гель SDS-PAGE и оставьте гель на 25 минут при напряжении 200 В. Окрасьте гель с помощью Coomassie Brilliant Blue, а затем удалите окрашивание.
  14. Соберите все фракции, содержащие очищенную Taq-полимеразу, и диализируйте с помощью буфера для хранения так-полимеразы (Таблица 3) при 4 °C. Подготовьте 2 л буфера для хранения и погрузите диализную кассету в буфер на 2 минуты для гидратации. Введите собранные фракции с помощью иглы в диализную кассету и оставьте на ночь в диализном буфере при 200 об/мин на мешалке.
  15. После диализа измерьте концентрацию белка с помощью спектрофотометра, сделайте 10 мкл аликвот, заморозьте в жидком азоте и храните при -80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед загрузкой в систему FPLC отфильтруйте все буферы для очистки с помощью фильтра 0,45 мкм.

2. Экспрессия MMLV-RT в системе экспрессии и очистка клеток насекомых

  1. Генерация и выделение бакмидной ДНК
    1. Клонируйте последовательность MMLV-RT с С-концевой расщепляемой меткой TEV-8xHis-Strep, как описано ранее41.
    2. Смешайте 100 нг вектора экспрессии с 50 мкл клеток DH10Bac и осторожно перемешайте, постукивая по пробирке.
    3. Инкубируйте клетки на льду в течение 15 минут. Подвергают элементы тепловому шоку в течение 1 мин при 42 °C.
    4. Сразу же переложите на лед и добавьте 400 мкл среды S.O.C. Выдерживают при 37 °С при встряхивании в течение 4 ч.
    5. Пластины 10 мкл и 15 мкл смеси на планшетах LB Agar, содержащие три антибиотика; 50 мкг/мл канамицина, 10 мкг/мл тетрациклина и 7 мкг/мл гентамицина, а также 40 мкг/мл IPTG и 100 мкг/мл X-Gal для сине-белого выбора.
    6. Инкубируют планшеты при температуре 37 °C в течение 48 ч. Выберите несколько белых колоний и одну синюю колонию в качестве контроля и повторно нанесите их на свежие пластины с агаром LB, содержащие вышеуказанные антибиотики. Инкубируйте планшеты в течение ночи при температуре 37 °C.
    7. После подтверждения белого фенотипа выберите пару колоний и инокулируйте их в 10 мл LB-среды, содержащей 50 мкг/мл канамицина, 10 мкг/мл тетрациклина и 7 мкг/мл гентамицина в пробирках по 50 мл.
    8. Инкубируют культуру при температуре 37 °C при встряхивании при 170 об/мин в течение ночи. Гранулируйте клетки, вращая их при 22 040 x g в течение 10 минут.
    9. Сцедите надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 250 мкл раствора ресуспендирования из набора miniprep (с этим раствором необходимо обращаться в соответствии с инструкциями производителя), затем перелейте раствор в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
    10. Добавить 250 мкл раствора лизиса, аккуратно перемешать и инкубировать в течение 3 мин. Добавьте 350 мкл нейтрализующего раствора, инвертируйте 2x-3x и центрифугируйте при 22,040 x g в течение 10 мин.
    11. Переложите надосадочную жидкость в свежую пробирку и добавьте равный объем ледяного изопропанола и инкубируйте в течение 30 мин при -20 °C.
    12. Гранулируйте осажденную ДНК путем вращения при 22 040 x g в течение 10 минут. Выбросьте надосадочную жидкость и промойте гранулу 700 мкл 70% ледяного этанола, 2 раза.
    13. Удалите надосадочную жидкость пипеткой, не касаясь гранулы. Дайте гранулам высохнуть на воздухе в ламинарном колпаке в течение 5-10 минут или до тех пор, пока в трубке не исчезнет жидкость. Растворите гранулу в 100 мкл ЭБ-буфера.
  2. Бакмидная трансфекция и амплификация вируса
    1. Препарат от вируса P1
      1. В 6-луночном планшете для культуры тканей засейте ~ 9 x 105 клеток/лунку в 2 мл питательной среды клеток насекомых.
      2. Инкубируйте планшет в течение ~30 минут при комнатной температуре, чтобы клетки прикрепились.
      3. Смесь Бакмид/Фуген готовят следующим образом: в одной пробирке смешивают 1 мкг ДНК Бакмида и 300 мкл среды клеток насекомых. В другой пробирке смешайте 8 мкл реагента для трансфекции и 300 мкл среды для клеток насекомых. Смешайте обе смеси щадящим пипетированием и оставьте на ~30 минут при комнатной температуре для образования комплекса реагентов бакмид/трансфекция.
      4. Добавьте бакмидную комплексную смесь (~210 мкл) в каждую лунку по каплям и запечатайте планшет прозрачной пленкой.
      5. Выдерживают планшет при температуре 27 °C в течение 3-4 дней.
      6. Возьмите среду, содержащую вирус, добавьте FBS (конечная концентрация 2%), отфильтруйте с помощью фильтра 0,45 мкм и храните при 4°C в темноте в качестве запаса вируса P1.
    2. Препарат от вируса P2
      1. Трансфицировать 50 мл клеток насекомых в дозе 2 x 106 клеток/мл 3 мл вируса P1 в колбу для культивирования.
      2. Инкубируют при 27 °С при встряхивании при 100 об/мин в течение 4-6 дней до тех пор, пока процент погибших клеток не достигнет 25%-30%.
      3. Центрифугу при 300 х г в течение 10 мин и соберите надосадочную жидкость, содержащую вирус.
      4. Добавьте FBS до конечной концентрации 2%, процедите через фильтр 0,45 мкм и аликвоту по 1 мл и храните при -80 °C в качестве запаса вируса P2.
    3. Препарат от вируса P3
      1. Трансфицируют 100 мл клеток насекомых в дозе 2 x 106 клеток/мл 2 мл вируса P2 в колбу для культивирования.
      2. Инкубируют при 27 °С при встряхивании при 100 об/мин в течение 3-4 дней до тех пор, пока процент погибших клеток не достигнет 15%-20%.
      3. Центрифугируют клетки при 300 x g в течение 10 мин и собирают надосадочную жидкость, содержащую вирус.
      4. Добавьте FBS до конечной концентрации 2%. Процеживают через фильтр 0,45 мкм. Его можно хранить в темноте при температуре 4 °C в течение 1 месяца.
  3. Экспрессия и очистка MMLV-RT в клетках насекомых
    1. Добавьте 5 мл вируса P3 к свежим клеткам насекомых с плотностью 2 x 106 клеток/мл (700 мл/2 л колбы), всего 6 колб.
    2. Собирают клетки через 55-60 ч после трансфекции путем отжима при 7808 x g в течение 10 мин.
    3. Ресуспендируйте клеточные гранулы в 200 мл лизисного буфера MMLV-RT (табл. 4). Пропустите лизат через клеточный дизраптор при давлении 15 кПсине и центрифугу при 22 040 x g в течение 30 мин при 4 °C.
    4. Перелейте надосадочную жидкость в новые пробирки и снова отжим при 95,834 x g при 4 °C в течение 1 ч. Соберите надосадочную жидкость и отфильтруйте ее на льду с помощью фильтра 0,45 мкм.
    5. Начните очистку белка с помощью FPLC, предварительно пропустив образец через колонку Ni-NTA Excel 5 мл (рис. 1B) со скоростью потока 4 мл/мин с помощью буфера MMLV-RT A (Таблица 5).
    6. Промывают колонку 10 CV буфера MMLV-RT A и 4% буфера MMLV-RT B (табл. 5) и элюируют белок с линейным градиентом буфера MMLV-RT B более 20 CV во флаконе объемом 100 мл.
    7. Пропустите элюированный образец через стрептококковую колонку объемом 5 мл (рис. 1B), уравновешенную буфером MMLV-RT C (табл. 5).
    8. Промывают колонку 10 CV 100% MMLV-RT буфера C и элюируют белок линейным градиентом с 20 CV буфера D (табл. 5).
    9. Проверьте элюированные фракции, выполнив SDS-PAGE, как это делается на шагах 1.13.-1.14. и собрать фракции, содержащие очищенный MMLV-RT, для диализа в буфере хранения MMLV-RT (табл. 6) при 4 °C.
    10. Измерьте концентрацию белка с помощью нанокапли, аликвоты, мгновенной заморозки в жидком азоте и храните при -80 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед загрузкой в систему FPLC отфильтруйте все буферы для очистки с помощью фильтра 0,45 мкм.

3. Подготовка компонентов одностадийного мультиплексного набора R3T RT-qPCR

  1. Приготовление буферной смеси
    1. Приготовьте 2-кратный буфер для реакции ОТ-кПЦР, содержащий реагенты, ранее показанные в37. Приготовьте все реагенты в воде, свободной от ДНКазы/РНКазы, и буферной смеси, хранящейся в морозильной камере при температуре -20 °C.
  2. Наборы грунтовок и зондов и приготовление смеси грунтовок
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используемые зонды и праймеры перечислены в таблице 7. Мультиплексный набор для гриппа и SARS-CoV-2 содержит 3 зонда и 4 набора прямых и обратных праймеров. Зонды помечены на 5'-концах с использованием 6-карбоксифлуоресцеина (FAM) для InfA, Texas Red-XN для SARS-CoV-2 (ген N) и Yakima Yellow для InfB. Мультиплексированный комплект для БВРС-КоВ и SARS-CoV-2 содержит 3 зонда и 3 комплекта праймеров прямого и обратного хода. Зонды также маркируются на 5'-концах с помощью репортеров Texas Red-XN для MERS-CoV (ген ORF1a), VIC для MERS-CoV (ген UpE) и 6-карбоксифлуоресцеин (FAM) SARS-CoV-2 (ген N).
    1. Приготовьте смесь праймеров, содержащую все праймеры и зонды, перечисленные в таблице 7 , с конечной концентрацией 6,7 мкМ для каждого прямого и обратного праймера и 1,25 мкМ для каждого зонда в пробирке объемом 1,5 мл. Храните грунтовочную смесь в морозильной камере при температуре -20 °C. Используйте буфер элюирования, чтобы восполнить необходимый объем.
  3. Приготовление ферментной смеси
    1. Приготовьте смесь Taq-полимеразы (30 U/мкл) и MMLV-RT (60 нг/мкл) в буфере для хранения Taq-полимеразы, как показано в таблице 3 , чтобы получить необходимый объем. Выполните этот шаг на льду и храните смесь ферментов при температуре -20 °C.
  4. Матрица РНК
    1. Ресуспендировать синтетические РНК SARS-CoV-2, гриппа А H1N1, гриппа А H3N2, гриппа B и БВРС-КоВ по отдельности в 100 мкл 1x буфера Tris-EDTA (10 мМ Tri-Cl и 1 мМ ЭДТА (pH 8,0) для получения запаса 1 x 106 копий РНК/мкл.
    2. Смешивают синтетические РНК для ОТ-кПЦР в следующих конфигурациях: 1) SARS-CoV-2, грипп А и грипп В, добавляя по 5 мкл каждого запаса вируса к объему 50 мкл, чтобы получить 1 x 105 копий РНК/мкл; 2) SARS-CoV-2, MERS-CoV путем добавления 5 мкл каждого запаса вируса к объему 50 мкл с получением 1 x 105 копий РНК/мкл. Производят 10-кратные серийные разведения каждой смеси синтетических РНК в диапазоне от 1 x 10 5копий РНК /мкл до 10 копий РНК/мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно используйте ледяную воду, не содержащую ДНКазы/РНКазы, для приготовления серийного разведения шаблонов.

4. Собственный мультиплексный тест на SARS-CoV-2, грипп A, грипп B и SARS-CoV-2, MERS-CoV одноэтапный тест ОТ-кПЦР

ПРИМЕЧАНИЕ: Продезинфицируйте поверхности рабочей станции и используйте шаблон 96-луночного планшета для планирования компоновки ПЦР-планшетов.

  1. Подготовка 96-луночного планшета
    1. Разморозьте 2 раза смесь буфера и грунтовки. Храните ферментную смесь на льду.
    2. В каждую лунку добавьте 10 мкл 2-кратной буферной смеси, 1,5 мкл смеси праймера, 1 мкл смеси ферментов, 6,5 мкл воды, не содержащей ДНКазы/РНКазы, и 1 мкл соответствующей смеси РНК, которую необходимо протестировать. Конечный объем в каждой лунке составляет 20 мкл. Пожалуйста, обратитесь к подготовленному макету для получения помощи на этом этапе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется делать мастер-микс на основе количества реакций, содержащих все реагенты, кроме образца РНК, чтобы избежать систематической ошибки пипетирования. Кроме того, выполняйте реакции в двух или трех экземплярах, чтобы избежать технических ошибок.
    3. Запечатайте планшет клейкой пломбиркой для ПЦР и ненадолго центрифугируйте в течение 1 минуты, чтобы собрать всю жидкость на дне планшета. Убедитесь, что каждая лунка имеет одинаковый объем жидкости и не содержит пузырьков, прежде чем переносить образцы в машину для кПЦР.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все ПЦР-реакции должны быть установлены на льду.
  2. Программа ПЦР
    1. Откройте программу аппарата для кПЦР в реальном времени и выберите следующие экспериментальные свойства:
      Тип блока: Быстрый 96-луночный (0,1 мл)
      Постановка эксперимента: Стандартная кривая
      Реагенты: Реагенты TaqMan
      Свойства запуска: Стандартный.
    2. Определите все гены-мишени и их репортерный краситель, как показано в таблице 7. Кроме того, определите имена образцов для каждой тестируемой реакции, чтобы упростить анализ кривых усиления.
    3. Назначение целей и образцов для компоновки планшетов программы на основе 96-луночного планшета.
    4. Установите следующую программу цикла в ПЦР-приборе следующим образом:
      55 °C в течение 10 мин
      40 циклов: 94 °C в течение 1 мин
      94 °C в течение 10 с
      68 °C в течение 10 с
      68 °С в течение 20 с; Здесь приобретают флуоресценцию.
    5. Перенесите планшет в аппарат для количественной ПЦР в режиме реального времени, поместите его в держатель, обеспечив правильную ориентацию планшета, и начните запуск.
    6. Выберите расположение файла для сохранения экспериментальных данных.
  3. Анализ данных
    1. Сначала необходимо изучить графики амплификации, полученные программой кПЦР. Проанализируйте предел обнаружения, чтобы оценить минимальную концентрацию РНК, которую можно обнаружить.
    2. Для оценки чувствительности анализа постройте логарифм числа копий РНК по оси x и соответствующее среднее значение Ct по оси y. Наклон иR2 указывают на надежность и эффективность реакции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В последние годы были достигнуты значительные успехи в диагностическом подходе к выявлению распространенных респираторных вирусов с использованием подходов ПЦР 21,22,23,24,25. Однако, несмотря на эти достижения, мультиплексный подход, позволяющий обнаруживать несколько вирусов в одном тесте, не получил широкого распространения, особенно в платформе RT-qPCR. Этот метод был успешно реализован с использованием синтетических РНК-вирусов и собственной оптимизацией компонентов реакции37. Специфичность, чувствительность и надежность диагностического анализа были оценены как высокие с использованием анализа предела обнаружения. Представленный подход может значительно повысить эффективность и точность диагностики респираторных вирусов, снизив потребность в нескольких тестах и минимизировав риск ошибочного диагноза, как показано в43. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы изучить преимущества этого подхода с использованием образцов пациентов и способствовать его внедрению в клиническую практику.

Экспрессия и очистка меченой гистидином Taq ДНК-полимеразы
Основываясь на установленном протоколе экспрессии и очистки Taq ДНК-полимеразы44, N-концевая плазмида Taq ДНК-полимеразы, меченная гистидином, была сконструирована под контролем промотора холодового шока для облегчения процесса ее экспрессии и очистки, как описано выше (рис. 1A и рис. 2A). Таким образом, просто изменяя концентрацию и температуру IPTG, можно легко контролировать уровень экспрессии этой новой конструкции. Инкубация клеток, содержащих плазмиду Taq ДНК-полимеразы при 16°C с 1 мМ IPTG, показала повышенную экспрессию ДНК-полимеразы His-Taq. Кроме того, ранее установленный протокол44 требовал трудоемких этапов осаждения полиэтиленимина (ПЭИ), которые можно пропустить с помощью используемой здесь конструкции, поскольку чистота конечного продукта не изменялась и была сопоставима с коммерчески доступной Taq-полимеразой (рисунок 2B). Очищенная Taq-полимераза мигрировала медленнее, чем коммерческая, из-за присутствия пептидов-линкеров между ферментом и гистидиновой меткой на N-конце. ДНК-полимераза Taq была успешно получена с 0,98 мг/л культуры чистого белка E. coli .

Экспрессия и очистка двойной His- и Strep-меченной MMLV обратной транскриптазы
Система экспрессии бакуловируса использовалась для экспрессии MMLV-RT с С-концевым двойным His и стрептококковой меткой в клетках насекомых (Sf9), как описано на рисунке 2A. Предыдущее исследование показало, что С-концевая меченая MMLV-RT демонстрирует более высокую активность там, где и N-концевой меченый белок, и С-концевой меченый белок были синтезированы у шелкопрядов с использованием системы векторов экспрессии шелкопряда-бакуловируса (тутовый шелкопряд-BEVS)41. Для получения однородного белка MMLV-RT использовались те же стратегии и протокол, что и в вышеупомянутом исследовании. В результате была достигнута повышенная экспрессия и более 95% чистого белка при выходе 7,5 мг/л культуры клеток насекомых, как показано результатом геля SDS-PAGE (рис. 2C).

Оптимизация и стандартизация мультиплексированной ОТ-ПЦР
Оптимизированный и разработанный собственный мультиплексный тест ОТ-кПЦР был собран и успешно произведен после нескольких этапов оптимизации буферной и праймерной смеси для одновременного обнаружения трех различных распространенных респираторных вирусов (рис. 3)37. Первый набор был разработан для воздействия на гены SARS-CoV-2 N, гриппа A H1N1 и H3N2, а также на ген гриппа B; а второй набор предназначен для генов SARS-CoV-2 N, MERS ORF1a и upE. Таким образом, оба комплекта могут успешно и одновременно обнаруживать все три цели, как показано в представленном здесь рабочем процессе (рис. 3). Синтетические образцы РНК каждого из вирусов, использованных в этом протоколе, были амплифицированы, что указывает на возможность использования такого мультиплексного набора для обнаружения распространенных респираторных вирусов. Чувствительность этого диагностического теста аналогична ранее опубликованным результатам в образцах пациентов. В тех случаях, когда у пациентов проявляются гриппоподобные симптомы, использование мультиплексной ОТ-кПЦР в режиме реального времени показало результаты, сопоставимые с мультиплексным анализом на SARS-CoV-2, грипп А и грипп В45.

Чувствительность и предел обнаружения собственного мультиплексного набора для ОТ-кПЦР к распространенным респираторным вирусам
Эффективность собственного мультиплексного набора оценивали с использованием двух наборов смеси праймеров и соответствующей синтетической РНК для каждого набора, как показано в рабочем процессе мультиплексной ОТ-кПЦР (рис. 3). Используя в качестве матрицы каждую смесь праймеров с 10-кратным серийным разведением каждой смеси синтетических РНК в диапазоне от 10 до 105 копий/мкл, чувствительность, специфичность и предел обнаружения обеих разработанных мультиплексированных ОТ-кПЦР можно определить с помощью стандартного анализа кривых. Это делается в трех независимых повторениях каждого теста, чтобы подтвердить эффективность и согласованность мультиплексного набора для ОТ-кПЦР. В результате, два разработанных здесь набора могут успешно амплифицировать все три гена-мишени одновременно с 10 копиями РНК/реакцией, что видно по кривой амплификации и пределу обнаружения (LoD) (рис. 4 и рис. 5). Для оценки эффективности отдельных анализов использовали значения наклона и R2 каждой кривой (рис. 4 и рис. 5). Значения R2 позволили оценить качество линейной аппроксимации точкам данных. В эффективном анализе кПЦРR2 должен быть очень близок или превышать 0,90. Эффективность амплификации титров для гриппа А, гриппа В и SARS-CoV-2 или MERS-CoV и SARS-CoV-2 была выше 99% для всех наборов праймеров (рисунок 4 и рисунок 5). Кроме того, небольшие полоски погрешности подтверждают воспроизводимость каждого мультиплексного набора для ОТ-кПЦР. Важно отметить, что в обоих мультиплексированных наборах не было выявлено образования димеров праймера, так как при отрицательном контроле не наблюдается амплификации (данные не показаны). Таким образом, дизайн обоих наборов успешно амплифицировал все гены-мишени с надежностью, специфичностью и чувствительностью.

Figure 1
Рисунок 1: Схематический обзор мультиплексированного одноэтапного набора для ОТ-кПЦР. Сборка набора начинается с экспрессии и очистки необходимых ферментов, Taq ДНК-полимеразы и обратной транскриптазы MMLV. Оба фермента нужно было пропустить через две колонки, как показано на рисунке. Во-вторых, после очистки была проведена оптимизация условий реакции и программы термоциклирования, в результате чего были созданы оптимальные условия для мультиплексированного испытательного набора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Плазмидные конструкции и результаты очистки His-Taq Pol и C-His/Strep MMLV-RT. (A) Схематическое изображение рекомбинантных плазмид экспрессии His-Taq Pol и C-His/Strep MMLV-RT. Сокращения: промотор CSPA - промотор белка холодового шока А; RBS - сайт связывания рибосом; 6x His - Его метка с шестью гистидинами; TEE - трансляционно-усиливающий элемент; Taq ORF - Открытая рамка для считывания Taq Pol; Polh - промотор полиэдрина; MMLV-RT ORF - открытая рамка считывания mmlv-rt; ТЭВ - травление вирусной протеазы, нацеленной на сайт; 8x His - Его метка с восемью гистидинами; Стрептококк - Стрептококковая метка; polyA - SV40 поздний сигнал полиаденилирования. (B) SDS-PAGE анализ His-Taq Pol, экспрессируемого в клетках BL21(DE3) E. coli и Taq-полимеразе. (C) SDS-PAGE анализ очищенного C-His/Strep MMLV-RT, экспрессируемого в клетках Sf9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Принципиальная схема двух оптимизированных, стандартизированных и разработанных мультиплексных наборов для одноэтапной ОТ-кПЦР вместе с компонентами реакции. Каждая отдельная мультиплексированная реакция состоит из dNTP, буферной смеси, смеси ферментов, мультиплексированной смеси праймеров и тестируемой матрицы синтетической РНК. (A) набор для гриппа A/B, SARS-CoV-2 и (B) MERS ORF1a/upE, SARS-CoV-2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Кривые амплификации и предел обнаружения для мультиплексного набора для ОТ-кПЦР для гриппа A/B и SARS-CoV2. Кривые амплификации мультиплексированной ОТ-кПЦР проводили с использованием смеси синтетических РНК с 10-кратными серийными разведениями (от 10 до 105 копий/мкл) со всеми мишенями (А) грипп А, (С) грипп В и (Е) SARS-CoV-2. Реакции проводили в трех экземплярах, показывая в качестве примера одну реплику. Предел обнаружения для (B) гриппа A, (D) гриппа B и (F) SARS-CoV-2 был определен путем построения графика среднего значения трех реплицированных значений Ct с номером копии журнала. Коэффициент детерминации (R2) и уравнение кривой линейной регрессии были рассчитаны и показаны на каждой панели. Полосы ошибок представляют собой стандартное отклонение между тремя репликациями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Кривые амплификации и предел обнаружения для набора для одноэтапной ОТ-кПЦР мультиплексного набора ОТ-кПЦР MERS ORF1a/upE и SARS-CoV2. Кривые амплификации мультиплексированной ОТ-кПЦР проводили с использованием смеси синтетических РНК с 10-кратными серийными разведениями (от 10 до 105 копий/мкл) со всеми мишенями (A) MERS ORF1a, (C) MERS upE и (E) SARS-Cov-2. Реакции проводили в трех экземплярах, показывая в качестве примера одну реплику. Предел обнаружения (B) MERS ORF1a, (D) MERS upE и (F) SARS-CoV-2 определяли путем построения графика между средним значением трех реплицированных значений Ct и номером копии журнала. Коэффициент детерминации (R2) и уравнение кривой линейной регрессии были рассчитаны и показаны на каждой панели. Полосы ошибок представляют собой стандартное отклонение между тремя репликациями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Перечень компонентов для буфера для лизиса Taq-полимеразы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Буферы для очистки Taq-полимеразы. Перечень буферных компонентов, необходимых для двухколоночной очистки Taq ДНК-полимеразы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 3: Буфер для хранения Taq-полимеразы. Перечень буферных компонентов, необходимых для диализа Taq ДНК-полимеразы после очистки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 4: Список компонентов лизисного буфера MMLV-RT. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 5: Буферы очистки MMLV-RT. Список буферных компонентов, необходимых для двухколонной очистки MMLV-RT. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 6: Буфер памяти MMLV-RT. Перечень буферных компонентов, необходимых для диализа MMLV-RT после очистки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 7: Информация о праймерах и зондах. Информация о последовательности праймеров и зондов, необходимых для каждой мультиплексированной смеси грунтовок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В связи с распространением распространенных респираторных вирусов, таких как SARS-CoV-2, грипп A/B и варианты БВРС-КоВ 12,19,20, на систему здравоохранения во всем мире ложится тяжелая экономическая нагрузка. Руководствуясь чувством ответственности за облегчение этого бремени, мы осознали необходимость быстрого, точного и доступного диагностического анализа, такого как ОТ-кПЦР, чтобы различать эти распространенные вирусы в одном тесте. Благодаря мультиплексному характеру ОТ-ПЦР можно диагностировать и отличать SARS-CoV-2 от других респираторных вирусов, таких как вирусы гриппа A/B и MERS-CoV. В конечном счете, более качественное и точное лечение пациентов может быть достигнуто с помощью существующего мультиплексного анализа46. Подводя итоги, можно сказать, что в этом исследовании описывается реализация собственного одноэтапного мультиплексного теста RT-qPCR, который может быть нацелен на две различные комбинации. Каждая комбинация состоит из трех различных респираторных вирусов, чтобы ограничить распространение таких инфекционных вирусов и снизить экономическую нагрузку на систему здравоохранения.

Данный мультиплексный набор для ОТ-кПЦР может быть нацелен на две комбинации распространенных респираторных вирусов (SARS-CoV-2, грипп A/B) и (SARS-CoV-2, MERS UpE/ORF1a). Описанный протокол прост, понятен в использовании и намного дешевле, чем коммерчески доступные наборы для одноэтапной ОТ-кПЦР. Еще одним преимуществом являются мультиплексные свойства набора, который может воздействовать на несколько вирусных генетических мишеней, используя различные комбинации зондов и праймеров. Таким образом, универсальность и простота комплекта позволяют легко внедрить его в условиях ограниченных ресурсов. Кроме того, набор подходит для обширного тестирования, в результате которого ставится точная и точная диагностика, которая может помочь ограничить распространение и коинфекцию нескольких респираторных вирусов.

Были проведены предварительные анализы, чтобы убедиться, что все мишени были успешно амплифицированы и с высокой точностью, чтобы ограничить образование неспецифических продуктов. Во-первых, мы провели несколько этапов оптимизации компонентов буферной смеси и их соответствующих концентраций в буферной смеси. Во-вторых, мы оптимизировали праймеры и их соответствующие концентрации как в смеси праймеров, так и в реакции ПЦР. В-третьих, мы оптимизировали состав ферментной смеси для максимизации ее активности и минимизации ингибирующего влияния MMLV-RT на активность Taq-полимеразы47. В-четвертых, мы оптимизировали условия термоциклирования с учетом ограничений по термостабильности обоих ферментов. Благодаря вышеупомянутым улучшениям оптимизированная версия нашего мультиплексного набора для ОТ-кПЦР, представленная здесь, смогла обнаружить до 10 копий/реакций РНК с высокой специфичностью, чувствительностью и воспроизводимостью.

Необходимо учитывать некоторые меры предосторожности для обеспечения высокой эффективности и успешного проведения мультиплексного анализа ОТ-кПЦР, чтобы предотвратить применение ингибиторов и избежать ошибок при пипетировании. Поскольку каждый объект уникален по своей настройке и оборудованию, вот несколько шагов, которые могут помочь при создании такого набора: во-первых, необходимо постоянно носить перчатки, чтобы избежать присутствия любого загрязнения и ингибитора ПЦР. Во-вторых, обязательно используйте аэрозолестойкие фильтрующие наконечники и калиброванную пипетку. Кроме того, обязательно используйте воду для ПЦР. Использование безшаблонного контроля поможет в проверке наличия каких-либо загрязнений. Важно отметить, что мастер-микс должен быть подготовлен для всех репликаций, чтобы избежать возможного загрязнения и вариаций пипетирования. Для поддержания качества зонда необходимо учитывать и другие советы по поиску и устранению неисправностей, такие как аликвотирование материала и избегание использования воды для его разбавления. Важно соблюдать рекомендации производителя по хранению и разбавлению используемой грунтовки и зонда. Таким образом, эти простые советы помогут в поддержании успеха мультиплексного анализа ОТ-кПЦР и обеспечат его высокую эффективность.

Несмотря на то, что мультиплексные тесты ОТ-кПЦР, разработанные в этом исследовании, показали хорошие результаты при тестировании с синтетическими вирусными РНК, их эффективность в реальных клинических условиях все еще нуждается в оценке и подтверждении. К сожалению, нехватка клинических образцов затрудняет определение специфичности и чувствительности анализа к вирусам, включенным в данное исследование. Однако стоит упомянуть, что LOD (limit of detection), который указывает на минимальное количество копий, которое может быть обнаружено в 100% выборок, был установлен с помощью статистически доказанной линейной регрессии. Это дает возможность для постановки клинического диагноза и является важным выводом исследования.

В этом исследовании был успешно разработан и валидирован с высокой эффективностью собственный мультиплексный одноэтапный ОТ-кПЦР-анализ на основе зонда. SARS-CoV-2 можно легко обнаружить и отличить от других распространенных респираторных вирусов, как описано выше, с высокой эффективностью и надежностью всего в одной пробирке. Таким образом, зависимость от этой мультиплексированной функции поможет повысить пропускную способность диагностики и сэкономить время, стоимость и образец по сравнению с другими подходами к тестированию и одиночной ПЦР. В целом, вероятность совместной циркуляции респираторных вирусов высока, и эта мультиплексная одноэтапная ОТ-кПЦР будет очень полезной.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Научно-технологическим университетом имени короля Абдаллы за счет основного финансирования и National Term Grand Challenge (NTGC) для S.M.H.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm filter cups Thermo Scientific 291-4545
10X Tris-Glycine SDS running buffer Novex LC2675
6-well tissue culturing plates Corning 353046
Ammonium sulfate Fisher Scientific A701-3
Ampicillin Corning 61-238-RH
Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL Cytiva 17-1152-01
D-(+)-Biotin, 98+% Thermo Scientific A14207.60
DH10Bac competent cells Fisher Scientific 10361012
Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC) Thermo Scientific 68100
Dithiothreitol (DTT) Thermo Scientific R0862
Dnase/Rnase Free Distilled Water Ambion AM9930
dNTPs Thermo Scientific R0192
E. coli BL21(DE3) competent cells Invitrogen C600003
EDTA Fisher Scientific BP120-1
Elution Buffer Qiagen 19086
ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media) Expression Systems 96-001-01
FBS Solution Gibco A38400-01
Fugene (transfection reagent) Promega E2311
Gentamicin Fisher Scientific 15750060
Glycerol Sigma Aldrich G5516-500
IGEPAL CA-630 Sigma Aldrich I8896-100ml
Imidazole Sigma Aldrich 56750-1Kg
Influenza A (H1N1) synthetic RNA Twist Bioscience 103001
Influenza A (H3N2)  synthetic RNA Twist Bioscience 103002
Influenza B synthetic RNA Twist Bioscience 103003
IPTG Gold Biotechnology I3481C100
Kanamycin Gibco 11815-032
LB Agar Fisher Scientific BP1425-500
LB Broth media Fisher Scientific BP1426-500
Lysozyme Sigma Aldrich L6876-10G
Magnesium Chloride Sigma Aldrich 13152-1Kg
MERS-CoV synthetic RNA Twist Bioscience 103015
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL) Applied Biosystems 10310855
Mini- PROTEAN TGX Precast Gel Bio-Rad 456-1093
Miniprep kit Qiagen 27106
Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL Cytiva 17-3712-06
Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL Cytiva 17-5248-02
Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free Applied Biosystems 4311971
Potassium Chloride Fisher Bioreagents BP366-1
Primers and Probes Integrated DNA Technologies, Inc.
Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free Thermo Scientific A32955
Protein marker Fermentas 26616
RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex) Applied Biosystems
S.O.C medium Fisher Scientific 15544034
SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA Twist Bioscience 102024
Sf9 insect cells Gibco A35243
Sodium Chloride Sigma Aldrich S3014-1Kg
StrepTrap XT 5 mL Cytiva 29401323
Tetracycline IBI Scientific IB02200
Tris Base Molecular Biology Grade Promega H5135
Tris-HCl Affymetrix 22676
Tween 20 Sigma Aldrich P1379-100ml
X-Gal Invitrogen B1690

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nat Rev Microbiol. 19 (3), 141-154 (2021).
  2. Zhu, N., et al. A novel Coronavirus from patients with Pneumonia in China, 2019. N Engl J Med. 382 (8), 727-733 (2019).
  3. Huang, C., et al. Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China. Lancet. 395 (10223), 497-506 (2020).
  4. Wu, F., et al. A new coronavirus associated with human respiratory disease in China. Nature. 579 (7798), 265-269 (2020).
  5. Yang, S., et al. Deep learning for detecting corona virus disease 2019 (COVID-19) on high-resolution computed tomography: a pilot study. Ann Transl Med. 8 (7), 450 (2020).
  6. El Hassan, M., et al. A review on the transmission of COVID-19 based on cough/sneeze/breath flows. Eur Phys J Plus. 137 (1), 1 (2022).
  7. World Health Organization. WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard. , https://covid19.who.int (2023).
  8. Kucharski, A. J., et al. Effectiveness of isolation, testing, contact tracing, and physical distancing on reducing transmission of SARS-CoV-2 in different settings: a mathematical modelling study. Lancet Infect Dis. 20 (10), 1151-1160 (2020).
  9. Reddy, K. P., et al. Cost-effectiveness of public health strategies for COVID-19 epidemic control in South Africa: a microsimulation modelling study. Lancet Glob Health. 9 (2), e120-e129 (2021).
  10. Cheng, H. Y., et al. Contact tracing assessment of COVID-19 transmission dynamics in Taiwan and risk at different exposure periods before and after symptom onset. JAMA Intern Med. 180 (9), 1156-1163 (2020).
  11. Kretzschmar, M. E., et al. Impact of delays on effectiveness of contact tracing strategies for COVID-19: a modelling study. Lancet Public Health. 5 (8), e452-e459 (2020).
  12. Krammer, F., et al. Influenza. Nat Rev Dis Primers. 4 (1), 3 (2018).
  13. Yang, J., et al. Prevalence of comorbidities and its effects in patients infected with SARS-CoV-2: a systematic review and meta-analysis. Int J Infect Dis. 94, 91-95 (2020).
  14. Lansbury, L., Lim, B., Baskaran, V., Lim, W. S. Co-infections in people with COVID-19: a systematic review and meta-analysis. J Infect. 81 (2), 266-275 (2020).
  15. Zaki, A. M., van Boheemen, S., Bestebroer, T. M., Osterhaus, A. D., Fouchier, R. A. Isolation of a novel coronavirus from a man with pneumonia in Saudi Arabia. N Engl J Med. 367 (19), 1814-1820 (2012).
  16. Azhar, E. I., et al. Evidence for camel-to-human transmission of MERS coronavirus. N Engl J Med. 370 (26), 2499-2505 (2014).
  17. Ling, Y., Qu, R., Luo, Y. Clinical analysis of the first patient with imported Middle East respiratory syndrome in China. Zhonghua Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue. 27 (8), 630-634 (2015).
  18. Nazer, R. I. Outbreak of Middle East Respiratory Syndrome-Coronavirus causes high fatality after cardiac operations. Ann Thorac Surg. 104 (2), e127-e129 (2017).
  19. Huang, P., et al. A rapid and specific assay for the detection of MERS-CoV. Front Microbiol. 9, 1101 (2018).
  20. Ezhilan, M., Suresh, I., Nesakumar, N. SARS-CoV, MERS-CoV and SARS-CoV-2: A diagnostic challenge. Measurement (Lond). 168, 108335 (2021).
  21. Ulloa, S., et al. A simple method for SARS-CoV-2 detection by rRT-PCR without the use of a commercial RNA extraction kit. J Virol Methods. 285, 113960 (2020).
  22. Kudo, E., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA by multiplex RT-qPCR. PLoS Biol. 18 (10), e3000867 (2020).
  23. Norz, D., Hoffmann, A., Aepfelbacher, M., Pfefferle, S., Lutgehetmann, M. Clinical evaluation of a fully automated, laboratory-developed multiplex RT-PCR assay integrating dual-target SARS-CoV-2 and influenza A/B detection on a high-throughput platform. J Med Microbiol. 70 (2), 001295 (2021).
  24. Yun, J., et al. Evaluation of three multiplex real-time reverse transcription PCR assays for simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and Respiratory Syncytial virus in nasopharyngeal swabs. J Korean Med Sci. 36 (48), e328 (2021).
  25. Lu, X., et al. Real-time reverse transcription-PCR assay panel for Middle East respiratory syndrome coronavirus. J Clin Microbiol. 52 (1), 67-75 (2014).
  26. Broughton, J. P., et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nat Biotechnol. 38 (7), 870-874 (2020).
  27. Ali, Z., et al. iSCAN: An RT-LAMP-coupled CRISPR-Cas12 module for rapid, sensitive detection of SARS-CoV-2. Virus Res. 288, 198129 (2020).
  28. Ali, Z., et al. Bio-SCAN: A CRISPR/dCas9-based lateral flow assay for rapid, specific, and sensitive detection of SARS-CoV-2. ACS Synth Biol. 11 (1), 406-419 (2022).
  29. Yoshimi, K., et al. CRISPR-Cas3-based diagnostics for SARS-CoV-2 and Influenza virus. iScience. 25 (2), 103830 (2022).
  30. Chen, Z., et al. Rapid and sensitive detection of anti-SARS-CoV-2 IgG, using Lanthanide-doped nanoparticles-based lateral flow immunoassay. Anal Chem. 92 (10), 7226-7231 (2020).
  31. Kasetsirikul, S., et al. Detection of the SARS-CoV-2 humanized antibody with paper-based ELISA. Analyst. 145 (23), 7680-7686 (2020).
  32. Joung, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK One-Pot testing. N Engl J Med. 383 (15), 1492-1494 (2020).
  33. Chen, Z., Wu, Q., Chen, J., Ni, X., Dai, J. A DNA aptamer based method for detection of SARS-CoV-2 nucleocapsid protein. Virol Sin. 35 (3), 351-354 (2020).
  34. Jang, W. S., et al. Development of a multiplex Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) assay for on-site diagnosis of SARS CoV-2. PLoS One. 16 (3), e0248042 (2021).
  35. McBride, R., Fielding, B. C. The role of Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS)-Coronavirus accessory proteins in virus pathogenesis. Viruses-Basel. 4 (11), 2902-2923 (2012).
  36. AlBalwi, M. A., et al. Evolving sequence mutations in the Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV). J Infection Public Health. 13 (10), 1544-1550 (2020).
  37. Takahashi, M., et al. Quick and easy assembly of a One-Step qRT-PCR Kit for COVID-19 diagnostics using In-House enzymes. ACS Omega. 6 (11), 7374-7386 (2021).
  38. Sambrook, J., Fritsch, E. R., Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual (2nd ed.). , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY, USA. (1989).
  39. Simpson, R. J. SDS-PAGE of Proteins. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
  40. Simpson, R. J. Staining proteins in gels with Coomassie blue. CSH Protoc. 2007, (2007).
  41. Takumi Yano, J. M. L., et al. Expression of the thermostable Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase by silkworm-baculovirus expression system. J Asia-Pac Entomol. 22 (2), 453-457 (2019).
  42. van Kasteren, P. B., et al. Comparison of seven commercial RT-PCR diagnostic kits for COVID-19. J Clin Virol. 128, 104412 (2020).
  43. Shu, B., et al. Multiplex Real-Time reverse transcription PCR for Influenza A virus, Influenza B virus, and Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2. Emerg Infect Dis. 27 (7), 1821-1830 (2021).
  44. Engelke, D. R., Krikos, A., Bruck, M. E., Ginsburg, D. Purification of Thermus aquaticus DNA polymerase expressed in Escherichia coli. Anal Biochem. 191 (2), 396-400 (1990).
  45. Pabbaraju, K., Wong, A. A., Ma, R., Zelyas, N., Tipples, G. A. Development and validation of a multiplex reverse transcriptase-PCR assay for simultaneous testing of Influenza A, Influenza B and SARS-CoV-2. J Virol Methods. 293, 114151 (2020).
  46. Hirotsu, Y., et al. Analysis of COVID-19 and non-COVID-19 viruses, including Influenza viruses, to determine the influence of intensive preventive measures in Japan. J Clin Virol. 132, 104634 (2020).
  47. Sellner, L. N., Coelen, R. J., Mackenzie, J. S. Reverse-Transcriptase inhibits Taq Polymerase-Activity. Nucleic Acids Res. 20 (7), 1487-1490 (1992).

Tags

В этом месяце в JoVE выпуск 201 Taq-полимераза MMLV-RT экспрессия белка COVID-19 SARS-CoV-2 грипп A/B MERS-CoV мультиплексная ОТ-кПЦР
Разработка мультиплексных ОТ-кПЦР-анализов в режиме реального времени для выявления SARS-CoV-2, гриппа A/B и БВРС-КоВ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Althobaiti, A., Hamdan, K., Sobhy,… More

Althobaiti, A., Hamdan, K., Sobhy, M. A., Rawas, R., Takahashi, M., Artyukh, O., Tehseen, M. Development of Multiplex Real-Time RT-qPCR Assays for the Detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and MERS-CoV. J. Vis. Exp. (201), e65822, doi:10.3791/65822 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter