Summary
Qui descriviamo un test interno di attività del fattore tissutale del tessuto delle vescicole extracellulari. I saggi basati sull'attività e i saggi basati sull'antigene sono stati utilizzati per misurare il fattore tissutale nelle vescicole extracellulari da campioni di plasma umano. I test basati sull'attività hanno una sensibilità e una specificità più elevate rispetto ai test basati sull'antigene.
Abstract
Il fattore tissutale (TF) è un recettore transmembrana per il fattore (F) VII e FVIIa. Il complesso TF/FVIIa avvia la cascata della coagulazione attivando sia FIX che FX. Il TF viene rilasciato dalle cellule nella circolazione sotto forma di vescicole extracellulari (EV). Il livello di vescicole extracellulari TF-positive (+) è aumentato in varie malattie, tra cui il cancro, le infezioni batteriche e virali e la cirrosi, ed è associato a trombosi, coagulazione intravascolare disseminata, gravità della malattia e mortalità. Esistono due modi per misurare le vescicole extracellulari TF+ nel plasma: saggi basati sull'antigene e sull'attività. I dati indicano che i test basati sull'attività hanno una sensibilità e una specificità più elevate rispetto ai test basati sull'antigene. Questo documento descrive il nostro saggio interno dell'attività EVTF basato su un saggio di generazione FXa a due stadi. FVIIa, FX e calcio vengono aggiunti ai campioni contenenti EV TF+ per generare FXa in presenza e assenza di anticorpi anti-TF per distinguere la generazione FXa TF-dipendente dalla generazione FXa TF-indipendente. Per determinare il livello di FXa viene utilizzato un substrato cromogenico scisso da FXa, mentre per la determinazione della concentrazione di TF viene utilizzata una curva standard generata con un TF ricombinante relipidato. Questo test di attività EVTF interno ha una sensibilità e una specificità più elevate rispetto a un test di attività TF commerciale.
Introduction
La coagulazione del sangue inizia con il legame del fattore (F) VII/VIIa al fattore tissutale (TF)1. Il complesso TF/FVIIa attiva sia FIX che FX per attivare la coagulazione del sangue1. Esistono due forme di TF full-length, legate alla membrana: crittografato e attivo. Inoltre, esiste una forma alternativa di TF (asTF). La sfingomielina e la fosfatidilcolina nel lembo esterno della membrana cellulare mantengono il TF in uno stato crittografato 2,3,4. Quando le cellule sono attivate o danneggiate, la scramblasi fosfolipidica trasferisce la fosfatidilserina e altri fosfolipidi caricati negativamente al foglietto esterno1. L'attivazione delle cellule provoca anche la traslocazione della sfingomielinasi acida nel foglietto esterno dove degrada la sfingomielina in ceramide5. Questi due meccanismi convertono TF crittografato nel formato attivo. Si propone inoltre che la proteina disolfuro isomerasi medierà la formazione di legami disolfuro tra Cys186 e Cys209 in TF crittografato, che si traduce nella decodifica di TF 6,7,8. asTF è presente anche in circolo ma manca del dominio transmembrana ed è quindi solubile 9,10. È importante sottolineare che l'asTF ha livelli molto bassi di attività procoagulante rispetto al TFattivo 10,11 a tutta lunghezza.
Le vescicole extracellulari (EV) vengono rilasciate dalle cellule ospiti a riposo, attivate e morenti, nonché dalle cellule tumorali12. Le vescicole extracellulari esprimono proteine dalle loro cellule parentali12. Le vescicole extracellulari attive portatrici di TF vengono rilasciate dai monociti attivati, dalle cellule endoteliali e dalle cellule tumorali nella circolazione 13,14,15. I livelli di TF nel plasma possono essere misurati mediante saggi basati sull'attività e sull'antigene. I saggi basati sull'antigene includono l'ELISA e la citometria a flusso16. Esistono due diversi saggi basati sull'attività: saggi di attività TF a uno e due stadi. Il test a una fase si basa su un test di coagulazione basato sul plasma. Il campione contenente TF viene aggiunto al plasma e viene misurato il tempo necessario per formare un coagulo dopo la ricalcificazione. Il test a due stadi misura la generazione FXa dei campioni aggiungendo FVII o FVIIa, FX e calcio. I livelli di FXa sono determinati utilizzando un substrato che viene scisso da FXa.
Sia nei saggi di attività TF a uno che a due stadi, la concentrazione di TF viene determinata utilizzando una curva standard generata con TF ricombinante. I saggi a due stadi hanno una sensibilità e una specificità più elevate rispetto ai saggi a uno stadio. Molti studi hanno confermato che i saggi basati sull'attività hanno una maggiore sensibilità e specificità rispetto ai saggi basati sull'antigene 17,18,19,20,21. Inoltre, il nostro test di attività in-house ha una sensibilità e una specificità più elevate rispetto a un test di attività commerciale22. Gli individui sani hanno livelli molto bassi o non rilevabili di attività EVTF nel plasma. Al contrario, gli individui con condizioni patologiche, come cancro, cirrosi, sepsi e infezione virale, hanno livelli rilevabili di attività EVTF e questo è associato a trombosi, coagulazione intravascolare disseminata, gravità della malattia e mortalità 23,24,25,26,27,28. Qui, descriveremo questo test interno di attività EVTF a due stadi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
La ricerca è stata approvata dall'Institutional Review Board dell'Università della Carolina del Nord a Chapel Hill (numero di protocollo: 14-2108).
1. Prelievo di sangue da donatori
- Prelevare il sangue intero con una venopuntura pulita nella vena antecubitale con un ago da 21 G. Scartare i primi 3 ml di sangue perché questa porzione di sangue può contenere TF da cellule perivascolari.
- Prelevare 2,7 o 1,8 mL (a seconda delle dimensioni delle provette) di sangue in un vacutainer contenente citrato di sodio al 3,2% (0,109 mol/L). Non riempire eccessivamente o troppo poco i tubi. Capovolgere delicatamente le provette subito dopo il prelievo di sangue per disperdere il citrato di sodio.
- Evitare l'agitazione se i tubi vengono trasportati prima della lavorazione. Preparare il plasma entro 2 ore dal prelievo di sangue.
2. Preparazione del plasma di controllo negativo
NOTA: I campioni non devono mai essere posti sul ghiaccio prima del congelamento finale.
- Preparare il plasma di controllo negativo utilizzando sangue intero di volontari sani. Subito dopo il prelievo di sangue, preparare il plasma privo di piastrine come segue.
- Trasferire i campioni di sangue dalle provette vacutainer alle provette da 15 ml.
- Centrifugare i campioni di sangue a 2.500 × g per 15 minuti a temperatura ambiente (20-24 °C) senza freno.
- Trasferire il surnatante (plasma povero di piastrine) in una nuova provetta e ripetere la rotazione nelle stesse condizioni.
- Trasferire il surnatante (plasma depleto di piastrine) in una nuova provetta.
- Aliquotare il campione in aliquote da ≥100 μL. Lasciare circa 100 μL sul fondo della provetta.
- Congelare immediatamente il plasma impoverito di piastrine a -80 °C (Figura 1).
3. Preparazione del plasma di controllo positivo
NOTA: La risposta al lipopolisaccaride è variabile tra gli individui.
- Trasferire i campioni di sangue dai vacutainer alle provette da 15 ml.
- Preparare il plasma di controllo positivo utilizzando sangue intero di volontari sani stimolati con lipopolisaccaride (LPS) da Escherichia coli O111:B4 (10 μg/mL) per 5 ore a 37 °C con agitazione.
- Dopo 5 ore di incubazione, seguire i passaggi da 2.1.2 a 2.1.6.
4. Isolamento di vescicole extracellulari dal plasma
NOTA: I pellet EV potrebbero non essere visibili. Il tempo di scongelamento dipende dal volume del campione, ma di solito scongeliamo plasma da 100 μL per 30 minuti a 37 °C.
- Scongelare i campioni di plasma a 37 °C.
- Aggiungere 1 mL di tampone HBSA senza calcio [HBSA-Ca(-)] [137 mM NaCl, 5,38 mM KCl, 5,55 mM di glucosio, 10 mM di HEPES, 0,1% (p/v) albumina sierica bovina] a ogni 100 μL di campione di plasma in una provetta da 1,5 mL.
- Centrifugare i campioni di plasma a 20.000 × g per 15 minuti a 4 °C.
- Aspirare il surnatante fino a 20 μL senza disturbare il pellet EV.
- Ricostituire il pellet EV aggiungendo 1 mL di tampone HBSA-Ca(-) a ciascuna provetta, pipettare su e giù nella posizione del pellet EV e vorticare ogni provetta prima di centrifugare per una seconda volta a 20.000 × g per 15 minuti a 4 °C.
- Aspirare il surnatante fino a 20 μL senza disturbare il pellet EV.
- Ricostituire il pellet EV in 80 μL di HBSA-Ca(-) e pipettare su e giù nella posizione del pellet EV (Figura 2).
5. Opzione: isolamento di piccole vescicole extracellulari mediante ultracentrifuga
- Dopo la fase 4.3, raccogliere il surnatante e l'ultracentrifuga a 100.000 × g per 70 minuti a 4 °C.
- Aspirare il surnatante fino a 20 μL senza disturbare il pellet EV.
- Ricostituire il pellet EV aggiungendo 1 mL di tampone HBSA-Ca(-) a ciascuna provetta e vorticare ciascuna provetta prima di ultracentrifugare per una seconda volta a 100.000 × g per 70 minuti a 4 °C.
- Aspirare il surnatante fino a 20 μL senza disturbare il pellet EV.
- Ricostituire il pellet EV in 80 μL di HBSA-Ca(-).
6. Misurazione dell'attività del fattore tissutale delle vescicole extracellulari
NOTA: I campioni EV devono essere pipettati e vortex per miscelare prima di essere aggiunti ai pozzetti. L'EDTA-disodio inibisce la capacità di FXa di scindere il substrato cromogenico. Pertanto, l'EDTA-disodio non può essere utilizzato come sostituto dell'EDTA-tetrasodio nella fase 6.7.
- Aggiungere 40 μL di un campione EV a due pozzetti di una piastra a 96 pozzetti.
- Aggiungere 11 μL di IgG TF anti-umano di topo inibitorio [(36,4 μg/mL, concentrazione finale 7,8 μg/mL)] in un pozzetto di un campione EV e 11 μL di IgG di topo di controllo [(36,4 μg/mL, concentrazione finale 7,8 μg/mL)] nell'altro pozzetto.
- Incubare la piastra a 96 pozzetti per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Durante il tempo di incubazione, preparare 50 μL/pozzetto di standard TF (0, 0,32, 0,63, 1,25, 2,5, 5, 10 e 20 pg/mL) in duplicato utilizzando TF ricombinante relipidato.
- Preparare la miscela di fattori mescolando 4 mL di HBSA con calcio [HBSA-Ca(+)] [HBSA-Ca(-) + 10 mM CaCl2, concentrazione finale 10 mM], 800 μL di 900 nM FX in HBSA-Ca(+) (concentrazione finale: 146,4 nM) e 120 μL di 200 nM FVIIa in HBSA-CA(+) (concentrazione finale: 4,8 nM).
- Aggiungere 50 μL della soluzione di miscela di fattori in ciascun pozzetto, coprire la piastra con pellicola e incubare per 2 ore in un incubatore a 37 °C.
- Dopo 2 ore, interrompere la generazione di FXa aggiungendo 25 μL di tampone HBSA acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) [HBSA-Ca(-) + 25 mM EDTA-tetrasodio, concentrazione finale 5 mM] e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Ricostituire il substrato cromogenico scisso da FXa a 4 mM (aggiungere 8,7 mL di acqua distillata a un flaconcino da 25 mg).
- Aggiungere 25 μL della soluzione di substrato cromogenico a ciascun pozzetto, coprire la piastra con pellicola e poi con un foglio di alluminio per proteggerla dalla luce e incubare per 15 minuti a 37 °C.
- Dopo 15 minuti di incubazione, rimuovere le bolle con un ago o per centrifugazione a 1.500 × g per 1 minuto.
- Leggere la piastra a 405 nm utilizzando un lettore di piastre con una miscela prima della lettura.
- Convertire la generazione FXa di ciascun pozzetto in attività TF utilizzando la curva standard generata utilizzando TF ricombinante relipidato.
- Calcolare Generazione FXa dipendente da TF (attività EVTF) utilizzando l'equazione (1):
Generazione FXa dipendente da TF (attività EVTF [pg/mL]) = Generazione FXa totale (pozzetto IgG di controllo) - Generazione FXa indipendente da TF (pozzetto IgG anti-TF) (Figura 3) (1)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Un risultato positivo fornisce un valore di controllo positivo di ≥0,5 pg/mL e un valore di controllo negativo di <0,5 pg/mL. È meglio trovare un risponditore LPS elevato con >1,0 pg/mL di attività EVTF per un controllo positivo. Il risultato rappresentativo mostra l'attività EVTF delle vescicole extracellulari isolate dal plasma del sangue intero di 11 donatori sani, con e senza attivazione di LPS (Figura 4). Sei donatori su undici (donatori 2, 4, 5, 8, 10, 11) hanno risposto con LPS medio-alto, mentre cinque donatori su undici (donatori 1, 3, 6, 7, 9) hanno risposto con LPS basso.
Figura 1: Preparazione del plasma depleto di piastrine. La figura è stata modificata da Hisada e Mackman29. Abbreviazione: PDP = plasma depleto di piastrine. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Isolamento di vescicole extracellulari da plasma impoverito di piastrine. La figura è stata modificata da Hisada e Mackman29. Abbreviazioni: PDP = plasma depleto di piastrine; EVs = vescicole extracellulari. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Misurazione dell'attività del fattore tissutale delle vescicole extracellulari. La figura è stata modificata da Hisada e Mackman29. Abbreviazioni: TF = fattore tissutale; EVs = vescicole extracellulari. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Attività EVTF del plasma del sangue intero di 11 donatori sani, con e senza attivazione di LPS. L'attivazione di LPS è stata eseguita nelle stesse condizioni del controllo positivo. Il controllo positivo proveniva da un responder LPS noto, mentre le risposte all'LPS di 11 donatori sani non erano note al momento dell'esperimento. Le barre bianche e nere indicano rispettivamente con e senza attivazione LPS. Abbreviazioni: EVTF = fattore di tessuto vescicolare extracellulare; LPS = lipopolisaccaride. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Un riassunto degli studi che confrontano questo test di attività EVTF interno, un ELISA TF commerciale e un test di attività. Abbreviazioni: EVTF = fattore di tessuto vescicolare extracellulare; ELISA = saggio di immunoassorbimento enzimatico. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Qui viene presentato il protocollo del nostro test interno di attività EVTF. Il protocollo prevede tre passaggi critici. Quando si ricostituisce il pellet EV, è importante pipettare su e giù nella posizione del pellet EV anche se non è visibile. La ricostituzione incompleta del pellet EV comporterà un falso negativo o una sottostima dei valori di attività EVTF dei campioni. In secondo luogo, l'utilizzo di HBSA-Ca(+) è fondamentale nella fase 6.5 del protocollo perché la generazione di FXa non può essere generata senza calcio. In terzo luogo, l'uso di EDTA-tetrasodio ma non EDTA-disodio per fermare la generazione di FXa è fondamentale perché quest'ultimo inibisce la capacità di FXa di scindere il substrato cromogenico.
Si consiglia il seguente metodo di conservazione e utilizzo per ciascun reagente. Conserviamo i tamponi del saggio e il substrato ricostituito a 4 °C e li utilizziamo ripetutamente fino a esaurirli. Se non esauriamo il substrato entro 2-3 settimane, lo scartiamo perché ingiallisce. Conserviamo TF ricombinante, anticorpi, FVIIa e FX a -80 °C e raccomandiamo di fare aliquote per un test per evitare un ciclo di gelo-disgelo.
In uno studio preliminare, abbiamo lasciato campioni di plasma per 9 ore a temperatura ambiente, li abbiamo ricongelati a -80 °C durante la notte e abbiamo eseguito il test il giorno successivo. Come controllo, abbiamo scongelato lo stesso plasma e lo abbiamo ricongelato immediatamente. Abbiamo scoperto che il campione lasciato per 9 ore a temperatura ambiente aveva una diminuzione del 16% dell'attività EVTF rispetto a quello che è stato scongelato e ricongelato immediatamente (Hisada e Mackman, dati non pubblicati 2017).
Oltre alla differenza nella risposta all'LPS, la differenza nella concentrazione di EV nel plasma dei singoli donatori può spiegare la diversa attività EVTF dei diversi donatori. In effetti, abbiamo osservato alcune variazioni nelle concentrazioni di EV nel plasma del sangue intero stimolato da LPS (1,9 ± 0,6 ×10 10 particelle/mL, n = 6, media ± deviazione standard)30.
Questo test di attività EVTF interno ha diverse caratteristiche che i saggi commerciali non hanno. In primo luogo, il test utilizza un anticorpo anti-TF per distinguere la generazione FXa TF-dipendente dalla generazione FXa TF-indipendente. Tre saggi di attività commerciale sono indicati per misurare l'attività del TF nel plasma, ma nessuno di essi utilizza anticorpi anti-TF16. Pertanto, questi saggi commerciali misurano semplicemente la generazione di FXa totale, ma non la generazione di FXa dipendente da TF. In secondo luogo, utilizziamo 2,4 nM di FVIIa (la concentrazione finale nella reazione) per ridurre al minimo la generazione di FXa indipendente da TF da parte di FVIIa. Un test di attività commerciale utilizza 12 nM di FVIIa nella reazione, che fornisce un elevato fondo22. Infatti, FVIIa attiva FX linearmente in funzione della concentrazione di FVIIa in assenza di TF31. Nella Tabella 1 sono stati riassunti gli studi che hanno confrontato questo test di attività EVTF interno e l'ELISA TF commerciale e un test di attività.
Vengono proposte quattro classificazioni di risposta dell'attività EVTF per il plasma povero di piastrine citrate: zero (da 0 a <0,5 pg/mL); debole (da 0,5 a <1,0 pg/mL), moderata (da 1,0 a <2,0 pg/mL) e forte (≥2,0 pg/mL)23. In particolare, diversi anticoagulanti influenzano i risultati dei saggi di attività EVTF. Ad esempio, sono stati osservati livelli più elevati di attività EVTF utilizzando l'eparina dopo la stimolazione LPS rispetto al citrato di sodio (Donatore A: 4,6 (citrato) vs 28,6 (eparina) pg/mL e Donatore B: 3,4 (citrato) vs 26,0 (eparina) pg/mL, rispettivamente, dati non pubblicati di Hisada e Mackman 2017). Al contrario, livelli più bassi di attività EVTF sono stati osservati utilizzando EDTA dopo stimolazione LPS rispetto al citrato di sodio (Donatore C: 3,9 (citrato) vs 1,4 (EDTA) pg/mL, Donatore D: 3,8 (citrato) vs 0,4 (EDTA) pg/mL, rispettivamente, dati non pubblicati di Tatsumi e Mackman 2016). Questi risultati indicano che i dati sull'attività dell'EVTF non sono confrontabili quando vengono utilizzati diversi anticoagulanti.
Ci sono alcune limitazioni al metodo. Il coefficiente di variazione (CV) è relativamente alto rispetto ai test clinici. Infatti, il CV per il controllo positivo in sette studi indipendenti è stato del 24%17,29. Isolamento delle vescicole extracellulari mediante centrifugazione di pellet, non solo vescicole extracellulari ma anche detriti cellulari. In precedenza abbiamo analizzato il pellet di plasma ricco di piastrine mediante microscopia elettronica a trasmissione e osservato piastrine, vescicole extracellulari e detriti cellulari32. Utilizziamo un rotore ad angolo fisso e non abbiamo mai sperimentato un rotore oscillante per una centrifugazione da 20.000 × g. Recentemente abbiamo scoperto che le piccole vescicole extracellulari che possono essere pellettate con 100.000 × g ma non con 20.000 × g hanno attività EVTF nei pazienti con cancro al pancreas e COVID-1930. Ciò indica che questo protocollo non misura l'attività EVTF da piccole vescicole extracellulari, come gli esosomi. In particolare, gli esosomi sono vescicole extracellulari ricche di sfingomielina e la presenza di esosomi contenenti TF è stata segnalata 30,33,34,35. Si consiglia di pellettare le vescicole extracellulari nel plasma utilizzando 100.000 × g per determinare in modo più accurato la quantità totale di attività EVTF nel campione. Da notare che richiede un'ultracentrifuga e un tempo di analisi più lungo perché il tempo di centrifugazione aumenta da 15 minuti a 70 minuti.
Questo metodo può essere applicato a campioni di plasma di qualsiasi tipo di malattia. L'attività dell'EVTF è associata alla gravità e alla sopravvivenza della malattia in pazienti con diverse malattie, tra cui cancro, COVID-19, infezione batterica e cirrosi 23,26,27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Non ci sono interessi concorrenti da divulgare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal NIH NHLBI R35HL155657 (NM) e dalla cattedra John C. Parker (NM). Vorremmo ringraziare la signora Sierra J. Archibald per i suoi utili commenti
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tube for 20,000 x g centrifuge | any company | N/A | We use the one from Fisher Scientific (Catalog number: 05-408-129). |
| 1.5 mL tube for ultracentrifuge | any company | N/A | We use the one from Beckman Coulter (Catalog number: 357448) |
| 15 mL tube | any company | N/A | We use the one from VWR (Catalog number: 89039-666) |
| 21 G x .75 in. BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set with 12 in. tubing and luer adapter | BD | 367281 | |
| 96-well plate | any company | N/A | We use the one from Globe Scientific (Catalog number: 120338). |
| BD Vacutainer Citrate Tubes | BD | 363083 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C69-500 | |
| Centrifuge for 1.5 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5417R (Eppendorf). |
| Centrifuge for 15 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5810R (Eppendorf). |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate | Sigma Aldrich | E6511 | |
| Hepes | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Human FVIIa | Enzyme Research Laboratory | HFVIIa | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
| Human FX | Enzyme Research Laboratory | HFX1010 | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
| Inhibitory mouse anti-human tissue factor IgG, clone HTF-1 | Fisher Scientific | 550252 | |
| Lipopolysaccharide from Escherichia coli O111:B4 | Sigma Aldrich | L2630 | There are several lipopolysaccharide from different E. coli. Different lipopolysaccharide have different potential to activate monocytes. |
| Mouse IgG | Sigma Aldrich | I5381 | |
| Pefachrome FXa 8595 | Enzyme Research Laboratory | 085-27 | |
| Plate reader | any company | N/A | We use the SpectraMax i3x from Molecular Devices |
| Re-lipidated recombinant tissue factor, Dade Innovin | Siemens | 10873566 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima TLX | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | TLA-55 |
References
- Grover, S. P., Mackman, N. Tissue factor: an essential mediator of hemostasis and trigger of thrombosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (4), 709-725 (2018).
- Shaw, A. W., Pureza, V. S., Sligar, S. G., Morrissey, J. H. The local phospholipid environment modulates the activation of blood clotting. Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6556-6563 (2007).
- Tavoosi, N., et al. Molecular determinants of phospholipid synergy in blood clotting. Journal of Biological Chemistry. 286 (26), 23247-23253 (2011).
- Wang, J., Pendurthi, U. R., Rao, L. V. M. Sphingomyelin encrypts tissue factor: ATP-induced activation of A-SMase leads to tissue factor decryption and microvesicle shedding. Blood Advances. 1 (13), 849-862 (2017).
- Kornhuber, J., Rhein, C., Muller, C. P., Muhle, C. Secretory sphingomyelinase in health and disease. Biological Chemistry. 396 (6-7), 707-736 (2015).
- Versteeg, H. H., Ruf, W. Tissue factor coagulant function is enhanced by protein-disulfide isomerase independent of oxidoreductase activity. Journal of Biological Chemistry. 282 (35), 25416-25424 (2007).
- Reinhardt, C., et al. Protein disulfide isomerase acts as an injury response signal that enhances fibrin generation via tissue factor activation. Journal of Clinical Investigation. 118 (3), 1110-1122 (2008).
- Langer, F., et al. Rapid activation of monocyte tissue factor by antithymocyte globulin is dependent on complement and protein disulfide isomerase. Blood. 121 (12), 2324-2335 (2013).
- Bogdanov, V. Y., et al. Alternatively spliced human tissue factor: a circulating, soluble, thrombogenic protein. Nature Medicine. 9 (4), 458-462 (2003).
- Mackman, N. Alternatively spliced tissue factor - one cut too many. Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 5-8 (2007).
- Censarek, P., Bobbe, A., Grandoch, M., Schror, K., Weber, A. A. Alternatively spliced human tissue factor (asHTF) is not pro-coagulant. Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 11-14 (2007).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Osterud, B., Bjorklid, E. Tissue factor in blood cells and endothelial cells. Frontiers in Bioscience (Elite Edition). 4 (1), 289-299 (2012).
- Hisada, Y., Mackman, N. Cancer cell-derived tissue factor-positive extracellular vesicles: biomarkers of thrombosis and survival. Current Opinion in Hematology. 26 (5), 349-356 (2019).
- Vatsyayan, R., Kothari, H., Pendurthi, U. R., Rao, L. V. 4-Hydroxy-2-nonenal enhances tissue factor activity in human monocytic cells via p38 mitogen-activated protein kinase activation-dependent phosphatidylserine exposure. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (7), 1601-1611 (2013).
- Mackman, N., Sachetto, A. T. A., Hisada, Y. Measurement of tissue factor-positive extracellular vesicles in plasma: strengths and weaknesses of current methods. Current Opinion in Hematology. 29 (5), 266-274 (2022).
- Lee, R. D., et al. Pre-analytical and analytical variables affecting the measurement of plasma-derived microparticle tissue factor activity. Thrombosis Research. 129 (1), 80-85 (2012).
- Claussen, C., et al. Microvesicle-associated tissue factor procoagulant activity for the preoperative diagnosis of ovarian cancer. Thrombosis Research. 141, 39-48 (2016).
- Mackman, N., Hisada, Y., Archibald, S. J., et al. Tissue factor and its procoagulant activity on cancer-associated thromboembolism in pancreatic cancer: Comment by Mackman et al. Cancer Science. 113 (5), 1885-1887 (2022).
- Sachetto, A. T. A., et al. Evaluation of four commercial ELISAs to measure tissue factor in human plasma. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 7 (3), 100133 (2023).
- Archibald, S. J., Hisada, Y., Bae-Jump, V. L., Mackman, N. Evaluation of a new bead-based assay to measure levels of human tissue factor antigen in extracellular vesicles in plasma. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 6 (2), e12677 (2022).
- Tatsumi, K., et al. Evaluation of a new commercial assay to measure microparticle tissue factor activity in plasma: communication from the SSC of the ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (11), 1932-1934 (2014).
- Hisada, Y., et al. Measurement of microparticle tissue factor activity in clinical samples: A summary of two tissue factor-dependent FXa generation assays. Thrombosis Research. 139, 90-97 (2016).
- Tatsumi, K., Hisada, Y., Connolly, A. F., Buranda, T., Mackman, N. Patients with severe orthohantavirus cardiopulmonary syndrome due to Sin Nombre Virus infection have increased circulating extracellular vesicle tissue factor and an activated coagulation system. Thrombosis Research. 179, 31-33 (2019).
- Schmedes, C. M., et al. Circulating Extracellular Vesicle Tissue Factor Activity During Orthohantavirus Infection Is Associated With Intravascular Coagulation. Journal of Infectious Diseases. 222 (8), 1392-1399 (2020).
- Rosell, A., et al. Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-Brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).
- Campbell, R. A., et al. Comparison of the coagulopathies associated with COVID-19 and sepsis. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 5 (4), e12525 (2021).
- Guervilly, C., et al. Dissemination of extreme levels of extracellular vesicles: tissue factor activity in patients with severe COVID-19. Blood Advances. 5 (3), 628-634 (2021).
- Hisada, Y., Mackman, N. Measurement of tissue factor activity in extracellular vesicles from human plasma samples. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 3 (1), 44-48 (2019).
- Sachetto, A. T. A., et al. Tissue factor activity of small and large extracellular vesicles in different diseases. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 7 (3), 100124 (2023).
- Bom, V. J., Bertina, R. M. The contributions of Ca2+, phospholipids and tissue-factor apoprotein to the activation of human blood-coagulation factor X by activated factor VII. Biochemical Journal. 265 (2), 327-336 (1990).
- Tilley, R. E., Holscher, T., Belani, R., Nieva, J., Mackman, N. Tissue factor activity is increased in a combined platelet and microparticle sample from cancer patients. Thrombosis Research. 122 (5), 604-609 (2008).
- Gurung, S., Perocheau, D., Touramanidou, L., Baruteau, J. The exosome journey: from biogenesis to uptake and intracellular signalling. Cell Communication and Signaling. 19 (1), 47 (2021).
- Garnier, D., et al. Cancer cells induced to express mesenchymal phenotype release exosome-like extracellular vesicles carrying tissue factor. Journal of Biological Chemistry. 287 (52), 43565-43572 (2012).
- Park, J. A., et al. Tissue factor-bearing exosome secretion from human mechanically stimulated bronchial epithelial cells in vitro and in vivo. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 130 (6), 1375-1383 (2012).
