Summary
Her beskriver vi en intern ekstracellulær vesikkelvevsfaktoraktivitetsanalyse. Aktivitetsbaserte analyser og antigenbaserte analyser har blitt brukt til å måle vevsfaktor i ekstracellulære vesikler fra humane plasmaprøver. Aktivitetsbaserte analyser har høyere sensitivitet og spesifisitet enn antigenbaserte analyser.
Abstract
Vevsfaktor (TF) er en transmembran reseptor for faktor (F) VII og FVIIa. TF/FVIIa-komplekset initierer koagulasjonskaskaden ved å aktivere både FIX og FX. TF frigjøres fra celler i sirkulasjonen i form av ekstracellulære vesikler (EV). Nivået av TF-positive (+) EV er økt i ulike sykdommer, inkludert kreft, bakterielle og virusinfeksjoner og skrumplever, og er assosiert med trombose, disseminert intravaskulær koagulasjon, sykdomsalvorlighetsgrad og dødelighet. Det er to måter å måle TF + EV i plasma: antigen- og aktivitetsbaserte analyser. Data indikerer at aktivitetsbaserte analyser har høyere sensitivitet og spesifisitet enn antigenbaserte analyser. Denne rapporten beskriver vår interne EVTF-aktivitetsanalyse basert på en totrinns FXa-generasjonsanalyse. FVIIa, FX og kalsium blir tilsatt til TF + EV-holdige prøver for å generere FXa i nærvær og fravær av anti-TF-antistoff for å skille TF-avhengig FXa-generasjon fra TF-uavhengig FXa-generasjon. Et kromogent substrat spaltet av FXa brukes til å bestemme FXa-nivået, mens en standardkurve generert med en relipidert rekombinant TF brukes til bestemmelse av TF-konsentrasjonen. Denne interne EVTF-aktivitetsanalysen har høyere sensitivitet og spesifisitet enn en kommersiell TF-aktivitetsanalyse.
Introduction
Blodkoagulasjon initieres med binding av faktor (F) VII/VIIa til vevsfaktor (TF)1. TF/FVIIa-komplekset aktiverer både FIX og FX for å aktivere blodkoagulasjon1. Det finnes to former for full lengde, membranbundet TF: kryptert og aktiv. I tillegg er det en alternativt spleiset form av TF (asTF). Sfingomyelin og fosfatidylkolin i den ytre brosjyren av cellemembranen opprettholder TF i kryptert tilstand 2,3,4. Når celler aktiveres eller skades, overfører fosfolipid scramblase fosfatidylserin og andre negativt ladede fosfolipider til den ytre brosjyren1. Aktivering av celler resulterer også i translokasjon av syre sfingomyelinase til det ytre pakningsvedlegget hvor det nedbryter sfingomyelin til ceramid5. Disse to mekanismene konverterer kryptert TF til den aktive formen. Det foreslås også at proteindisulfid isomerase medierer disulfidbindingsdannelse mellom Cys186 og Cys209 i kryptert TF, noe som resulterer i dekryptering av TF 6,7,8. asTF er også tilstede i sirkulasjonen, men mangler transmembrandomenet og er derfor løselig 9,10. Det er viktig at asTF har svært lave nivåer av prokoagulant aktivitet sammenlignet med full lengde aktiv TF 10,11.
Ekstracellulære vesikler (EV) frigjøres fra hvilende, aktiverte og døende vertsceller, samt kreftceller12. Elbiler uttrykker proteiner fra foreldrecellene12. Aktive TF-bærende EVer frigjøres fra aktiverte monocytter, endotelceller og tumorceller i sirkulasjonen 13,14,15. Nivåer av TF i plasma kan måles ved aktivitets- og antigenbaserte analyser. Antigenbaserte analyser inkluderer ELISA og flowcytometri16. Det er to forskjellige aktivitetsbaserte analyser: ett- og to-trinns TF-aktivitetsanalyser. Ett-trinns analysen er basert på en plasmabasert koagulasjonsanalyse. Den TF-holdige prøven tilsettes plasma og tiden for å danne en blodpropp måles etter rekalsifisering. To-trinns analysen måler FXa-generering av prøver ved å legge til FVII eller FVIIa, FX og kalsium. FXa-nivåer bestemmes ved hjelp av et substrat som spaltes av FXa.
I både en- og to-trinns TF-aktivitetsanalyser bestemmes TF-konsentrasjonen ved hjelp av en standardkurve generert med rekombinant TF. To-trinns analyser har høyere sensitivitet og spesifisitet enn ett-trinns analysen. Mange studier har bekreftet at aktivitetsbaserte analyser har høyere sensitivitet og spesifisitet enn antigenbaserte analyser 17,18,19,20,21. I tillegg har vår interne aktivitetsanalyse høyere sensitivitet og spesifisitet enn en kommersiell aktivitetsanalyse22. Friske individer har svært lave eller udetekterbare nivåer av EVTF-aktivitet i plasma. I motsetning til dette har personer med patologiske tilstander, som kreft, skrumplever, sepsis og virusinfeksjon, påviselige nivåer av EVTF-aktivitet, og dette er forbundet med trombose, spredt intravaskulær koagulasjon, sykdommens alvorlighetsgrad og dødelighet 23,24,25,26,27,28. Her vil vi beskrive denne interne to-trinns EVTF-aktivitetsanalysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forskningen ble godkjent av Institutional Review Board ved University of North Carolina i Chapel Hill (protokollnummer: 14-2108).
1. Blodinnsamling fra givere
- Samle fullblod ved hjelp av ren venepunktur i antecubital vene med en 21 G nål. Kast de første 3 ml blod fordi denne delen av blodet kan inneholde TF fra perivaskulære celler.
- Trekk 2,7 eller 1,8 ml (avhengig av størrelsen på rørene) blod inn i en vakanse som inneholder 3,2 % natriumsitrat (0,109 mol/l). Ikke over- eller underfyll rørene. Snu forsiktig rørene umiddelbart etter blodoppsamling for å spre natriumcitratet.
- Unngå omrøring hvis rørene transporteres før behandling. Klargjør plasma innen 2 timer etter blodoppsamling.
2. Fremstilling av negativt kontrollplasma
MERK: Prøver skal ikke legges på is på noe tidspunkt før den endelige frysingen.
- Forbered negativt kontrollplasma ved bruk av fullblod fra friske frivillige. Umiddelbart etter blodoppsamling, lag blodplatefritt plasma som følger.
- Overfør blodprøver fra vakanserørene til 15 ml rør.
- Sentrifuge blodprøver ved 2 500 × g i 15 minutter ved romtemperatur (20-24 °C) uten brems.
- Overfør supernatanten (blodplatefattig plasma) til et nytt rør og gjenta sentrifugeringen under de samme forholdene.
- Overfør supernatanten (blodplateutarmet plasma) til en ny tube.
- Aliquot prøven i ≥100 μL alikoter. La det være ca. 100 μL i bunnen av røret.
- Det blodplateutarmede plasmaet fryses umiddelbart ved −80 °C (figur 1).
3. Fremstilling av positivt kontrollplasma
MERK: Respons på lipopolysakkarid er variabel mellom individer.
- Overfør blodprøver fra vakanerne til 15 ml rør.
- Tilbered positivt kontrollplasma ved bruk av fullblod fra friske frivillige stimulert med lipopolysakkarid (LPS) fra Escherichia coli O111:B4 (10 μg/ml) i 5 timer ved 37 °C ved agitasjon.
- Etter 5 timers inkubasjon, følg trinnene 2.1.2 til 2.1.6.
4. Isolering av ekstracellulære vesikler fra plasma
MERK: EV-pellets er kanskje ikke synlige. Avrimingstiden er avhengig av prøvevolum, men vi tiner vanligvis 100 μL plasma i 30 minutter ved 37 °C.
- Tin plasmaprøver ved 37 °C.
- Tilsett 1 ml HBSA uten kalsium [HBSA-Ca(-)] buffer [137 mM NaCl, 5,38 mM KCl, 5,55 mM glukose, 10 mM HEPES, 0,1 % (w/v) bovint serumalbumin] til hver 100 μL plasmaprøve i et 1,5 ml rør.
- Sentrifugeplasmaprøver ved 20 000 × g i 15 minutter ved 4 °C.
- Aspirer supernatanten ned til 20 μL uten å forstyrre EV-pelleten.
- Rekonstituer EV-pelleten ved å tilsette 1 ml HBSA-Ca(-)-buffer til hvert rør, pipette opp og ned på stedet for EV-pelleten, og virvle hvert rør før sentrifugering for andre gang ved 20 000 × g i 15 minutter ved 4 °C.
- Aspirer supernatanten ned til 20 μL uten å forstyrre EV-pelleten.
- Rekonstituer EV-pelleten i 80 μL HBSA-Ca(-) og pipette opp og ned på stedet for EV-pelleten (figur 2).
5. Alternativ: Isolering av små ekstracellulære vesikler ved bruk av ultrasentrifuge
- Etter trinn 4.3, samle supernatanten og ultrasentrifugen ved 100 000 × g i 70 minutter ved 4 °C.
- Aspirer supernatanten ned til 20 μL uten å forstyrre EV-pelleten.
- Rekonstituer EV-pelleten ved å tilsette 1 ml HBSA-Ca(-)-buffer til hvert rør og virvel hvert rør før ultrasentrifugering for andre gang ved 100 000 × g i 70 minutter ved 4 °C.
- Aspirer supernatanten ned til 20 μL uten å forstyrre EV-pelleten.
- Rekonstituer EV-pelleten i 80 μL HBSA-Ca(-).
6. Måling av ekstracellulær vesikkelvevsfaktoraktivitet
MERK: EV-prøver bør pipetteres og vortexes godt for å blande før de legges til brønner. EDTA-dinatrium vil hemme FXas evne til å spalte det kromogene substratet. EDTA-dinatrium kan derfor ikke brukes som erstatning for EDTA-tetranatrium i trinn 6.7.
- Legg til 40 μL av en EV-prøve til to brønner på en 96-brønnsplate.
- Legg til 11 μL av en hemmende anti-human TF IgG fra mus [(36,4 μg / ml, endelig konsentrasjon 7,8 μg / ml)] til en brønn i en EV-prøve og 11 μL kontrollmus IgG [(36,4 μg / ml, endelig konsentrasjon 7,8 μg / ml)] til den andre brønnen.
- Inkuber platen med 96 brønner i 15 minutter ved romtemperatur.
- I løpet av inkubasjonstiden, lag 50 μL / brønn av TF-standarder (0, 0,32, 0,63, 1,25, 2,5, 5, 10 og 20 pg / ml) i duplikat ved bruk av relipidert rekombinant TF.
- Forbered faktorblanding ved å blande 4 ml HBSA med kalsium [HBSA-Ca(+)] [HBSA-Ca(-) + 10 mM CaCl2, endelig konsentrasjon 10 mM], 800 μL 900 nM FX i HBSA-Ca(+) (endelig konsentrasjon: 146,4 nM) og 120 μL 200 nM FVIIa i HBSA-CA(+) (endelig konsentrasjon: 4,8 nM).
- Tilsett 50 μL av faktorblandingsløsningen til hver brønn, dekk platen med film og inkuber i 2 timer i en inkubator ved 37 °C.
- Etter 2 timer, stopp FXa generasjon ved å tilsette 25 μL HBSA etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) buffer [HBSA-Ca (-) + 25 mM EDTA-tetranatrium, endelig konsentrasjon 5 mM] og inkuber i 5 minutter ved romtemperatur.
- Rekonstituer det kromogene substratet som spaltes av FXa til 4 mM (tilsett 8,7 ml destillert vann til et 25 mg hetteglass).
- Tilsett 25 μL av den kromogene substratløsningen til hver brønn, dekk platen med film og deretter med aluminiumsfolie for å beskytte den mot lys, og inkuber i 15 minutter ved 37 °C.
- Etter 15 min inkubasjon, fjern bobler med en nål eller ved sentrifugering ved 1.500 × g i 1 min.
- Les platen på 405 nm ved hjelp av en plateleser med en blanding før du leser.
- Konverter FXa-generasjonen av hver brønn til TF-aktivitet ved hjelp av standardkurven generert ved bruk av relipidert rekombinant TF.
- Beregn TF-avhengig FXa-generering (EVTF-aktivitet) ved hjelp av ligning (1):
TF-avhengig FXa-generasjon (EVTF-aktivitet [pg/ml]) = Total FXa-generasjon (kontroll-IgG-brønn) - TF-uavhengig FXa-generasjon (anti-TF IgG-brønn) (figur 3) (1)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et vellykket resultat gir en positiv kontrollverdi på ≥0,5 pg/ml og en negativ kontrollverdi på <0,5 pg/ml. Det er best å finne en høy LPS-responder med >1,0 pg / ml EVTF-aktivitet for en positiv kontroll. Det representative resultatet viser EVTF-aktiviteten til elbiler isolert fra plasma fra fullblod hos 11 friske donorer, med og uten LPS-aktivering (figur 4). Seks av elleve donorer (Donorer 2, 4, 5, 8, 10, 11) var middels til høye LPS-respondere, mens fem av elleve donorer (Donorer 1, 3, 6, 7, 9) var LPS-respondere.
Figur 1 Tilberedning av blodplatefattig plasma. Figuren ble modifisert fra Hisada og Mackman29. Forkortelse: PDP = blodplateutarmet plasma. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Isolering av ekstracellulære vesikler fra trombocyttutarmet plasma. Figuren ble modifisert fra Hisada og Mackman29. Forkortelser: PDP = blodplateutarmet plasma; EV = ekstracellulære vesikler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Måling av ekstracellulær vesikkelvevsfaktoraktivitet. Figuren ble modifisert fra Hisada og Mackman29. Forkortelser: TF = vevsfaktor; EV = ekstracellulære vesikler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: EVTF-aktivitet av plasma fra fullblod hos 11 friske givere, med og uten LPS-aktivering. LPS-aktivering ble utført under samme betingelse som positiv kontroll. Den positive kontrollen var fra en kjent LPS-responder, mens responsen på LPS fra 11 friske donorer ikke var kjent på tidspunktet for forsøket. Hvite og svarte striper indikerer henholdsvis med og uten LPS-aktivering. Forkortelser: EVTF = ekstracellulær vesikkelvevsfaktor; LPS = lipopolysakkarid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Et sammendrag av studiene som sammenlignet denne interne EVTF-aktivitetsanalysen, en kommersiell TF ELISA og en aktivitetsanalyse. Forkortelser: EVTF = ekstracellulær vesikkelvevsfaktor; ELISA = enzymbundet immunosorbentanalyse. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her presenteres protokollen for vår interne EVTF-aktivitetsanalyse. Det er tre kritiske trinn i protokollen. Ved rekonstituering av EV-pelleten er det viktig å pipette opp og ned på stedet for EV-pelleten selv om den ikke er synlig. Ufullstendig rekonstituering av EV-pelleten vil resultere i en falsk negativ eller underestimering av EVTF-aktivitetsverdiene til prøvene. For det andre er bruk av HBSA-Ca(+) kritisk i protokolltrinn 6.5 fordi FXa-generasjon ikke kan genereres uten kalsium. For det tredje er bruk av EDTA-tetranatrium, men ikke EDTA-dinatrium for å stoppe FXa-generasjonen, kritisk fordi sistnevnte hemmer FXas evne til å spalte det kromogene substratet.
Vi anbefaler følgende lagrings- og bruksmetode for hvert reagens. Vi oppbevarer analysebuffere og det rekonstituerte substratet ved 4 °C og bruker dem gjentatte ganger til vi går tom for dem. Hvis vi ikke går tom for underlaget innen 2-3 uker, kaster vi det fordi det blir gult. Vi lagrer rekombinant TF, antistoffer, FVIIa og FX ved -80 °C og anbefaler å lage alikoter for en analyse for å unngå en fryse-tine-syklus.
I en forstudie lot vi plasmaprøver ligge i 9 timer ved romtemperatur, frøs dem til -80 °C over natten og utførte analysen neste dag. Som kontroll tinte vi det samme plasmaet og frøs det umiddelbart. Vi fant at prøven igjen i 9 timer ved romtemperatur hadde en 16% reduksjon i EVTF-aktivitet sammenlignet med den som ble tint og frosset umiddelbart (Hisada og Mackman, upubliserte data 2017).
I tillegg til forskjellen i respons på LPS, kan forskjellen i konsentrasjonen av elbiler i plasma fra individuelle donorer forklare den forskjellige EVTF-aktiviteten til forskjellige givere. Faktisk observerte vi noen variasjoner i konsentrasjonen av elbiler i plasma fra LPS-stimulert fullblod (1,9 ± 0,6 × 1010 partikler/ml, n = 6, gjennomsnittlig ± standardavvik)30.
Denne interne EVTF-aktivitetsanalysen har flere funksjoner som kommersielle analyser ikke har. For det første bruker analysen et anti-TF-antistoff for å skille TF-avhengig FXa-generasjon fra TF-uavhengig FXa-generasjon. Tre kommersielle aktivitetsanalyser hevdes å måle TF-aktivitet i plasma, men ingen av dem bruker anti-TF-antistoffer16. Derfor måler disse kommersielle analysene bare total FXa-generasjon, men ikke TF-avhengig FXa-generasjon. For det andre bruker vi 2,4 nM FVIIa (den endelige konsentrasjonen i reaksjonen) for å minimere TF-uavhengig FXa-generering av FVIIa. En kommersiell aktivitetsanalyse bruker 12 nM FVIIa i reaksjonen, noe som gir en høy bakgrunn22. Faktisk aktiverer FVIIa FX lineært avhengig av FVIIa-konsentrasjon i fravær av TF31. Vi oppsummerte studiene som sammenlignet denne interne EVTF-aktivitetsanalysen og kommersiell TF ELISA og en aktivitetsanalyse i tabell 1.
Fire responsklassifikasjoner av EVTF-aktivitet for citrert blodplatefattig plasma er foreslått: null (0 til <0,5 pg / ml); svak (0,5 til <1,0 pg/ml), moderat (1,0 til <2,0 pg/ml) og sterk (≥2,0 pg/ml)23. Spesielt påvirker forskjellige antikoagulantia resultatene av EVTF-aktivitetsanalyser. For eksempel ble høyere nivåer av EVTF-aktivitet observert ved bruk av heparin etter LPS-stimulering sammenlignet med natriumsitrat (Donor A: 4.6 (citrat) vs 28.6 (heparin) pg / ml og Donor B: 3.4 (citrat) vs 26.0 (heparin) pg / ml, henholdsvis Hisada og Mackman upubliserte data 2017). I kontrast ble lavere nivåer av EVTF-aktivitet observert ved bruk av EDTA etter LPS-stimulering sammenlignet med natriumsitrat (Donor C: 3,9 (citrat) vs 1,4 (EDTA) pg / ml, Donor D: 3,8 (citrat) vs 0,4 (EDTA) pg / ml, henholdsvis Tatsumi og Mackman upubliserte data 2016). Disse resultatene indikerer at EVTF-aktivitetsdata ikke er sammenlignbare når forskjellige antikoagulantia brukes.
Det er noen begrensninger i metoden. Variasjonskoeffisienten (CV) er relativt høy sammenlignet med kliniske analyser. Faktisk var CV for positiv kontroll i syv uavhengige studier 24%17,29. Isolering av elbiler ved hjelp av sentrifugeringspellets, ikke bare elbiler, men også celleavfall. Vi har tidligere analysert pelleten av blodplaterikt plasma ved transmisjonselektronmikroskopi og observert blodplater, EV og cellulært rusk32. Vi bruker en rotor med fast vinkel og har ikke opplevd en utsvingbar rotor på 20 000 × g sentrifugering. Vi fant nylig ut at små elbiler som kan pelleteres med 100 000 × g, men ikke med 20 000 × g, har EVTF-aktivitet hos pasienter med kreft i bukspyttkjertelen og COVID-1930. Dette indikerer at denne protokollen ikke måler EVTF-aktivitet fra små EV-er, for eksempel eksosomer. Spesielt er eksosomer sfingomyelinrike EVer, og tilstedeværelsen av TF-bærende eksosomer er rapportert 30,33,34,35. Vi anbefaler pelletering av EV i plasma ved bruk av 100 000 × g for mer nøyaktig å bestemme den totale mengden EVTF-aktivitet i prøven. Merk at det krever en ultrasentrifuge og en lengre analysetid fordi sentrifugeringstiden øker fra 15 min til 70 min.
Denne metoden kan brukes på plasmaprøver fra enhver form for sykdom. EVTF-aktivitet er assosiert med sykdommens alvorlighetsgrad og overlevelse hos pasienter med forskjellige sykdommer, inkludert kreft, COVID-19, bakteriell infeksjon og skrumplever 23,26,27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det er ingen konkurrerende interesser å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH NHLBI R35HL155657 (N.M.) og John C. Parker professorship (N.M.). Vi vil gjerne takke Sierra J. Archibald for hennes nyttige kommentarer
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tube for 20,000 x g centrifuge | any company | N/A | We use the one from Fisher Scientific (Catalog number: 05-408-129). |
| 1.5 mL tube for ultracentrifuge | any company | N/A | We use the one from Beckman Coulter (Catalog number: 357448) |
| 15 mL tube | any company | N/A | We use the one from VWR (Catalog number: 89039-666) |
| 21 G x .75 in. BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set with 12 in. tubing and luer adapter | BD | 367281 | |
| 96-well plate | any company | N/A | We use the one from Globe Scientific (Catalog number: 120338). |
| BD Vacutainer Citrate Tubes | BD | 363083 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C69-500 | |
| Centrifuge for 1.5 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5417R (Eppendorf). |
| Centrifuge for 15 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5810R (Eppendorf). |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate | Sigma Aldrich | E6511 | |
| Hepes | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Human FVIIa | Enzyme Research Laboratory | HFVIIa | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
| Human FX | Enzyme Research Laboratory | HFX1010 | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
| Inhibitory mouse anti-human tissue factor IgG, clone HTF-1 | Fisher Scientific | 550252 | |
| Lipopolysaccharide from Escherichia coli O111:B4 | Sigma Aldrich | L2630 | There are several lipopolysaccharide from different E. coli. Different lipopolysaccharide have different potential to activate monocytes. |
| Mouse IgG | Sigma Aldrich | I5381 | |
| Pefachrome FXa 8595 | Enzyme Research Laboratory | 085-27 | |
| Plate reader | any company | N/A | We use the SpectraMax i3x from Molecular Devices |
| Re-lipidated recombinant tissue factor, Dade Innovin | Siemens | 10873566 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima TLX | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | TLA-55 |
References
- Grover, S. P., Mackman, N. Tissue factor: an essential mediator of hemostasis and trigger of thrombosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (4), 709-725 (2018).
- Shaw, A. W., Pureza, V. S., Sligar, S. G., Morrissey, J. H. The local phospholipid environment modulates the activation of blood clotting. Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6556-6563 (2007).
- Tavoosi, N., et al. Molecular determinants of phospholipid synergy in blood clotting. Journal of Biological Chemistry. 286 (26), 23247-23253 (2011).
- Wang, J., Pendurthi, U. R., Rao, L. V. M. Sphingomyelin encrypts tissue factor: ATP-induced activation of A-SMase leads to tissue factor decryption and microvesicle shedding. Blood Advances. 1 (13), 849-862 (2017).
- Kornhuber, J., Rhein, C., Muller, C. P., Muhle, C. Secretory sphingomyelinase in health and disease. Biological Chemistry. 396 (6-7), 707-736 (2015).
- Versteeg, H. H., Ruf, W. Tissue factor coagulant function is enhanced by protein-disulfide isomerase independent of oxidoreductase activity. Journal of Biological Chemistry. 282 (35), 25416-25424 (2007).
- Reinhardt, C., et al. Protein disulfide isomerase acts as an injury response signal that enhances fibrin generation via tissue factor activation. Journal of Clinical Investigation. 118 (3), 1110-1122 (2008).
- Langer, F., et al. Rapid activation of monocyte tissue factor by antithymocyte globulin is dependent on complement and protein disulfide isomerase. Blood. 121 (12), 2324-2335 (2013).
- Bogdanov, V. Y., et al. Alternatively spliced human tissue factor: a circulating, soluble, thrombogenic protein. Nature Medicine. 9 (4), 458-462 (2003).
- Mackman, N. Alternatively spliced tissue factor - one cut too many. Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 5-8 (2007).
- Censarek, P., Bobbe, A., Grandoch, M., Schror, K., Weber, A. A. Alternatively spliced human tissue factor (asHTF) is not pro-coagulant. Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 11-14 (2007).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Osterud, B., Bjorklid, E. Tissue factor in blood cells and endothelial cells. Frontiers in Bioscience (Elite Edition). 4 (1), 289-299 (2012).
- Hisada, Y., Mackman, N. Cancer cell-derived tissue factor-positive extracellular vesicles: biomarkers of thrombosis and survival. Current Opinion in Hematology. 26 (5), 349-356 (2019).
- Vatsyayan, R., Kothari, H., Pendurthi, U. R., Rao, L. V. 4-Hydroxy-2-nonenal enhances tissue factor activity in human monocytic cells via p38 mitogen-activated protein kinase activation-dependent phosphatidylserine exposure. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (7), 1601-1611 (2013).
- Mackman, N., Sachetto, A. T. A., Hisada, Y. Measurement of tissue factor-positive extracellular vesicles in plasma: strengths and weaknesses of current methods. Current Opinion in Hematology. 29 (5), 266-274 (2022).
- Lee, R. D., et al. Pre-analytical and analytical variables affecting the measurement of plasma-derived microparticle tissue factor activity. Thrombosis Research. 129 (1), 80-85 (2012).
- Claussen, C., et al. Microvesicle-associated tissue factor procoagulant activity for the preoperative diagnosis of ovarian cancer. Thrombosis Research. 141, 39-48 (2016).
- Mackman, N., Hisada, Y., Archibald, S. J., et al. Tissue factor and its procoagulant activity on cancer-associated thromboembolism in pancreatic cancer: Comment by Mackman et al. Cancer Science. 113 (5), 1885-1887 (2022).
- Sachetto, A. T. A., et al. Evaluation of four commercial ELISAs to measure tissue factor in human plasma. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 7 (3), 100133 (2023).
- Archibald, S. J., Hisada, Y., Bae-Jump, V. L., Mackman, N. Evaluation of a new bead-based assay to measure levels of human tissue factor antigen in extracellular vesicles in plasma. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 6 (2), e12677 (2022).
- Tatsumi, K., et al. Evaluation of a new commercial assay to measure microparticle tissue factor activity in plasma: communication from the SSC of the ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (11), 1932-1934 (2014).
- Hisada, Y., et al. Measurement of microparticle tissue factor activity in clinical samples: A summary of two tissue factor-dependent FXa generation assays. Thrombosis Research. 139, 90-97 (2016).
- Tatsumi, K., Hisada, Y., Connolly, A. F., Buranda, T., Mackman, N. Patients with severe orthohantavirus cardiopulmonary syndrome due to Sin Nombre Virus infection have increased circulating extracellular vesicle tissue factor and an activated coagulation system. Thrombosis Research. 179, 31-33 (2019).
- Schmedes, C. M., et al. Circulating Extracellular Vesicle Tissue Factor Activity During Orthohantavirus Infection Is Associated With Intravascular Coagulation. Journal of Infectious Diseases. 222 (8), 1392-1399 (2020).
- Rosell, A., et al. Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-Brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).
- Campbell, R. A., et al. Comparison of the coagulopathies associated with COVID-19 and sepsis. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 5 (4), e12525 (2021).
- Guervilly, C., et al. Dissemination of extreme levels of extracellular vesicles: tissue factor activity in patients with severe COVID-19. Blood Advances. 5 (3), 628-634 (2021).
- Hisada, Y., Mackman, N. Measurement of tissue factor activity in extracellular vesicles from human plasma samples. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 3 (1), 44-48 (2019).
- Sachetto, A. T. A., et al. Tissue factor activity of small and large extracellular vesicles in different diseases. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 7 (3), 100124 (2023).
- Bom, V. J., Bertina, R. M. The contributions of Ca2+, phospholipids and tissue-factor apoprotein to the activation of human blood-coagulation factor X by activated factor VII. Biochemical Journal. 265 (2), 327-336 (1990).
- Tilley, R. E., Holscher, T., Belani, R., Nieva, J., Mackman, N. Tissue factor activity is increased in a combined platelet and microparticle sample from cancer patients. Thrombosis Research. 122 (5), 604-609 (2008).
- Gurung, S., Perocheau, D., Touramanidou, L., Baruteau, J. The exosome journey: from biogenesis to uptake and intracellular signalling. Cell Communication and Signaling. 19 (1), 47 (2021).
- Garnier, D., et al. Cancer cells induced to express mesenchymal phenotype release exosome-like extracellular vesicles carrying tissue factor. Journal of Biological Chemistry. 287 (52), 43565-43572 (2012).
- Park, J. A., et al. Tissue factor-bearing exosome secretion from human mechanically stimulated bronchial epithelial cells in vitro and in vivo. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 130 (6), 1375-1383 (2012).
