Summary
Здесь мы опишем собственный анализ активности фактора внеклеточной везикулярной ткани. Анализы, основанные на активности, и анализы на основе антигенов были использованы для измерения тканевого фактора во внеклеточных везикулах из образцов плазмы крови человека. Анализы, основанные на активности, имеют более высокую чувствительность и специфичность, чем анализы на основе антигенов.
Abstract
Тканевый фактор (ТФ) является трансмембранным рецептором для факторов (F) VII и FVIIa. Комплекс TF/FVIIa инициирует коагуляционный каскад, активируя как FIX, так и FX. ТФ высвобождается из клеток в кровоток в виде внеклеточных везикул (ВВ). Уровень ТФ-положительных (+) ВВ повышен при различных заболеваниях, включая онкологические, бактериальные и вирусные инфекции, цирроз печени, и связан с тромбозом, диссеминированным внутрисосудистым свертыванием, тяжестью заболевания и летальностью. Существует два способа измерения ТФ+ ВВ в плазме: анализ на основе антигена и анализ на основе активности. Данные свидетельствуют о том, что анализы, основанные на активности, обладают более высокой чувствительностью и специфичностью, чем анализы на основе антигенов. В этом документе описывается наш собственный анализ активности EVTF, основанный на двухступенчатом анализе генерации FXa. FVIIa, FX и кальций добавляют к образцам, содержащим ТФ+ EV, для генерации FXa в присутствии и отсутствии антител к ТФ, чтобы отличить ТФ-зависимую генерацию FXa от TF-независимой генерации FXa. Для определения уровня FXa используется хромогенный субстрат, расщепленный FXa, в то время как стандартная кривая, сгенерированная с помощью релипированного рекомбинантного TF, используется для определения концентрации TF. Этот собственный анализ активности ЭВТФ обладает более высокой чувствительностью и специфичностью, чем коммерческий анализ активности ТФ.
Introduction
Свертывание крови начинается со связывания фактора (F) VII/VIIa с тканевым фактором (TF)1. Комплекс TF/FVIIa активирует как FIX, так и FX для активации свертывания крови1. Существует две формы полноразмерного мембранного ТФ: зашифрованный и активный. Кроме того, существует альтернативно сплайсированная форма ТФ (asTF). Сфингомиелин и фосфатидилхолин в наружной створке клеточной мембраны поддерживают ТФ в зашифрованном состоянии 2,3,4. Когда клетки активируются или повреждаются, фосфолипидная скрамблаза переносит фосфатидилсерин и другие отрицательно заряженные фосфолипиды на внешнюю створку1. Активация клеток также приводит к транслокации кислой сфингомиелиназы на внешнюю створку, где она разлагает сфингомиелин до церамида5. Эти два механизма преобразуют зашифрованный TF в активную форму. Также предполагается, что белковая дисульфидизомераза опосредует образование дисульфидных связей между Cys186 и Cys209 в зашифрованном ТФ, что приводит к расшифровке ТФ 6,7,8. asTF также присутствует в кровотоке, но у него отсутствует трансмембранный домен, и поэтому он растворим 9,10. Важно отметить, что asTF имеет очень низкий уровень прокоагулянтной активности по сравнению с полноразмерным активным TF10,11.
Внеклеточные везикулы (ВВ) высвобождаются из покоящихся, активированных и умирающих клеток хозяина, а также из раковых клеток12. ВВ экспрессируют белки из родительских клеток12. Активные ТФ-содержащие ВВ высвобождаются из активированных моноцитов, эндотелиальных клеток и опухолевых клеток в кровоток 13,14,15. Уровни ТФ в плазме могут быть измерены с помощью анализов активности и антигенов. Анализы на основе антигенов включают ИФА и проточную цитометрию16. Существует два различных анализа активности: одноэтапный и двухэтапный анализ активности ТФ. Одноэтапный анализ основан на анализе свертывания крови на основе плазмы. Образец, содержащий ТФ, добавляют в плазму и измеряют время образования сгустка после повторной кальцификации. Двухступенчатый анализ измеряет генерацию образцов FXa путем добавления FVII или FVIIa, FX и кальция. Уровни FXa определяются с помощью субстрата, который расщепляется FXa.
Как в одностадийном, так и в двухступенчатом анализе активности ТФ концентрация ТФ определяется с помощью стандартной кривой, полученной с помощью рекомбинантного ТФ. Двухэтапные анализы обладают более высокой чувствительностью и специфичностью, чем одностадийные. Многие исследования подтвердили, что анализы, основанные на активности, имеют более высокую чувствительность и специфичность, чем анализы на основе антигенов 17,18,19,20,21. Кроме того, наш собственный анализ активности имеет более высокую чувствительность и специфичность, чем анализ коммерческой деятельности22. Здоровые люди имеют очень низкие или неопределяемые уровни активности ЭВТФ в плазме. Напротив, лица с патологическими состояниями, такими как рак, цирроз печени, сепсис и вирусная инфекция, имеют обнаруживаемые уровни активности ЭВТФ, и это связано с тромбозом, диссеминированным внутрисосудистым свертыванием, тяжестью заболевания и смертностью 23,24,25,26,27,28. В этой статье мы опишем этот собственный двухступенчатый анализ активности EVTF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Исследование было одобрено Институциональным наблюдательным советом Университета Северной Каролины в Чапел-Хилл (номер протокола: 14-2108).
1. Забор крови у доноров
- Соберите цельную кровь с помощью чистой венепункции в локтевую вену иглой 21 G. Первые 3 мл крови выбросить, так как эта порция крови может содержать ТФ из периваскулярных клеток.
- Наберите 2,7 или 1,8 мл (в зависимости от размера пробирок) крови в вакутейнер, содержащий 3,2% цитрата натрия (0,109 моль/л). Не переполняйте или недополняйте трубки. Осторожно переверните пробирки сразу после забора крови, чтобы диспергировать цитрат натрия.
- Избегайте перемешивания, если пробирки транспортируются перед обработкой. Плазму готовят в течение 2 ч после забора крови.
2. Подготовка плазмы отрицательного контроля
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы не должны быть помещены на лед в любое время до окончательного замораживания.
- Приготовьте отрицательную контрольную плазму, используя цельную кровь здоровых добровольцев. Сразу после забора крови подготовьте безтромбоцитарную плазму следующим образом.
- Переложите образцы крови из пробирок вакутейнера в пробирки объемом 15 мл.
- Центрифугируют образцы крови при 2 500 × г в течение 15 мин при комнатной температуре (20-24 °C) без тормоза.
- Перенесите надосадочную жидкость (бедную тромбоцитами плазму) в новую пробирку и повторите отжим в тех же условиях.
- Перенесите надосадочную жидкость (плазму, обедненную тромбоцитами) в новую пробирку.
- Раздробьте образец на ≥100 мкл аликвоты. Оставьте примерно 100 мкл на дне пробирки.
- Немедленно замораживают плазму, обедненную тромбоцитами, при температуре −80 °C (рис. 1).
3. Подготовка плазмы положительного контроля
ПРИМЕЧАНИЕ: Реакция на липополисахарид варьируется у разных людей.
- Переложите образцы крови из вакутейнеров в пробирки объемом 15 мл.
- Приготовьте положительную контрольную плазму с использованием цельной крови здоровых добровольцев, стимулированной липополисахаридом (ЛПС) из Escherichia coli O111:B4 (10 мкг/мл) в течение 5 ч при 37 °C с перемешиванием.
- После 5 ч инкубации выполните шаги 2.1.2 - 2.1.6.
4. Выделение внеклеточных везикул из плазмы
ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулы EV могут быть не видны. Время размораживания зависит от объема образца, но обычно мы размораживаем плазму объемом 100 мкл в течение 30 минут при температуре 37 °C.
- Размораживайте образцы плазмы при 37 °C.
- Добавьте 1 мл HBSA без буфера кальция [HBSA-Ca(-)] [137 мМ NaCl, 5,38 мМ KCl, 5,55 мМ глюкозы, 10 мМ HEPES, 0,1% (w/v) бычьего сывороточного альбумина] к каждые 100 мкл образца плазмы в пробирке объемом 1,5 мл.
- Центрифужные образцы плазмы при 20 000 × g в течение 15 мин при 4 °C.
- Отсасывайте надосадочную жидкость до 20 мкл, не повреждая гранулу EV.
- Восстановите гранулу EV, добавив 1 мл буфера HBSA-Ca(-) в каждую пробирку, пипетку вверх и вниз в месте расположения гранулы EV и встряхните каждую пробирку перед повторным центрифугированием при 20 000 × г в течение 15 минут при 4 °C.
- Отсасывайте надосадочную жидкость до 20 мкл, не повреждая гранулу EV.
- Восстановите гранулу EV в 80 мкл HBSA-Ca(-) и пипетку вверх и вниз в месте расположения гранулы EV (рис. 2).
5. Вариант: Выделение мелких внеклеточных везикул с помощью ультрацентрифуги
- После шага 4.3 соберите надосадочную жидкость и ультрацентрифугу при 100 000 × г в течение 70 мин при 4 °C.
- Отсасывайте надосадочную жидкость до 20 мкл, не повреждая гранулу EV.
- Восстановите гранулу EV, добавив 1 мл буфера HBSA-Ca(-) в каждую пробирку и встряхните каждую пробирку перед повторным ультрацентрифугированием при 100 000 × г в течение 70 минут при 4 °C.
- Отсасывайте надосадочную жидкость до 20 мкл, не повреждая гранулу EV.
- Восстановите гранулу EV в 80 мкл HBSA-Ca(-).
6. Измерение активности фактора внеклеточной везикулярной ткани
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы EV должны быть пипетированы и хорошо перемешаны перед добавлением в лунки. ЭДТА-динатрий ингибирует способность FXa расщеплять хромогенный субстрат. Таким образом, ЭДТА-динатрий не может быть использован в качестве замены ЭДТА-тетранатрия на стадии 6.7.
- Добавьте 40 мкл образца EV в две лунки 96-луночного планшета.
- Добавьте 11 мкл ингибирующего мышиного античеловеческого TF IgG [(36,4 мкг/мл, конечная концентрация 7,8 мкг/мл)] в одну лунку образца EV и 11 мкл контрольного мышиного IgG [(36,4 мкг/мл, конечная концентрация 7,8 мкг/мл)] в другую лунку.
- Инкубируйте 96-луночную планшет в течение 15 минут при комнатной температуре.
- В течение инкубационного периода готовят 50 мкл/лунку стандартов ТФ (0, 0,32, 0,63, 1,25, 2,5, 5, 10 и 20 пг/мл) в двух экземплярах, используя релипированный рекомбинантный ТФ.
- Приготовьте факторную смесь, смешав 4 мл HBSA с кальцием [HBSA-Ca(+)] [HBSA-Ca(-) + 10 мМ CaCl2, конечная концентрация 10 мМ], 800 мкл 900 нМ FX в HBSA-Ca(+) (конечная концентрация: 146,4 нМ) и 120 мкл 200 нМ FVIIa в HBSA-CA(+) (конечная концентрация: 4,8 нМ).
- В каждую лунку добавляют по 50 мкл раствора факторной смеси, накрывают планшет пленкой и инкубируют 2 ч в инкубаторе при 37 °С.
- Через 2 ч прекращают образование FXa, добавляя 25 мкл этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) [HBSA-Ca(-) + 25 мМ ЭДТА-тетранатрия, конечная концентрация 5 мМ] и инкубируют в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Восстановите хромогенный субстрат, расщепленный FXa до 4 мМ (добавьте 8,7 мл дистиллированной воды во флакон 25 мг).
- Добавьте 25 мкл раствора хромогенного субстрата в каждую лунку, накройте планшет пленкой, а затем алюминиевой фольгой, чтобы защитить его от света, и инкубируйте в течение 15 минут при 37 °C.
- После 15 мин инкубации пузырьки удаляют иглой или центрифугированием при 1 500 × г в течение 1 мин.
- Считайте пластину на длине волны 405 нм с помощью считывателя пластин с одним смешением перед считыванием.
- Преобразуйте генерацию FXa каждой скважины в активность ТФ, используя стандартную кривую, построенную с использованием релипированного рекомбинантного ТФ.
- Рассчитаем TF-зависимую генерацию FXa (активность EVTF) по уравнению (1):
TF-зависимая генерация FXa (активность EVTF [пг/мл]) = Общая генерация FXa (контрольная скважина IgG) - TF-независимая генерация FXa (анти-TF IgG-скважина) (Рисунок 3) (1)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
При успешном получении положительного контрольного значения ≥0,5 пг/мл и отрицательного контрольного значения <0,5 пг/мл. Для положительного контроля лучше всего найти ответчик с высоким ЛПС с активностью EVTF >1,0 пг/мл. Репрезентативный результат показывает активность ЭВТФ ВВ, выделенных из плазмы цельной крови 11 здоровых доноров, с активацией ЛПС и без нее (рис. 4). Шесть из одиннадцати доноров (доноры 2, 4, 5, 8, 10, 11) имели средний и высокий уровень ответа на ЛПС, в то время как пять из одиннадцати доноров (доноры 1, 3, 6, 7, 9) имели низкий ответ на ЛПС.
Рисунок 1: Подготовка плазмы, обедненной тромбоцитами. Фигура была изменена с Хисады и Макмана29. Аббревиатура: PDP = плазма, обедненная тромбоцитами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Выделение внеклеточных везикул из плазмы, обедненной тромбоцитами. Фигура была изменена с Хисады и Макмана29. Сокращения: PDP = плазма, обедненная тромбоцитами; ВВ = внеклеточные везикулы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Измерение активности фактора внеклеточных везикул ткани. Фигура была изменена с Хисады и Макмана29. Сокращения: TF = тканевый фактор; ВВ = внеклеточные везикулы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Активность ЭВТФ плазмы из цельной крови 11 здоровых доноров с активацией ЛПС и без нее. Активация ЛПС проводилась при тех же условиях, что и положительный контроль. Положительный контроль был получен от известного респондента ЛПС, в то время как реакция на ЛПС у 11 здоровых доноров на момент эксперимента не была известна. Белая и черная полосы обозначают активацию LPS и без нее соответственно. Сокращения: ЭВТФ = фактор внеклеточной везикулярной ткани; ЛПС = липополисахарид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Резюме исследований, в которых сравнивали этот внутренний анализ активности ЭВТФ, коммерческий ТФ ИФА и анализ активности. Сокращения: ЭВТФ = фактор внеклеточной везикулярной ткани; ИФА = иммуноферментный анализ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь представлен протокол нашего собственного анализа активности ЭВТФ. Протокол состоит из трех важнейших этапов. При восстановлении гранулы EV важно проводить пипеткой вверх и вниз в том месте, где находится гранула EV, даже если она не видна. Неполное восстановление гранулы EV приведет к ложноотрицательному результату или занижению значений активности EVTF образцов. Во-вторых, использование HBSA-Ca(+) имеет решающее значение на шаге 6.5 протокола, поскольку генерация FXa не может быть произведена без кальция. В-третьих, использование ЭДТА-тетранатрия, но не ЭДТА-динатрия для остановки образования FXa имеет решающее значение, поскольку последний ингибирует способность FXa расщеплять хромогенный субстрат.
Мы рекомендуем следующий способ хранения и использования для каждого реагента. Мы храним пробирные буферы и восстановленный субстрат при температуре 4 °C и используем их до тех пор, пока они не закончатся. Если субстрат не закончится в течение 2-3 недель, мы его выбрасываем, потому что он желтеет. Мы храним рекомбинантные ТФ, антитела, FVIIa и FX при -80 °C и рекомендуем делать аликвоты для одного анализа, чтобы избежать цикла замораживания-оттаивания.
В предварительном исследовании мы оставляли образцы плазмы на 9 ч при комнатной температуре, замораживали их при -80 °C на ночь и проводили анализ на следующий день. В качестве контроля мы размораживали ту же плазму и сразу же замораживали ее. Мы обнаружили, что образец, оставленный на 9 ч при комнатной температуре, имел снижение активности EVTF на 16% по сравнению с тем, который был немедленно разморожен и повторно заморожен (Hisada and Mackman, неопубликованные данные 2017 г.).
В дополнение к разнице в ответе на ЛПС, разница в концентрации ВВ в плазме крови от отдельных доноров может объяснить различную активность ЭВТФ у разных доноров. Действительно, мы наблюдали некоторые вариации концентраций ВВ в плазме цельной крови, стимулированной ЛПС (1,9 ± 0,6 × 1010 частиц/мл, n = 6, среднее ± стандартное отклонение)30.
Этот собственный анализ активности EVTF имеет несколько особенностей, которых нет у коммерческих анализов. Во-первых, в анализе используется антитело к ТФ, чтобы отличить ТФ-зависимую генерацию FXa от TF-независимой генерации FXa. Утверждается, что для измерения активности ТФ в плазме используются три теста коммерческой активности, но ни в одном из них не используются антитела к ТФ16. Таким образом, эти коммерческие анализы просто измеряют общую генерацию FXa, но не TF-зависимую генерацию FXa. Во-вторых, мы используем 2,4 нМ FVIIa (конечная концентрация в реакции) для минимизации TF-независимой генерации FXa FVIIa. В одном анализе коммерческой деятельности в реакции используется 12 нМ FVIIa, что дает высокий фон22. Действительно, FVIIa активирует FX линейно в зависимости от концентрации FVIIa в отсутствие ТФ31. Мы обобщили исследования, в которых сравнивали этот собственный анализ активности ЭВТФ и коммерческий ИФА ТФ и анализ активности в таблице 1.
Предложены четыре классификации активности ЭВТФ для цитратной плазмы, бедной тромбоцитами: от нуля (от 0 до <0,5 пг/мл); слабая (от 0,5 до <1,0 пг/мл), умеренная (от 1,0 до <2,0 пг/мл) и сильная (≥2,0 пг/мл)23. Примечательно, что различные антикоагулянты влияют на результаты анализа активности ЭВТФ. Например, более высокие уровни активности ЭВТФ наблюдались при использовании гепарина после стимуляции ЛПС по сравнению с цитратом натрия (донор А: 4,6 (цитрат) против 28,6 (гепарин) пг/мл и донор В: 3,4 (цитрат) против 26,0 (гепарин) пг/мл соответственно, неопубликованные данные Хисады и Макмана за 2017 год). Напротив, более низкие уровни активности ЭВТФ наблюдались при использовании ЭДТА после стимуляции ЛПС по сравнению с цитратом натрия (донор C: 3,9 (цитрат) против 1,4 (ЭДТА) пг/мл, донор D: 3,8 (цитрат) против 0,4 (ЭДТА) пг/мл, соответственно, неопубликованные данные Tatsumi and Mackman 2016). Эти результаты указывают на то, что данные об активности ЭВТФ несопоставимы при использовании различных антикоагулянтов.
У метода есть несколько ограничений. Коэффициент вариации (CV) относительно высок по сравнению с клиническими анализами. Действительно, CV для положительного контроля в семи независимых исследованиях составила 24%17,29. Изоляция электромобилей с помощью центрифугирования гранул не только для электромобилей, но и для клеточного мусора. Ранее мы анализировали гранулы обогащенной тромбоцитами плазмы с помощью просвечивающей электронной микроскопии и наблюдали тромбоциты, ВВ и клеточный мусор32. Мы используем ротор с фиксированным углом наклона и не сталкивались с поворотно-откидным ротором для центрифугирования 20 000 × г. Недавно мы обнаружили, что небольшие ВВ, которые можно гранулировать со 100 000 × г, но не с 20 000 × г, обладают активностью ЭВТФ у пациентов с раком поджелудочной железы и COVID-1930. Это указывает на то, что этот протокол не измеряет активность EVTF небольших EV, таких как экзосомы. Примечательно, что экзосомы являются богатыми сфингомиелином ВВ, и сообщалось о присутствии экзосом, содержащих ТФ, 30,33,34,35. Мы рекомендуем гранулировать ВВ в плазме с использованием 100 000 × г для более точного определения общего количества активности ЭВТФ в образце. Следует отметить, что для этого требуется ультрацентрифуга и более длительное время анализа, поскольку время центрифугирования увеличивается с 15 минут до 70 минут.
Этот метод может быть применен к образцам плазмы любого вида заболевания. Активность ЭВТФ связана с тяжестью заболевания и выживаемостью у пациентов с различными заболеваниями, включая рак, COVID-19, бактериальную инфекцию и цирроз печени 23,26,27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет никаких конкурирующих интересов, которые нужно раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана R35HL155657 NIH NHLBI (Нью-Мексико) и профессором Джона С. Паркера (Нью-Мексико). Мы хотели бы поблагодарить г-жу Сьерру Арчибальд за ее полезные комментарии
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tube for 20,000 x g centrifuge | any company | N/A | We use the one from Fisher Scientific (Catalog number: 05-408-129). |
| 1.5 mL tube for ultracentrifuge | any company | N/A | We use the one from Beckman Coulter (Catalog number: 357448) |
| 15 mL tube | any company | N/A | We use the one from VWR (Catalog number: 89039-666) |
| 21 G x .75 in. BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set with 12 in. tubing and luer adapter | BD | 367281 | |
| 96-well plate | any company | N/A | We use the one from Globe Scientific (Catalog number: 120338). |
| BD Vacutainer Citrate Tubes | BD | 363083 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C69-500 | |
| Centrifuge for 1.5 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5417R (Eppendorf). |
| Centrifuge for 15 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5810R (Eppendorf). |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate | Sigma Aldrich | E6511 | |
| Hepes | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Human FVIIa | Enzyme Research Laboratory | HFVIIa | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
| Human FX | Enzyme Research Laboratory | HFX1010 | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
| Inhibitory mouse anti-human tissue factor IgG, clone HTF-1 | Fisher Scientific | 550252 | |
| Lipopolysaccharide from Escherichia coli O111:B4 | Sigma Aldrich | L2630 | There are several lipopolysaccharide from different E. coli. Different lipopolysaccharide have different potential to activate monocytes. |
| Mouse IgG | Sigma Aldrich | I5381 | |
| Pefachrome FXa 8595 | Enzyme Research Laboratory | 085-27 | |
| Plate reader | any company | N/A | We use the SpectraMax i3x from Molecular Devices |
| Re-lipidated recombinant tissue factor, Dade Innovin | Siemens | 10873566 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima TLX | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | TLA-55 |
References
- Grover, S. P., Mackman, N. Tissue factor: an essential mediator of hemostasis and trigger of thrombosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (4), 709-725 (2018).
- Shaw, A. W., Pureza, V. S., Sligar, S. G., Morrissey, J. H. The local phospholipid environment modulates the activation of blood clotting. Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6556-6563 (2007).
- Tavoosi, N., et al. Molecular determinants of phospholipid synergy in blood clotting. Journal of Biological Chemistry. 286 (26), 23247-23253 (2011).
- Wang, J., Pendurthi, U. R., Rao, L. V. M. Sphingomyelin encrypts tissue factor: ATP-induced activation of A-SMase leads to tissue factor decryption and microvesicle shedding. Blood Advances. 1 (13), 849-862 (2017).
- Kornhuber, J., Rhein, C., Muller, C. P., Muhle, C. Secretory sphingomyelinase in health and disease. Biological Chemistry. 396 (6-7), 707-736 (2015).
- Versteeg, H. H., Ruf, W. Tissue factor coagulant function is enhanced by protein-disulfide isomerase independent of oxidoreductase activity. Journal of Biological Chemistry. 282 (35), 25416-25424 (2007).
- Reinhardt, C., et al. Protein disulfide isomerase acts as an injury response signal that enhances fibrin generation via tissue factor activation. Journal of Clinical Investigation. 118 (3), 1110-1122 (2008).
- Langer, F., et al. Rapid activation of monocyte tissue factor by antithymocyte globulin is dependent on complement and protein disulfide isomerase. Blood. 121 (12), 2324-2335 (2013).
- Bogdanov, V. Y., et al. Alternatively spliced human tissue factor: a circulating, soluble, thrombogenic protein. Nature Medicine. 9 (4), 458-462 (2003).
- Mackman, N. Alternatively spliced tissue factor - one cut too many. Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 5-8 (2007).
- Censarek, P., Bobbe, A., Grandoch, M., Schror, K., Weber, A. A. Alternatively spliced human tissue factor (asHTF) is not pro-coagulant. Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 11-14 (2007).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Osterud, B., Bjorklid, E. Tissue factor in blood cells and endothelial cells. Frontiers in Bioscience (Elite Edition). 4 (1), 289-299 (2012).
- Hisada, Y., Mackman, N. Cancer cell-derived tissue factor-positive extracellular vesicles: biomarkers of thrombosis and survival. Current Opinion in Hematology. 26 (5), 349-356 (2019).
- Vatsyayan, R., Kothari, H., Pendurthi, U. R., Rao, L. V. 4-Hydroxy-2-nonenal enhances tissue factor activity in human monocytic cells via p38 mitogen-activated protein kinase activation-dependent phosphatidylserine exposure. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (7), 1601-1611 (2013).
- Mackman, N., Sachetto, A. T. A., Hisada, Y. Measurement of tissue factor-positive extracellular vesicles in plasma: strengths and weaknesses of current methods. Current Opinion in Hematology. 29 (5), 266-274 (2022).
- Lee, R. D., et al. Pre-analytical and analytical variables affecting the measurement of plasma-derived microparticle tissue factor activity. Thrombosis Research. 129 (1), 80-85 (2012).
- Claussen, C., et al. Microvesicle-associated tissue factor procoagulant activity for the preoperative diagnosis of ovarian cancer. Thrombosis Research. 141, 39-48 (2016).
- Mackman, N., Hisada, Y., Archibald, S. J., et al. Tissue factor and its procoagulant activity on cancer-associated thromboembolism in pancreatic cancer: Comment by Mackman et al. Cancer Science. 113 (5), 1885-1887 (2022).
- Sachetto, A. T. A., et al. Evaluation of four commercial ELISAs to measure tissue factor in human plasma. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 7 (3), 100133 (2023).
- Archibald, S. J., Hisada, Y., Bae-Jump, V. L., Mackman, N. Evaluation of a new bead-based assay to measure levels of human tissue factor antigen in extracellular vesicles in plasma. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 6 (2), e12677 (2022).
- Tatsumi, K., et al. Evaluation of a new commercial assay to measure microparticle tissue factor activity in plasma: communication from the SSC of the ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (11), 1932-1934 (2014).
- Hisada, Y., et al. Measurement of microparticle tissue factor activity in clinical samples: A summary of two tissue factor-dependent FXa generation assays. Thrombosis Research. 139, 90-97 (2016).
- Tatsumi, K., Hisada, Y., Connolly, A. F., Buranda, T., Mackman, N. Patients with severe orthohantavirus cardiopulmonary syndrome due to Sin Nombre Virus infection have increased circulating extracellular vesicle tissue factor and an activated coagulation system. Thrombosis Research. 179, 31-33 (2019).
- Schmedes, C. M., et al. Circulating Extracellular Vesicle Tissue Factor Activity During Orthohantavirus Infection Is Associated With Intravascular Coagulation. Journal of Infectious Diseases. 222 (8), 1392-1399 (2020).
- Rosell, A., et al. Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-Brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).
- Campbell, R. A., et al. Comparison of the coagulopathies associated with COVID-19 and sepsis. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 5 (4), e12525 (2021).
- Guervilly, C., et al. Dissemination of extreme levels of extracellular vesicles: tissue factor activity in patients with severe COVID-19. Blood Advances. 5 (3), 628-634 (2021).
- Hisada, Y., Mackman, N. Measurement of tissue factor activity in extracellular vesicles from human plasma samples. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 3 (1), 44-48 (2019).
- Sachetto, A. T. A., et al. Tissue factor activity of small and large extracellular vesicles in different diseases. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 7 (3), 100124 (2023).
- Bom, V. J., Bertina, R. M. The contributions of Ca2+, phospholipids and tissue-factor apoprotein to the activation of human blood-coagulation factor X by activated factor VII. Biochemical Journal. 265 (2), 327-336 (1990).
- Tilley, R. E., Holscher, T., Belani, R., Nieva, J., Mackman, N. Tissue factor activity is increased in a combined platelet and microparticle sample from cancer patients. Thrombosis Research. 122 (5), 604-609 (2008).
- Gurung, S., Perocheau, D., Touramanidou, L., Baruteau, J. The exosome journey: from biogenesis to uptake and intracellular signalling. Cell Communication and Signaling. 19 (1), 47 (2021).
- Garnier, D., et al. Cancer cells induced to express mesenchymal phenotype release exosome-like extracellular vesicles carrying tissue factor. Journal of Biological Chemistry. 287 (52), 43565-43572 (2012).
- Park, J. A., et al. Tissue factor-bearing exosome secretion from human mechanically stimulated bronchial epithelial cells in vitro and in vivo. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 130 (6), 1375-1383 (2012).
