Summary
Descriviamo un protocollo dettagliato per la preparazione di cellule progenitrici fotorecettrici derivate da hESC post-crioconservate e la somministrazione sub-retinica di queste cellule in topi rd10 .
Abstract
La rigenerazione di cellule fotorecettrici utilizzando cellule staminali pluripotenti umane è una terapia promettente per il trattamento di malattie retiniche ereditarie e di invecchiamento in fase avanzata. Abbiamo dimostrato che la matrice isoforme di laminina retina-specifica ricombinante umana è in grado di supportare la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane (hESC) in progenitori dei fotorecettori. Inoltre, l'iniezione sottoretinica di queste cellule ha anche mostrato un ripristino parziale nei modelli di roditore e coniglio rd10 . L'iniezione sottoretinica è nota per essere un metodo consolidato che è stato utilizzato per fornire composti farmaceutici alle cellule fotorecettrici e allo strato epiteliale pigmentato retinico (RPE) dell'occhio a causa della sua vicinanza allo spazio bersaglio. È stato anche utilizzato per fornire vettori virali adeno-associati nello spazio sottoretinico per trattare le malattie della retina. La somministrazione sottoretinica di composti farmaceutici e cellule nel modello murino è impegnativa a causa del vincolo delle dimensioni del bulbo oculare murino. Questo protocollo descrive la procedura dettagliata per la preparazione di cellule progenitrici fotorecettrici derivate da hESC per l'iniezione e la tecnica di somministrazione sottoretinica di queste cellule in topi mutanti genetici di retinite pigmentosa, rd10. Questo approccio consente la terapia cellulare nell'area bersaglio, in particolare lo strato nucleare esterno della retina, dove si verificano malattie che portano alla degenerazione dei fotorecettori.
Introduction
Le malattie ereditarie della retina e la degenerazione maculare legata all'età portano alla perdita di cellule fotorecettrici e alla cecità. Il fotorecettore retinico è lo strato del segmento esterno della retina composto da cellule specializzate responsabili della fototrasduzione (cioè la conversione della luce in segnali neuronali). Le cellule fotorecettrici dei coni e dei bastoncelli sono adiacenti allo strato pigmentato retinico (RPE)1. La terapia sostitutiva cellulare con fotorecettori per compensare la perdita cellulare è stato un approccio terapeutico emergente e in via di sviluppo. Le cellule staminali embrionali (ESCs)2,3,4, le cellule RPE derivate da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) e le cellule progenitrici retiniche (RPC)4,5,6,7,8 sono state utilizzate per ripristinare le cellule fotorecettrici danneggiate. Lo spazio sotto-retinico, uno spazio confinato tra la retina e l'RPE, è un luogo attraente per depositare queste cellule per sostituire le cellule fotorecettrici danneggiate, l'RPE e le cellule di Mueller a causa della sua vicinanza 9,10,11.
Le terapie geniche e cellulari hanno utilizzato lo spazio sottoretinico per la medicina rigenerativa per varie malattie della retina in studi preclinici. Ciò include la consegna di copie funzionali del gene o degli strumenti di editing genetico sotto forma di terapia oligonucleotidica antisenso12,13 o CRISPR/Cas9 o editing di base tramite la strategia basata su virus adeno-associati (AAV) 14,15,16, l'impianto di materiali (ad esempio, foglio RPE, protesi retiniche 17,18,19) e organoidi retinici derivati da cellule staminali differenziate 20,21,22 per il trattamento delle malattie retiniche e correlate all'RPE. Studi clinici che utilizzano hESC-RPE31 nello spazio sottoretinico per il trattamento dell'amaurosi congenita di Leber (LCA) associata a RPE6523,24, acromatopsia legata a CNGA325, retinite pigmentosa associata a MERTK26, coroideremia 27,28,29,30 si sono dimostrati efficaci. L'iniezione diretta di cellule in prossimità dell'area danneggiata migliora notevolmente la possibilità di insediamento cellulare nella regione appropriata, l'integrazione sinaptica e l'eventuale miglioramento visivo.
Anche se è stata stabilita l'iniezione sub-retinica in modelli umani e con occhi grandi (cioè maiale 32,33,34,35, coniglio 36,37,38,39,40 e primate non umano 41,42,43), tale iniezione nel modello murino è ancora impegnativa a causa del vincolo delle dimensioni del bulbo oculare e dell'enorme lente che occupa l'occhio del topo 44,45,46. Tuttavia, i modelli geneticamente modificati sono prontamente disponibili solo in piccoli animali e non in animali di grandi dimensioni (ad esempio, conigli e primati non umani), pertanto l'iniezione sottoretinica nei topi attira l'attenzione per studiare nuovi approcci terapeutici nelle malattie genetiche retiniche. Per veicolare cellule o AAV nello spazio sottoretinico vengono utilizzati tre approcci principali, vale a dire la via transcorneale, la via trans-sclerale e la via pars plana (vedere la Figura 2). Le vie transcorneali e transsclerali sono associate alla formazione di cataratta, alle sinechie, al sanguinamento coroideale e al reflusso dal sito di iniezione 11,44,45,47,48,49. Abbiamo adottato l'approccio pars plana come visualizzazione diretta del processo di iniezione e il sito di iniezione può essere raggiunto in tempo reale al microscopio.
Recentemente abbiamo descritto un metodo in grado di differenziare le cellule staminali embrionali umane (hESC) in progenitori fotorecettori in condizioni xenolibere, chimicamente definite, utilizzando l'isoforma di laminina ricombinante LN523 specifica per la retina umana. Poiché è stato scoperto che LN523 è presente nella retina, abbiamo ipotizzato che la nicchia della matrice extracellulare della retina umana potesse essere ricapitolata in vitro e quindi supportare la differenziazione dei fotorecettori dalle hESC36. L'analisi trascrittomica a singola cellula ha mostrato che i progenitori dei fotorecettori che co-esprimono l'omeobox cono-bastoncino e la recoverina sono stati generati dopo 32 giorni. Un modello murino mutante di degenerazione retinica 10 (rd10) che imita la retinite pigmentosa umana autosomica è stato utilizzato per valutare l'efficacia dei progenitori dei fotorecettori derivati da hESC al giorno 32 in vivo. Le cellule progenitrici dei fotorecettori derivate da hESC sono state iniettate nello spazio sub-retinico di topi rd10 a P20, dove la disfunzione e la degenerazione dei fotocettori sono in corso36. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la preparazione dei progenitori dei fotorecettori derivati da hESC post-crioconservati e la consegna nello spazio sotto-retinico di topi rd10 . Questo metodo può essere utilizzato anche per somministrare AAV, sospensioni cellulari, peptidi o sostanze chimiche nello spazio sottoretinico nei topi.
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Protocol
Gli esperimenti in vivo sono stati condotti in conformità con le linee guida e il protocollo approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee of SingHealth (IACUC) e dalla Dichiarazione dell'Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) per l'uso di animali nella ricerca oftalmica e sulla visione. I cuccioli sono stati immunodepressi da P17 (pre-trapianto) a P30 (post-trapianto) nutrendoli con acqua potabile contenente ciclosporina (260 g/L).
1. Preparazione dei progenitori dei fotorecettori derivati da hESC del giorno 32 dopo crioconservazione
- Mezzo di differenziazione dei fotorecettori preriscaldati (PRDM) in un bagno d'acqua a 37 °C.
- Recupera dall'azoto liquido un crioviale contenente cellule progenitrici di fotorecettori derivate da hESC al giorno 32. Conservare con ghiaccio secco.
- Scongelare il crioviale a 37 °C a bagnomaria per 3-5 minuti. Risospendere il giorno 32 cellule in 1 mL di PRDM e centrifugare a 130 x g per 4 min.
- Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di PRDM.
- Rimuovere 10 μL della miscela per il conteggio delle cellule. Mescolare le celle utilizzando lo 0,2% di blu di tripano secondo le istruzioni del produttore. Pipettare la miscela di cellule nel vetrino della camera di conteggio delle cellule. Determina il numero di celle e la vitalità tramite il contatore automatico delle cellule.
- Procedere al passaggio successivo quando la vitalità cellulare è superiore al 70%. Centrifugare la sospensione cellulare rimanente a 130 x g per 4 min. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in PRDM alla concentrazione di 3 x 105 cellule/μL per il trapianto.
- Osservare la presenza di grumi cellulari visibili. Risospendere ripetutamente i grumi di cellule utilizzando un puntale di pipetta da 10 μL nella provetta per microfuge fino a quando non si osserva alcun grumo di cellule visibile. Caricare nella siringa per iniezione 33G per osservare l'estrusione della soluzione cellulare attraverso l'ago.
2. Rilascio sottoretinico delle hESC nei topi rd10
- Preparazione degli animali
- Anestetizzare il topo (P20, maschio/femmina, 3-6 g) utilizzando una combinazione di ketamina (20 mg/kg di peso corporeo) e xilazina (2 mg/kg di peso corporeo) in una siringa di tubercolina da 1 mL collegata a un ago da 27G mediante approccio intraperitoneale. Somministrare un'iniezione sottocutanea di buprenorfina (0,05 mg/kg) al topo come analgesico preventivo.
- Dopo aver somministrato l'anestesia, instillare una goccia ciascuna di tropicamide all'1% e fenilefrina al 2,5% per la dilatazione della pupilla. Applicare un gel oftalmico sulla cornea per prevenire la secchezza dell'occhio e la cataratta correlata all'anestesia.
- Metti il topo in una gabbia vuota fino a quando non sarà completamente anestetizzato. Valutare il corretto livello di anestetico pizzicando il cuscinetto della zampa e verificare se l'animale non reagisce al forte pizzicotto.
- Quando il topo è completamente anestetizzato, posizionare l'animale su un tappetino caldo a 38 °C.
- Rilascio sottoretinico delle cellule
- Per utilizzare un approccio pars plana transvitreale a 1 porta, come fatto qui, eseguire l'iniezione sottoretinica in un ambiente sterile. Utilizzare un microscopio operativo verticale con un percorso di luce diretto per eseguire l'iniezione.
- Preparare la siringa di vetro da 10 μL rimuovendo il mozzo dell'ago. Montare l'ago smussato da 33G sulla siringa di vetro. Prenda il coperchio metallico del mozzo e fissi con cura l'ago sulla siringa.
- Sciacquare con acqua distillata per verificare la presenza di eventuali segni di perdite e pervietà dell'ago. Svuotare la siringa e metterla da parte con cura.
- Posizionare il topo anestetizzato su un cuscino, con l'occhio di trattamento rivolto verso l'alto verso l'obiettivo del microscopio. Applicare il cloridrato di proparacaina allo 0,5% e attendere 30 s. Applicare 150 μL di gel oftalmico sull'occhio e posizionare su di esso un vetrino coprioggetto rotondo.
- Eseguire un esame approssimativo dell'occhio osservando la cornea, l'iride, la pupilla, il cristallino e la congiuntiva. Attraverso la pupilla, visualizza il fondo oculare dell'occhio del topo regolando il piano focale. Regolare la testina fino a quando la testa ottica non è posizionata al centro della pupilla e ridurre al minimo il movimento della testa posizionandola correttamente sul cuscino.
- Picchiettare delicatamente la base del tubo con le hESC più volte per ottenere una sospensione cellulare uniforme. Utilizzando la siringa da microlitri di vetro da 10 μL con un ago smussato da 33 G, prelevare 2 μL di cellule/terreni. Prelevare le cellule subito prima dell'iniezione per evitare l'assestamento/aggregazione delle cellule nella siringa.
- Utilizzando un ago monouso da 30 G, praticare una ferita da sclerectomia 2 mm dietro il limbus. Mantenere l'angolo dell'ago a ~45° per evitare di toccare l'obiettivo. Una volta visualizzata la punta dell'ago nell'occhio, ritirare delicatamente l'ago. Gettare l'ago nel contenitore appuntito dopo l'uso per evitare lesioni da puntura dell'ago.
- Prendere la siringa di vetro e inserire l'ago smussato nella ferita della sclerectomia. Senza toccare la lente, far avanzare l'ago smussato fino a raggiungere la retina opposta alla ferita d'ingresso. Assicurarsi che l'area di iniezione sia libera dai principali vasi sanguigni della retina per evitare sanguinamento.
- Penetrare delicatamente nella retina fino a quando non si vede un ramo di pressione sulla sclera. Tenere l'estremità smussata dell'ago parallela alla sclera per evitare la fuoriuscita delle cellule nello spazio vitreo.
- Iniettare lentamente 2 μL di sospensione cellulare o terreno PRDM (controllo) nello spazio sottoretinico mantenendo una leggera pressione sulla siringa. Con un'iniezione riuscita, nel sito di iniezione deve formarsi una bolla visibile (cioè retina sollevata con la sospensione/terreno cellulare al suo interno).
NOTA: Durante l'iniezione deve essere esercitata solo una leggera pressione per evitare la lacerazione della retina e il blocco delle cellule sulla punta dell'ago. - Dopo aver confermato la bolla, attendere 10 secondi per lasciare che le cellule si stabilizzino. Ritrarre delicatamente l'ago dalla cruna di ritiro.
- Tomografia a coerenza ottica (OCT) intraoperatoria del bleb (opzionale)
- Posiziona l'occhio del mouse per visualizzare il bollo sotto il microscopio muovendo lentamente la testa. Fissare la posizione tenendo delicatamente la testa. Non è necessaria alcuna dilatazione aggiuntiva della pupilla. Non rimuovere il vetrino coprioggetto e il gel sull'occhio. Fornisce un chiaro supporto ottico per visualizzare l'ebola.
- Eseguire l'OCT intraoperatorio utilizzando la funzione iOCT integrata del microscopio operatorio.
- Premere l'opzione Cubo nella schermata dello Strumento di personalizzazione di Office e posizionare l'area di scansione sul bleb premendo i pulsanti freccia . Regolare l'OCT facendo scorrere Centratura e Messa a fuoco per ottenere la migliore qualità OCT. Premere Acquisisci/Scansione per acquisire la scansione OCT dell'area bleb. Esaminare le immagini per verificare la qualità delle scansioni.
- Guarigione
- Rimuovere il vetrino coprioggetto e pulire il gel dall'occhio con una garza. Applicare un unguento antibiotico una volta dopo l'iniezione per prevenire l'infezione.
- Lasciare che l'animale si riprenda dall'anestesia sotto una luce calda fino a quando non riacquista sufficiente coscienza per mantenere il decubito sternale e tornare alla gabbia di casa. Monitorare l'animale per almeno 3 giorni dopo l'iniezione per segni di infiammazione, infezione e angoscia.
NOTA: La luce calda da 150 W deve trovarsi ad almeno 30 cm di distanza dalla gabbia dell'animale e prestare attenzione per evitare ustioni. - Somministrare un'iniezione sottocutanea di buprenorfina (0,05 mg/kg) 8 ore per 1 giorno o secondo le raccomandazioni del veterinario. Se si osserva un'infiammazione o un'infezione dell'occhio, consultare un veterinario per un trattamento appropriato.
- Pulizia e sterilizzazione degli strumenti
- Sciacquare la siringa da microlitro di vetro da 10 μL e l'ago smussato da 33G con etanolo al 100% 10x. Lavare via l'etanolo facendo lampeggiare la siringa con acqua distillata.
- Smontare la siringa di vetro e l'ago. Asciugare la siringa per la conservazione.
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Representative Results
La siringa di vetro da 10 μL è stata assemblata secondo le istruzioni del produttore (Figura 1) e l'ago smussato utilizzato per erogare la sospensione/il terreno cellulare è mostrato nella Figura 1B. I diversi approcci per l'iniezione sottoretinica sono illustrati nella Figura 2. Descriviamo l'approccio pars plana in questo protocollo (Figura 2C). L'ago smussato montato su una siringa di vetro è stato inserito attraverso una ferita da sclerotomia e ha avuto accesso allo spazio sottoretinico in tutto il mondo. Come mostrato nella Figura 3A, la traiettoria dell'ago, la penetrazione attraverso la retina e la consegna delle cellule sono state monitorate direttamente al microscopio durante l'esecuzione dell'iniezione. Il successo della somministrazione delle cellule/terreni è stato confermato osservando una bolla nel sito di iniezione (Figura 3B). Un bleb di successo può essere identificato come un colore biancastro chiaro simile a un palloncino d'acqua. Un parto fallito si osserva per la fuoriuscita delle cellule/terreni nello spazio vitreo nel sito di iniezione e per la mancata formazione di un bleb. La scansione OCT è stata eseguita sull'area iniettata e la scansione ha mostrato hESC individuali fluttuanti nell'occhio trattato con cellule (Figura 4A), mentre l'occhio trattato con terreno ha mostrato fluido chiaro senza cellule nello spazio sottoretinico (Figura 4B). Le hESC individualizzate sono identificate come materiali iperriflettenti distribuiti nello spazio sottoretinico (Figura 4A). Il tasso di successo dell'iniezione è stato calcolato annotando il numero di occhi con la formazione riuscita della bolla. Abbiamo incluso le applicazioni che hanno adottato questo approccio nel nostro laboratorio e il tasso di successo delle iniezioni (Tabella 1).
Figura 1: Strumenti utilizzati durante l'iniezione. (A) La siringa di vetro da 10 μL è montata con un ago smussato da 33G. (B) Ingrandisci l'immagine dell'ago smussato 33G. (C) Cuscino su cui appoggiare la testa dell'animale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Diverse vie di iniezione sottoretinica. (A) Via transcorneale: l'ago per iniezione passa attraverso la cornea e la pupilla per entrare nello spazio sottoretinico. (B) Via trans-sclerale: lo spazio sottoretinico è accessibile direttamente attraverso la sclera. (C) Via Pars plana: l'ago per iniezione viene inserito nello spazio vitreo attraverso un'incisione sul limbus. L'ago raggiunge lo spazio sottoretinico penetrando nella retina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Immagini del fondo oculare dell'occhio durante l'iniezione sottoretinica. (A) Prima dell'esecuzione dell'iniezione sottoretinica, la punta dell'ago poteva essere vista nello spazio vitreo a contatto con la retina, evitando i principali vasi sanguigni della retina. (B) Dopo l'iniezione sottoretinica, si è formata una bolla visibile nel sito di iniezione (linea gialla tratteggiata). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Scansioni OCT intraoperatorie degli occhi iniettati. Le scansioni sono state eseguite immediatamente dopo l'iniezione. (A) occhio trattato con hESC: il pannello superiore mostrava la posizione della scansione OCT (linee della sezione trasversale ciano e rosa) sull'occhio; Le hESC sono state osservate nell'occhio trattato nello spazio sottoretinico (linea tratteggiata gialla, pannelli centrale e inferiore). (B) Occhio trattato con media: il pannello superiore mostrava la posizione della scansione OCT (linee della sezione trasversale ciano e rosa) sull'occhio; È stato osservato un fluido chiaro senza cellule nello spazio sottoretinico nell'occhio a cui è stata iniettata la matrice (linea tratteggiata gialla, pannelli centrale e inferiore). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Applicazioni | Deformazione ricevente | Tasso di successo |
| AAV | RPE65RD12/J | 80% |
| AAV | C57BL/6 | 95% |
| Cellule progenitrici derivate da hESC | Rd10-/- | 95% |
Tabella 1: Il tasso di successo dell'iniezione sottoretinica in diverse applicazioni.
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Discussion
L'iniezione sottoretinica è stata utilizzata per il trapianto di sospensione cellulare per il trattamento di RPE e malattie retiniche 23,25,26,27,28,31,40. Questo approccio è molto essenziale negli studi sui roditori non solo per il trapianto di cellule e gli approcci di terapia genica, ma anche per valutare nuovi composti terapeutici per le malattie della retina. Attualmente, vengono utilizzate tre vie principali per fornire cellule o AAV nello spazio sotto-retinico, ovvero le vie trans-corneali, trans-sclerali e pars plana.
Nell'approccio transcorneale, l'ago per iniezione passa attraverso la cornea, la pupilla e, infine, la retina per consegnare le cellule nello spazio sottoretinico e formare un bleb di successo. Il vantaggio dell'approccio transcorneale è la capacità di creare un distacco completo della retina nel ricevente47. Può fornire un numero maggiore di celle; Tuttavia, l'osservazione longitudinale per studiare la conformazione strutturale e l'integrazione cellulare è impegnativa in questo approccio. Inoltre, le complicanze includono la formazione della cataratta, le sinechie e l'opacità della cornea, rendendo le osservazioni longitudinali impegnative 11,45,47,48. In alternativa, l'approccio trans-sclerale viene utilizzato anche per veicolare AAV nello spazio sottoretinico44,49. Questo approccio è utile per i topi neonatali ed è considerato più sicuro in quanto non è necessario che l'ago passi attraverso il mezzo oculare. Tuttavia, il sanguinamento coroideale, il reflusso della soluzione dal sito di iniezione, la perforazione della retina e la perdita nello spazio vitreo non devono essere ignorati.
Abbiamo adottato l'approccio pars plana per introdurre i progenitori dei fotorecettori derivati dalle hESC nello spazio sottoretinico utilizzando un ago smussato da 33G. In questo approccio, l'ago per iniezione è stato inserito attraverso l'incisione nell'area del limbus. L'ago è stato quindi fatto passare attraverso la cavità vitreale e infine ha avuto accesso allo spazio sottoretinico attraverso la retina. Sono stati spesso osservati grumi di cellule che possono bloccare la somministrazione di cellule quando si utilizzano aghi di dimensioni non idonee. La risospensione delle cellule nella provetta microfuge deve essere eseguita diligentemente utilizzando un puntale per pipetta da 10 μL prima di caricarle nella siringa per iniezione. Inizialmente abbiamo tentato di utilizzare un ago 34G, dove è stato spesso osservato il blocco dell'ago da parte delle cellule. Una dimensione appropriata dell'ago deve essere testata per specifici tipi di cellule, in particolare gli aghi a foro stretto tendono a dare cellule meno vitali quando iniettati50. Uno dei vantaggi di questo approccio è la visualizzazione diretta durante l'iniezione, che consente al chirurgo di monitorare e selezionare attentamente la posizione specifica per la somministrazione delle cellule. L'area di iniezione e l'ago devono essere chiaramente visibili durante la procedura. La cataratta indotta dall'anestesia e l'opacità della cornea possono influenzare notevolmente la corretta consegna delle cellule in una posizione specifica.
Durante l'esecuzione dell'iniezione, l'ago deve penetrare perpendicolarmente nella retina e l'estremità smussata dell'ago deve essere parallela alla sclera per ridurre al minimo la fuoriuscita delle cellule iniettate nello spazio vitreale (Figura 3). Durante l'esecuzione dell'iniezione, applicare solo una leggera pressione sulla siringa. Una forte pressione può portare a lacerazioni della retina, emorragia, fuoriuscita delle cellule nello spazio coroidale, incapacità delle cellule di passare attraverso l'ago e perforazione del bulbo oculare. La pressione ottimale può essere assicurata quando la punta dell'ago è appena passata attraverso la retina e si vede un piccolo punto bianco di pressione sulla punta dell'ago. Dopo l'iniezione, l'ago deve essere retratto lentamente e delicatamente dal punto di iniezione per evitare la fuoriuscita delle cellule iniettate nello spazio vitreo.
Il limite di questo approccio è la difficile curva di apprendimento. Uno studio ha dimostrato che un oftalmologo addestrato doveva eseguire 364 iniezioni nei topi per ottenere un tasso di successo del 95%, mentre i tirocinanti meno esperti con esperienza chirurgica dovevano richiedere un numero maggiore di corsi di formazione46. Le complicanze di questo approccio includono la traccia dell'ago nella retina, il reflusso delle cellule nello spazio vitreo, il sanguinamento dalla coroide/retina e la cataratta iatrogena. Tuttavia, con una quantità sufficiente di allenamento, queste complicanze sono significativamente meno osservate46.
In conclusione, il nostro metodo è in grado di veicolare i progenitori dei fotorecettori derivati da hESC nello spazio sub-retinico dei topi rd10 , come dimostrato dalle scansioni OCT. Questo approccio può essere adottato per esplorare nuovi composti terapeutici, diversi tipi di trapianto di cellule e terapia genica per il trattamento della retina esterna e delle malattie correlate all'RPE.
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Disclosures
Hwee Goon Tay è co-fondatore di Alder Therapeutics AB. Altri autori dichiarano di non avere interessi contrastanti.
Acknowledgments
Ringraziamo Wei Sheng Tan, Luanne Chiang Xue Yen, Xinyi Lee e Yingying Chung per aver fornito assistenza tecnica per la preparazione dei progenitori dei fotorecettori derivati da hESC del giorno 32 dopo la crioconservazione. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalle sovvenzioni del National Medical Research Council Young Investigator Research Grant Award (NMRC/OFYIRG/0042/2017) e dalla National Research Foundation24th Competitive Research Program Grant (CRP24-2020-0083) a H.G.T.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3% Tobramycin | Novartis | NDC 0078-0813-01 | Tobrex (3.5 g) |
| 0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone | Novartis | NDC 0078-0876-01 | Tobradex (3.5 g) |
| 0.5% Proparacaine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0016-15 | 0.5% Alcaine (15 mL) |
| 1 mL Tuberculin syringe | Turemo | SS01T2713 | |
| 1% Tropicamide | Alcon | NDC 0998-0355-15 | 1% Mydriacyl (15 mL) |
| 2.5% Phenylephrine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0342-05 | 2.5% Mydfrin (5 mL) |
| 24-well tissue culture plate | Costar | 3526 | |
| 30 G Disposable needle | Becton Dickinson (BD) | 305128 | |
| 33 G, 20 mm length blunt needles | Hamilton | 7803-05 | |
| Automated Cell Counter | NanoEnTek | Model: Eve | |
| B27 without Vitamin A | Life Technologies | 12587001 | 2%36 |
| Buprenorphine | Ceva | Vetergesic vet (0.3 mg/mL) | |
| CKI-7 | Sigma | C0742 | 5 µM36 |
| Cyclosporine | Novartis | 260 g/L in drinking water | |
| Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells | DUKE-NUS Medical School | Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36. | |
| Gauze | Winner Industries Co. Ltd. | 1SNW475-4 | |
| Glasgow Minimum Essential Medium | Gibco | 11710–035 | |
| hESC cell line H1 | WiCell Research Institute | WA01 | |
| Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02-50 | 10 ng/mL36 |
| Human ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Prospec-Tany Technogene | CYT-272 | 10 ng/mL36 |
| Ketamine hydrochloride (100 mg/mL) | Ceva Santé Animale | KETALAB03 | |
| LN-521 | Biolamina | LN521-02 | 1 µg36 |
| mFreSR | STEMCELL Technologies | 5854 | |
| Microlitre glass syringe (10 mL) | Hamilton | 7653-01 | |
| N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT) | Selleckchem | S2215 | 10 µM36 |
| N-2 supplement | Life Technologies | A13707-01 | 1%36 |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140–050 | 1x36 |
| NutriStem XF Media | Satorius | 05-100-1A | |
| Operating microscope | Zeiss | OPMI LUMERA 700 | With Built-in iOCT function |
| PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml) | DUKE-NUS Medical School | See media composition36. Basal Medium, 10 µM DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 µM Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA). | |
| Pyruvate | Gibco | 11360–070 | 1 mM36 |
| Rd10 mice | Jackson Laboratory | B6.CXB1-Pde6brd10/J mice | Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g |
| Retinoic acid | Tocris Bioscience | 0695/50 | 0.5 µM36 |
| Round Cover Slip (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| SB431542 | Sigma | S4317 | 0.5 µM36 |
| Vidisic Gel (10 g) | Dr. Gerhard Mann | ||
| Xylazine hydrochloride (20 mg/mL) | Troy Laboratories | LI0605 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985–023 | 0.1 mM36 |
References
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