Summary
我々は、凍結保存後のヒトES細胞由来の光受容体前駆細胞の調製と、 rd10 マウスにおけるこれらの細胞の網膜下送達のための詳細なプロトコルについて記述する。
Abstract
ヒト多能性幹細胞を用いた視細胞の再生は、進行期の遺伝性網膜疾患と老化性網膜疾患の両方を治療するための有望な治療法です。ヒト組換え網膜特異的ラミニンアイソフォームマトリックスは、ヒト胚性幹細胞(hESC)の視細胞前駆細胞への分化をサポートできることを示しました。さらに、これらの細胞の網膜下注射も、 rd10 げっ歯類およびウサギモデルで部分的な回復を示しています。網膜下注射は、標的空間に近いため、眼の視細胞および網膜色素上皮(RPE)層に医薬品化合物を送達するために使用されている確立された方法であることが知られています。また、網膜疾患を治療するために、アデノ随伴ウイルスベクターを網膜下腔に送達するためにも使用されています。マウスモデルにおける医薬品化合物および細胞の網膜下送達は、マウス眼球のサイズに制約があるため、困難である。このプロトコルは遺伝の網膜色素変性症の突然変異体、 rd10 マウスのこれらのセルの注入そして網膜の下配達技術のためのhESC得られた光受容体の祖先のセルの準備のための詳しいプロシージャを記述する。このアプローチにより、標的領域、特に視細胞変性につながる疾患が発生する網膜の外側の核層への細胞治療が可能になります。
Introduction
遺伝性の網膜疾患や加齢黄斑変性症は、視細胞の喪失や最終的には失明につながります。網膜光受容体は、光伝達(すなわち、光をニューロン信号に変換すること)に関与する特殊な細胞で構成される網膜の外側セグメント層です。桿体および錐体視細胞は、網膜色素層(RPE)1に隣接しています。細胞の損失を補うための光受容体細胞補充療法は、新しく発展している治療アプローチです。損傷した視細胞を修復するために、胚性幹細胞(ESC)2,3,4、人工多能性幹細胞(iPS細胞)由来RPE細胞、網膜前駆細胞(RPC)4,5,6,7,8を使用しました。網膜下腔、網膜とRPEの間の閉鎖空間は、その近傍のために損傷した視細胞、RPE、およびミューラー細胞を置き換えるためにこれらの細胞を沈着させる魅力的な場所です9,10,11。
遺伝子治療や細胞治療は、前臨床試験において様々な網膜疾患に対する再生医療に網膜下腔を活用しています。これには、抗センスオリゴヌクレオチド療法12,13またはCRISPR/Cas9、またはアデノ随伴ウイルス(AAV)ベースの戦略14,15,16、材料の移植(RPEシート、網膜補綴物17,18,19)、分化幹細胞由来網膜オルガノイド20のいずれかの形での遺伝子または遺伝子編集ツールの機能コピーの送達が含まれます、21,22網膜およびRPE関連疾患を治療する。RPE65関連レーバー先天性黒内障(LCA)23,24、CNGA3連鎖色覚異常25、MERTK関連網膜色素変性症26、脈絡膜血症27,28,29,30を治療するための網膜下腔におけるhESC-RPE31を用いた臨床試験効果的なアプローチであることが証明されています。損傷部位付近に細胞を直接注入することで、適切な領域への細胞の沈降、シナプス統合、および最終的な視覚的改善の可能性が大幅に向上します。
ヒトおよび大型眼モデル(すなわち、ブタ32,33,34,35、ウサギ36,37,38,39,40、および非ヒト霊長類41,42,43)への網膜下注射が確立されていますが、マウスモデルへのそのような注射は、眼球のサイズと巨大さの制約のために依然として困難ですマウスの目44、45、46を占めるレンズ。しかし、遺伝子改変モデルは小動物でのみ容易に利用でき、大型動物(ウサギやヒト以外の霊長類)では入手できないため、マウスへの網膜下注射は、網膜遺伝性疾患の新しい治療法を検討するために注目を集めています。細胞またはAAVを網膜下腔に送達するために、3つの主要なアプローチ、すなわち経角膜経路、経強膜経路、および扁平部経路が使用されています(図2を参照)。経角膜および経強膜経路は、白内障形成、癒着、脈絡膜出血、および注射部位からの逆流に関連しています11,44,45,47,48,49。射出プロセスを直接可視化するパースプラナアプローチを採用し、顕微鏡下でリアルタイムに射出部位を把握することができます。
我々は最近、組換えヒト網膜特異的ラミニンアイソフォームLN523を用いて、ゼノフリーの化学的に定義された条件下でヒト胚性幹細胞(hESC)を光受容体前駆細胞に分化させる方法を記載した。LN523が網膜に存在することがわかったので、ヒト網膜の細胞外マトリックスニッチが in vitro で再現され、それによってヒトES細胞からの光受容体の分化をサポートできるという仮説を立てました36。シングルセルトランスクリプトーム解析により、コーンロッドホメオボックスとリフェリンを共発現する光受容体前駆細胞が32日後に生成されることが示されました。常染色体ヒト網膜色素変性症を模倣した網膜変性10(rd10)変異マウスモデルを用いて、ヒトES細胞由来光受容体前駆細胞32日目の生体内における有効性を評価し た。ヒトES細胞由来の視細胞前駆細胞を、視受容器の機能不全と変性が進行しているP20の rd10 マウスの網膜下腔に注入した36。ここでは、凍結保存後のヒトES細胞由来の光受容体前駆細胞の調製と rd10 マウスの網膜下腔への送達に関する詳細なプロトコルについて説明します。この方法は、AAV、細胞懸濁液、ペプチド、または化学物質をマウスの網膜下腔に投与するためにも使用できます。
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Protocol
in vivo実験は、SingHealthの動物管理および使用委員会(IACUC)および眼科および眼科研究における動物の使用に関するAssociation for Research in Vision and Ophthalmology(ARVO)の声明によって承認されたガイドラインとプロトコルに従って行われました。仔犬は、シクロスポリン(260 g / L)を含む飲料水を与えることにより、P17(移植前)からP30(移植後)までの免疫抑制を行いました。
1. 凍結保存後の32日目のヒトES細胞由来光受容体前駆細胞の調製
- 37°Cのウォーターバスで予熱した光受容体分化培地(PRDM)。
- 液体窒素から32日目のヒトES細胞由来の光受容体前駆細胞を含むクライオバイアルを回収します。ドライアイスの上に保管してください。
- クライオバイアルを37°Cのウォーターバスで3〜5分間解凍します。32日目の細胞を1 mLのPRDMに再懸濁し、130 x g で4分間遠心分離します。
- 上清を除去し、細胞を 1 mL の PRDM に再懸濁します。
- 細胞計数のために10 μLの混合物を取り除きます。メーカーの指示に従って、0.2%トリパンブルーを使用して細胞を混合します。細胞混合物を細胞計数チャンバースライドにピペットで移します。自動セルカウンターで細胞数と生存率を決定します。
- 細胞生存率が70%を超えたら次のステップに進みます。残りの細胞懸濁液を130 x g で4分間遠心分離します。上清を除去し、細胞ペレットを3 x 105 細胞/μLの濃度でPRDMに再懸濁して移植します。
- 目に見える細胞の塊を観察します。10 μLのピペットチップをマイクロチューブに入れて、目に見える細胞凝集が観察されなくなるまで、細胞凝集を繰り返し再懸濁します。33G注射シリンジに装填し、針を通して細胞溶液が押し出されるのを観察します。
2. rd10 マウスにおけるヒトES細胞の網膜下送達
- 動物の準備
- 腹腔内アプローチにより、27Gの針に取り付けられた1 mLのツベルクリン注射器でケタミン(20 mg / kg体重)とキシラジン(2 mg / kg体重)の組み合わせを使用して、マウス(P20、男性/女性、3〜6 g)を麻酔します。先制鎮痛薬としてマウスにブプレノルフィン(0.05 mg / kg)の皮下注射を投与します。.
- 麻酔後、瞳孔散大のために1%トロピカミドと2.5%フェニレフリンをそれぞれ点滴します。角膜に眼科用ジェルを塗布して、目の乾燥や麻酔関連の白内障を防ぎます。
- 完全に麻酔されるまでマウスを空のケージに入れます。肉球をつまんで適切な麻酔レベルを評価し、動物が強くつまんでも反応しないかどうかを確認します。
- マウスが完全に麻酔されたら、38°Cに設定された温かいパッドの上にマウスを置きます。
- 細胞の網膜下送達
- ここで行うように、1ポート経硝子体扁平部アプローチを使用するには、無菌環境で網膜下注射を実行します。直接光路を備えた直立手術用顕微鏡を使用して注入を行います。
- ニードルハブを取り外して、10 μLのガラスシリンジを準備します。33G鈍針をガラスシリンジに取り付けます。金属製のハブカバーを取り、針をシリンジに慎重に固定します。
- 蒸留水で洗い流して、針の漏れや開存性の兆候がないか確認します。シリンジを空にして、慎重に横に置きます。
- 麻酔をかけたマウスを枕の上に置き、治療眼を顕微鏡の対物レンズにまっすぐ見上げます。0.5%のプロパラカインの塩酸塩を加え、30秒待ちます。眼科用ジェル150μLを眼に塗布し、その上に丸いカバースリップを置きます。
- 角膜、虹彩、瞳孔、水晶体、結膜を観察して、目の大まかな検査を行います。瞳孔を通して、焦点面を調整してマウスの眼底を視覚化します。視神経ヘッドが瞳孔の中心に配置されるまでヘッドを調整し、枕に適切に配置して頭の動きを最小限に抑えます。
- チューブの底部をhESCで複数回軽くたたいて、均一な細胞懸濁液を得ます。10 μLのガラスマイクロリットルシリンジと33Gの鈍い針を使用して、2 μLの細胞/培地を回収します。注射の直前に細胞を抜いて、シリンジ内での細胞の沈降/凝集を防ぎます。
- 30Gの使い捨て針を使用して、リンバスの後ろに2mmのところに硬化切除の傷を作ります。レンズに触れないように、針の角度を~45°に保ちます。針の先端が目に映ったら、針をそっと引き抜きます。針刺しによる怪我を防ぐために、使用後は針を鋭利なビンに捨ててください。
- ガラス注射器を取り、鈍い針を硬化切除術の傷口に挿入します。レンズに触れずに、鈍い針を進入創の反対側の網膜に達するまで進めます。出血を避けるために、注射領域に主要な網膜血管がないことを確認してください。.
- 強膜の圧力分岐が見られるまで、網膜を静かに貫通します。針の鈍い端を強膜と平行に保ち、細胞が硝子体腔に漏れないようにします。
- 2 μLの細胞懸濁液またはPRDM培地(コントロール)を、シリンジに穏やかな圧力を維持しながら、網膜下腔にゆっくりと注入します。注射が成功すると、目に見えるブレブ(すなわち、細胞懸濁液/培地が入った網膜の隆起)が注射部位に形成されるはずです。
注:注射中は、網膜の裂傷や針先の細胞の閉塞を避けるために、穏やかな圧力のみを使用する必要があります。 - ブレブを確認したら、細胞が落ち着くまで10秒待ちます。針を目からそっと引っ込めます。
- ブレブの術中光干渉断層撮影(OCT)スキャン(オプション)
- マウスの目の位置を調整し、頭をゆっくりと動かして顕微鏡下でブレブを視覚化します。頭をそっと持って位置を固定します。追加の瞳孔散大は必要ありません。カバースリップや目のジェルを剥がさないでください。それはblebを視覚化するための明確な光学媒体を与える。
- 手術用顕微鏡に内蔵されているiOCT機能を使用して、術中OCTを行います。
- OCT画面の Cube(キューブ )オプションを押し、 矢印 ボタンを押してスキャン領域をブレブに配置します。 センタリングとフォーカス をスライドさせてOCTを調整し、最高のOCT品質を実現します。 Capture/Scan(キャプチャ/スキャン )を押して、ブレブ領域のOCTスキャンを取得します。画像を確認して、スキャンの品質を確認します。
- 回復
- カバースリップをはがし、ガーゼで目からジェルをきれいにします。感染を防ぐために、注射後に抗生物質軟膏を1回塗布します。
- 動物が胸骨臥位を維持してホームケージに戻るのに十分な意識を取り戻すまで、温かい光の下で麻酔から回復するのを待ちます。注射後少なくとも3日間、炎症、感染、苦痛の兆候がないか動物を監視します。.
注意: 150Wのウォームライトは、動物ケージから少なくとも30cm離す必要があり、火傷をしないように注意する必要があります。 - ブプレノルフィン(0.05 mg / kg)の皮下注射を8時間ごとに1日間、または獣医師の推奨に従って投与します。.目の炎症や感染が観察された場合は、獣医師に相談して適切な治療を受けてください。
- 器具の洗浄と滅菌
- 10 μLのガラスマイクロリットルシリンジと33Gの鈍い針を100%エタノールで10回洗い流します。シリンジを蒸留水で点滅させてエタノールを洗い流します。
- ガラスシリンジと針を分解します。シリンジを乾燥させて保管します。
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Representative Results
10 μL のガラスシリンジはメーカーの指示に従って組み立て(図 1)、細胞懸濁液/培地の送達に使用した鈍い針を 図 1B に示します。網膜下注射のさまざまなアプローチを 図2に示します。このプロトコルでは、pars planaアプローチについて説明します(図2C)。ガラス注射器に取り付けられた鈍い針は、硬化切開の傷口から挿入され、世界中の網膜下腔にアクセスしました。 図3Aに示すように、注射を行う際に、針の軌跡、網膜の貫通、および細胞の送達を顕微鏡下で直接モニターした。細胞/培地の送達が成功したことは、注入部位のブレブを観察することで確認されました(図3B)。成功したブレブは、水風船に似た薄い白っぽい色として識別できます。送達の失敗は、注射部位の硝子体腔への細胞/培地の漏出とブレブの形成の失敗によって観察されます。OCTスキャンは注射部位に対して実施され、スキャンでは細胞処理された眼に浮遊する個別化ヒトESCが示され(図4A)、培地処理された眼では網膜下腔に細胞のない透明な液体が示されました(図4B)。個別化されたヒトES細胞は、網膜下腔に分布する過反射性物質として識別されます(図4A)。注射の成功率は、ブレブの形成が成功した眼の数に注目することによって計算されました。このアプローチを採用したアプリケーションと、注射の成功率を研究室に含めました(表1)。
図1:注入中に使用される器具。 (A)10μLのガラスシリンジには、33Gの鈍い針が取り付けられています。(B)33G鈍針の拡大画像。(C)動物の頭を乗せるための枕。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:網膜下注射のさまざまな経路。 (A)経角膜経路:注射針は角膜と瞳孔を通過して網膜下腔に入ります。(B)経強膜経路:網膜下腔は強膜を介して直接アクセスされます。(C)扁平部経路:注射針は、辺縁部を切開して硝子体腔に挿入されます。針は網膜を貫通することによって網膜下腔に到達します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:網膜下注射中の眼底画像。 (A)網膜下注射を行う前に、針の先端が網膜に接触する硝子体腔に見え、主要な網膜血管を避けていました。(B)網膜下注射後、注射部位に目に見えるブレブが形成された(黄色の点線)。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:注射された眼球の術中OCTスキャン。 スキャンは注射後すぐに行われました。(A)ヒトES細胞で治療された眼:上部パネルは、眼のOCTスキャンの位置(シアンとピンクの断面線)を示しました。hESCは、網膜下腔(黄色の点線、中央および底面のパネル)で治療された眼で観察されました。(B)メディア処理された眼球:上部パネルは、眼球上のOCTスキャンの位置(シアンとピンクの断面線)を示しました。培地注入眼の網膜下腔に細胞を含まない透明な液体が観察された(黄色の点線、中央パネルと下部パネル)。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| アプリケーション | レシピエント負担 | 成功率 |
| AAVの | RPE65rd12/J | 80% |
| AAVの | C57BL/6 (シナ) | 95% |
| ヒトES細胞由来前駆細胞 | 第10回-/- | 95% |
表1:さまざまなアプリケーションにおける網膜下注射の成功率。
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Discussion
網膜下注射は、RPEおよび網膜疾患を治療するための細胞懸濁移植に使用されています23,25,26,27,28,31,40。このアプローチは、細胞移植や遺伝子治療のアプローチだけでなく、網膜疾患の新規治療化合物を評価するためにも、げっ歯類の研究において非常に重要です。現在、細胞またはAAVを網膜下腔に送達するために、3つの主要な経路、すなわち経角膜経路、経硬化経路、および扁平筋経路が使用されています。
経角膜アプローチでは、注射針が角膜、瞳孔、そして最後に網膜を通過して細胞を網膜下腔に送り込み、成功したブレブを形成します。経角膜アプローチの利点は、レシピエント47に完全な網膜剥離を生じさせる能力である。より多くの細胞を送達できます。しかし、このアプローチでは、構造構造や細胞の組み込みを研究するための縦断的観察は困難です。さらに、合併症には白内障の形成、癒着、角膜混濁などがあり、縦断的観察は困難です11,45,47,48。あるいは、経強膜アプローチは、AAVを網膜下腔に送達するためにも使用される44,49。このアプローチは、新生児マウスに有用であり、針が眼球媒体を通過する必要がないため、より安全であると考えられています。ただし、脈絡膜出血、注射部位からの溶液の逆流、網膜の穿孔、および硝子体腔への漏出は無視されるべきではありません。
33Gの鈍針を使用して、hESC由来の視細胞前駆細胞を網膜下腔に導入するために、扁平部アプローチを採用しました。このアプローチでは、注射針は辺縁部の切開部から挿入されました。次に、針を硝子体腔に通し、最終的に網膜から網膜下腔にアクセスしました。細胞の凝集がしばしば観察され、不適切な針サイズを使用すると細胞の送達が妨げられる可能性があります。マイクロチューブ内の細胞の再懸濁は、注射シリンジにロードする前に、10 μLのピペットチップを使用して入念に行う必要があります。当初は34Gの針を使用しようとしましたが、細胞による針の閉塞がよく観察されました。針の適切なサイズは、特定の細胞タイプ、特に狭口径の針は、50を注入したときにより少ない生存細胞を与える傾向があります。このアプローチの利点の1つは、注射中に直接可視化できることで、外科医は細胞送達のための特定の場所を監視し、慎重に選択することができます。注射部位と針は、施術中にはっきりと見えるはずです。麻酔による白内障や角膜混濁は、特定の場所への細胞の適切な送達に大きく影響します。
注射中は、針を網膜に垂直に貫通させ、針の鈍い端を強膜と平行にして、注射した細胞の硝子体腔への漏出を最小限に抑えます(図3)。注射を行うときは、シリンジに穏やかな圧力のみを加える必要があります。.強い圧力は、網膜裂傷、出血、脈絡膜腔への細胞の漏出、細胞の針の通過の失敗、および眼球の穿刺につながる可能性があります。針先が網膜を通過したばかりの場合に最適な圧力が保証され、針先に小さな白い圧力点が見られます。注射後、注射した細胞が硝子体腔に漏れるのを防ぐために、注射スポットから針をゆっくりと静かに引っ込める必要があります。
このアプローチの限界は、学習曲線が難しいことです。ある研究では、訓練を受けた眼科医が95%の成功率を達成するためには、マウスに364回の注射を行う必要があり、外科手術の経験が浅い研修生は、より多くの訓練を必要とすると予想されたことが示されました46。このアプローチの合併症には、網膜の針跡、硝子体腔への細胞の逆流、脈絡膜/網膜からの出血、および医原性白内障が含まれます。しかし、十分な量のトレーニングを積めば、これらの合併症は観察されることが著しく少なくなります46。
結論として、我々の方法は、OCTスキャンによって明らかに示されているように、ヒトESC由来の視細胞前駆細胞を rd10 マウスの網膜下腔に送達することができます。このアプローチは、網膜外部およびRPE関連疾患の治療のための新規治療化合物、異なる細胞型移植、および遺伝子治療の探索に採用できます。
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Disclosures
Hwee Goon Tayは、Alder Therapeutics ABの共同設立者です。他の著者は、競合する利害関係がないと宣言しています。
Acknowledgments
凍結保存後32日目のヒトES細胞由来光受容体前駆細胞の調製に技術支援を提供してくれたWei Sheng Tan氏、Luanne Chiang Xue Yen氏、Xinyi Lee氏、Yingying Chung氏に感謝します。この研究の一部は、National Medical Research Council Young Investigator Research Grant Award(NMRC/OFYIRG/0042/2017)およびNational Research Foundation24th Competitive Research Program Grant(CRP24-2020-0083)からH.G.T.への助成金によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3% Tobramycin | Novartis | NDC 0078-0813-01 | Tobrex (3.5 g) |
| 0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone | Novartis | NDC 0078-0876-01 | Tobradex (3.5 g) |
| 0.5% Proparacaine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0016-15 | 0.5% Alcaine (15 mL) |
| 1 mL Tuberculin syringe | Turemo | SS01T2713 | |
| 1% Tropicamide | Alcon | NDC 0998-0355-15 | 1% Mydriacyl (15 mL) |
| 2.5% Phenylephrine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0342-05 | 2.5% Mydfrin (5 mL) |
| 24-well tissue culture plate | Costar | 3526 | |
| 30 G Disposable needle | Becton Dickinson (BD) | 305128 | |
| 33 G, 20 mm length blunt needles | Hamilton | 7803-05 | |
| Automated Cell Counter | NanoEnTek | Model: Eve | |
| B27 without Vitamin A | Life Technologies | 12587001 | 2%36 |
| Buprenorphine | Ceva | Vetergesic vet (0.3 mg/mL) | |
| CKI-7 | Sigma | C0742 | 5 µM36 |
| Cyclosporine | Novartis | 260 g/L in drinking water | |
| Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells | DUKE-NUS Medical School | Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36. | |
| Gauze | Winner Industries Co. Ltd. | 1SNW475-4 | |
| Glasgow Minimum Essential Medium | Gibco | 11710–035 | |
| hESC cell line H1 | WiCell Research Institute | WA01 | |
| Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02-50 | 10 ng/mL36 |
| Human ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Prospec-Tany Technogene | CYT-272 | 10 ng/mL36 |
| Ketamine hydrochloride (100 mg/mL) | Ceva Santé Animale | KETALAB03 | |
| LN-521 | Biolamina | LN521-02 | 1 µg36 |
| mFreSR | STEMCELL Technologies | 5854 | |
| Microlitre glass syringe (10 mL) | Hamilton | 7653-01 | |
| N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT) | Selleckchem | S2215 | 10 µM36 |
| N-2 supplement | Life Technologies | A13707-01 | 1%36 |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140–050 | 1x36 |
| NutriStem XF Media | Satorius | 05-100-1A | |
| Operating microscope | Zeiss | OPMI LUMERA 700 | With Built-in iOCT function |
| PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml) | DUKE-NUS Medical School | See media composition36. Basal Medium, 10 µM DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 µM Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA). | |
| Pyruvate | Gibco | 11360–070 | 1 mM36 |
| Rd10 mice | Jackson Laboratory | B6.CXB1-Pde6brd10/J mice | Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g |
| Retinoic acid | Tocris Bioscience | 0695/50 | 0.5 µM36 |
| Round Cover Slip (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| SB431542 | Sigma | S4317 | 0.5 µM36 |
| Vidisic Gel (10 g) | Dr. Gerhard Mann | ||
| Xylazine hydrochloride (20 mg/mL) | Troy Laboratories | LI0605 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985–023 | 0.1 mM36 |
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