Summary
Descrevemos um protocolo detalhado para a preparação de células progenitoras fotorreceptoras derivadas de hESC pós-criopreservadas e a liberação sub-retiniana dessas células em camundongos rd10 .
Abstract
A regeneração de células fotorreceptoras utilizando células-tronco pluripotentes humanas é uma terapia promissora para o tratamento de doenças retinianas hereditárias e envelhecidas em estágios avançados. Mostramos que a matriz isoforme de laminina recombinante específica da retina humana é capaz de apoiar a diferenciação de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) em progenitores fotorreceptores. Além disso, a injeção sub-retiniana dessas células também mostrou restauração parcial nos modelos rd10 de roedores e coelhos. A injeção sub-retiniana é conhecida por ser um método estabelecido que tem sido usado para entregar compostos farmacêuticos às células fotorreceptoras e à camada epitelial pigmentada da retina (EPR) do olho devido à sua proximidade com o espaço alvo. Ele também tem sido usado para entregar vetores virais adenoassociados no espaço sub-retiniano para tratar doenças da retina. A entrega sub-retiniana de compostos farmacêuticos e células no modelo murino é desafiadora devido à restrição no tamanho do globo ocular murino. Este protocolo descreve o procedimento detalhado para a preparação de células progenitoras fotorreceptoras derivadas de hESC para injeção e a técnica de liberação sub-retiniana dessas células em camundongos mutantes genéticos da retinose pigmentosa, rd10. Esta abordagem permite a terapia celular para a área alvo, em particular a camada nuclear externa da retina, onde ocorrem doenças que levam à degeneração dos fotorreceptores.
Introduction
Doenças hereditárias da retina e degeneração macular relacionada à idade levam à perda de células fotorreceptoras e eventual cegueira. O fotorreceptor retiniano é a camada do segmento externo da retina composta por células especializadas responsáveis pela fototransdução (isto é, conversão de luz em sinais neuronais). As células fotorreceptoras do bastonete e do cone estão adjacentes à camada pigmentada da retina (EPR)1. A terapia de reposição de células fotorreceptoras para compensar a perda celular tem sido uma abordagem terapêutica emergente e em desenvolvimento. Células-tronco embrionárias (CTEs)2,3,4, células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) derivadas de EPRs e células progenitoras da retina (RPCs)4,5,6,7,8 foram usadas para restaurar as células fotorreceptoras danificadas. O espaço sub-retiniano, um espaço confinado entre a retina e o EPR, é um local atraente para depositar essas células para substituir as células fotorreceptoras danificadas, o EPR e as células de Mueller devido à sua vizinhança9,10,11.
Terapias gênicas e celulares têm utilizado o espaço sub-retiniano para medicina regenerativa para várias doenças retinianas em estudos pré-clínicos. Isso inclui a entrega de cópias funcionais do gene ou ferramentas de edição gênica na forma de terapia anti-senso com oligonucleotídeos12,13 ou CRISPR/Cas9 ou edição de base via estratégia baseada em vírus adenoassociado (AAV) 14,15,16, implantação de materiais (por exemplo, folha de EPR, próteses retinianas 17,18,19) e organoides retinianos derivados de células-tronco diferenciadas 20,21,22 para tratar doenças retinianas e relacionadas à EPR. Ensaios clínicos utilizando hESC-RPE31 no espaço sub-retiniano para tratar amaurose congênita de Leber (LCA) associada ao EPR6523,24, acromatopsia ligada ao CNGA325, retinite pigmentosa associada a MERTK26, coroideremia 27,28,29,30 provaram ser uma abordagem eficaz. A injeção direta de células nas proximidades da área danificada melhora muito a chance de assentamento celular na região apropriada, integração sináptica e eventual melhora visual.
Embora a injeção sub-retiniana em modelos humanos e de olhos grandes (i.e., porco 32,33,34,35, coelho 36,37,38,39,40 e primata não humano 41,42,43) tenha sido estabelecida, tal injeção no modelo murino ainda é desafiadora devido à restrição do tamanho do globo ocular e enorme lente ocupando o olho do rato 44,45,46. No entanto, modelos geneticamente modificados só estão prontamente disponíveis em pequenos animais e não em animais de grande porte (ou seja, coelhos e primatas não humanos), portanto, a injeção sub-retiniana em camundongos chama a atenção para investigar novas abordagens terapêuticas em doenças genéticas da retina. Três abordagens principais estão sendo usadas para entregar células ou AAVs no espaço sub-retiniano: a via transcorneana, a via transescleral e a via pars plana (ver Figura 2). As vias transcórnea e transescleral estão associadas à formação de catarata, sinéquias, sangramento de coroide e refluxo do local da injeção 11,44,45,47,48,49. Adotamos a abordagem pars plana como visualização direta do processo de injeção, e o local de injeção pode ser obtido em tempo real ao microscópio.
Recentemente, descrevemos um método que pode diferenciar células-tronco embrionárias humanas (hESCs) em progenitores fotorreceptores sob condições xenofree, quimicamente definidas, usando a isoforma LN523 recombinante de laminina específica da retina humana. Uma vez que o LN523 estava presente na retina, hipotetizamos que o nicho da matriz extracelular da retina humana poderia ser recapitulado in vitro e, assim, apoiar a diferenciação dos fotorreceptores das hESCs36. A análise transcriptômica de célula única mostrou que progenitores fotorreceptores co-expressando homeobox e recuperatina cone-rod foram gerados após 32 dias. Um modelo mutante de camundongo com degeneração retiniana 10 (rd10) que imita retinose pigmentar humana autossômica foi usado para avaliar a eficácia dos progenitores de fotorreceptores derivados do hESC do dia 32 in-vivo. As células progenitoras do fotorreceptor derivadas do hESC foram injetadas no espaço sub-retiniano de camundongos rd10 em P20, onde a disfunção e a degeneração dos fotoceptores estão em curso36. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a preparação dos progenitores fotorreceptores derivados de hESC pós-criopreservados e liberação no espaço sub-retiniano de camundongos rd10 . Este método também pode ser usado para administrar AAVs, suspensões celulares, peptídeos ou produtos químicos no espaço sub-retiniano em camundongos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Os experimentos in vivo foram realizados de acordo com as diretrizes e protocolos aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee of SingHealth (IACUC) e pela Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Statement para o uso de animais em Pesquisa Oftalmológica e da Visão. Os filhotes foram imunossuprimidos de P17 (pré-transplante) a P30 (pós-transplante) alimentando-os com água potável contendo ciclosporina (260 g/L).
1. Preparação de progenitores fotorreceptores derivados de hESC do Dia 32 após criopreservação
- Meio de diferenciação fotorreceptor pré-aquecido (PRDM) em banho-maria a 37 °C.
- Recuperar um criovial contendo células progenitoras fotorreceptoras derivadas de hESC do dia 32 a partir de nitrogênio líquido. Mantenha no gelo seco.
- Descongelar o criovial a 37 °C em banho-maria por 3-5 min. Ressuspender no dia 32 células em 1 mL de PRDM e centrifugar a 130 x g por 4 min.
- Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de PRDM.
- Remover 10 μL da mistura para contagem celular. Misture as células usando 0,2% de azul de tripano de acordo com as instruções do fabricante. Pipetar a mistura de células para a lâmina da câmara de contagem de células. Determine o número e a viabilidade de células por contador de células automatizado.
- Prossiga para a próxima etapa quando a viabilidade celular estiver acima de 70%. Centrifugar a suspensão de células restantes a 130 x g por 4 min. Retirar o sobrenadante e ressuspender o pellet de células em PRDM na concentração de 3 x 105 células/μL para transplante.
- Observe se há aglomerados celulares visíveis. Ressuspenda os aglomerados celulares repetidamente usando uma ponta de pipeta de 10 μL no tubo de microfuga até que nenhum aglomerado celular visível seja observado. Coloque na seringa de injeção 33G para observar a extrusão da solução celular através da agulha.
2. Liberação sub-retiniana das hESCs em camundongos rd10
- Preparo dos animais
- Anestesiar o camundongo (P20, macho/fêmea, 3-6 g) usando uma combinação de cetamina (20 mg/kg de peso corporal) e xilazina (2 mg/kg de peso corporal) em uma seringa tuberculínica de 1 mL conectada a uma agulha 27G por abordagem intraperitoneal. Administrar uma injeção subcutânea de buprenorfina (0,05 mg/kg) no camundongo como analgésico preventivo.
- Após a administração da anestesia, instilar uma gota cada de tropicamida a 1% e fenilefrina a 2,5% para dilatação pupilar. Aplique um gel oftálmico na córnea para evitar o ressecamento do olho e catarata relacionada à anestesia.
- Coloque o rato numa gaiola vazia até ficar totalmente anestesiado. Avalie o nível anestésico adequado apertando a pata e confirme se o animal não reage ao pinça dura.
- Quando o rato estiver totalmente anestesiado, coloque o animal numa almofada quente regulada a 38 °C.
- Entrega sub-retiniana das células
- Para usar uma abordagem de pars plana transvítrea de 1 porta, como feito aqui, execute a injeção sub-retiniana em um ambiente estéril. Use um microscópio cirúrgico vertical com um caminho de luz direto para realizar a injeção.
- Prepare a seringa de vidro de 10 μL removendo o cubo da agulha. Monte a agulha romba 33G na seringa de vidro. Pegue a tampa do cubo de metal e prenda cuidadosamente a agulha na seringa.
- Lave com água destilada para verificar se há sinais de vazamento e patência da agulha. Esvazie a seringa e coloque-a ao lado com cuidado.
- Coloque o rato anestesiado em um travesseiro, com o olho de tratamento olhando diretamente para a objetiva do microscópio. Aplicar o cloridrato de proparacaína a 0,5% e aguardar 30 s. Aplique 150 μL de gel oftálmico no olho e coloque uma tampa redonda sobre ele.
- Realize um exame áspero do olho observando a córnea, íris, pupila, lente e conjuntiva. Através da pupila, visualize o fundo do olho do mouse ajustando o plano focal. Ajuste a cabeça até que a cabeça óptica esteja posicionada no centro da pupila e minimize o movimento da cabeça posicionando-se adequadamente no travesseiro.
- Bata suavemente na base do tubo com as hESCs várias vezes para obter uma suspensão de célula uniforme. Usando a seringa de microlitro de vidro de 10 μL com uma agulha romba 33G, retire 2 μL de células/meio. Retire as células imediatamente antes da injeção para evitar o assentamento/aglomeração celular na seringa.
- Usando uma agulha descartável 30G, faça uma ferida de esclerectomia 2 mm atrás do limbo. Mantenha o ângulo da agulha em ~45° para evitar tocar na lente. Uma vez que a ponta da agulha é visualizada no olho, retire suavemente a agulha. Descarte a agulha no compartimento afiado após o uso para evitar ferimentos por picada de agulha.
- Pegue a seringa de vidro e insira a agulha romba na ferida de esclerectomia. Sem tocar na lente, avance a agulha romba até atingir a retina oposta da ferida de entrada. Certifique-se de que a área de injeção está livre dos principais vasos sanguíneos da retina para evitar hemorragias.
- Penetre suavemente na retina até que um ramo de pressão na esclera seja visto. Mantenha a extremidade romba da agulha paralela à esclera para evitar o vazamento das células para o espaço vítreo.
- Injete lentamente 2 μL de suspensão celular ou meio PRDM (controle) no espaço sub-retiniano enquanto a pressão suave é mantida na seringa. Com uma injeção bem-sucedida, uma mancha visível (ou seja, retina elevada com a suspensão/mídia celular) deve ser formada no local da injeção.
NOTA: Apenas uma pressão suave deve ser usada durante a injeção para evitar o rasgo da retina e o bloqueio das células na ponta da agulha. - Depois de confirmar a bolha, aguarde 10 s para deixar as células se acomodarem. Retraia suavemente a agulha do olho.
- Tomografia de coerência óptica (OCT) intraoperatória (OCT) da bolha (opcional)
- Posicione o olho do mouse para visualizar a mancha sob o microscópio, movendo lentamente a cabeça. Fixe a posição segurando suavemente a cabeça. Nenhuma dilatação pupilar adicional é necessária. Não retire a tampa e o gel no olho. Ele dá uma mídia óptica clara para visualizar o bleb.
- Execute a OCT intraoperatória usando a função iOCT integrada do microscópio cirúrgico.
- Pressione a opção Cubo na tela da OCT e posicione a área de digitalização no bleb pressionando os botões de seta . Ajuste a OCT deslizando Centralização e Foco para obter a melhor qualidade da OCT. Pressione Capturar/Digitalizar para adquirir a varredura da OCT da área de bleb. Revise as imagens para verificar a qualidade das digitalizações.
- Recuperação
- Retire a tampa e limpe o gel do olho com gaze. Aplique pomada antibiótica uma vez após a injeção para prevenir a infecção.
- Permitir que o animal se recupere da anestesia sob uma luz quente até que recupere a consciência suficiente para manter a decúbito esternal e retornar à gaiola de origem. Monitore o animal por pelo menos 3 dias após a injeção em busca de sinais de inflamação, infecção e angústia.
NOTA: A luz quente de 150 W deve estar a pelo menos 30 cm de distância da gaiola do animal, e deve-se tomar cuidado para evitar uma lesão por queimadura. - Administrar uma injeção subcutânea de buprenorfina (0,05 mg/kg) 8 de hora em hora por 1 dia ou por recomendação do veterinário. Se for observada inflamação ou infecção do olho, consulte um profissional veterinário para o tratamento adequado.
- Limpeza e esterilização dos instrumentais
- Lave a seringa de microlitro de vidro de 10 μL e a agulha romba 33G com etanol 100% 10x. Lave o etanol piscando a seringa com água destilada.
- Dissimule a seringa de vidro e a agulha. Seque a seringa para armazenamento.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A seringa de vidro de 10 μL foi montada de acordo com as instruções do fabricante (Figura 1), e a agulha romba usada para entregar a suspensão/meio celular é mostrada na Figura 1B. Diferentes abordagens para injeção sub-retiniana são ilustradas na Figura 2. Descrevemos a abordagem pars plana neste protocolo (Figura 2C). A agulha romba montada em uma seringa de vidro foi inserida através de uma ferida de esclerotomia e acessou o espaço sub-retiniano em todo o globo. Como mostrado na Figura 3A, o trajeto da agulha, a penetração através da retina e a liberação das células foram monitorados diretamente ao microscópio ao realizar a injeção. O sucesso da liberação das células/meios foi confirmado pela observação de uma bolha no local da injeção (Figura 3B). Uma mancha bem-sucedida pode ser identificada como uma cor esbranquiçada clara que se assemelha a um balão de água. Uma falha na entrega é observada pelo vazamento das células/meios para o espaço vítreo no local da injeção e falha na formação de uma bolha. O OCT foi realizado na área injetada, e o exame mostrou hESCs individualizadas flutuantes no olho tratado com células (Figura 4A), enquanto o olho tratado com mídia mostrou líquido claro, sem células no espaço sub-retiniano (Figura 4B). As hESCs individualizadas são identificadas como materiais hiperreflexivos distribuídos no espaço sub-retiniano (Figura 4A). A taxa de sucesso da injeção foi calculada observando-se o número de olhos com sucesso na formação da bolha. Foram incluídas as aplicações que adotaram essa abordagem em nosso laboratório e a taxa de sucesso das injeções (Tabela 1).
Figura 1: Instrumentos utilizados durante a injeção. (A) A seringa de vidro de 10 μL é montada com uma agulha romba 33G. (B) Imagem de zoom da agulha romba 33G. (C) Travesseiro para a cabeça do animal descansar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Diferentes vias de injeção sub-retiniana. (A) Via transcórnea: A agulha de injeção passa através da córnea e da pupila para entrar no espaço sub-retiniano. (B) Via transescleral: O espaço sub-retiniano é acessado diretamente através da esclera. (C) Via Pars plana: A agulha de injeção é inserida no espaço vítreo através de uma incisão no limbo. A agulha atinge o espaço sub-retiniano penetrando na retina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagens fundoscópicas do olho durante a injeção sub-retiniana. (A) Antes da injeção sub-retiniana, a ponta da agulha podia ser vista no espaço vítreo tocando a retina, evitando os principais vasos sanguíneos da retina. (B) Após a injeção sub-retiniana, uma mancha visível foi formada no local da injeção (linha pontilhada amarela). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Exames intraoperatórios de OCT dos olhos injetados. Os exames foram feitos imediatamente após a injeção. (A) olho tratado com hESCs: o painel superior mostrou a localização do exame de OCT (linhas transversais ciano e rosa) no olho; As hESCs foram observadas no olho tratado no espaço sub-retiniano (linha pontilhada amarela, painéis médio e inferior). (B) Olho mediano: o painel superior mostrou a localização do exame de OCT (linhas transversais ciano e rosa) no olho; Líquido claro sem células foi observado no espaço sub-retiniano no olho injetado na mídia (linha pontilhada amarela, painéis médio e inferior). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Aplicativos | Cepa do destinatário | Taxa de Sucesso |
| AAV | Rpe65rd12/J | 80% |
| AAV | C57BL/6 | 95% |
| Células progenitoras derivadas de hESC | Rd10-/- | 95% |
Tabela 1: Taxa de sucesso da injeção sub-retiniana em diferentes aplicações.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A injeção sub-retiniana tem sido utilizada para transplante de suspensão celular para tratamento de EPR e doenças retinianas23,25,26,27,28,31,40. Esta abordagem é altamente essencial em estudos com roedores, não apenas para abordagens de transplante celular e terapia gênica, mas também para avaliar novos compostos terapêuticos para doenças da retina. Atualmente, três rotas principais estão sendo usadas para entregar células ou AAVs no espaço sub-retiniano, ou seja, via transcórnea, vias transescleral e pars plana.
Na abordagem transcórnea, a agulha de injeção passa pela córnea, pupila e, por último, pela retina para entregar as células no espaço sub-retiniano e formar uma bolha bem-sucedida. A vantagem da abordagem transcórnea é a capacidade de criar um descolamento completo de retina no receptor47. Pode entregar um número maior de células; no entanto, a observação longitudinal para estudar a conformação estrutural e a integração celular é um desafio nessa abordagem. Além disso, as complicações incluem formação de catarata, sinéquias e opacidade corneana, tornando as observações longitudinais desafiadoras11,45,47,48. Alternativamente, a abordagem transescleral também é usada para liberar o AAV para o espaço sub-retiniano44,49. Essa abordagem é útil para camundongos neonatais e considerada mais segura, pois não é necessário que a agulha passe pelos meios oculares. No entanto, sangramento de coroide, refluxo da solução do local da injeção, perfuração da retina e vazamento para o espaço vítreo não devem ser ignorados.
Adotamos a abordagem pars plana para introduzir os progenitores fotorreceptores derivados da hESC no espaço sub-retiniano usando uma agulha romba 33G. Nessa abordagem, a agulha de injeção foi inserida através da incisão na área do limbo. A agulha foi então passada através da cavidade vítrea e, finalmente, acessada o espaço sub-retiniano através da retina. Aglomerados celulares foram frequentemente observados e podem bloquear a entrega de células quando se usam tamanhos inadequados de agulhas. A ressuspensão das células no tubo de microfuga deve ser realizada diligentemente usando uma ponta de pipeta de 10 μL antes de carregar na seringa de injeção. Inicialmente, procurou-se utilizar uma agulha 34G, onde o bloqueio da agulha pelas células era frequentemente observado. Um tamanho adequado da agulha deve ser testado para tipos celulares específicos, especialmente agulhas de calibre estreito tendem a dar células menos viáveis quando injetadas50. Uma das vantagens dessa abordagem é a visualização direta durante a injeção, permitindo que o cirurgião monitore e selecione cuidadosamente o local específico para a entrega celular. A área de injeção e a agulha devem ser claramente visíveis durante o procedimento. A catarata induzida pela anestesia e a opacidade da córnea podem afetar muito a entrega adequada das células em um local específico.
Durante a injeção, a agulha deve penetrar perpendicularmente na retina e a extremidade romba da agulha deve estar paralela à esclera para minimizar o vazamento das células injetadas para o espaço vítreo (Figura 3). Apenas uma pressão suave deve ser aplicada à seringa ao realizar a injeção. Uma forte pressão pode levar a rupturas da retina, hemorragia, vazamento das células para o espaço coroidal, falha das células em passar pela agulha e punção do globo ocular. A pressão ideal pode ser assegurada quando a ponta da agulha acaba de passar pela retina, e um pequeno ponto de pressão branco é visto na ponta da agulha. Após a injeção, a agulha deve ser retraída lenta e suavemente do local de injeção para evitar o vazamento de células injetadas para o espaço vítreo.
A limitação dessa abordagem é a desafiadora curva de aprendizado. Um estudo mostrou que um oftalmologista treinado precisava realizar 364 injeções em camundongos para atingir uma taxa de sucesso de 95%, enquanto estagiários menos experientes e com experiência cirúrgica deveriam exigir um número maior de treinamentos46. As complicações dessa abordagem incluem trajeto de agulha na retina, refluxo de células para o espaço vítreo, sangramento da coroide/retina e catarata iatrogênica. No entanto, com uma quantidade suficiente de treinamento, essas complicações são significativamente menos observadas46.
Em conclusão, nosso método pode entregar os progenitores fotorreceptores derivados da hESC no espaço sub-retiniano de camundongos rd10 , como evidentemente demonstrado pelos exames de OCT. Essa abordagem pode ser adotada para explorar novos compostos terapêuticos, diferentes tipos de transplante celular e terapia gênica para o tratamento de retina externa e doenças relacionadas ao EPR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hwee Goon Tay é co-fundador da Alder Therapeutics AB. Outros autores declaram não haver interesses concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos a Wei Sheng Tan, Luanne Chiang Xue Yen, Xinyi Lee e Yingying Chung por fornecerem assistência técnica para a preparação do dia 32 progenitores fotorreceptores derivados de hESC após criopreservação. Este trabalho foi apoiado em parte por subsídios do National Medical Research Council Young Investigator Research Grant Award (NMRC/OFYIRG/0042/2017) e National Research Foundation24th Competitive Research Program Grant (CRP24-2020-0083) para H.G.T.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3% Tobramycin | Novartis | NDC 0078-0813-01 | Tobrex (3.5 g) |
| 0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone | Novartis | NDC 0078-0876-01 | Tobradex (3.5 g) |
| 0.5% Proparacaine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0016-15 | 0.5% Alcaine (15 mL) |
| 1 mL Tuberculin syringe | Turemo | SS01T2713 | |
| 1% Tropicamide | Alcon | NDC 0998-0355-15 | 1% Mydriacyl (15 mL) |
| 2.5% Phenylephrine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0342-05 | 2.5% Mydfrin (5 mL) |
| 24-well tissue culture plate | Costar | 3526 | |
| 30 G Disposable needle | Becton Dickinson (BD) | 305128 | |
| 33 G, 20 mm length blunt needles | Hamilton | 7803-05 | |
| Automated Cell Counter | NanoEnTek | Model: Eve | |
| B27 without Vitamin A | Life Technologies | 12587001 | 2%36 |
| Buprenorphine | Ceva | Vetergesic vet (0.3 mg/mL) | |
| CKI-7 | Sigma | C0742 | 5 µM36 |
| Cyclosporine | Novartis | 260 g/L in drinking water | |
| Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells | DUKE-NUS Medical School | Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36. | |
| Gauze | Winner Industries Co. Ltd. | 1SNW475-4 | |
| Glasgow Minimum Essential Medium | Gibco | 11710–035 | |
| hESC cell line H1 | WiCell Research Institute | WA01 | |
| Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02-50 | 10 ng/mL36 |
| Human ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Prospec-Tany Technogene | CYT-272 | 10 ng/mL36 |
| Ketamine hydrochloride (100 mg/mL) | Ceva Santé Animale | KETALAB03 | |
| LN-521 | Biolamina | LN521-02 | 1 µg36 |
| mFreSR | STEMCELL Technologies | 5854 | |
| Microlitre glass syringe (10 mL) | Hamilton | 7653-01 | |
| N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT) | Selleckchem | S2215 | 10 µM36 |
| N-2 supplement | Life Technologies | A13707-01 | 1%36 |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140–050 | 1x36 |
| NutriStem XF Media | Satorius | 05-100-1A | |
| Operating microscope | Zeiss | OPMI LUMERA 700 | With Built-in iOCT function |
| PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml) | DUKE-NUS Medical School | See media composition36. Basal Medium, 10 µM DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 µM Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA). | |
| Pyruvate | Gibco | 11360–070 | 1 mM36 |
| Rd10 mice | Jackson Laboratory | B6.CXB1-Pde6brd10/J mice | Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g |
| Retinoic acid | Tocris Bioscience | 0695/50 | 0.5 µM36 |
| Round Cover Slip (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| SB431542 | Sigma | S4317 | 0.5 µM36 |
| Vidisic Gel (10 g) | Dr. Gerhard Mann | ||
| Xylazine hydrochloride (20 mg/mL) | Troy Laboratories | LI0605 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985–023 | 0.1 mM36 |
References
- Molday, R. S., Moritz, O. L.
- Aboualizadeh, E., et al. Imaging Transplanted Photoreceptors in Living Nonhuman Primates with Single-Cell Resolution. Stem Cell Reports. 15 (2), 482-497 (2020).
- Petrus-Reurer, S., et al. Preclinical safety studies of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells for the treatment of age-related macular degeneration. Stem cells translational medicine. 9 (8), 936-953 (2020).
- Wang, S. T., et al. Transplantation of Retinal Progenitor Cells from Optic Cup-Like Structures Differentiated from Human Embryonic Stem Cells In Vitro and In Vivo Generation of Retinal Ganglion-Like Cells. Stem cells and development. 28 (4), 258-267 (2019).
- Wang, Z., et al. Intravitreal Injection of Human Retinal Progenitor Cells for Treatment of Retinal Degeneration. Medical Science Monitor: International Medical Journal of Experimental and Clinical Research. 26, e921184-e921191 (2020).
- Semo, M., et al. Efficacy and Safety of Human Retinal Progenitor Cells. Translational vision science & technology. 5 (4), 6 (2016).
- Luo, J., et al. Human Retinal Progenitor Cell Transplantation Preserves Vision. The Journal of Biological Chemistry. 289 (10), 6362 (2014).
- Liu, Y., et al. Long-term safety of human retinal progenitor cell transplantation in retinitis pigmentosa patients. Stem cell research & therapy. 8 (1), 209 (2017).
- Maia, M., et al. Effects of indocyanine green injection on the retinal surface and into the subretinal space in rabbits. Retina (Philadelphia, Pa). 24 (1), 80-91 (2004).
- Nickerson, J. M., et al. Subretinal delivery and electroporation in pigmented and nonpigmented adult mouse eyes. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 884, 53 (2012).
- Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. Subretinal Injection: A Review on the Novel Route of Therapeutic Delivery for Vitreoretinal Diseases. Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).
- Murray, S. F., et al. Allele-Specific Inhibition of Rhodopsin With an Antisense Oligonucleotide Slows Photoreceptor Cell Degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6362 (2015).
- Cideciyan, A. V., et al. Mutation-independent rhodopsin gene therapy by knockdown and replacement with a single AAV vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), E8547-E8556 (2018).
- Maeder, M. L., et al. Development of a gene-editing approach to restore vision loss in Leber congenital amaurosis type 10. Nature medicine. 25 (2), 229-233 (2019).
- Katrekar, D., et al. In vivo RNA editing of point mutations via RNA-guided adenosine deaminases. Nature methods. 16 (3), 239 (2019).
- Ong, T., Pennesi, M. E., Birch, D. G., Lam, B. L., Tsang, S. H. Adeno-Associated Viral Gene Therapy for Inherited Retinal Disease. Pharmaceutical Research. 36 (2), 34 (2019).
- Pardue, M. T., et al. Neuroprotective effect of subretinal implants in the RCS rat. Investigative ophthalmology & visual science. 46 (2), 674-682 (2005).
- Liu, Z., et al. Surgical Transplantation of Human RPE Stem Cell-Derived RPE Monolayers into Non-Human Primates with Immunosuppression. Stem cell reports. 16 (2), 237-251 (2021).
- Martinez Camarillo, J. C., et al. Development of a Surgical Technique for Subretinal Implants in Rats. Journal of visualized experiments: JoVE. (190), e64585 (2022).
- Xue, Y., et al. The Prospects for Retinal Organoids in Treatment of Retinal Diseases. Asia-Pacific Journal of Ophthalmology. 11 (4), 314-327 (2022).
- McLelland, B. T., et al. Transplanted hESC-derived retina organoid sheets differentiate, integrate, and improve visual function in retinal degenerate rats. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (6), 2586-2603 (2018).
- Lin, B., et al. Retina organoid transplants develop photoreceptors and improve visual function in RCS rats with RPE dysfunction. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 61 (11), 34 (2020).
- Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet (London, England). 390 (10097), 849-860 (2017).
- Testa, F., et al. Three Year Follow-Up after Unilateral Subretinal Delivery of Adeno-Associated Virus in Patients with Leber Congenital Amaurosis Type 2. Ophthalmology. 120 (6), 1283 (2013).
- Fischer, M. D., et al. Safety and Vision Outcomes of Subretinal Gene Therapy Targeting Cone Photoreceptors in Achromatopsia: A Nonrandomized Controlled Trial. JAMA ophthalmology. 138 (6), 643-651 (2020).
- Ghazi, N. G., et al. Treatment of retinitis pigmentosa due to MERTK mutations by ocular subretinal injection of adeno-associated virus gene vector: results of a phase I trial. Human genetics. 135 (3), 327-343 (2016).
- MacLaren, R. E., et al. Retinal gene therapy in patients with choroideremia: initial findings from a phase 1/2 clinical trial. Lancet (London, England). 383 (9923), 1129-1137 (2014).
- Lam, B. L., et al. Choroideremia Gene Therapy Phase 2 Clinical Trial: 24-Month Results. American journal of ophthalmology. 197, 65-73 (2019).
- Xue, K., et al. Beneficial effects on vision in patients undergoing retinal gene therapy for choroideremia. Nature medicine. 24 (10), 1507-1512 (2018).
- Zhai, Y., et al. AAV2-Mediated Gene Therapy for Choroideremia: 5-Year Results and Alternate Anti-sense Oligonucleotide Therapy. American Journal of Ophthalmology. 248, 145-156 (2023).
- Schwartz, S. D., Tan, G., Hosseini, H., Nagiel, A. Subretinal Transplantation of Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelium for the Treatment of Macular Degeneration: An Assessment at 4 Years. Investigative ophthalmology & visual science. 57 (5), ORSFc1-ORSFc9 (2016).
- Vu, Q. A., et al. Structural changes in the retina after implantation of subretinal three-dimensional implants in mini pigs. Frontiers in Neuroscience. 16, 1010445 (2022).
- Spindler, L., et al. Controlled injection pressure prevents damage during subretinal injections in pigs. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (9), 5918-5918 (2018).
- Yang, K., et al. Robot-assisted subretinal injection system: development and preliminary verification. BMC Ophthalmology. 22 (1), 1-10 (2022).
- Olufsen, M. E., et al. Controlled Subretinal Injection Pressure Prevents Damage in Pigs. Ophthalmologica. Journal international d’ophtalmologie. International journal of ophthalmology. Zeitschrift fur Augenheilkunde. 245 (3), 285-293 (2022).
- Tay, H. G., et al. Photoreceptor laminin drives differentiation of human pluripotent stem cells to photoreceptor progenitors that partially restore retina function. Molecular therapy the journal of the American Society of Gene Therapy. 31 (3), 825-846 (2023).
- Petrus-Reurer, S., et al. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy. Journal of visualized experiments: JoVE. (131), e56702 (2018).
- Petrus-Reurer, S., et al. Integration of subretinal suspension transplants of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in a large-eyed model of geographic atrophy. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (2), 1314-1322 (2017).
- Babu, V. S., et al. Depleted Hexokinase1 and lack of AMPKα activation favor OXPHOS-dependent energetics in Retinoblastoma tumors. Translational research the journal of laboratory and clinical medicine. (23), 00108-00111 (2023).
- Plaza Reyes, A., et al. Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model. Stem cell reports. 6 (1), 9-17 (2016).
- Takahashi, K., et al. The influence of subretinal injection pressure on the microstructure of the monkey retina. PLoS ONE. 13 (12), e0209996 (2018).
- Tan, G. S. W., et al. Hints for Gentle Submacular Injection in Non-Human Primates Based on Intraoperative OCT Guidance. Translational Vision Science & Technology. 10 (1), 10-10 (2021).
- Yiu, G., et al. Suprachoroidal and Subretinal Injections of AAV Using Transscleral Microneedles for Retinal Gene Delivery in Nonhuman Primates. Molecular therapy. Methods & clinical development. 16, 179-191 (2020).
- Mühlfriedel, R., Michalakis, S., Garrido, M. G., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized Technique for Subretinal Injections in Mice. Methods in Molecular Biology. 935, 343-349 (2012).
- Huang, P., et al. Subretinal injection in mice to study retinal physiology and disease. Nature Protocols. 17 (6), 1468-1485 (2022).
- Huang, P., et al. The Learning Curve of Murine Subretinal Injection Among Clinically Trained Ophthalmic Surgeons. Translational Vision Science & Technology. 11 (3), 13 (2022).
- Qi, Y., et al. Trans-Corneal Subretinal Injection in Mice and Its Effect on the Function and Morphology of the Retina. PLOS ONE. 10 (8), e0136523 (2015).
- Irigoyen, C., et al. Subretinal Injection Techniques for Retinal Disease: A Review. Journal of Clinical Medicine. 11 (16), 4717 (2022).
- Parikh, S., et al. An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach. Journal of visualized experiments: JoVE. (118), e54808 (2016).
- Amer, M. H., White, L. J., Shakesheff, K. M. The effect of injection using narrow-bore needles on mammalian cells: Administration and formulation considerations for cell therapies. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (5), 640-650 (2015).
