Summary
Kriyoprezervasyon sonrası hESC kaynaklı fotoreseptör progenitör hücrelerin hazırlanması ve bu hücrelerin rd10 farelerde retina altı verilmesi için ayrıntılı bir protokol tanımladık.
Abstract
İnsan pluripotent kök hücreleri kullanılarak fotoreseptör hücrelerin rejenerasyonu, hem kalıtsal hem de yaşlanan retina hastalıklarının ileri evrelerde tedavisi için umut verici bir tedavidir. İnsan rekombinant retinaya özgü laminin izoform matrisinin, insan embriyonik kök hücrelerinin (hESC'ler) fotoreseptör progenitörlerine farklılaşmasını destekleyebildiğini gösterdik. Ek olarak, bu hücrelerin subretinal enjeksiyonu, rd10 kemirgen ve tavşan modellerinde kısmi restorasyon göstermiştir. Subretinal enjeksiyonun, hedef boşluğa yakınlığı nedeniyle gözün fotoreseptör hücrelerine ve retina pigmentli epitel (RPE) tabakasına farmasötik bileşikler vermek için kullanılan yerleşik bir yöntem olduğu bilinmektedir. Ayrıca, retina hastalıklarını tedavi etmek için adeno ile ilişkili viral vektörleri retina altı boşluğa iletmek için de kullanılmıştır. Fare modelindeki farmasötik bileşiklerin ve hücrelerin retina altı iletimi, murin göz küresinin boyutundaki kısıtlama nedeniyle zordur. Bu protokol, genetik retinitis pigmentosa mutant, rd10 farelerinde hESC'den türetilen fotoreseptör progenitör hücrelerin enjeksiyon için hazırlanması ve bu hücrelerin retina altı dağıtım tekniği için ayrıntılı prosedürü açıklar. Bu yaklaşım, hedeflenen bölgeye, özellikle de fotoreseptör dejenerasyonuna yol açan hastalıkların meydana geldiği retinanın dış nükleer tabakasına hücre tedavisine izin verir.
Introduction
Kalıtsal retina hastalıkları ve yaşa bağlı makula dejenerasyonu, fotoreseptör hücre kaybına ve sonunda körlüğe yol açar. Retina fotoreseptörü, fototransdüksiyondan (yani ışığın nöronal sinyallere dönüştürülmesinden) sorumlu özel hücrelerden oluşan retinanın dış segment tabakasıdır. Çubuk ve koni fotoreseptör hücreleri, retina pigmentli tabakaya (RPE) bitişiktir1. Hücre kaybını telafi etmek için fotoreseptör hücre replasman tedavisi ortaya çıkan ve gelişen bir terapötik yaklaşım olmuştur. Hasarlı fotoreseptör hücrelerini restore etmek için embriyonik kök hücreler (ESC'ler)2,3,4, indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) kaynaklı RPE hücreleri ve retinal progenitör hücreler (RPC'ler)4,5,6,7,8 kullanıldı. Retina ve RPE arasında sınırlı bir boşluk olan sub-retinal boşluk, çevresi nedeniyle hasarlı fotoreseptör hücreleri, RPE ve Mueller hücrelerini değiştirmek için bu hücreleri biriktirmek için çekici bir yerdir 9,10,11.
Gen ve hücre tedavileri, klinik öncesi çalışmalarda çeşitli retina hastalıkları için rejeneratif tıp için retina altı boşluğu kullanmaktadır. Bu, genin veya gen düzenleme araçlarının fonksiyonel kopyalarının anti-sens oligonükleotid tedavisi12,13 veya CRISPR/Cas9 veya adeno-ilişkili virüs (AAV) tabanlı strateji 14,15,16 yoluyla baz düzenleme, materyallerin implantasyonu (örneğin, RPE tabakası, retina protezleri 17,18,19) ve farklılaşmış kök hücre kaynaklı retinal organoidler 20,21,22 retina ve RPE ile ilişkili hastalıkları tedavi etmek için. RPE65 ile ilişkili Leber konjenital amauroz (LCA) 23,24, CNGA3 ile ilişkili akromatopsi25, MERTK ile ilişkili retinitis pigmentosa26, koroideremi 27,28,29,30 tedavi etmek için retina altı boşlukta hESC-RPE 31 kullanan klinik çalışmalar etkili bir yaklaşım olduğu kanıtlanmıştır. Hücrelerin hasarlı alanın çevresine doğrudan enjeksiyonu, uygun bölgede hücre yerleşimi, sinaptik entegrasyon ve nihai görsel iyileşme şansını büyük ölçüde artırır.
İnsan ve iri gözlü modellerde (yani domuz 32,33,34,35, tavşan36,37,38,39,40 ve insan olmayan primat 41,42,43) retina altı enjeksiyon yapılmış olsa da, murin modelinde bu tür bir enjeksiyon, göz küresi boyutunun kısıtlanması ve muazzam olması nedeniyle hala zordur. fare gözünü işgal eden lens 44,45,46. Bununla birlikte, genetiği değiştirilmiş modeller büyük hayvanlarda (yani tavşanlarda ve insan olmayan primatlarda) değil, yalnızca küçük hayvanlarda kolayca bulunur, bu nedenle farelerde retina altı enjeksiyon, retinal genetik bozukluklarda yeni terapötik yaklaşımları araştırmak için dikkat çekmektedir. Hücreleri veya AAV'leri retina altı boşluğa iletmek için trans-kornea yolu, trans-skleral yol ve pars plana yolu olmak üzere üç ana yaklaşım kullanılmaktadır (Bkz. Şekil 2). Transkorneal ve transskleral yollar katarakt oluşumu, sineşi, koroid kanaması ve enjeksiyon bölgesinden reflü ile ilişkilidir 11,44,45,47,48,49. Enjeksiyon işleminin doğrudan görselleştirilmesi olarak pars plana yaklaşımını benimsedik ve enjeksiyon bölgesi mikroskop altında gerçek zamanlı olarak elde edilebiliyor.
Yakın zamanda, rekombinant insan retinasına özgü laminin izoformu LN523 kullanılarak ksenofree, kimyasal olarak tanımlanmış koşullar altında insan embriyonik kök hücrelerini (hESC'ler) fotoreseptör progenitörlerine farklılaştırabilen bir yöntem tanımladık. LN523'ün retinada mevcut olduğu tespit edildiğinden, insan retinasının hücre dışı matriks nişinin in vitro olarak özetlenebileceğini ve böylece hESC'lerden36 fotoreseptör farklılaşmasını destekleyebileceğini varsaydık. Tek hücreli transkriptomik analiz, koni-çubuk homeobox ve recoverin'i birlikte eksprese eden fotoreseptör progenitörlerinin 32 gün sonra üretildiğini gösterdi. Otozomal insan retinitis pigmentosa'yı taklit eden bir retina dejenerasyonu 10 (rd10) mutant fare modeli, 32 hESC'den türetilen fotoreseptör progenitörlerinin etkinliğini in vivo olarak değerlendirmek için kullanıldı. hESC'den türetilen fotoreseptör progenitör hücreler, fotoseptör disfonksiyonu ve dejenerasyonunun devam ettiği P20'de rd10 farelerin retina altı boşluğuna enjekte edildi36. Burada, kriyoprezervasyon sonrası hESC türevi fotoreseptör progenitörlerinin hazırlanması ve rd10 farelerin retina altı boşluğuna verilmesi için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Bu yöntem aynı zamanda farelerde AAV'leri, hücre süspansiyonlarını, peptitleri veya kimyasalları retina altı boşluğa uygulamak için de kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
İn vivo deneyler, SingHealth Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) ve Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği (ARVO) tarafından Oftalmik ve Görme Araştırmalarında hayvanların kullanımına ilişkin Bildiri tarafından onaylanan kılavuzlara ve protokole uygun olarak yapılmıştır. Yavrular, siklosporin (260 g / L) içeren içme suyuyla beslenerek P17'den (nakil öncesi) P30'a (nakil sonrası) kadar immünosuprese edildi.
1. Kriyoprezervasyon sonrası 32. gün hESC'den türetilen fotoreseptör progenitörlerinin hazırlanması
- 37 °C'lik bir su banyosunda ön ısıtma fotoreseptör farklılaşma ortamı (PRDM).
- Sıvı nitrojenden 32. gün hESC'den türetilmiş fotoreseptör progenitör hücreleri içeren bir kriyoviyal alın. Kuru buz üzerinde tutun.
- Cryovial'i 37 °C'de bir su banyosunda 3-5 dakika çözdürün. Gün 32 hücreyi 1 mL PRDM'de tekrar süspanse edin ve 4 dakika boyunca 130 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı çıkarın ve hücreleri 1 mL PRDM'de yeniden süspanse edin.
- Hücre sayımı için karışımın 10 μL'sini çıkarın. Üreticinin talimatlarına göre% 0.2 tripan mavisi kullanarak hücreleri karıştırın. Hücre karışımını hücre sayma haznesine pipetleyin slayt. Otomatik hücre sayacı ile hücre sayısını ve canlılığını belirleyin.
- Hücre canlılığı% 70'in üzerinde olduğunda bir sonraki adıma geçin. Kalan hücre süspansiyonunu 4 dakika boyunca 130 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve transplantasyon için 3 x 105 hücre / μL konsantrasyonunda PRDM'deki hücre peletini yeniden süspanse edin.
- Görünür hücre kümelerini gözlemleyin. Görünür hücre kümelenmesi gözlenene kadar mikrofüj tüpünde 10 μL'lik bir pipet ucu kullanarak hücre kümelerini tekrar tekrar süspanse edin. Hücre çözeltisinin iğneden ekstrüzyonunu gözlemlemek için 33G enjeksiyon şırıngasına yükleyin.
2. rd10 farelerde hESC'lerin retina altı verilmesi
- Hayvanların hazırlanması
- İntraperitoneal yaklaşımla 27G iğneye bağlı 1 mL'lik bir tüberkülin şırıngasında ketamin (20 mg/kg vücut ağırlığı) ve ksilazin (2 mg/kg vücut ağırlığı) kombinasyonu kullanarak fareyi (P20, erkek/dişi, 3-6 g) uyuşturun. Önleyici bir analjezik olarak fareye deri altı buprenorfin (0.05 mg / kg) enjeksiyonu uygulayın.
- Anesteziyi uyguladıktan sonra, pupil dilatasyonu için% 1 tropikamid ve% 2.5 fenilefrin damlatın. Gözün kuruluğunu ve anesteziye bağlı kataraktı önlemek için korneaya oftalmik bir jel uygulayın.
- Tamamen uyuşturulana kadar fareyi boş bir kafese yerleştirin. Pençe yastığını sıkıştırarak uygun anestezi seviyesini değerlendirin ve hayvanın sert çimdiklemeye tepki verip vermediğini onaylayın.
- Fare tamamen uyuşturulduğunda, hayvanı 38 °C'ye ayarlanmış ılık bir ped üzerine yerleştirin.
- Hücrelerin retina altı iletimi
- Burada yapıldığı gibi 1 portlu trans-vitreal pars plana yaklaşımını kullanmak için steril bir ortamda retina altı enjeksiyon yapın. Enjeksiyonu gerçekleştirmek için doğrudan ışık yoluna sahip dik bir ameliyat mikroskobu kullanın.
- İğne göbeğini çıkararak 10 μL'lik cam şırıngayı hazırlayın. 33G kör iğneyi cam şırıngaya monte edin. Metal göbek kapağını alın ve iğneyi şırıngaya dikkatlice sabitleyin.
- İğnede herhangi bir sızıntı belirtisi ve açıklığı olup olmadığını kontrol etmek için damıtılmış suyla yıkayın. Şırıngayı boşaltın ve dikkatlice yan tarafa koyun.
- Anestezi uygulanmış fareyi, tedavi gözü doğrudan mikroskobun hedefine bakacak şekilde bir yastığın üzerine yerleştirin. % 0.5 proparakain hidroklorür uygulayın ve 30 saniye bekleyin. Göze 150 μL oftalmik jel uygulayın ve üzerine yuvarlak bir örtü yerleştirin.
- Kornea, iris, göz bebeği, lens ve konjonktivayı gözlemleyerek gözün kaba bir muayenesini yapın. Göz bebeği aracılığıyla, odak düzlemini ayarlayarak fare gözünün fundusunu görselleştirin. Optik başlık göz bebeğinin ortasına yerleştirilene kadar başlığı ayarlayın ve yastığın üzerine uygun şekilde konumlandırarak başın hareketini en aza indirin.
- Düzgün bir hücre süspansiyonu elde etmek için tüpün tabanına hESC'lerle birden çok kez hafifçe vurun. 10 μL cam mikrolitrelik şırıngayı 33G künt iğne ile kullanarak 2 μL hücre/ortam çekin. Şırıngada hücre yerleşimini / kümelenmesini önlemek için enjeksiyondan hemen önce hücreleri geri çekin.
- 30G tek kullanımlık bir iğne kullanarak, limbusun 2 mm arkasında bir sklerektomi yarası yapın. Lense dokunmamak için iğnenin açısını ~45°'de tutun. İğnenin ucu gözde görüntülendikten sonra iğneyi yavaşça geri çekin. İğne batmasını önlemek için kullandıktan sonra iğneyi keskin çöp kutusuna atın.
- Cam şırıngayı alın ve künt iğneyi sklerektomi yarasına yerleştirin. Lense dokunmadan, künt iğneyi giriş yarasının karşı retinasına ulaşana kadar ilerletin. Kanamayı önlemek için enjeksiyon alanının ana retina kan damarlarından arınmış olduğundan emin olun.
- Sklera üzerinde bir basınç dalı görülene kadar retinaya hafifçe nüfuz edin. Hücrelerin vitreus boşluğuna sızmasını önlemek için iğnenin kör ucunu skleraya paralel tutun.
- Şırınga üzerinde hafif bir basınç korunurken retina altı boşluğa 2 μL hücre süspansiyonu veya PRDM ortamı (kontrol) yavaşça enjekte edin. Başarılı bir enjeksiyonla, enjeksiyon bölgesinde görünür bir bleb (yani, içinde hücre süspansiyonu/ortamı bulunan yükseltilmiş retina) oluşturulmalıdır.
NOT: Retina yırtılmasını ve iğne ucundaki hücrelerin tıkanmasını önlemek için enjeksiyon sırasında sadece hafif basınç kullanılmalıdır. - Blebi onayladıktan sonra, hücrelerin yerleşmesi için 10 saniye bekleyin. İğneyi gözden yavaşça geri çekin.
- İntraoperatif optik koherens tomografi (OCT) bleb taraması (isteğe bağlı)
- Kafayı yavaşça hareket ettirerek kabarmayı mikroskop altında görselleştirmek için fare gözünü konumlandırın. Kafayı nazikçe tutarak pozisyonu sabitleyin. Ek bir göz bebeği genişlemesine gerek yoktur. Kapak fişini ve gözdeki jeli çıkarmayın. Blebi görselleştirmek için net bir optik ortam sağlar.
- Ameliyat mikroskobunun yerleşik iOCT işlevini kullanarak intraoperatif OCT'yi gerçekleştirin.
- OCT ekranında Küp seçeneğine basın ve Ok düğmelerine basarak tarama alanını bleb üzerine konumlandırın. En iyi OCT kalitesi için Merkezleme ve Odaklanma'yı kaydırarak OCT'yi ayarlayın. Bleb bölgesinin OCT taramasını almak için Yakala/Tara'ya basın. Taramaların kalitesini kontrol etmek için görüntüleri inceleyin.
- Kurtarma
- Kapak fişini çıkarın ve jeli gazlı bezle gözden temizleyin. Enfeksiyonu önlemek için enjeksiyondan sonra bir kez antibiyotik merhem sürün.
- Sternal yaslanmanın sürdürülmesi ve ev kafesine geri dönmesi için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvanın ılık bir ışık altında anesteziden kurtulmasına izin verin. Hayvanı enjeksiyondan sonra en az 3 gün boyunca iltihaplanma, enfeksiyon ve sıkıntı belirtileri açısından izleyin.
NOT: 150 W sıcak ışık, hayvan kafesinden en az 30 cm uzakta olmalı ve yanık yaralanmasını önlemek için dikkatli olunmalıdır. - Deri altı buprenorfin enjeksiyonu (0.05 mg / kg) 1 gün boyunca 8 saatte bir veya veteriner hekimin tavsiyesine göre uygulayın. Gözde iltihaplanma veya enfeksiyon görülürse, uygun tedavi için bir veteriner hekime danışın.
- Aletlerin temizlenmesi ve sterilizasyonu
- 10 μL cam mikrolitre şırıngayı ve 33G kör iğneyi %100 etanol 10x ile yıkayın. Şırıngayı damıtılmış suyla yakarak etanolü yıkayın.
- Cam şırıngayı ve iğneyi sökün. Şırıngayı saklamak için kurutun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
10 μL'lik cam şırınga, üreticinin talimatlarına göre monte edilmiştir (Şekil 1) ve hücre süspansiyonunu/ortamını iletmek için kullanılan kör iğne Şekil 1B'de gösterilmektedir. Subretinal enjeksiyon için farklı yaklaşımlar Şekil 2'de gösterilmektedir. Bu protokolde pars plana yaklaşımını açıklıyoruz (Şekil 2C). Bir cam şırıngaya monte edilen künt iğne, bir sklerotomi yarasından sokuldu ve dünya çapında retina altı boşluğa erişti. Şekil 3A'da gösterildiği gibi, enjeksiyon yapılırken iğnenin yörüngesi, retinadan penetrasyon ve hücrelerin iletimi doğrudan mikroskop altında izlendi. Hücrelerin/ortamın başarılı bir şekilde verilmesi, enjeksiyon bölgesinde bir kabarcık gözlemlenerek doğrulandı (Şekil 3B). Başarılı bir bleb, su balonuna benzeyen açık beyazımsı bir renk olarak tanımlanabilir. Hücrelerin/ortamın enjeksiyon bölgesindeki vitreus boşluğuna sızması ve bir kabarcık oluşturmaması nedeniyle başarısız bir doğum gözlenir. OCT taraması enjekte edilen alanda gerçekleştirildi ve tarama, hücre ile tedavi edilen gözde yüzen bireyselleştirilmiş hESC'ler gösterirken (Şekil 4A), medya ile tedavi edilen göz, retina altı boşlukta hücresiz berrak sıvı gösterdi (Şekil 4B). Bireyselleştirilmiş hESC'ler, retina altı boşlukta dağılmış hiperreflektif materyaller olarak tanımlanır (Şekil 4A). Enjeksiyonun başarı oranı, blebin başarılı bir şekilde oluştuğu göz sayısı not edilerek hesaplandı. Laboratuvarımızda bu yaklaşımı benimseyen uygulamalara ve enjeksiyonların başarı oranlarına yer verdik (Tablo 1).
Şekil 1: Enjeksiyon sırasında kullanılan aletler. (A) 10 μL cam şırınga, 33G künt iğne ile monte edilmiştir. (B) 33G künt iğnenin yakınlaştırılmış resmi. (C) Hayvanın başının dinlenmesi için yastık. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Retina altı enjeksiyonun farklı yolları. (A) Transkornea yolu: Enjeksiyon iğnesi kornea ve göz bebeğinden geçerek retina altı boşluğa girer. (B) Transskleral yol: Retina altı boşluğa doğrudan sklera yoluyla erişilir. (C) Pars plana yolu: Enjeksiyon iğnesi, limbusta bir kesi yoluyla vitreus boşluğuna sokulur. İğne retinayı delerek retina altı boşluğa ulaşır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Subretinal enjeksiyon sırasında gözün fundus görüntüleri. (A) Subretinal enjeksiyon yapılmadan önce, iğnenin ucu, ana retina kan damarlarından kaçınarak retinaya temas eden vitreus boşluğunda görülebilir. (B) Subretinal enjeksiyondan sonra, enjeksiyon bölgesinde görünür bir kabarcık oluştu (sarı noktalı çizgi). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Enjekte edilen gözlerin intraoperatif OCT taramaları. Taramalar enjeksiyondan hemen sonra yapıldı. (A) hESC ile tedavi edilen göz: üst panel, OCT taramasının (camgöbeği ve pembe kesit çizgileri) gözdeki yerini gösterdi; Tedavi edilen gözde retina altı boşlukta (sarı noktalı çizgi, orta ve alt paneller) hESC'ler gözlendi. (B) Medyayla tedavi edilen göz: üst panel, OCT taramasının gözdeki yerini (camgöbeği ve pembe kesit çizgileri) gösterdi; Ortam enjekte edilen gözde retina altı boşlukta (sarı noktalı çizgi, orta ve alt paneller) hücresiz berrak sıvı gözlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Uygulama | Alıcı Zorlanması | Başarı Oranı |
| AAV (AAV) | Rpe65rd12/J | 80% |
| AAV (AAV) | C57BL/6 Serisi | 95% |
| hESC türevli progenitör hücreler | Rd10-/- | 95% |
Tablo 1: Farklı uygulamalarda retina altı enjeksiyonun başarı oranı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Subretinal enjeksiyon, RPE ve retina hastalıklarını tedavi etmek için hücre süspansiyon transplantasyonu için kullanılmıştır 23,25,26,27,28,31,40. Bu yaklaşım, kemirgen çalışmalarında sadece hücre nakli ve gen tedavisi yaklaşımları için değil, aynı zamanda retina hastalıkları için yeni terapötik bileşiklerin değerlendirilmesi için de son derece önemlidir. Şu anda, hücreleri veya AAV'leri retina altı boşluğa iletmek için üç ana yol kullanılmaktadır: trans-kornea yolu, trans-skleral ve pars plana yolları.
Transkorneal yaklaşımda, enjeksiyon iğnesi kornea, göz bebeği ve son olarak retinadan geçerek hücreleri retina altı boşluğa iletir ve başarılı bir bleb oluşturur. Trans-korneal yaklaşımın avantajı, alıcıda tam bir retina dekolmanı oluşturma yeteneğidir47. Daha fazla sayıda hücre sağlayabilir; Bununla birlikte, yapısal konformasyon ve hücre entegrasyonunu incelemek için uzunlamasına gözlem bu yaklaşımda zordur. Ek olarak, komplikasyonlar katarakt oluşumu, sineşi ve kornea opaklığını içerir ve bu da uzunlamasına gözlemlerizorlaştırır 11,45,47,48. Alternatif olarak, trans-skleral yaklaşım, AAV'yi retina altı boşluğa iletmek için de kullanılır44,49. Bu yaklaşım yenidoğan fareler için yararlıdır ve iğnenin oküler ortamdan geçmesi gerekmediğinden daha güvenli kabul edilir. Ancak koroid kanaması, enjeksiyon bölgesinden solüsyonun geri kaçması, retinanın delinmesi ve vitreus boşluğuna sızıntı göz ardı edilmemelidir.
33G künt iğne kullanarak hESC'den türetilen fotoreseptör progenitörlerini retina altı boşluğa sokmak için pars plana yaklaşımını benimsedik. Bu yaklaşımda enjeksiyon iğnesi limbus bölgesindeki kesiden sokuldu. İğne daha sonra vitreus boşluğundan geçirildi ve son olarak retina yoluyla retina altı boşluğa erişildi. Hücre kümeleri sıklıkla gözlenmiştir ve uygun olmayan iğne boyutları kullanıldığında hücrelerin verilmesini engelleyebilir. Mikrofüj tüpündeki hücrelerin yeniden süspansiyonu, enjeksiyon şırıngasına yüklenmeden önce 10 μL'lik bir pipet ucu kullanılarak özenle yapılmalıdır. Başlangıçta, iğnenin hücreler tarafından tıkanmasının sıklıkla gözlemlendiği bir 34G iğnesi kullanmaya çalıştık. Belirli hücre tipleri için uygun bir iğne boyutu test edilmelidir, özellikle dar delikli iğneler enjekte edildiğinde daha az canlı hücreler verme eğilimindedir50. Bu yaklaşımın avantajlarından biri, enjeksiyon sırasında doğrudan görselleştirmedir ve cerrahın hücre iletimi için belirli yeri izlemesine ve dikkatlice seçmesine olanak tanır. İşlem sırasında enjeksiyon bölgesi ve iğne net bir şekilde görülebilmelidir. Anesteziye bağlı katarakt ve kornea opaklığı, hücrelerin belirli bir yere uygun şekilde iletilmesini büyük ölçüde etkileyebilir.
Enjeksiyon yapılırken iğne retinaya dik olarak girmeli ve enjekte edilen hücrelerin vitreus boşluğuna sızmasını en aza indirmek için iğnenin künt ucu skleraya paralel olmalıdır (Şekil 3). Enjeksiyon yapılırken şırıngaya sadece hafif bir basınç uygulanmalıdır. Güçlü bir basınç retina yırtıklarına, kanamaya, hücrelerin koroid boşluğuna sızmasına, hücrelerin iğneden geçememesine ve göz küresinin delinmesine neden olabilir. İğne ucu retinadan yeni geçtiğinde ve iğne ucunda küçük beyaz bir basınç noktası görüldüğünde optimum basınç sağlanabilir. Enjeksiyondan sonra, enjekte edilen hücrelerin vitreus boşluğuna sızmasını önlemek için iğne enjeksiyon noktasından yavaşça ve nazikçe geri çekilmelidir.
Bu yaklaşımın sınırlaması, zorlu öğrenme eğrisidir. Bir çalışma, eğitimli bir göz doktorunun %95'lik bir başarı oranı elde etmek için farelerde 364 enjeksiyon yapması gerektiğini, cerrahi deneyime sahip daha az deneyimli kursiyerlerin ise daha fazla sayıda eğitim gerektirmesi beklendiğinigösterdi 46. Bu yaklaşımın komplikasyonları arasında retinada iğne izi, hücrelerin vitreus boşluğuna geri kaçması, koroid/retinadan kanama ve iyatrojenik katarakt sayılabilir. Bununla birlikte, yeterli miktarda eğitim ile bu komplikasyonlar önemli ölçüde daha az gözlenmektedir46.
Sonuç olarak, yöntemimiz, OCT taramalarında açıkça görüldüğü gibi, hESC'den türetilmiş fotoreseptör progenitörlerini rd10 farelerin retina altı boşluğuna iletebilir. Bu yaklaşım, dış retina ve RPE ile ilişkili hastalıkların tedavisi için yeni terapötik bileşikleri, farklı hücre tipi transplantasyonunu ve gen terapisini araştırmak için benimsenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hwee Goon Tay, Alder Therapeutics AB'nin kurucu ortağıdır. Diğer yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.
Acknowledgments
Wei Sheng Tan, Luanne Chiang Xue Yen, Xinyi Lee ve Yingying Chung'a, kriyoprezervasyondan sonra 32 hESC'den türetilmiş fotoreseptör progenitörlerinin hazırlanması için teknik yardım sağladıkları için teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Ulusal Tıbbi Araştırma Konseyi Genç Araştırmacı Araştırma Hibe Ödülü (NMRC/OFYIRG/0042/2017) ve Ulusal Araştırma Vakfı24'üncü Rekabetçi Araştırma Programı Hibesi (CRP24-2020-0083) tarafından HGT'ye verilen hibelerle desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3% Tobramycin | Novartis | NDC 0078-0813-01 | Tobrex (3.5 g) |
| 0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone | Novartis | NDC 0078-0876-01 | Tobradex (3.5 g) |
| 0.5% Proparacaine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0016-15 | 0.5% Alcaine (15 mL) |
| 1 mL Tuberculin syringe | Turemo | SS01T2713 | |
| 1% Tropicamide | Alcon | NDC 0998-0355-15 | 1% Mydriacyl (15 mL) |
| 2.5% Phenylephrine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0342-05 | 2.5% Mydfrin (5 mL) |
| 24-well tissue culture plate | Costar | 3526 | |
| 30 G Disposable needle | Becton Dickinson (BD) | 305128 | |
| 33 G, 20 mm length blunt needles | Hamilton | 7803-05 | |
| Automated Cell Counter | NanoEnTek | Model: Eve | |
| B27 without Vitamin A | Life Technologies | 12587001 | 2%36 |
| Buprenorphine | Ceva | Vetergesic vet (0.3 mg/mL) | |
| CKI-7 | Sigma | C0742 | 5 µM36 |
| Cyclosporine | Novartis | 260 g/L in drinking water | |
| Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells | DUKE-NUS Medical School | Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36. | |
| Gauze | Winner Industries Co. Ltd. | 1SNW475-4 | |
| Glasgow Minimum Essential Medium | Gibco | 11710–035 | |
| hESC cell line H1 | WiCell Research Institute | WA01 | |
| Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02-50 | 10 ng/mL36 |
| Human ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Prospec-Tany Technogene | CYT-272 | 10 ng/mL36 |
| Ketamine hydrochloride (100 mg/mL) | Ceva Santé Animale | KETALAB03 | |
| LN-521 | Biolamina | LN521-02 | 1 µg36 |
| mFreSR | STEMCELL Technologies | 5854 | |
| Microlitre glass syringe (10 mL) | Hamilton | 7653-01 | |
| N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT) | Selleckchem | S2215 | 10 µM36 |
| N-2 supplement | Life Technologies | A13707-01 | 1%36 |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140–050 | 1x36 |
| NutriStem XF Media | Satorius | 05-100-1A | |
| Operating microscope | Zeiss | OPMI LUMERA 700 | With Built-in iOCT function |
| PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml) | DUKE-NUS Medical School | See media composition36. Basal Medium, 10 µM DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 µM Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA). | |
| Pyruvate | Gibco | 11360–070 | 1 mM36 |
| Rd10 mice | Jackson Laboratory | B6.CXB1-Pde6brd10/J mice | Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g |
| Retinoic acid | Tocris Bioscience | 0695/50 | 0.5 µM36 |
| Round Cover Slip (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| SB431542 | Sigma | S4317 | 0.5 µM36 |
| Vidisic Gel (10 g) | Dr. Gerhard Mann | ||
| Xylazine hydrochloride (20 mg/mL) | Troy Laboratories | LI0605 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985–023 | 0.1 mM36 |
References
- Molday, R. S., Moritz, O. L.
- Aboualizadeh, E., et al. Imaging Transplanted Photoreceptors in Living Nonhuman Primates with Single-Cell Resolution. Stem Cell Reports. 15 (2), 482-497 (2020).
- Petrus-Reurer, S., et al. Preclinical safety studies of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells for the treatment of age-related macular degeneration. Stem cells translational medicine. 9 (8), 936-953 (2020).
- Wang, S. T., et al. Transplantation of Retinal Progenitor Cells from Optic Cup-Like Structures Differentiated from Human Embryonic Stem Cells In Vitro and In Vivo Generation of Retinal Ganglion-Like Cells. Stem cells and development. 28 (4), 258-267 (2019).
- Wang, Z., et al. Intravitreal Injection of Human Retinal Progenitor Cells for Treatment of Retinal Degeneration. Medical Science Monitor: International Medical Journal of Experimental and Clinical Research. 26, e921184-e921191 (2020).
- Semo, M., et al. Efficacy and Safety of Human Retinal Progenitor Cells. Translational vision science & technology. 5 (4), 6 (2016).
- Luo, J., et al. Human Retinal Progenitor Cell Transplantation Preserves Vision. The Journal of Biological Chemistry. 289 (10), 6362 (2014).
- Liu, Y., et al. Long-term safety of human retinal progenitor cell transplantation in retinitis pigmentosa patients. Stem cell research & therapy. 8 (1), 209 (2017).
- Maia, M., et al. Effects of indocyanine green injection on the retinal surface and into the subretinal space in rabbits. Retina (Philadelphia, Pa). 24 (1), 80-91 (2004).
- Nickerson, J. M., et al. Subretinal delivery and electroporation in pigmented and nonpigmented adult mouse eyes. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 884, 53 (2012).
- Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. Subretinal Injection: A Review on the Novel Route of Therapeutic Delivery for Vitreoretinal Diseases. Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).
- Murray, S. F., et al. Allele-Specific Inhibition of Rhodopsin With an Antisense Oligonucleotide Slows Photoreceptor Cell Degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6362 (2015).
- Cideciyan, A. V., et al. Mutation-independent rhodopsin gene therapy by knockdown and replacement with a single AAV vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), E8547-E8556 (2018).
- Maeder, M. L., et al. Development of a gene-editing approach to restore vision loss in Leber congenital amaurosis type 10. Nature medicine. 25 (2), 229-233 (2019).
- Katrekar, D., et al. In vivo RNA editing of point mutations via RNA-guided adenosine deaminases. Nature methods. 16 (3), 239 (2019).
- Ong, T., Pennesi, M. E., Birch, D. G., Lam, B. L., Tsang, S. H. Adeno-Associated Viral Gene Therapy for Inherited Retinal Disease. Pharmaceutical Research. 36 (2), 34 (2019).
- Pardue, M. T., et al. Neuroprotective effect of subretinal implants in the RCS rat. Investigative ophthalmology & visual science. 46 (2), 674-682 (2005).
- Liu, Z., et al. Surgical Transplantation of Human RPE Stem Cell-Derived RPE Monolayers into Non-Human Primates with Immunosuppression. Stem cell reports. 16 (2), 237-251 (2021).
- Martinez Camarillo, J. C., et al. Development of a Surgical Technique for Subretinal Implants in Rats. Journal of visualized experiments: JoVE. (190), e64585 (2022).
- Xue, Y., et al. The Prospects for Retinal Organoids in Treatment of Retinal Diseases. Asia-Pacific Journal of Ophthalmology. 11 (4), 314-327 (2022).
- McLelland, B. T., et al. Transplanted hESC-derived retina organoid sheets differentiate, integrate, and improve visual function in retinal degenerate rats. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (6), 2586-2603 (2018).
- Lin, B., et al. Retina organoid transplants develop photoreceptors and improve visual function in RCS rats with RPE dysfunction. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 61 (11), 34 (2020).
- Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet (London, England). 390 (10097), 849-860 (2017).
- Testa, F., et al. Three Year Follow-Up after Unilateral Subretinal Delivery of Adeno-Associated Virus in Patients with Leber Congenital Amaurosis Type 2. Ophthalmology. 120 (6), 1283 (2013).
- Fischer, M. D., et al. Safety and Vision Outcomes of Subretinal Gene Therapy Targeting Cone Photoreceptors in Achromatopsia: A Nonrandomized Controlled Trial. JAMA ophthalmology. 138 (6), 643-651 (2020).
- Ghazi, N. G., et al. Treatment of retinitis pigmentosa due to MERTK mutations by ocular subretinal injection of adeno-associated virus gene vector: results of a phase I trial. Human genetics. 135 (3), 327-343 (2016).
- MacLaren, R. E., et al. Retinal gene therapy in patients with choroideremia: initial findings from a phase 1/2 clinical trial. Lancet (London, England). 383 (9923), 1129-1137 (2014).
- Lam, B. L., et al. Choroideremia Gene Therapy Phase 2 Clinical Trial: 24-Month Results. American journal of ophthalmology. 197, 65-73 (2019).
- Xue, K., et al. Beneficial effects on vision in patients undergoing retinal gene therapy for choroideremia. Nature medicine. 24 (10), 1507-1512 (2018).
- Zhai, Y., et al. AAV2-Mediated Gene Therapy for Choroideremia: 5-Year Results and Alternate Anti-sense Oligonucleotide Therapy. American Journal of Ophthalmology. 248, 145-156 (2023).
- Schwartz, S. D., Tan, G., Hosseini, H., Nagiel, A. Subretinal Transplantation of Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelium for the Treatment of Macular Degeneration: An Assessment at 4 Years. Investigative ophthalmology & visual science. 57 (5), ORSFc1-ORSFc9 (2016).
- Vu, Q. A., et al. Structural changes in the retina after implantation of subretinal three-dimensional implants in mini pigs. Frontiers in Neuroscience. 16, 1010445 (2022).
- Spindler, L., et al. Controlled injection pressure prevents damage during subretinal injections in pigs. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (9), 5918-5918 (2018).
- Yang, K., et al. Robot-assisted subretinal injection system: development and preliminary verification. BMC Ophthalmology. 22 (1), 1-10 (2022).
- Olufsen, M. E., et al. Controlled Subretinal Injection Pressure Prevents Damage in Pigs. Ophthalmologica. Journal international d’ophtalmologie. International journal of ophthalmology. Zeitschrift fur Augenheilkunde. 245 (3), 285-293 (2022).
- Tay, H. G., et al. Photoreceptor laminin drives differentiation of human pluripotent stem cells to photoreceptor progenitors that partially restore retina function. Molecular therapy the journal of the American Society of Gene Therapy. 31 (3), 825-846 (2023).
- Petrus-Reurer, S., et al. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy. Journal of visualized experiments: JoVE. (131), e56702 (2018).
- Petrus-Reurer, S., et al. Integration of subretinal suspension transplants of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in a large-eyed model of geographic atrophy. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (2), 1314-1322 (2017).
- Babu, V. S., et al. Depleted Hexokinase1 and lack of AMPKα activation favor OXPHOS-dependent energetics in Retinoblastoma tumors. Translational research the journal of laboratory and clinical medicine. (23), 00108-00111 (2023).
- Plaza Reyes, A., et al. Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model. Stem cell reports. 6 (1), 9-17 (2016).
- Takahashi, K., et al. The influence of subretinal injection pressure on the microstructure of the monkey retina. PLoS ONE. 13 (12), e0209996 (2018).
- Tan, G. S. W., et al. Hints for Gentle Submacular Injection in Non-Human Primates Based on Intraoperative OCT Guidance. Translational Vision Science & Technology. 10 (1), 10-10 (2021).
- Yiu, G., et al. Suprachoroidal and Subretinal Injections of AAV Using Transscleral Microneedles for Retinal Gene Delivery in Nonhuman Primates. Molecular therapy. Methods & clinical development. 16, 179-191 (2020).
- Mühlfriedel, R., Michalakis, S., Garrido, M. G., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized Technique for Subretinal Injections in Mice. Methods in Molecular Biology. 935, 343-349 (2012).
- Huang, P., et al. Subretinal injection in mice to study retinal physiology and disease. Nature Protocols. 17 (6), 1468-1485 (2022).
- Huang, P., et al. The Learning Curve of Murine Subretinal Injection Among Clinically Trained Ophthalmic Surgeons. Translational Vision Science & Technology. 11 (3), 13 (2022).
- Qi, Y., et al. Trans-Corneal Subretinal Injection in Mice and Its Effect on the Function and Morphology of the Retina. PLOS ONE. 10 (8), e0136523 (2015).
- Irigoyen, C., et al. Subretinal Injection Techniques for Retinal Disease: A Review. Journal of Clinical Medicine. 11 (16), 4717 (2022).
- Parikh, S., et al. An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach. Journal of visualized experiments: JoVE. (118), e54808 (2016).
- Amer, M. H., White, L. J., Shakesheff, K. M. The effect of injection using narrow-bore needles on mammalian cells: Administration and formulation considerations for cell therapies. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (5), 640-650 (2015).
