Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

कैंसर अनुसंधान के लिए एक शारीरिक मानव संवहनी माइक्रो-ट्यूमर मॉडल की स्थापना

Published: September 15, 2023 doi: 10.3791/65865
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Molecular Biology and Biochemistry, University of California, Irvine, 2Biomedical Engineering, University of California, Irvine

Summary

यह प्रोटोकॉल उच्च-थ्रूपुट बुनियादी और अनुवाद संबंधी मानव कैंसर अनुसंधान करने के लिए एक शारीरिक रूप से प्रासंगिक ट्यूमर-ऑन-ए-चिप मॉडल प्रस्तुत करता है, जो लोडिंग, रखरखाव और मूल्यांकन प्रक्रियाओं के विवरण के साथ दवा स्क्रीनिंग, रोग मॉडलिंग और व्यक्तिगत चिकित्सा दृष्टिकोण को आगे बढ़ाता है।

Abstract

इन विट्रो में ठोस कैंसर के ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को पुन: व्यवस्थित करने वाले मान्य कैंसर मॉडल की कमी प्रीक्लिनिकल कैंसर अनुसंधान और चिकित्सीय विकास के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा बनी हुई है। इस समस्या को दूर करने के लिए, हमने संवहनी माइक्रोट्यूमर (वीएमटी), या ट्यूमर चिप, एक माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम विकसित किया है जो वास्तविक रूप से जटिल मानव ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को मॉडल करता है। वीएमटी गतिशील, शारीरिक प्रवाह स्थितियों के तहत कई मानव कोशिका प्रकारों की सह-संस्कृति द्वारा एक माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म के भीतर डी नोवो बनाता है। इस ऊतक-इंजीनियर माइक्रो-ट्यूमर निर्माण में एक जीवित सुगंधित संवहनी नेटवर्क शामिल है जो बढ़ते ट्यूमर द्रव्यमान का समर्थन करता है जैसे नवगठित जहाजों विवो में करते हैं। महत्वपूर्ण रूप से, दवाओं और प्रतिरक्षा कोशिकाओं को ट्यूमर तक पहुंचने के लिए एंडोथेलियल परत को पार करना होगा, चिकित्सीय वितरण और प्रभावकारिता के लिए विवो शारीरिक बाधाओं में मॉडलिंग करना होगा। चूंकि वीएमटी प्लेटफॉर्म ऑप्टिकली पारदर्शी है, इसलिए प्रतिरक्षा सेल एक्सट्रावेशन और मेटास्टेसिस जैसी गतिशील प्रक्रियाओं की उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग ऊतक के भीतर फ्लोरोसेंटली लेबल वाली कोशिकाओं के प्रत्यक्ष दृश्य के साथ प्राप्त की जा सकती है। इसके अलावा, वीएमटी विवो ट्यूमर विषमता, जीन अभिव्यक्ति हस्ताक्षर और दवा प्रतिक्रियाओं में बरकरार है। वस्तुतः किसी भी ट्यूमर प्रकार को मंच पर अनुकूलित किया जा सकता है, और ताजा सर्जिकल ऊतकों से प्राथमिक कोशिकाएं बढ़ती हैं और वीएमटी में दवा उपचार का जवाब देती हैं, जिससे वास्तव में व्यक्तिगत दवा की ओर मार्ग प्रशस्त होता है। यहां, वीएमटी स्थापित करने और ऑन्कोलॉजी अनुसंधान के लिए इसका उपयोग करने के तरीकों को रेखांकित किया गया है। यह अभिनव दृष्टिकोण ट्यूमर और दवा प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए नई संभावनाएं खोलता है, शोधकर्ताओं को कैंसर अनुसंधान को आगे बढ़ाने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है।

Introduction

कैंसर दुनिया भर में एक प्रमुख स्वास्थ्य चिंता बनी हुई है और संयुक्त राज्य अमेरिका में मृत्यु का दूसरा प्रमुख कारण है। अकेले वर्ष 2023 के लिए, नेशनल सेंटर फॉर हेल्थ स्टैटिस्टिक्स ने अमेरिका1 में 1.9 मिलियन से अधिक नए कैंसर के मामलों और 600,000 से अधिक कैंसर से होने वाली मौतों का अनुमान लगाया है, जो प्रभावी उपचार दृष्टिकोणों की तत्काल आवश्यकता पर प्रकाश डालता है। हालांकि, वर्तमान में, नैदानिक परीक्षणों में प्रवेश करने वाले कैंसर विरोधी चिकित्सा विज्ञान के केवल 5.1% अंततः एफडीए अनुमोदन प्राप्त करते हैं। नैदानिक परीक्षणों के माध्यम से सफलतापूर्वक प्रगति करने के लिए होनहार उम्मीदवारों की विफलता आंशिक रूप से गैर-शारीरिक मॉडल सिस्टम, जैसे 2 डी और स्फेरॉइड संस्कृतियों के उपयोग के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है, प्रीक्लिनिकल दवा विकास2 के दौरान। इन शास्त्रीय कैंसर मॉडल में ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के आवश्यक घटकों की कमी होती है, जैसे कि स्ट्रोमल आला, संबद्ध प्रतिरक्षा कोशिकाएं, और सुगंधित वाहिका, जो चिकित्सीय प्रतिरोध और रोग की प्रगति के प्रमुख निर्धारक हैं। इस प्रकार, एक नया मॉडल सिस्टम जो विवो ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में मानव की बेहतर नकल करता है, प्रीक्लिनिकल निष्कर्षों के नैदानिक अनुवाद में सुधार करने के लिए आवश्यक है।

ऊतक इंजीनियरिंग का क्षेत्र तेजी से आगे बढ़ रहा है, प्रयोगशाला सेटिंग्स में मानव रोगों के अध्ययन के लिए बेहतर तरीके प्रदान करता है। एक महत्वपूर्ण विकास माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम (एमपीएस) का उद्भव है, जिसे अंग चिप्स या ऊतक चिप्स के रूप में भी जाना जाता है, जो कार्यात्मक, लघु मानव अंग हैं जो स्वस्थ या रोगग्रस्त स्थितियों 3,4,5 को दोहराने में सक्षम हैं। इस संदर्भ में, ट्यूमर चिप्स, जो इन विट्रो मानव ट्यूमर मॉडल में तीन आयामी माइक्रोफ्लुइडिक-आधारित हैं, ऑन्कोलॉजी अनुसंधान 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 के लिए विकसित किए गए हैं . ये उन्नत मॉडल एक गतिशील ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के भीतर जैव रासायनिक और बायोफिजिकल संकेतों को शामिल करते हैं, जिससे शोधकर्ताओं को ट्यूमर के व्यवहार और अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक संदर्भ में उपचार के प्रति प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने में सक्षम बनाता है। हालांकि, इन प्रगति के बावजूद, कुछ समूहों ने सफलतापूर्वक एक जीवित, कार्यात्मक वाहिका को शामिल किया है, विशेष रूप से एक जो शारीरिक प्रवाह 3,4,5,6 के जवाब में आत्म-पैटर्न है। एक कार्यात्मक संवहनी नेटवर्क का समावेश महत्वपूर्ण है क्योंकि यह भौतिक बाधाओं को मॉडलिंग करने की अनुमति देता है जो दवा या सेल डिलीवरी को प्रभावित करते हैं, अलग-अलग माइक्रोएन्वायरमेंट के लिए सेल होमिंग, और ट्यूमर, स्ट्रोमल और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के ट्रांसेंडोथेलियल माइग्रेशन। इस सुविधा को शामिल करके, ट्यूमर चिप इन विवो ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में देखी गई जटिलताओं का बेहतर प्रतिनिधित्व कर सकती है।

इस अपूर्ण आवश्यकता को पूरा करने के लिए, हमने एक उपन्यास दवा-स्क्रीनिंग प्लेटफ़ॉर्म विकसित किया है जो माइक्रो-पोत नेटवर्क को माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस 8,9,10,11,12,13,14,15,16 के भीतर बनाने में सक्षम बनाता है। यह बेस ऑर्गन चिप प्लेटफॉर्म, जिसे संवहनी सूक्ष्म अंग (वीएमओ) कहा जाता है, को रोग मॉडलिंग, ड्रग स्क्रीनिंग और व्यक्तिगत दवा अनुप्रयोगों के लिए मूल ऊतक शरीर क्रिया विज्ञान को दोहराने के लिए लगभग किसी भी अंग प्रणाली के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। वीएमओ को एंडोथेलियल कॉलोनी बनाने वाले सेल-व्युत्पन्न एंडोथेलियल कोशिकाओं (ईसीएफसी-ईसी), एचयूवीईसी या आईपीएससी-ईसी (इसके बाद ईसी), और कक्ष में कई स्ट्रोमल कोशिकाओं द्वारा स्थापित किया जाता है, जिसमें सामान्य मानव फेफड़े के फाइब्रोब्लास्ट (एनएचएलएफ) शामिल हैं, जो मैट्रिक्स को फिर से तैयार करते हैं, और पेरिसाइट्स जो जहाजों को लपेटते और स्थिर करते हैं। VMO को संवहनी माइक्रो-ट्यूमर (VMT)8,9,10,11,12,13, या ट्यूमर चिप, मॉडल बनाने के लिए संबंधित स्ट्रोमा के साथ ट्यूमर कोशिकाओं को सह-संवर्धन करके कैंसर मॉडल प्रणाली के रूप में भी स्थापित किया जा सकता है। एक गतिशील प्रवाह वातावरण में कई सेल प्रकार के सह-संस्कृति के माध्यम से, perfused microvascular नेटवर्क बारीकी से अंतरालीय प्रवाह दर 14,15 द्वारा विनियमित है, जहां vasculogenesis बारीकी से अंतरालीय प्रवाह दरद्वारा नियंत्रित किया जाता है, डिवाइस के ऊतक कक्षों में डे नोवो फार्म. मध्यम को हाइड्रोस्टेटिक दबाव सिर द्वारा डिवाइस के माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों के माध्यम से संचालित किया जाता है जो ऊतक कक्ष के आसपास की कोशिकाओं को विशेष रूप से सूक्ष्म वाहिकाओं के माध्यम से पोषक तत्वों के साथ आपूर्ति करता है, जिसमें 1.2 x 10-7 सेमी/एस के पारगम्यता गुणांक के साथ, विवो8 में केशिकाओं के लिए क्या देखा जाता है।

वीएमटी मॉडल में स्व-आयोजन सूक्ष्म जहाजों का समावेश एक महत्वपूर्ण सफलता का प्रतिनिधित्व करता है क्योंकि यह: 1) विवो में संवहनी ट्यूमर द्रव्यमान की संरचना और कार्य की नकल करता है; 2) मेटास्टेसिस के प्रमुख चरणों को मॉडल कर सकते हैं, जिसमें ट्यूमर-एंडोथेलियल और स्ट्रोमल सेल इंटरैक्शन शामिल हैं; 3) पोषक तत्व और दवा वितरण के लिए शारीरिक रूप से चयनात्मक बाधाओं को स्थापित करता है, दवा स्क्रीनिंग में सुधार; और 4) एंटी-एंजियोजेनिक और एंटी-मेटास्टेटिक क्षमताओं के साथ दवाओं के प्रत्यक्ष मूल्यांकन की अनुमति देता है। एक जटिल 3 डी माइक्रोएन्वायरमेंट में पोषक तत्वों, दवाओं और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विवो डिलीवरी की नकल करके, वीएमओ / वीएमटी प्लेटफॉर्म एक शारीरिक रूप से प्रासंगिक मॉडल है जिसका उपयोग दवा स्क्रीनिंग करने और कैंसर, संवहनी या अंग-विशिष्ट जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। महत्वपूर्ण रूप से, वीएमटी विभिन्न प्रकार के ट्यूमर के विकास का समर्थन करता है, जिसमें कोलन कैंसर, मेलेनोमा, स्तन कैंसर, ग्लियोब्लास्टोमा, फेफड़ों का कैंसर, पेरिटोनियल कार्सिनोमैटोसिस, डिम्बग्रंथि के कैंसर और अग्नाशय के कैंसर 8,9,10,11,12,13 शामिल हैं। कम लागत वाली, आसानी से स्थापित, और उच्च थ्रूपुट प्रयोगों के लिए सरणी होने के अलावा, माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म ट्यूमर-स्ट्रोमल इंटरैक्शन के वास्तविक समय की छवि विश्लेषण और उत्तेजनाओं या चिकित्सीय प्रतिक्रिया के लिए पूरी तरह से वैकल्पिक रूप से संगत है। सिस्टम में प्रत्येक सेल प्रकार को एक अलग फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ लेबल किया जाता है ताकि पूरे प्रयोग में सेल व्यवहार के प्रत्यक्ष दृश्य और ट्रैकिंग की अनुमति मिल सके, जिससे गतिशील ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में एक खिड़की बन सके। हम पहले दिखाया है कि वीएमटी अधिक ईमानदारी से विवो ट्यूमर विकास में मॉडल, वास्तुकला, विषमता, जीन अभिव्यक्ति हस्ताक्षर, और मानक संस्कृति तौर-तरीकों10 की तुलना में दवा प्रतिक्रियाओं. महत्वपूर्ण बात, VMT विकास और कैंसर कोशिकाओं, जो बेहतर मानक अंडाकार संस्कृतियों की तुलना में माता पिता ट्यूमर की विकृति मॉडल और आगे व्यक्तिगत चिकित्सा के प्रयासों11 अग्रिम सहित रोगी-व्युत्पन्न कोशिकाओं के अध्ययन का समर्थन करता है. यह पांडुलिपि वीएमटी की स्थापना के तरीकों की रूपरेखा तैयार करती है, जो मानव कैंसर के अध्ययन के लिए इसकी उपयोगिता को प्रदर्शित करती है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. डिजाइन और निर्माण

  1. डिवाइस डिजाइन
    1. माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस निर्माण के लिए, एक सी-वेफर (आरसीए-1 साफ और 2% हाइड्रोजन फ्लोराइड (एचएफ) इलाज) पर एसयू -8 स्पिन-लेपित की 200 माइक्रोन परत का उपयोग करके एक एसयू -8 मोल्ड बनाएं, इसके बाद एक एकल मुखौटा फोटोलिथोग्राफी कदम के रूप में पहले 8,9 वर्णित है।
    2. डाउनस्ट्रीम फैब्रिकेशन चरणों के लिए एक टिकाऊ पॉलीयूरेथेन मोल्ड उत्पन्न करने के लिए एसयू -8 मोल्ड से 4 मिमी मोटी पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) प्रतिकृति कास्ट करें। विभिन्न डिजाइन पुनरावृत्तियों का उपयोग 8,9,10,11,12,13,14,15 किया जा सकता है।
    3. वर्तमान पुनरावृत्ति में, माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस को मानक 96-वेल प्लेट प्रारूप में कस्टम-फिट करने के लिए डिज़ाइन करें और जिसमें 12 माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस इकाइयों के साथ 2 मिमी मोटी पीडीएमएस फीचर परत शामिल हो, जो एक पतली (1/16 इंच) पारदर्शी बहुलक झिल्ली परत से घिरा हो।
    4. सुनिश्चित करें कि व्यक्तिगत ऊतक इकाइयों में जेल लोडिंग इनलेट (एल 1) और आउटलेट (एल 2), एक दबाव नियामक (पीआर) 16, और प्रत्येक तरफ 2 मीडिया इनलेट और आउटलेट से जुड़े डिकपल्ड माइक्रोफ्लुइडिक चैनल (एम 1-एम 2, एम 3-एम 4; चित्रा 1 बी)।
    5. प्रत्येक इनलेट और आउटलेट को एक एकल कुएं के भीतर रखें जो माइक्रोफ्लुइडिक चैनल में हाइड्रोस्टेटिक दबाव (10 मिमी एच2ओ) स्थापित करने के लिए एक मध्यम जलाशय के रूप में कार्य करता है। बाहरी चैनलों के साथ संवहनी नेटवर्क एनास्टोमोस की अनुमति देने के लिए, माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों को 50 माइक्रोन चौड़े संचार छिद्रों (शीर्ष पर 6, नीचे 6) के माध्यम से ऊतक कक्ष से कनेक्ट करें।
      नोट: माइक्रोफ्लुइडिक प्रतिरोधक ऊतक कक्ष में एक 5 मिमी एच2ओ अंतरालीय दबाव ढाल बनाते हैं जो संवहनी नेटवर्क पूरी तरह से 8,10 बनने के बाद इंट्राल्यूमिनल हो जाता है। बाद की प्रक्रियाएं पूरी तरह से इकट्ठे उच्च थ्रूपुट प्लेट से शुरू होती हैं।

Figure 1
चित्र 1. माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म डिजाइन। (ए) प्लेटफ़ॉर्म असेंबली का योजनाबद्ध पीडीएमएस फीचर परत को 12 डिवाइस इकाइयों के साथ दिखाता है जो एक अथाह 96-अच्छी प्लेट से बंधे होते हैं और एक पतली पारदर्शी बहुलक झिल्ली के साथ सील होते हैं। प्रत्येक उपकरण इकाई प्लेट पर कुओं के एक स्तंभ पर कब्जा कर लेती है। लाल रंग में उल्लिखित एकल उपकरण इकाई को (बी) में विवरण के साथ दिखाया गया है। (बी)एक डिवाइस इकाई के योजनाबद्ध 96 अच्छी तरह से थाली के एक अच्छी तरह से और इनलेट और आउटलेट (एल 1-एल 2) छेद के साथ दो लोडिंग बंदरगाहों सेल मैट्रिक्स मिश्रण पेश किया जा करने के लिए छिद्रित के एक अच्छी तरह से के भीतर तैनात एक एकल ऊतक कक्ष से पता चलता है. मध्यम इनलेट और आउटलेट (एम 1-एम 2, एम 3-एम 4) छेद-छिद्रित हैं और मीडिया जलाशयों के रूप में काम करने वाले कुओं के भीतर स्थित हैं। मीडिया के विभिन्न संस्करणों decoupled microfluidic चैनलों के माध्यम से ऊतक कक्ष भर में एक हाइड्रोस्टेटिक दबाव ढाल स्थापित. दबाव नियामक (पीआर) इकाई लोडिंग में आसानी बढ़ाने के लिए जेल फट वाल्व के रूप में कार्य करती है। ध्यान दें कि डिवाइस 200 माइक्रोन गहरा है, और ऊतक कक्ष 2 मिमी x 6 मिमी है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

2. लोड करने से पहले तैयारी

  1. सेल संस्कृति
    1. एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में निर्माता की सिफारिशों के अनुसार कोशिकाओं को बनाए रखें.
    2. ट्रांसड्यूड ईसी, एनएचएलएफ, या अन्य फाइब्रोब्लास्ट/स्ट्रोमल सेल के प्लेट टी 75 फ्लास्क और निर्माता और उपयोगकर्ता प्रोटोकॉल द्वारा सूचित घनत्व पर लोड होने से 3-4 दिन पहले वांछित कैंसर कोशिकाएं। इस प्रोटोकॉल के लिए, प्रत्येक सेल प्रकार के लिए प्रति फ्लास्क प्लेट 1 x 106 कोशिकाएं। एंडोथेलियल ग्रोथ मीडिया 2 (ईजीएम 2) में संस्कृति ईसी पूर्ण मीडिया, 10% एफबीएस के साथ डुलबेको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम) में एनएचएलएफ, और सेल प्रकार के आधार पर उपयुक्त मीडिया में कैंसर कोशिकाएं।
    3. हर 2-3 दिनों में संबंधित मीडिया के साथ खिलाकर कोशिकाओं को बनाए रखें और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की कल्पना करके पारगमन या लेबलिंग दक्षता की पुष्टि करें। लोडिंग के दिन, सुनिश्चित करें कि ईसी 80% -100% संगम है, जबकि एनएचएलएफ 70% -80% पर उप-संगम है।
  2. फाइब्रिनोजेन की तैयारी
    1. वांछित एकाग्रता के लिए फाइब्रिनोजेन समाधान तैयार करें (आमतौर पर, 5-8 मिलीग्राम / एमएल मजबूत संवहनी नेटवर्क गठन का समर्थन करता है), फाइब्रिनोजेन के प्रतिशत थक्के के लिए लेखांकन। निम्नलिखित समीकरण के साथ आवश्यक फाइब्रिनोजेन की मात्रा की गणना करें:
      फाइब्रिनोजेन (मिलीग्राम) = (मात्रा (एमएल)) x (एकाग्रता (मिलीग्राम/एमएल))/(थक्के%)
    2. फाइब्रिनोजेन को एंडोथेलियल बेसल मीडिया 2 (ईबीएम2) की उचित मात्रा में भंग, 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया जाता है, धीरे से ट्यूब को फ्लिक करके (भंवर नहीं)। फाइब्रिनोजेन को 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में इनक्यूबेट करें ताकि यह पूरी तरह से समाधान में जा सके। महत्वपूर्ण रूप से, एक पूर्ण माध्यम का उपयोग न करें।
    3. बाँझ-फ़िल्टर फाइब्रिनोजेन समाधान 0.22 माइक्रोन फ़िल्टर और वांछित मात्रा में विभाज्य के साथ, आमतौर पर 400 माइक्रोन प्रति माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब।
      नोट: अन्य मैट्रिक्स प्रोटीन (जैसे, कोलेजन, फाइब्रोनेक्टिन, या लेमिनिन) को फाइब्रिनोजेन मिश्रण में बढ़ाया जा सकता है।

3. नमूनों की लोडिंग

नोट: लोडिंग समय के प्रति संवेदनशील है और इष्टतम परिणाम सुनिश्चित करने के लिए लगभग 1.5-1.75 घंटे के भीतर (उपकरणों के लिए मीडिया के अलावा) शुरू (सेल उठाने) से पूरा किया जाना चाहिए। उपयोगकर्ता को ट्रैक पर रखने में मदद करने के लिए प्रत्येक चरण को सुझाए गए टाइमर के साथ नोट किया जाता है।

  1. सामग्री की तैयारी (लोडिंग का दिन)
    1. 10-15 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में निम्नलिखित रखें: हांक संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) या कोशिकाओं धोने के लिए फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस), सेल पृथक्करण अभिकर्मक, मीडिया (जैसे, ईजीएम 2, डीएमईएम)
    2. उपयोग के लिए तैयार होने तक निम्नलिखित अभिकर्मकों को 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में रखें: थ्रोम्बिन, लेमिनिन (4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर पिघलाया गया)।
    3. कमरे के तापमान पर फाइब्रिनोजेन विभाज्य पिघलाना। 500 माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में थ्रोम्बिन के 1.5 माइक्रोन एलिकोट तैयार करें, प्रति डिवाइस यूनिट एक ट्यूब के साथ। सुनिश्चित करें कि थ्रोम्बिन विभाज्य लोडिंग की सुविधा के लिए प्रत्येक ट्यूब के नीचे है।
    4. माइक्रोफ्लुइडिक्स में फंसी हवा को हटाने के लिए लोडिंग से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए यूवी-निष्फल उच्च थ्रूपुट प्लेटों को एक desiccator में रखें।
  2. सेल तैयारी (टाइमर शुरू = 0 मिनट से शुरू)
    1. संगम और पारगमन दक्षता की पुष्टि करने के लिए 4x आवर्धन पर माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की जाँच करें।
    2. HBSS के 5 एमएल के साथ कोशिकाओं 2x के प्रत्येक T75 फ्लास्क को धोएं और पूरी तरह से महाप्राण करें। प्रत्येक फ्लास्क में 1 एमएल पृथक्करण अभिकर्मक जोड़ें और 1-2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें।
    3. धीरे अपने हाथ की हथेली का उपयोग कर थाली नल और सभी कोशिकाओं उठा लिया गया है कि जाँच करें.
    4. उपयुक्त मीडिया के 9 एमएल के साथ फ्लास्क से कोशिकाओं को धो लें और उन्हें 15 एमएल शंक्वाकार में इकट्ठा करें। तुरंत सेल गिनती के लिए एक छोटे से विभाज्य हटा दें.
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3-5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र. कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करते समय, कोशिकाओं की गणना करें। ईसी या एनएचएलएफ के एक संगम टी 75 फ्लास्क को कम से कम 2 x 106 कोशिकाओं का उत्पादन करना चाहिए।
    6. centrifugation के बाद, महाप्राण मीडिया और 1 एक्स 106 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता पर उपयुक्त मीडिया में गोली resuspend. बर्फ पर कोशिकाओं रखें.
  3. सेल और फाइब्रिनोजेन मिश्रण की तैयारी (टाइमर = 20 मिनट से शुरू)
    1. निर्धारित करें कि कितने उपकरणों को लोड किया जाएगा, पाइपिंग हानि के लिए खाते में 1-2 जोड़कर, और प्रति डिवाइस आवश्यक सेल/फाइब्रिनोजेन मिश्रण की मात्रा से गुणा करें। यह डिवाइस कॉन्फ़िगरेशन पर निर्भर करेगा, लेकिन इस आलेख में प्रस्तुत डिवाइस डिज़ाइन के लिए, प्रति डिवाइस 6 माइक्रोन की आवश्यकता होती है।
    2. प्रत्येक सेल प्रकार की एकाग्रता प्रयोगात्मक निर्धारित किया जाना चाहिए. एक प्रारंभिक बिंदु के लिए, लगभग 7 x 106 कोशिकाओं/एमएल और एनएचएलएफ की एकाग्रता पर 3.5 x 106 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता पर ईसी लोड करें। कैंसर कोशिकाओं की एकाग्रता उनकी वृद्धि दर के आधार पर काफी भिन्न हो सकती है लेकिन आम तौर पर 0.5-2 x 106 कोशिकाओं / एमएल की सीमा के भीतर होती है। आवश्यक कक्षों की संख्या परिकलित करने के लिए इस समीकरण का उपयोग करें:
      आवश्यक कोशिकाओं की संख्या = (फाइब्रिन का आयतन (μL))/1000 μL x (कोशिकाओं की एकाग्रता)
    3. 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और आवश्यक कोशिकाओं की मात्रा निर्धारित करने के लिए निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करें:
      आवश्यक कोशिकाओं की मात्रा (μL) = (आवश्यक कोशिकाओं की संख्या)/1000
    4. ईसी, एनएचएलएफ, और कैंसर कोशिकाओं (केवल वीएमटी के लिए) के संबंधित संस्करणों को एक शंक्वाकार ट्यूब में मिलाएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर 3-5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें।
    5. कताई के बाद, ध्यान से महाप्राण मीडिया और गोली के पास किसी भी अवशिष्ट मीडिया दूर पाइप. धीरे लेकिन अच्छी तरह से फाइब्रिनोजेन की गणना की मात्रा में गोली resuspend, अतिरिक्त देखभाल हवा बुलबुले शुरू नहीं लेने. बर्फ पर रखें।
    6. टिशू कल्चर हुड में निष्फल प्लेटें और थ्रोम्बिन एलिकोट लाओ।
  4. लोड हो रहा है डिवाइस (टाइमर = 30-35 मिनट से शुरू)
    1. पी 20 पिपेट का उपयोग करके, सेल/फाइब्रिन मिश्रण से 6 माइक्रोन आयतन का पाइप करें। एक समान सेल निलंबन सुनिश्चित करने के लिए मिश्रण को कम से कम 5x ऊपर और नीचे पाइप करना सुनिश्चित करें। थक्के को धीमा करने के लिए मिश्रण को बर्फ पर रखें।
    2. धीरे से सेल/फाइब्रिन को थ्रोम्बिन की एक ट्यूब में मिलाएं, जिसमें पिपेट टिप को सीधे ट्यूब के नीचे थ्रोम्बिन एलिकोट में डाल दिया जाए। तुरंत कम से कम 2x ऊपर और नीचे पाइप करें, ध्यान रखें कि हवाई बुलबुले न लगें। थ्रोम्बिन के साथ मिश्रित होने के बाद फाइब्रिन थक्का बनना शुरू हो जाएगा, इसलिए जल्दी लेकिन जानबूझकर चरण 3.4.3 पूरा करें। और 3.4.4। विंदुक टिप (~ 3 एस) में फाइब्रिन जैल से पहले।
    3. उच्च थ्रूपुट प्लेट को एक कोण पर उठाएं और डिवाइस लोडिंग पोर्ट (L1 या L2) में से किसी एक में जल्दी से पिपेट टिप डालें। योजनाबद्ध के लिए चित्रा 2 ए देखें।
    4. ऊतक कक्ष में सेल/फाइब्रिन मिश्रण इंजेक्ट करने के लिए एक चिकनी, द्रव गति के साथ पिपेट प्लंजर को पहले स्टॉप पर धकेलें। जेल कक्ष के माध्यम से पूरी तरह से पार करने के लिए देखें.
      नोट: इस चरण के दौरान बहुत अधिक दबाव लागू करने से ऊतक कक्षों के ऊपर और/या नीचे माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों में जेल फट सकता है।
    5. धीरे पिपेट टिप को हटाने के बिना, विंदुक सवार जारी करने, या विंदुक परेशान करने के बिना टिशू कल्चर हुड में फ्लैट वापस प्लेट जगह है. मोड़ और P20 से विंदुक टिप हटाने के लिए अपने हाथ का प्रयोग करें और लोड हो रहा है बंदरगाह छेद में छोड़ दें. टिप को हटाने के लिए इजेक्टर बटन का उपयोग न करें क्योंकि इससे बहुत अधिक दबाव पड़ेगा।
    6. शेष उपकरणों के लिए चरण 3.4.1-3.4.5 के साथ आगे बढ़ें।
    7. लोड हो रहा है पूरा हो गया है, जब थाली टिशू कल्चर हुड में undisturbed 2 मिनट के लिए बैठने के लिए अनुमति देते हैं.
    8. धीरे घुमा और उन्हें लोड हो रहा बंदरगाहों से खींच द्वारा विंदुक युक्तियाँ निकालें. प्लेट पर ढक्कन बदलें।
    9. जेल को पूरी तरह से पोलीमराइज़ करने की अनुमति देने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 15-20 मिनट के लिए पूरी प्लेट को इनक्यूबेट करें।
    10. इनक्यूबेट करने के बाद, माइक्रोस्कोप के नीचे प्रत्येक डिवाइस यूनिट की जांच करें। कोशिकाओं को समान रूप से किसी भी हवा बुलबुले के बिना कक्ष भर में वितरित कर रहे हैं और ऊतक कक्ष और microfluidic चैनलों के बीच एक स्पष्ट रूप से दिखाई जेल अंतरफलक है कि देखने के लिए जाँच करें चित्रा 2B-सी में के रूप में.
  5. लैमिनिन के साथ चैनल कोटिंग (टाइमर = 45-50 मिनट से शुरू)
    1. जैल पूरी तरह से ठोस होने के बाद, संवहनी एनास्टोमोसिस को बढ़ावा देने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों में लेमिनिन का परिचय दें।
    2. P20 का उपयोग करके, डिवाइस के प्रत्येक माइक्रोफ्लुइडिक चैनल (ऊपर और नीचे) में 4 माइक्रोन लैमिनिन का परिचय दें। पिपेट टिप को M1 या M3 में डालें और लेमिनिन को धीरे-धीरे बाहर निकालें, यह सुनिश्चित करने के लिए कि लेमिनिन पूरे शीर्ष चैनल को कोट करता है, और फिर पूरे निचले चैनल को कोट करने के लिए M2 या M4 के लिए दोहराएं।
    3. दबाव नियामक के विपरीत तरफ से लेमिनिन को पाइप करके अभिविन्यास निर्धारित करें ताकि इसे धक्का देने के लिए पर्याप्त दबाव की अनुमति मिल सके। हालांकि, अगर लेमिनिन एक तरफ से आसानी से यात्रा नहीं करता है, तो एक तरफ से टिप को हटा दें और दूसरी तरफ से लेमिनिन को धक्का दें। विंदुक के दूसरे पड़ाव के लिए जा रहे हैं (यानी, सवार सभी तरह से नीचे धक्का) पूरे चैनल के माध्यम से लेमिनिन धक्का करने के लिए पर्याप्त दबाव उत्पन्न करने के लिए आवश्यक हो सकता है.
    4. टिप को मीडिया इनलेट/आउटलेट से धीरे से निकालें। P20 पर इजेक्टर बटन का उपयोग न करें।
    5. प्रत्येक डिवाइस के लिए कदम 3.5.1-3.5.4 दोहराएं और 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  6. मीडिया जोड़ (टाइमर = लगभग 1 घंटे 10 मिनट से शुरू)
    1. पंक्तियों ए और बी या जी और एच में कुओं के अयुग्मित मीडिया जलाशयों में ईजीएम 2 पूर्ण मीडिया के 275 माइक्रोन जोड़ें। यह उच्च पक्ष होगा, और अभिविन्यास शुरू करने के लिए दबाव नियामक उच्च मात्रा के विपरीत पक्ष पर कुओं बनाने के द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए. मीडिया को गुरुत्वाकर्षण द्वारा उच्च पक्ष से धकेल दिया जाएगा।
    2. P200 पिपेट का उपयोग करके, EGM2 के 275 μL वाले कुओं के मध्यम इनलेट/आउटलेट में मीडिया के 75 माइक्रोन का परिचय दें। टिप को मीडिया इनलेट छेद में डालें और धीरे-धीरे माध्यम को निष्कासित करें, यह देखते हुए कि मीडिया चैनल के माध्यम से यात्रा करता है और दूसरी तरफ बुलबुले करता है।
    3. पिपेट टिप निकालें और टिप से शेष मीडिया को मीडिया जलाशय में धकेलें ताकि उच्च पक्ष पर कुल मात्रा 350 माइक्रोन हो।
    4. प्रत्येक डिवाइस इकाई, ऊपर और नीचे चैनलों के लिए चरण 3.6.1-3.6.3 दोहराएं।
    5. ऊपर वर्णित अभिविन्यास के आधार पर, पंक्तियों ए और बी या जी और एच में कुओं को पूरी तरह से कम पक्ष को कवर करने के लिए मीडिया के 50 माइक्रोन जोड़ें। सुनिश्चित करें कि कुएं के तल को कवर करने वाले मीडिया की एक समान परत है। जलाशयों में मीडिया की मात्रा दिखाने वाले योजनाबद्ध के लिए चित्रा 2 डी का संदर्भ लें।
  7. हवाई बुलबुले हटाना (पोस्ट-लोडिंग)
    नोट: बुलबुले को हटाना प्रत्येक डिवाइस में उचित प्रवाह सुनिश्चित करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। 2 दिन तक, एंडोथेलियल कोशिकाएं और फाइब्रोब्लास्ट प्रवाह (चित्रा 2ई) के जवाब में बाहर निकलना शुरू कर देंगे।
    1. एक बार सभी मीडिया जोड़ा जाता है, चैनलों में या मध्यम इनलेट/आउटलेट पर हवा के बुलबुले की जांच से पहले 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 1-2 घंटे के लिए प्लेटें सेते हैं।
    2. माइक्रोस्कोप पर मीडिया चैनलों में बुलबुले कल्पना और बुलबुले बाहर धक्का करने के लिए चैनलों में मीडिया के 75 माइक्रोन reintroducing द्वारा निष्कासन.
    3. आंख से मध्यम इनलेट/आउटलेट में बुलबुले की कल्पना करें। प्लंजर को नीचे धकेलकर, छेद में टिप को पेश करके, और नकारात्मक दबाव लागू करने और बुलबुले को चूसने के लिए प्लंजर को उठाकर बुलबुले को बाहर निकालकर मध्यम इनलेट्स और आउटलेट पर फंसे हवा के बुलबुले को हटाने के लिए एक P200 पिपेट का उपयोग करें।

Figure 2
चित्र 2. डिवाइस लोडिंग का योजनाबद्ध। (ए) पी 20 पिपेट का उपयोग करके, सेल/फाइब्रिन मिक्स को लोडिंग पोर्ट में से एक के माध्यम से प्रत्येक डिवाइस यूनिट के ऊतक कक्ष में पेश किया जाता है। (बी) ब्राइटफील्ड माइक्रोग्राफ वीएमटी बनाने के लिए ईसी, फाइब्रोब्लास्ट और कैंसर कोशिकाओं से भरा एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस दिखाता है। स्केल बार = 500 माइक्रोन। (सी) बी में डिवाइस का प्रतिदीप्ति माइक्रोग्राफ लाल रंग में ईसी, सियान में ट्यूमर और नीले रंग में फाइब्रोब्लास्ट दिखा रहा है। (डी) योजनाबद्ध जलाशयों में माध्यम के अलावा दिखाता है, उच्च तरफ 350 माइक्रोन और कम तरफ 50 माइक्रोन के साथ हाइड्रोस्टेटिक दबाव सिर उत्पन्न करने के लिए। (ई) वीएमटी संस्कृति के दिन 2 से पता चलता है कि फाइब्रोब्लास्ट और ईसी संवहनी नेटवर्क बनाने के लिए बाहर निकलना शुरू कर देता है। स्केल बार = 200 माइक्रोन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

4. डिवाइस रखरखाव और प्रयोगात्मक अनुप्रयोग

  1. रखरखाव और दवा उपचार
    नोट: सिस्टम में प्रवाह बनाए रखने के लिए, हाइड्रोस्टेटिक दबाव को कम तरफ से उच्च पक्ष या इसके विपरीत मीडिया की मात्रा को पाइप करके दैनिक रूप से फिर से स्थापित किया जाना चाहिए, यह सुनिश्चित करना कि उच्च पक्ष में कुल मात्रा 350 माइक्रोन पर बनी हुई है। VMO या VMT स्थापना के दिन 2 के बाद हर दिन प्रवाह की दिशा बदल दी जाती है। अतिरिक्त रखरखाव और उपचार विवरण नीचे दिए गए हैं।
    1. ईजीएम 2 के साथ हर दूसरे दिन मीडिया बदलें जब तक कि वास्कुलचर पूरी तरह से स्थापित न हो जाए (दिन 5-6)। पुराने मीडिया को पूरी तरह से महाप्राण करें और उच्च दबाव वाले कुओं (350 μL) और कम दबाव वाले कुओं (50 μL) को बदलें।
      नोट: अनुकूलित मीडिया योगों का प्रायोगिक निर्धारण अन्य सेल प्रकारों के लिए आयोजित किया जा सकता है, जिसमें अक्सर 50:50 मिश्रण या ईजीएम 2 में विशिष्ट घटकों के अलावा शामिल होता है।
    2. एक बार संवहनी नेटवर्क का गठन किया है और ऊतक पूरी तरह से विकसित (दिन 4-7) है, प्रयोगों (4.2.1 कदम) के लिए उपकरणों का उपयोग करने से पहले एक डेक्सट्रान छिड़काव परीक्षण प्रदर्शन. केवल उन उपकरणों का उपयोग करें जिनके पास ऊतक कक्ष में पर्याप्त छिड़काव है।
    3. चिकित्सीय का उपयोग प्रयोगों के लिए, दिन उपचार शुरू होता है, प्रत्येक डिवाइस के लिए सभी फ्लोरोसेंट चैनलों में छवियों ले. यह एक आधार रेखा के रूप में काम करेगा।
    4. वांछित एकाग्रता पर पतला दवा युक्त ताजा माध्यम के साथ माध्यम को बदलकर वांछित चिकित्सीय उपकरणों का इलाज करें। सुनिश्चित करें कि निर्माता की सिफारिश के आधार पर उपयुक्त वाहनों में दवाओं को पतला किया जाता है, लेकिन मीडिया में 0.01% डीएमएसओ से अधिक नहीं होता है।
    5. वांछित समय के लिए दवा के लिए उपकरणों को बेनकाब करें (आमतौर पर 48 घंटे लेकिन फार्माकोकाइनेटिक्स द्वारा सूचित किया जा सकता है)।
    6. उपचार प्रतिक्रिया की निगरानी के लिए वांछित समय अंतराल पर प्रत्येक डिवाइस के प्रत्येक चैनल की छवि। प्रयोगों की अवधि के लिए चरण 4.1.1 में संकेत के रूप में प्लेटों को बनाए रखें.
    7. प्रयोग के पूरा होने पर, ब्लीच प्लेटें और एक biohazard कंटेनर में जगह, immunofluorescent धुंधला (कदम 4.3.) के लिए 4% पीएफए के साथ तय, या जीवित सेल या शाही सेना अलगाव (4.4 कदम) के लिए फसल.
  2. छिड़काव परख
    1. डेक्सट्रान का छिड़काव
      नोट: संवहनी पारगम्यता/धैर्य अलग-अलग आणविक भार (40 केडी, 70 केडी, या 150 केडी) के फ्लोरोसेंटली लेबल डेक्सट्रान के साथ संवहनी नेटवर्क को छिद्रित करके निर्धारित किया जा सकता है। FITC- या रोडामाइन-डेक्सट्रान का उपयोग EC के फ्लोरोसेंट लेबल के आधार पर किया जा सकता है।
      1. छिड़काव से पहले, तरल पदार्थ चैनल या एक खाली डिवाइस के कक्ष के भीतर डेक्सट्रान के कुछ माइक्रोन जोड़कर एफआईटीसी या रोडामाइन चैनल के उचित जोखिम का निर्धारण करें। पिक्सेल तीव्रता के हिस्टोग्राम को प्रदर्शित करने के लिए माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर के उपयोग के माध्यम से संतृप्ति स्तर के ठीक नीचे एक्सपोजर समय सेट करें, उच्च तीव्रता वाले मूल्यों के किसी भी उल्लेखनीय एकाग्रता के बिना समान रूप से वितरित पिक्सल द्वारा विशेषता एक गतिशील रेंज सुनिश्चित करना।
      2. ब्याज के चैनलों में सभी उपकरणों के micrographs ले लो, फ्लोरोसेंट dextran चैनल में सभी उपकरणों की एक पृष्ठभूमि छवि सहित, पृष्ठभूमि के खिलाफ जांचना करने के लिए. ऊपर निर्धारित के रूप में एक ही जोखिम का प्रयोग करें और परिमाणीकरण के लिए लगातार छवियों को सुनिश्चित करने के लिए छवि फ्रेम के केंद्र में ऊतक कक्ष संरेखित.
      3. 1x DPBS में 5 mg/mL की एकाग्रता पर FITC-dextran या rhodamine-dextran का एक मुख्य स्टॉक तैयार करें। इस स्टॉक को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है।
      4. एक कार्यशील स्टॉक तैयार करने के लिए, ईजीएम 2 में 50 माइक्रोग्राम/एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए 5 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक को पतला करें।
      5. जलाशयों में मीडिया को पतला डेक्सट्रान समाधान के साथ आधा अधिकतम मात्रा (ऊतक कक्ष के ऊपर या नीचे चैनल पर उच्च पक्ष के रूप में एक अच्छी तरह से 175 माइक्रोन में) के रूप में बदलें। अन्य कुओं में मीडिया को बदलें ताकि अनकपल्ड हाई साइड को डेक्सट्रान के बिना ताजा ईजीएम 2 का 175 माइक्रोन मिल जाए, और कम तरफ के कुओं में प्रत्येक में केवल 50 माइक्रोन हो।
        नोट: डेक्सट्रान को केवल माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों (ऊपर या नीचे) के एक तरफ जोड़ा जाना चाहिए ताकि उच्च दबाव वाले पक्ष के माध्यम से, संवहनी बिस्तर में, और कम दबाव वाले पक्ष से यात्रा करने वाले डाई के दृश्य की अनुमति मिल सके।
      6. माइक्रोस्कोप के तहत, फ्लोरोसेंट डेक्सट्रान संवहनी नेटवर्क के माध्यम से प्रवाह के लिए देखें। यह आम तौर पर मीडिया जलाशय में डाई जोड़ने के बाद लगभग 2 मिनट के भीतर होगा.
      7. फ्लोरोसेंट डेक्सट्रान चैनल (और अन्य चैनलों, यदि वांछित है) इमेजिंग शुरू. यह T = 0 टाइमपॉइंट है। कई समय बिंदुओं (आमतौर पर हर 10 मिनट) या एक एकल अंत बिंदु छवि पर अतिरिक्त छवियों ले लो.
    2. कोशिकाओं का छिड़काव
      नोट: विभिन्न सेल प्रकारों को अध्ययन डिजाइन के आधार पर वास्कुलचर के माध्यम से छिद्रित किया जा सकता है, जिसमें कैंसर इम्यूनोलॉजी अध्ययन के लिए लिम्फोसाइट्स या मैक्रोफेज शामिल हैं, साथ ही मेटास्टेसिस अध्ययन के लिए कैंसर कोशिकाएं भी शामिल हैं। कोशिकाओं fluorescently समय के साथ ट्रैकिंग की सुविधा के लिए लेबल किया जाना चाहिए.
      1. कोशिकाओं को सुगंधित करने से पहले कम से कम 2 घंटे, ऊपर उल्लिखित सभी उपकरणों पर डेक्सट्रान छिड़काव करें। कोशिकाओं को जोड़ने से पहले संवहनी धैर्य निर्धारित करने के लिए यह कदम महत्वपूर्ण है।
      2. कोशिकाओं को परफ्यूज करने के लिए उपयुक्त कैमरा एक्सपोजर निर्धारित करें। माइक्रोस्कोप के नीचे देखने के लिए कोशिकाओं का एक छोटा सा नमूना लें और उस फ्लोरोसेंट मार्कर के लिए एक्सपोजर समय निर्धारित करें। संतृप्ति स्तर के ठीक नीचे एक्सपोज़र समय सेट करें।
      3. ब्याज के चैनलों में सभी उपकरणों के micrographs ले लो, फ्लोरोसेंट dextran चैनल में सभी उपकरणों की एक पृष्ठभूमि छवि सहित, पृष्ठभूमि के खिलाफ जांचना करने के लिए. चरण 4.2.2.1 में निर्धारित के रूप में एक ही जोखिम का उपयोग करें.
      4. पुष्टि करें कि डेक्सट्रान छिड़काव के लिए कोशिकाओं की कटाई से पहले ऊतक कक्षों से पूरी तरह से बाहर फैल गया है। फसल और ब्याज की कोशिकाओं की गिनती.
      5. ईजीएम 2 में उचित घनत्व पर कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। उदाहरण के लिए, टी कोशिकाओं को आमतौर पर रक्त में एकाग्रता की नकल करने के लिए लगभग 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल में जोड़ा जाता है।
        नोट: ईसी मीडिया संरचना के प्रति संवेदनशील हैं लेकिन अधिकांश अन्य मीडिया के साथ 50% मिश्रण को सहन कर सकते हैं। पहले से परीक्षण करें।
      6. प्रत्येक डिवाइस के उच्च पक्ष पर एक अच्छी तरह से सेल निलंबन के 175 माइक्रोन जोड़ें और ईजीएम 2 के 175 माइक्रोन को दूसरे कुएं में पूरा करें। कम तरफ, दोनों कुओं में ईजीएम 2 पूर्ण मीडिया के 50 माइक्रोन जोड़ें।
      7. माइक्रोस्कोप के तहत, फ्लोरोसेंट कोशिकाओं को संवहनी नेटवर्क के माध्यम से प्रवाह करने के लिए देखें। यह आम तौर पर मीडिया जलाशय में कोशिकाओं को जोड़ने के बाद लगभग 2 मिनट के भीतर घटित होगा.
      8. एक बार सेल प्रवाह स्थापित हो जाने के बाद, फ्लोरोसेंट सेल चैनल (और अन्य चैनलों, यदि वांछित हो) इमेजिंग शुरू करें। यह T = 0 टाइमपॉइंट है। अध्ययन डिजाइन के आधार पर कई समय बिंदुओं या एकल अंत-बिंदु छवि पर अतिरिक्त छवियां लें। उदाहरण के लिए, इमेजिंग हर 10 मिनट उच्च संकल्प समय पाठ्यक्रम या आवधिक सेल आंदोलनों को ट्रैक करने के लिए हर 6-12 घंटे में परिणाम होगा.
  3. इम्यूनोफ्लोरोसेंट (आईएफ) धुंधला हो जाना
    1. कुओं से मीडिया को आकांक्षित करें। प्रत्येक डिवाइस इकाई के उच्च पक्ष के दोनों कुओं में 4% पीएफए के 200 माइक्रोन और कम तरफ 50 माइक्रोन जोड़ें। पीएफए कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए कक्षों के माध्यम से प्रवाह या 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट की अनुमति दें.
    2. इनक्यूबेशन के दौरान, अच्छी तरह से प्रति 1x पीबीएस के 500 माइक्रोन के साथ एक 24 अच्छी तरह से थाली तैयार करें। गणना करें कि प्रत्येक डिवाइस को दागने के लिए कितने कुओं की आवश्यकता होती है।
    3. कुओं से पीएफए को पूरी तरह से हटा दें। प्लेट उल्टा मुड़ें और ध्यान से झिल्ली पर प्लास्टिक बैकिंग हटा दें.
      नोट: यदि धुंधला झिल्ली और डिवाइस को हटाने के बिना स्वस्थानी में भी किया जा सकता है। ऐसा करने के लिए, VMO/VMT के माध्यम से अभिकर्मकों perfusing द्वारा धुंधला कदम प्रदर्शन और लगभग 6 गुना द्वारा प्रत्येक इनक्यूबेशन कदम की अवधि में वृद्धि.
    4. बहुत धीरे और ध्यान से डिवाइस की सुविधा परत बंद नीचे झिल्ली परत छील ऊतक कक्षों दोनों कोनों पकड़ और एक धीमी और चिकनी गति में नीचे खींच द्वारा बेनकाब करने के लिए. अधिकांश ऊतक ऊतक कक्ष में रहना चाहिए। कृपया चित्र 3A देखें।
    5. फीचर परत के माध्यम से पूरी तरह से कटौती करने के लिए पर्याप्त बल लागू करने के लिए एक रेजर ब्लेड या स्केलपेल का उपयोग करें और प्रत्येक व्यक्तिगत डिवाइस इकाई के चारों ओर एक छोटी आयत काट लें, जैसा कि चित्र 3 बी में दिखाया गया है।
    6. फीचर लेयर और वेल प्लेट के बीच एक स्पैटुला वेज करें। अच्छी तरह से प्लेट से ऊतक कक्ष युक्त पूरी सुविधा परत को ध्यान से हटाने के लिए सुविधा परत के नीचे कोमल दबाव लागू करें।
    7. प्रत्येक आयताकार PDMS सुविधा परत टुकड़ा ऊतक चेहरे नीचे एक एकल अच्छी तरह से पीबीएस युक्त में रखें.
    8. एक बार सभी इकाइयों कुओं में हैं, 5 मिनट के लिए एक सौम्य घुमाव पर थाली रखकर पीबीएस के साथ धो लें, अच्छी तरह से पीबीएस aspirating, और ताजा पीबीएस के 500 माइक्रोन के साथ यह जगह. कुल 3 washes के लिए दोहराएं।
    9. प्रत्येक अच्छी तरह से पीबीएस एस्पिरेट करें और पीबीएस में 0.5% ट्राइटन-एक्स के 500 माइक्रोन के साथ ऊतकों को पारगम्य करें, एक सौम्य घुमाव पर प्रत्येक 10 मिनट के लिए 2x। पारगम्यता समाधान निकालें।
    10. कोमल रॉकिंग के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 0.1% ट्राइटन-एक्स प्रति डिवाइस में 10% सीरम के 500 माइक्रोन में ब्लॉक।
    11. वांछित एकाग्रता और मात्रा के लिए 0.1% ट्राइटन-एक्स में 3% सीरम में प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करें। अवरुद्ध समाधान निकालें और प्रत्येक कुएं के नीचे पूरी तरह से कवर करने के लिए पर्याप्त प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें और डिवाइस के ऊतकों (~ 200 माइक्रोन) की मुक्त आवाजाही की अनुमति दें। प्लेट को एक पारदर्शी फिल्म से ढक दें।
    12. प्लेट 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर कमाल सेते हैं. अगले दिन, डिवाइस ऊतकों युक्त प्लेट कमरे के तापमान (~ 15 मिनट) के लिए वापस लाने.
    13. प्रत्येक अच्छी तरह से प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान महाप्राण और पीबीएस के 500 माइक्रोन के साथ कक्षों को धोने, एक सौम्य घुमाव पर प्रत्येक 5 मिनट के लिए 3x।
    14. वांछित एकाग्रता पर 0.1% ट्राइटन-एक्स में 3% सीरम में माध्यमिक एंटीबॉडी के 200 माइक्रोन जोड़ें। अंधेरे में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए कोमल कमाल के साथ थाली सेते हैं.
    15. माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान महाप्राण और पीबीएस के साथ धो लें, कोमल कमाल के साथ प्रत्येक 5 मिनट के लिए 3x। अंधेरे में कमाल करते हुए 10 मिनट के लिए 0.1% ट्राइटन-एक्स में 1x DAPI का घोल जोड़ें।
    16. चिमटी का उपयोग करके प्लेट से सना हुआ ऊतकों युक्त आयताकार डिवाइस कट-आउट निकालें और एक कागज तौलिया पर ऊतक-पक्ष रखें।
    17. पिपेट प्रत्येक कक्ष और coverslip पर सीधे antifade समाधान के कुछ μL (~ 10 μL) बुलबुले शुरू करने के लिए नहीं ख्याल रखना. अंधेरे में कमरे के तापमान पर रात भर कक्षों पर इलाज करने के लिए antifade की अनुमति दें और फिर इमेजिंग के साथ आगे बढ़ें.
  4. आणविक assays के लिए ऊतक और सेल अलगाव
    नोट: प्रत्येक उच्च थ्रूपुट प्लेट में फसल के समय बिंदु के आधार पर लगभग 1-2 x 105 कोशिकाएं होंगी। कुल कोशिकाओं के साथ-साथ कटाई के दौरान संभावित नुकसान के लिए खाते में प्रयोगात्मक प्रतिकृतियों की संख्या स्केल करें।
    1. एकल-कोशिका विश्लेषण
      1. प्रत्येक कुएं से मीडिया को महाप्राण करें और उच्च-थ्रूपुट प्लेट को उल्टा करें ताकि डिवाइस की परत ऊपर की ओर हो।
      2. झिल्ली पर प्लास्टिक बैकिंग निकालें। बहुत धीरे और ध्यान से डिवाइस की सुविधा परत बंद PDMS नीचे झिल्ली छील ऊतक कक्षों दोनों कोनों पकड़ और एक धीमी और चिकनी गति में नीचे खींच द्वारा बेनकाब करने के लिए.
      3. उचित संबंध के साथ भी झिल्ली को हटाया जा सकता है। झिल्ली को हटाने के बाद अधिकांश ऊतक ऊतक कक्ष में रहना चाहिए; हालांकि, अगर कोई हिस्सा झिल्ली से चिपक गया है, तो झिल्ली पर ही नीचे दिए गए चरणों का पालन करें।
      4. प्रत्येक डिवाइस इकाई को HBSS या PBS के 500 μL से धोएं। प्रत्येक डिवाइस इकाई के लिए, पृथक्करण अभिकर्मक के 100 माइक्रोन जोड़ें और इसे डिवाइस के शीर्ष पर एक छोटी बूंद के रूप में बैठने की अनुमति दें। प्लेट को 5 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में वापस रखें।
      5. पाचन के बाद, ऊतक कक्षों में ऊपर और नीचे पाइप करने के लिए एक P200 विंदुक का उपयोग करें और पृथक्करण अभिकर्मक में ऊतकों को इकट्ठा करें। ऊतक के पूर्ण निष्कासन को सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक डिवाइस में पिपेट टिप को आगे और पीछे ले जाएं और पृथक्करण अभिकर्मक को बेअसर करने के लिए ईजीएम 2 के 500 माइक्रोन के साथ 15 एमएल शंक्वाकार में इकट्ठा करें।
      6. ऊतक कक्ष से शेष कोशिकाओं को पूरी तरह से हटाने के लिए, प्रत्येक डिवाइस इकाई में ईजीएम 2 के 500 माइक्रोन जोड़ें और पी 200 पिपेट के साथ धो लें।
      7. एकल कोशिकाओं और पूरे ऊतकों को गोली देने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर अव्यवस्थित ऊतकों वाले पाचन समाधान को अपकेंद्रित्र करें।
      8. मीडिया को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें और ऊतकों में एचबीएसएस में 1 मिलीग्राम/एमएल (200 यू/एमएल) कोलेजनेज टाइप IV, 0.1 मिलीग्राम/एमएल हाइलूरोनिडेस टाइप वी, और 200 यू/एमएल डीएनए टाइप IV के 500 माइक्रोन जोड़ें।
      9. कोमल resuspension के बाद, जेल अलग करने के लिए धीरे से फिर से pipetting से पहले कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए बैठने के लिए समाधान की अनुमति दें.
      10. ईजीएम 2 के 10 एमएल के साथ पाचन मिश्रण धोएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें। 1% बीएसए या एचएसए के साथ 1x डीपीबीएस में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और 1 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर कताई करके पूर्व-गीला 70 माइक्रोन फिल्टर से गुजरें।
      11. कोशिकाओं की गणना करें और मात्रा को समायोजित करें ताकि अंतिम एकाग्रता 1000 कोशिकाएं प्रति μL हो। सेलुलर निलंबन को तब एफएसीएस, प्रवाह साइटोमेट्री या एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण के अधीन किया जा सकता है।
    2. पूरे ऊतकों से आरएनए अलगाव
      1. ऊपर दिए गए चरणों 4.4.1.1 और 4.4.1.2 का पालन करें।
      2. प्रत्येक उजागर ऊतक कक्ष पर आरएनए lysis बफर के लगभग 10 माइक्रोन जोड़ें, यह सुनिश्चित करते हुए कि बफर सीधे ऊतकों के शीर्ष पर पूल. कुल मिलाकर आरएनए लाइसिस बफर के 100 माइक्रोन से अधिक का उपयोग न करें।
      3. कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए सेते हैं. प्रत्येक डिवाइस इकाई पर ऊपर और नीचे पाइप करने के लिए P20 का उपयोग करें और यदि आवश्यक हो तो ऊतक कक्ष से किसी भी अवशिष्ट सामग्री को परिमार्जन करने के लिए पिपेट टिप का उपयोग करें।
      4. एक 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में जितना संभव हो उतना लाइसिस बफर स्थानांतरित करें। दोहराएँ कदम 4.4.2.2.-4.4.2.3. शेष उपकरणों और पूल नमूनों के लिए 1.5 एमएल ट्यूब में।
      5. किट या अभिकर्मकों के आधार पर आरएनए को अलग करने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें।

Figure 3
चित्र 3. इम्यूनोस्टेनिंग के लिए मंच तैयार करना। (ए) शीर्ष पर झिल्ली परत के साथ पूरी तरह से इकट्ठे डिवाइस प्लेटफॉर्म का योजनाबद्ध। झिल्ली को हटाने के लिए, बाहरी परत के प्रत्येक कोने को एक स्थिर, कोमल गति में ध्यान से नीचे खींचें। (बी) एक बार झिल्ली परत पूरी तरह से हटा दिया जाता है, एक ब्लेड, स्केलपेल, या चाकू का उपयोग करने के लिए प्रत्येक डिवाइस इकाई के ऊतक कक्ष के आसपास आयतों को काटने के लिए, ध्यान रखना ऊतक में ही कटौती नहीं है. एक स्पैटुला को तब प्रत्येक आयत के नीचे रखा जा सकता है ताकि इसे प्लेट से हटा दिया जा सके और प्रत्येक इकाई को धुंधला होने के लिए पीबीएस के साथ 24-अच्छी प्लेट के एक कुएं में रखा जा सके। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल के बाद, वीएमओ और वीएमटी को व्यावसायिक रूप से खरीदे गए ईसी, एनएचएलएफ, और, वीएमटी के लिए, ट्रिपल-नकारात्मक स्तन कैंसर सेल लाइन एमडीए-एमबी -231 का उपयोग करके स्थापित किया गया था। स्थापित वीएमओ को मेटास्टेसिस की नकल करने के लिए कैंसर कोशिकाओं के साथ भी लगाया गया था। प्रत्येक मॉडल में, सह-संस्कृति के दिन 5 तक, ऊतक कक्ष में गुरुत्वाकर्षण-संचालित प्रवाह के जवाब में एक संवहनी नेटवर्क आत्म-इकट्ठा होता है, जो पोषक तत्वों, चिकित्सीय, और कैंसर या प्रतिरक्षा कोशिकाओं के वितरण जैसे विवो में स्ट्रोमल आला (चित्रा 4) के लिए एक नाली के रूप में कार्य करता है। वीएमओ को पहली बार ऊतक कक्ष में एमचेरी-लेबल ईसी शुरू करके स्थापित किया गया था, जैसा कि कोशिकाओं के समान वितरण के साथ चित्रा 4 ए (संस्कृति का दिन 0) में दिखाया गया है। वीएमओ संस्कृति के दिन 2 पर, ईसी बाहर खिंचाव और लुमेनाइज करना शुरू करता है (चित्रा 4 बी), और दिन 4 तक, ईसी ने बाहरी माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों के साथ एनास्टोमोस किया है और एक निरंतर संवहनी नेटवर्क(चित्रा 4सी)बनाते हैं। वास्कुलचर के बाद एनास्टोमोस का गठन किया और बाहरी चैनलों को पंक्तिबद्ध किया, वीएमओ ऊतक को संवहनी पेटेंसी (चित्रा 4डी) की पुष्टि करने के लिए 70 केडी एफआईटीसी-डेक्सट्रान के साथ छिद्रित किया गया था। FITC-डेक्सट्रान को उच्चतम हाइड्रोस्टेटिक दबाव के साथ मीडिया जलाशय में पेश किया गया था और तीरों द्वारा इंगित किए गए अनुसार उच्च दबाव पक्ष से कम दबाव वाले पक्ष तक सूक्ष्म वाहिकाओं के माध्यम से ऊतक कक्ष में छिड़कने की अनुमति दी गई थी। वीएमओ में, एफआईटीसी-डेक्सट्रान ने कम से कम संवहनी रिसाव के साथ 15 मिनट के भीतर माइक्रोवैस्कुलर नेटवर्क को पूरी तरह से छिद्रित किया, तंग संवहनी बाधा समारोह(चित्रा 4ई)की पुष्टि करता है। एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं को तब वीएमओ में छिद्रित किया गया था, जहां कोशिकाओं ने एंडोथेलियल अस्तर(चित्रा 4एफ)का पालन किया और ऊतक कक्ष(चित्रा 4जी)के भीतर कई माइक्रो-मेटास्टेस बनाते हुए, 24 घंटे के बाद छिड़काव के भीतर अतिरिक्त-संवहनी अंतरिक्ष में अतिरिक्त प्रवेश किया। समय चूक सूक्ष्म फ्लोरोसेंट छवियों वास्तविक समय (पूरक वीडियो 1, पूरक वीडियो 2) में microvasculature के माध्यम से perfusing कैंसर कोशिकाओं का निरीक्षण करने के लिए एक उल्टे confocal खुर्दबीन पर 4x और 10x हवा के उद्देश्यों के साथ हर 50 एमएस लिया गया.

वीएमओ में, टी कोशिकाओं को 45 मिनट(चित्रा 4एच-आई)के दौरान बाह्य अंतरिक्ष में अतिरिक्त देखा जा सकता है। समय चूक फ्लोरोसेंट micrographs वास्तविक समय (पूरक वीडियो 3) में टी सेल extravasation निरीक्षण करने के लिए हर 15 मिनट में 150 माइक्रोन गहराई के एक जेड स्टैक प्राप्त करने के लिए एक confocal खुर्दबीन पर लिया गया. जैसा कि चित्र 4J में दिखाया गया है, MDA-MB-231 VMT पूरी तरह से गठित, गैर-टपका हुआ जहाजों के साथ टी कोशिकाओं (पीला) के साथ perfused थे, जिनमें से कई तेजी से संवहनी दीवार (तीर) का पालन करते थे; चित्रा 4K, पूरक वीडियो 4, पूरक वीडियो 5)। ये परिणाम, पूर्व अध्ययनों 8,9,10,11,12,13,14,15 के अलावा, क्रमशः इम्यूनोलॉजी और प्रतिरक्षा-ऑन्कोलॉजी अनुसंधान के लिए वीएमओ और वीएमटी प्लेटफार्मों की उपयोगिता को प्रदर्शित करते हैं।

Figure 4
चित्रा 4. MDA-MB-231 VMT और VMO के लिए प्रतिनिधि परिणाम. (ए) ऊतक कक्ष में कोशिकाओं को लोड करने के तुरंत बाद 0 दिन पर वीएमओ। ईसी लाल रंग में दिखाए गए हैं। स्केल बार = 500 माइक्रोन। (बी) वीएमओ संस्कृति के दिन 2 तक, ईसी प्रवाह के जवाब में खिंचाव शुरू करता है। (सी) वीएमओ दिन 4 से पता चलता है कि संवहनी नेटवर्क बाहरी माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों के साथ एनास्टोमोस्ड है, और वाहिकाएं लगभग परिपक्व हैं। (डी) वीएमओ नेटवर्क पूरी तरह से सुगंधित हैं और संस्कृति के 5 वें दिन पेटेंट हैं। वेसल्स लाल रंग में दिखाए गए हैं, 70 केडी FITC-डेक्सट्रान ग्रीन। प्रवाह की दिशा तीरों द्वारा इंगित की जाती है। स्केल बार = 500 माइक्रोन। (ई) ज़ूम दृश्य perfused VMO की. स्केल बार = 100 माइक्रोन। (एफ) एमडीए-एमबी -231 (सियान) ई में दिखाए गए एक ही वीएमओ नेटवर्क के माध्यम से छिद्रित है, और समय 0 पर, कैंसर कोशिकाओं ने एंडोथेलियल पोत अस्तर (एरोहेड्स) का पालन किया है। स्केल बार = 100 माइक्रोन। (जी) 24 घंटे तक, एमडीए-एमबी -231 कोशिकाओं ने बाह्य अंतरिक्ष में अतिरिक्त किया है, संवहनी आला के भीतर कई सूक्ष्म मेटास्टेस स्थापित किए हैं। स्केल बार = 100 माइक्रोन। (एच) समय चूक कन्फोकल फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी 45 मिनट के पाठ्यक्रम पर वीएमओ (मैं) के भीतर एक सूक्ष्म पोत के माध्यम से टी सेल एक्सट्रावेशन का पता चलता है. एरोहेड अपव्यय के क्षेत्रों को दर्शाते हैं। स्केल बार = 50 माइक्रोन। (जे) ट्रिपल-नकारात्मक स्तन कैंसर सेल लाइन एमडीए-एमबी -231 वीएमटी में स्थापित है और 5 दिन पर सुगंधित है। स्केल बार = 500 माइक्रोन। संवहनी नेटवर्क 15 मिनट के बाद छिड़काव (इनसेट, स्केल बार = 100 माइक्रोन) पर न्यूनतम रिसाव दिखाता है। (के) एमडीए-एमबी -231 वीएमटी (बी के समान) टी कोशिकाओं (पीला) के साथ छिद्रित होता है, टी सेल के कई क्षेत्रों के साथ संवहनी दीवार (तीर) का पालन होता है। स्केल बार = 500 माइक्रोन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक वीडियो 1. "वीएमओ में डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं का छिड़काव"। COV362 कोशिकाओं (सियान) के समय चूक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी एक संवहनी नेटवर्क (लाल) के माध्यम से perfused और 4x उद्देश्य हर 50 एमएस 1 मिनट के लिए imaged. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक वीडियो 2. "वीएमओ में ट्रिपल-नकारात्मक स्तन कैंसर कोशिकाओं का छिड़काव"। एमडीए-एमबी -231 कोशिकाओं (सियान) के समय चूक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी एक संवहनी नेटवर्क (लाल) के माध्यम से perfused और 10x उद्देश्य हर 50 एमएस के लिए 30 एस पर imaged. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक वीडियो 3. वीएमओ का टी सेल परफ्यूजन। समय चूक confocal फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी एक 45 मिनट की अवधि में VMO के भीतर एक सूक्ष्म पोत के माध्यम से टी सेल एक्सट्रावेशन की प्रक्रिया पर कब्जा कर लिया. जेड स्टैक छवियों 2 माइक्रोन के एक कदम आकार और 150 माइक्रोन की गहराई के साथ, हर 15 मिनट प्राप्त किए गए थे. पोत लाल है, टी कोशिकाएं पीली हैं। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक वीडियो 4. वीएमटी का टी सेल परफ्यूजन। 4x उद्देश्य पर एमडीए-एमबी -231 वीएमटी के माध्यम से टी कोशिकाओं की समय चूक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी। टी कोशिकाओं को पीले रंग में, एमडीए-एमबी -231 सियान में, और लाल रंग में जहाजों / ईसी को दिखाया गया है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक वीडियो 5. टी सेल-VMT छिड़काव के ज़ूम दृश्य. टी कोशिकाओं ( पूरक वीडियो 4 से) के साथ perfused एमडीए-एमबी -231 VMT के आवर्धित 10x दृश्य. टी कोशिकाओं को पीले रंग में, एमडीए-एमबी -231 सियान में, और लाल रंग में जहाजों / ईसी को दिखाया गया है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

शरीर में लगभग हर ऊतक वाहिका के माध्यम से पोषक तत्व और ऑक्सीजन प्राप्त करता है, जिससे यह यथार्थवादी रोग मॉडलिंग और इन विट्रो में दवा स्क्रीनिंग के लिए एक महत्वपूर्ण घटक बन जाता है। इसके अलावा, कई विकृतियों और रोग राज्यों को संवहनी एंडोथेलियल डिसफंक्शन और हाइपरपरमेबिलिटी3 द्वारा परिभाषित किया गया है। विशेष रूप से, कैंसर में, ट्यूमर से जुड़े वास्कुलचर अक्सर बीमार-छिद्रित, बाधित और टपका हुआ होता है, इस प्रकार ट्यूमर को चिकित्सीय और प्रतिरक्षा कोशिका वितरण में बाधा के रूप में कार्य करता है। इसके अलावा, वास्कुलचर एक नाली के रूप में कार्य करता है जिसके माध्यम से कैंसर कोशिकाएं बीज के दूर के ऊतकों को मेटास्टेसाइज कर सकती हैं और सेल-सेल संचार की सुविधा प्रदान करती हैं जो कैंसर कोशिका के विकास और प्रसार को बढ़ावा देते हुए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को कम करती हैं। ये घटनाएं चिकित्सीय प्रतिरोध और कैंसर की प्रगति में संवहनी आला की महत्वपूर्ण भूमिका और प्रीक्लिनिकल अध्ययन के दौरान ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को सटीक रूप से मॉडल करने की आवश्यकता को उजागर करती हैं। फिर भी इन विट्रो मॉडल सिस्टम में मानक उपयुक्त स्ट्रोमल और संवहनी घटकों को शामिल करने या गतिशील प्रवाह की स्थिति को शामिल करने में विफल रहते हैं। वर्तमान मॉडल प्रणालियों में इन कमियों को दूर करने के लिए, एक अच्छी तरह से विशेषता वाले माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम को स्थापित करने के तरीके जो फिजियोलॉजिकल ऑन्कोलॉजी अनुसंधान के लिए एक जीवित, सुगंधित मानव माइक्रो-ट्यूमर (वीएमटी) के गठन का समर्थन करते हैं, प्रस्तुत किए गए थे। महत्वपूर्ण रूप से, वीएमटी मॉडल ट्यूमर से जुड़े जहाजों और ट्यूमर-स्ट्रोमल इंटरैक्शन की प्रमुख विशेषताएं, जो इसे बायोमिमेटिक रोग मॉडलिंग और चिकित्सीय प्रभावकारिता परीक्षण10 के लिए आदर्श बनाती हैं।

उपयोग में आसानी के लिए, प्लेटफ़ॉर्म को किसी भी बाहरी पंप या वाल्व की आवश्यकता नहीं होती है और, 96-वेल प्लेट प्रारूप के कारण मानक संस्कृति उपकरण और वर्कफ़्लो के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अलावा, अलग-अलग जैविक प्रश्नों और स्थापित ऊतक- और रोगी-विशिष्ट डिब्बों को संबोधित करने के लिए विभिन्न उपकरण पुनरावृत्तियों को 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 मान्य किया गया है . जबकि मंच को विभिन्न सेल प्रकारों को एकीकृत करके लगभग किसी भी अंग- या ऊतक-विशिष्ट उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, कोशिकाओं को इष्टतम सीडिंग घनत्व और सह-संस्कृति स्थितियों को निर्धारित करने के लिए अलग-अलग सेल सांद्रता पर वीएमओ / वीएमटी के भीतर विकास और वास्कुलोजेनिक क्षमता के लिए पहले परीक्षण किया जाना चाहिए। वाहिका स्थापित करने के लिए, मानव एंडोथेलियल कॉलोनी बनाने वाले सेल-व्युत्पन्न एंडोथेलियल कोशिकाओं (ईसीएफसी-ईसी) को सीडी 31 + कोशिकाओं का चयन करके व्यावसायिक रूप से या ताजा कॉर्ड रक्त से अलग किया जा सकता है। मानव गर्भनाल शिरा एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचयूवीईसी) का उपयोग वीएमओ/वीएमटी के भीतर वास्कुलचर स्थापित करने के लिए भी किया जा सकता है और इसे या तो व्यावसायिक रूप से खरीदा जा सकता है या गर्भनाल डोरियों से ताजा अलग किया जा सकता है। इसके साथ ही, प्रेरित pluripotent स्टेम सेल व्युत्पन्न endothelial कोशिकाओं (IPSC-ईसी) सफलतापूर्वक मंच में परीक्षण किया गया है, एक पूरी तरह से ऑटोलॉगस प्रणाली18 की संभावना खोलने. व्यावसायिक रूप से व्युत्पन्न फाइब्रोब्लास्ट (मानक, सामान्य मानव फेफड़े के फाइब्रोब्लास्ट उनकी वास्कुलोजेनिक क्षमता के लिए) वीएमओ / वीएमटी में अच्छी तरह से काम करते हैं, और कुछ प्राथमिक-व्युत्पन्न स्ट्रोमल सेल आबादी को भी शामिल या प्रतिस्थापित किया जा सकता है। प्राथमिक-व्युत्पन्न ट्यूमर को वीएमटी में एकल कोशिकाओं, स्फेरॉइड, ऑर्गेनोइड या ट्यूमर विखंडू के रूप में पेश किया जा सकता है। मैट्रिक्स संरचना कोलेजन, लेमिनिन, fibronectin, या यहां तक कि decellularized ऊतक matrices19 के साथ spiking सहित, प्रयोगात्मक जरूरतों के अनुसार संशोधित किया जा सकता है.

प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम शामिल हैं जहां आम मुद्दों (चित्रा 5) से बचने के लिए विशेष देखभाल आवश्यक है। लोडिंग के दौरान, सावधान पाइपिंग और ऊतक कक्ष(चित्रा 5ए)में चिकनी परिचय द्वारा सेल/फाइब्रिन घोल के सजातीय मिश्रण को सुनिश्चित करें। आंशिक लोडिंग (चित्रा 5बी) को रोकने के लिए जेल को पूरी तरह से कक्ष में निष्कासित करने के लिए उचित दबाव लागू करें। पूरे ऊतक कक्ष को पार करने वाले सेल/फाइब्रिन घोल की कल्पना करना पूर्ण कक्ष भरने को सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है और डिवाइस यूनिट के पीछे एक दस्ताने वाली उंगली रखकर सुविधा प्रदान की जा सकती है। माइक्रोफ्लूइडिक चैनलों(चित्रा 5सी)में सेल/फाइब्रिन मिश्रण को फटने से रोकने के लिए माइक्रोपिपेट प्लंजर पर बहुत मुश्किल दबाने से बचें। ऊतक विकास और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों(चित्रा 5डी)के साथ हस्तक्षेप को रोकने के लिए पाइपिंग के दौरान हवाई बुलबुले पेश नहीं करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। उचित मिश्रण और लोडिंग गति असंगत थक्के (चित्रा 5E) के क्षेत्रों से बचने के लिए महत्वपूर्ण हैं, जबकि समय से पहले पिपेट टिप को हटाने से कक्ष में जेल (चित्रा 5F) बाधित हो सकता है। प्रक्रिया के समयबद्ध तत्व और लोडिंग चरण के साथ उपयोगकर्ताओं को परिचित करने के लिए अभ्यास लोडिंग की सिफारिश की जाती है। इसके अलावा, माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों में लैमिनिन को ठीक से पेश करना ईसी माइग्रेशन, बाहरी चैनलों के साथ एनास्टोमोसिस और पोषक तत्वों के वितरण के लिए एक निरंतर, परफ्यूजेबल नेटवर्क के गठन के लिए महत्वपूर्ण है। अपूर्ण या अनुपस्थित चैनल अस्तर खराब छिड़काव परिणाम और अनुपयोगी VMO/VMT को जन्म देगा।

Figure 5
चित्रा 5. लोडिंग के साथ सामान्य गलतियाँ। (ए) माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस यूनिट दोषों के बिना ठीक से लोड की गई है। (बी) सेल/फाइब्रिन मिक्स को पूरी तरह से चैम्बर में पेश नहीं किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप आंशिक लोडिंग हुई। (सी) लोडिंग के दौरान बहुत अधिक दबाव लागू होता है, जिसके परिणामस्वरूप जेल माइक्रोफ्लुइडिक चैनल में फट जाता है, प्रवाह को अवरुद्ध करता है। (डी) हवा के बुलबुले सेल में पेश किए गए/पाइपिंग करते समय कक्ष के भीतर फाइब्रिन मिश्रण करते हैं। (ई) सेल/फाइब्रिन मिक्स का अनुचित मिश्रण या धीमी लोडिंग के कारण थक्के में विसंगतियां होती हैं। (एफ) लोड हो रहा है बंदरगाह से विंदुक टिप को हटाने से पहले जेल पर्याप्त रूप से सेट ऊतक कक्ष में सेल / फाइब्रिन मिश्रण के विघटन में परिणाम होगा. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

VMO/VMT अध्ययनों में विश्लेषण के लिए मजबूत और मानकीकृत वर्कफ़्लो महत्वपूर्ण हैं, क्योंकि वे पर्याप्त मात्रा में इमेजिंग डेटा उत्पन्न करते हैं। VMO/VMT के लिए इमेज प्रोसेसिंग और विश्लेषणात्मक तरीकों का वर्णन पहले 8,9,10,11,12,13 किया गया है। ट्यूमर मात्रात्मक विश्लेषण के लिए, ट्यूमर कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व रंग चैनल में फ्लोरोसेंट तीव्रता ImageJ/फिजी (स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान)20 या CellProfiler (ब्रॉड संस्थान)21 की तरह खुला स्रोत सॉफ्टवेयर का उपयोग कर मापा जाता है. ट्यूमर माइक्रोग्राफिक छवियों की दहलीज फ्लोरोसेंट ट्यूमर क्षेत्र का चयन करने के लिए सेट है, और मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता उस क्षेत्र के भीतर मापा जाता है. ट्यूमर की कुल फ्लोरोसेंट तीव्रता की गणना फ्लोरोसेंट क्षेत्र के उत्पाद और इसकी औसत तीव्रता के रूप में की जाती है, जो प्रयोगात्मक अवधि में प्रति डिवाइस ट्यूमर विकास में गुना परिवर्तन प्राप्त करने के लिए आधारभूत मूल्यों (पूर्व-उपचार) के लिए सामान्यीकृत होती है। पोत मात्रात्मक विश्लेषण के संबंध में, एंजियोटूल (नेशनल कैंसर इंस्टीट्यूट) 22, इमेजजे / फिजी मैक्रो स्क्रिप्ट, या मैटलैब सॉफ्टवेयर, जैसे रीवर23, का उपयोग कुल पोत लंबाई, समापन बिंदुओं की संख्या, जंक्शनों की संख्या, औसत पोत लंबाई, पोत व्यास, मतलब अभाव, और पोत प्रतिशत क्षेत्र को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। मशीन लर्निंग एल्गोरिदम को यौगिकों की पहचान करने के लिए संवहनी छवियों के स्वचालित विश्लेषण के लिए वर्कफ़्लो में एकीकृत किया जा सकता है जो प्रभावी रूप से वास्कुलचर24 को बाधित करते हैं। छिड़काव छवियों बाह्य अंतरिक्ष के क्षेत्रों के भीतर प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन को मापने और पारगम्यता गुणांक10 की गणना के द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं. एक माइक्रोवैस्कुलर नेटवर्क के अंदर इंट्राल्यूमिनल प्रवाह के परिमित तत्व सिमुलेशन COMSOL मल्टीफिजिक्स25 का उपयोग करके किया जा सकता है। वीएमटी अध्ययनों में उत्पन्न डेटा की विशाल मात्रा से सार्थक अंतर्दृष्टि निकालने के लिए मानकीकृत विश्लेषणात्मक तरीकों का कार्यान्वयन महत्वपूर्ण है।

यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल उपयोगकर्ता को ट्यूमर जीव विज्ञान के कई पहलुओं का अध्ययन करने के लिए वीएमओ / वीएमटी प्लेटफॉर्म का लाभ उठाने की अनुमति देगा, जिसमें ट्यूमर विकास / प्रगति, ट्यूमर मेटास्टेसिस, इंट्रा-ट्यूमर टी सेल गतिशीलता और कीमोथेरेपी और एंटी-एंजियोजेनिक उपचार के लिए ट्यूमर प्रतिक्रिया शामिल है। शारीरिक रूप से प्रासंगिक इम्यूनो-ऑन्कोलॉजी अध्ययनों को सक्षम करने के लिए, यह प्रदर्शित किया गया था कि कैसे ताजा पृथक टी कोशिकाएं माइक्रोवैस्कुलचर के माध्यम से छिड़कती हैं, एंडोथेलियल सेल बाधा के पार एक्सट्रावेस करती हैं, और ऊतक निर्माण में पलायन करती हैं। समय चूक सूक्ष्म confocal इमेजिंग स्थानिक यादृच्छिक, अस्थायी तेजी से घटनाओं, टी सेल extravasation सहित, जो आसानी से अन्य मॉडल प्रणालियों के साथ कल्पना नहीं कर रहे हैं देखने के लिए एक उपकरण के रूप में प्रस्तुत किया गया था. इसके अलावा, हमने पहले वीएमटी में कई प्रकार की एंटीनोप्लास्टिक दवाओं का परीक्षण किया है, जिसमें कीमोथेरेप्यूटिक्स, छोटे अणु / टायरोसिन किनसे अवरोधक, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (जैसे एंटी-पीडी 1 और बेवासिज़ुमैब), एंटी-एंजियोजेनिक यौगिक और संवहनी स्थिरीकरण एजेंट शामिल हैं, यह रेखांकित करते हुए कि ट्यूमर और संबंधित स्ट्रोमा8 दोनों को लक्षित करने वाली दवाओं के विभिन्न वर्गों का परीक्षण करने के लिए मंच का उपयोग कैसे किया जा सकता है, 9,10,11,12,13. प्रवाह को मंच से एकत्र किया जा सकता है और विभिन्न साइटोकिन्स के साथ-साथ एक्सोसोम के लिए विश्लेषण किया जा सकता है। भविष्य के अध्ययनों में, वीएमटी प्लेटफॉर्म का उपयोग व्यक्तिगत रोगी स्तर पर टी-सेल-मध्यस्थता हमले के लिए ट्यूमर कोशिकाओं की संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। अंत में, वीएमटी एक लचीला और शक्तिशाली मंच है और एक जो ट्यूमर जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए आदर्श है, जहां संवहनी और स्ट्रोमल घटकों का रीमॉडेलिंग ट्यूमर की प्रगति की कुंजी है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

CCWH की Aracari Biosciences, Inc. में इक्विटी रुचि है, जो इस पेपर में वर्णित तकनीक के एक संस्करण का व्यावसायीकरण कर रहा है। इस व्यवस्था की शर्तों की समीक्षा की गई है और कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, इरविन द्वारा इसकी हितों के टकराव की नीतियों के अनुसार अनुमोदित किया गया है। हितों का कोई अन्य टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम वर्णित प्रक्रियाओं में उनके मूल्यवान इनपुट के लिए डॉ क्रिस्टोफर ह्यूजेस की प्रयोगशाला के सदस्यों के साथ-साथ मंच डिजाइन और निर्माण के साथ उनकी सहायता के लिए डॉ अब्राहम ली की प्रयोगशाला में हमारे सहयोगियों को धन्यवाद देते हैं। इस काम को निम्नलिखित अनुदानों द्वारा समर्थित किया गया था: UG3/UH3 TR002137, R61/R33 HL154307, 1R01CA244571, 1R01 HL149748, U54 CA217378 (CCWH) और TL1 TR001415 और W81XWH2110393 (SJH)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fabrication
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane, 95%  Sigma-Aldrich 175617-100G
Greiner Bio-One μClear Bottom 96-well Polystyrene Microplates Greiner Bio-One 655096
Methanol ≥99.8% ACS VWR Chemicals BDH BDH1135-1LP
MILTEX Sterile Disposable Biopsy Punch with Plunger, 1mm diameter, Integra Miltex 33-31AA-P/25
PDMS membrane PAX Industries HT-6240
Plasma Cleaner PDC-001 Harrick Plasma N/A
Smooth-Cast 385 Smooth-On N/A
SP Bel-Art Lab Companion Clear Polycarbonate Cabinet Style Vacuum Desiccator Bel-Art F42400-4031
Standard Lids with Condensation Rings, 96-well plate VWR 82050-827
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) Dow 4019862
Cell culture/Loading
BioTek Lionheart FX Automated Microscope Agilent  CYT5MFAW
CELLvo Human Endothelial Progenitor Cells StemBioSys N/A
Collagen I, rat tail Enzo Life Sciences
Collagenase from Clostridium histolyticum (type 4) Sigma-Aldrich C5138
Corning Hank’s Balanced Salt Solution, 1X without calcium and magnesium Corning 21-021-CV
Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate Corning 10013CV
DAPI Sigma-Aldrich D9542
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190144
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit Lonza CC-3162
Fibrinogen from bovine plasma Neta Scientific SIAL-341573
Fibronectin human plasma Sigma-Aldrich F0895
Fluorescein isothiocyanate–dextran (70kDa) Sigma-Aldrich FD70S-1G
Gelatin from porcine skin Sigma-Aldrich G1890
Hyaluronidase from sheep testes (type 4) Sigma-Aldrich H6254
Laminin Mouse Protein Gibco 23017015
Leica TCS SP8 Leica N/A
MDA-MB-231 ATCC HTB-26
NHLF – Normal Human Lung Fibroblasts Lonza CC-2512
Nikon Eclipse Ti Nikon N/A
Paraformaldehyde 4% in 0.1M Phosphate BufferSaline, pH 7.4 Electron Microscopy Sciences  15735-90-1L
PBMCs - Peripheral blood mononuclear cells Lonza CC-2702
PBS, pH 7.4 Gibco 10010049
Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated Avantor Seradigm 97068-091
ProLong Gold Antifade Mountant Invitrogen P10144
Quick-RNA Microprep Kit Zymo Research R1051
Thrombin from bovine plasma Sigma-Aldrich T4648
Triton X-100 (Electrophoresis), Fisher BioReagents BP151-100
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red Gibco 12605028
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300062
Vasculife Lifeline Cell Technology LL-0003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. Cancer statistics, 2023. CA Cancer J Clin. 73 (1), 17-48 (2023).
  2. Hachey, S. J., Hughes, C. C. W. Applications of tumor chip technology. Lab Chip. 18 (19), 2893-2912 (2018).
  3. Ewald, M. L., Chen, Y. H., Lee, A. P., Hughes, C. C. W. The vascular niche in next generation microphysiological systems. Lab Chip. 21 (17), 3615-3616 (2021).
  4. Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Vascularized microfluidic organ-chips for drug screening, disease models and tissue engineering. Curr Opin Biotechnol. 52, 116-123 (2018).
  5. Shirure, V. S., Hughes, C. C. W., George, S. C. Engineering vascularized organoid-on-a-chip models. Annu Rev Biomed Eng. 23, 141-167 (2021).
  6. Del Piccolo, N., et al. Tumor-on-chip modeling of organ-specific cancer and metastasis. Adv Drug Deliv Rev. 175, 113798 (2021).
  7. Sontheimer-Phelps, A., Hassell, B. A., Ingber, D. E. Modelling cancer in microfluidic human organs-on-chips. Nat Rev Cancer. 19 (2), 65-81 (2019).
  8. Sobrino, A., et al. 3D microtumors in vitro supported by perfused vascular networks. Sci Rep. 6, 31589 (2016).
  9. Phan, D. T. T., et al. A vascularized and perfused organ-on-a-chip platform for large-scale drug screening applications. Lab Chip. 17 (3), 511-520 (2017).
  10. Hachey, S. J., et al. An in vitro vascularized micro-tumor model of human colorectal cancer recapitulates in vivo responses to standard-of-care therapy. Lab Chip. 21 (7), 1333-1351 (2021).
  11. Hachey, S. J., et al. A Human Vascularized Micro-Tumor Model of Patient-Derived Colorectal Cancer Recapitulates Clinical Disease. Transl Res. 255, 97-108 (2023).
  12. Liu, Y., et al. Human in vitro vascularized micro-organ and micro-tumor models are reproducible organ-on-a-chip platforms for studies of anticancer drugs. Toxicology. 445, 152601 (2020).
  13. Jahid, S., et al. Structure-based Design of CDC42 Effector Interaction Inhibitors for the Treatment of Cancer. Cell Rep. 39 (4), 110760 (2022).
  14. Hsu, Y. H., Moya, M. L., Hughes, C. C. W., George, S. C., Lee, A. P. A microfluidic platform for generating large-scale nearly identical human microphysiological vascularized tissue arrays. Lab Chip. 13 (15), 2990-2998 (2013).
  15. Moya, M. L., Hsu, Y. H., Lee, A. P., Christopher, C. W. H., George, S. C. In vitro perfused human capillary networks. Tissue Eng - Part C: Methods. 19 (9), 730-737 (2013).
  16. Wang, X., et al. An on-chip microfluidic pressure regulator that facilitates reproducible loading of cells and hydrogels into microphysiological system platforms. Lab Chip. 16 (5), 868-876 (2016).
  17. Phan, D. T., et al. Blood-brain barrier-on-a-chip: Microphysiological systems that capture the complexity of the blood-central nervous system interface. Exp Biol Med. 242 (17), 1669-1678 (2017).
  18. Kurokawa, Y. K., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells for three-dimensional microphysiological systems. Tissue Eng Part C: Methods. 23 (8), 474-484 (2017).
  19. Romero-López, M., et al. Recapitulating the human tumor microenvironment: Colon tumor-derived extracellular matrix promotes angiogenesis and tumor cell growth. Biomaterials. 116, 118-129 (2017).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  21. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: Image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).
  22. Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS one. 6 (11), e27385 (2011).
  23. Corliss, B. A., et al. REAVER: A program for improved analysis of high-resolution vascular network images. Microcirculation. 27 (5), e12618 (2020).
  24. Urban, G., et al. Deep learning for drug discovery and cancer research: Automated analysis of vascularization images. IEEE/ACM Trans Comput Biol Bioinform. 16 (3), 1029-1035 (2019).
  25. COMSOL Multiphysics. , Stockholm, Sweden. www.comsol.com (2023).

Tags

संवहनी माइक्रो-ट्यूमर मॉडल कैंसर अनुसंधान ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट ठोस कैंसर प्रीक्लिनिकल कैंसर अनुसंधान चिकित्सीय विकास ट्यूमर चिप माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम मानव कोशिका प्रकार माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म सुगंधित संवहनी नेटवर्क एंडोथेलियल परत चिकित्सीय वितरण प्रतिरक्षा कोशिका अपव्यय मेटास्टेसिस फ्लोरोसेंटली लेबल कोशिकाएं ट्यूमर विषमता जीन अभिव्यक्ति हस्ताक्षर दवा प्रतिक्रियाएं निजीकृत चिकित्सा
कैंसर अनुसंधान के लिए एक शारीरिक मानव संवहनी माइक्रो-ट्यूमर मॉडल की स्थापना
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hachey, S. J., Gaebler, D., Hughes,… More

Hachey, S. J., Gaebler, D., Hughes, C. C. W. Establishing a Physiologic Human Vascularized Micro-Tumor Model for Cancer Research. J. Vis. Exp. (199), e65865, doi:10.3791/65865 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter