Summary
이 프로토콜은 생리학적으로 관련된 종양온어칩(tumor-on-a-chip) 모델을 제시하여 고처리량 기초 및 중개 인간 암 연구를 수행하고, 약물 스크리닝, 질병 모델링 및 로딩, 유지 관리 및 평가 절차에 대한 설명과 함께 맞춤형 의학 접근법을 발전시킵니다.
Abstract
시험관 내 고형암의 종양 미세환경을 재현하는 검증된 암 모델의 부족은 전임상 암 연구 및 치료제 개발에 있어 여전히 중요한 병목 현상으로 남아 있습니다. 이러한 문제를 극복하기 위해 복잡한 인간 종양 미세환경을 현실적으로 모델링하는 미세생리학적 시스템인 혈관화 미세종양(vascularized microtumor, VMT) 또는 종양 칩(tumor chip)을 개발했습니다. VMT는 역동적이고 생리적인 유동 조건에서 여러 인간 세포 유형을 공동 배양하여 미세유체 플랫폼 내에서 새로운 세포를 형성합니다. 이 조직 공학적 미세 종양 구조는 생체 내에서 새로 형성된 혈관과 마찬가지로 성장하는 종양 덩어리를 지원하는 살아있는 관류 혈관 네트워크를 통합합니다. 중요한 것은 약물과 면역 세포가 종양에 도달하기 위해 내피층을 통과해야 하며, 치료 전달 및 효능에 대한 생체 내 생리학적 장벽을 모델링해야 한다는 것입니다. VMT 플랫폼은 광학적으로 투명하기 때문에 조직 내에서 형광 표지된 세포를 직접 시각화하여 면역 세포 유출 및 전이와 같은 동적 과정에 대한 고해상도 이미징을 달성할 수 있습니다. 또한 VMT는 생체 내 종양 이질성, 유전자 발현 시그니처 및 약물 반응을 유지합니다. 거의 모든 유형의 종양을 플랫폼에 적용할 수 있으며, 신선한 수술 조직의 일차 세포가 VMT에서 성장하고 약물 치료에 반응하여 진정한 맞춤형 의학을 향한 길을 열었습니다. 여기에서는 VMT를 확립하고 종양학 연구에 활용하는 방법을 간략하게 설명합니다. 이 혁신적인 접근 방식은 종양 및 약물 반응 연구를 위한 새로운 가능성을 열어 연구자들에게 암 연구를 발전시킬 수 있는 강력한 도구를 제공합니다.
Introduction
암은 전 세계적으로 주요 건강 문제로 남아 있으며 미국에서는 두 번째로 큰 사망 원인입니다. 미국 국립보건통계센터(National Center for Health Statistics)는 2023년 한 해에만 미국에서 190만 건 이상의 새로운 암 사례와 60만 명 이상의 암 사망자가 발생할 것으로 예상하고있다 1 효과적인 치료 접근법의 시급한 필요성을 강조하고 있다. 그러나 현재 임상시험에 진입한 항암제 중 5.1%만이 FDA 승인을 받고 있다. 유망한 후보 물질이 임상시험을 성공적으로 진행하지 못하는 것은 전임상 약물 개발 과정에서 2D 및 스페로이드 배양과 같은 비생리학적 모델 시스템을 사용하기 때문일 수 있다2. 이러한 고전적 암 모델에는 치료 내성 및 질병 진행의 주요 결정 요인인 기질 틈새, 관련 면역 세포 및 관류된 혈관과 같은 종양 미세환경의 필수 구성 요소가 부족합니다. 따라서 전임상 결과의 임상 번역을 개선하기 위해 인간 생체 내 종양 미세환경을 더 잘 모방하는 새로운 모델 시스템이 필요합니다.
조직 공학 분야는 빠르게 발전하고 있으며, 실험실 환경에서 인간의 질병을 연구하기 위한 개선된 방법을 제공하고 있습니다. 한 가지 중요한 발전은 장기 칩 또는 조직 칩으로도 알려진 미세 생리학 시스템(MPS)의 출현으로, 이는 건강하거나 병든 상태를 복제할 수 있는 기능적이고 소형화된 인간 장기입니다 3,4,5. 이러한 맥락에서 3차원 미세유체 기반 체외 인간 종양 모델인 종양 칩이 종양학 연구를 위해 개발되었습니다 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . 이러한 고급 모델은 역동적인 종양 미세환경 내에서 생화학적 및 생물물리학적 단서를 통합하여 연구자들이 생리학적으로 보다 관련성이 높은 맥락에서 종양 행동과 치료에 대한 반응을 연구할 수 있도록 합니다. 그러나 이러한 발전에도 불구하고 살아 있고 기능적인 혈관 구조, 특히 생리적 흐름에 반응하여 자체 패턴을 만드는 혈관을 성공적으로 통합한 그룹은 거의 없습니다 3,4,5,6. 기능적 혈관 네트워크의 포함은 약물 또는 세포 전달, 뚜렷한 미세 환경으로의 세포 귀환, 종양, 기질 및 면역 세포의 경내피 이동에 영향을 미치는 물리적 장벽을 모델링할 수 있기 때문에 매우 중요합니다. 이 특징을 포함시킴으로써, 종양 칩은 생체 내 종양 미세환경에서 관찰되는 복잡성을 더 잘 표현할 수 있다.
이러한 미충족 수요를 해결하기 위해 당사는 미세유체 장치 8,9,10,11,12,13,14,15,16 내에서 미세 혈관 네트워크를 형성할 수 있는 새로운 약물 스크리닝 플랫폼을 개발했습니다. 혈관화된 미세장기(vascularized micro-organ, VMO)라고 하는 이 기본 장기 칩 플랫폼은 질병 모델링, 약물 스크리닝 및 맞춤형 의학 응용 분야를 위해 원래 조직 생리학을 복제하기 위해 거의 모든 장기 시스템에 적용할 수 있습니다. VMO는 내피 콜로니 형성 세포 유래 내피 세포(ECFC-EC), HUVEC 또는 iPSC-EC(이하 EC)와 챔버 내 여러 기질 세포(기질을 리모델링하는 정상 인간 폐 섬유아세포(NHLF)와 혈관을 감싸고 안정화하는 주피를 포함한 여러 기질 세포를 공동 배양하여 확립합니다. VMO는 또한 종양 세포를 관련 기질과 공동 배양하여 혈관화된 미세 종양(VMT)8,9,10,11,12,13 또는 종양 칩 모델을 생성함으로써 암 모델 시스템으로 확립될 수 있습니다. 동적 유동 환경에서 여러 세포 유형의 공동 배양을 통해 관류된 미세혈관 네트워크는 혈관 형성이 간질 유속14,15에 의해 밀접하게 조절되는 장치의 조직 챔버에서 de novo를 형성합니다. 배지는 생체 내 모세혈관에서 볼 수 있는 것과 유사한 1.2 x 10-7 cm/s의 투과성 계수로 미세 혈관을 통해서만 조직 챔버의 주변 세포에 영양분을 공급하는 정수압 헤드에 의해 장치의 미세유체 채널을 통해 구동됩니다 8.
VMT 모델에 자기 조직화 된 마이크로 혈관의 통합은 다음과 같은 이유로 중요한 돌파구를 나타냅니다 : 1) 생체 내에서 혈관 종양 덩어리의 구조와 기능을 모방합니다. 2) 종양-내피 및 기질 세포 상호 작용을 포함한 전이의 주요 단계를 모델링할 수 있습니다. 3) 영양소 및 약물 전달을 위한 생리학적 선택적 장벽을 설정하여 의약품 스크리닝을 개선합니다. 4) 항혈관신생 및 항전이성 기능이 있는 약물을 직접 평가할 수 있습니다. VMO/VMT 플랫폼은 복잡한 3D 미세환경에서 영양소, 약물 및 면역 세포의 생체 내 전달을 복제함으로써 약물 스크리닝을 수행하고 암, 혈관 또는 장기 특이적 생물학을 연구하는 데 사용할 수 있는 생리학적으로 관련된 모델입니다. 중요한 것은 VMT가 대장암, 흑색종, 유방암, 교모세포종, 폐암, 복막암, 난소암, 췌장암 등 다양한 유형의 종양의 성장을 지원한다는 것입니다 8,9,10,11,12,13. 미세유체 플랫폼은 비용이 저렴하고 쉽게 설정할 수 있으며 고처리량 실험을 위해 배열할 수 있을 뿐만 아니라 종양-기질 상호 작용 및 자극 또는 치료에 대한 반응의 실시간 이미지 분석을 위해 광학적으로 완벽하게 호환됩니다. 시스템의 각 세포 유형은 서로 다른 형광 마커로 표지되어 전체 실험에서 세포 행동을 직접 시각화하고 추적할 수 있어 동적 종양 미세환경을 들여다볼 수 있습니다. 우리는 이전에 VMT가 표준 배양 양식보다 생체 내 종양 성장, 구조, 이질성, 유전자 발현 시그니처 및 약물 반응을 더 충실하게 모델링한다는 것을 보여주었습니다10. 중요한 것은 VMT가 암세포를 포함한 환자 유래 세포의 성장과 연구를 지원하여 표준 스페로이드 배양보다 모종양의 병리학을 더 잘 모델링하고 맞춤형 의학 노력을 더욱 발전시킨다는 것입니다11. 이 원고는 VMT를 확립하는 방법을 간략하게 설명하고 인간 암 연구에 대한 유용성을 보여줍니다.
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Protocol
1. 설계 및 제작
- 장치 설계
- 미세유체 장치 제조의 경우 Si-웨이퍼(RCA-1 세척 및 2% 불화수소(HF) 처리)에 스핀 코팅된 SU-8 2μm 층을 사용하여 SU-8 금형을 만든 다음 앞서 설명한 대로 단일 마스크 포토리소그래피 단계를 수행합니다 8,9.
- SU-8 금형에서 4mm 두께의 폴리디메틸실록산(PDMS) 복제본을 주조하여 다운스트림 제조 단계를 위한 내구성 있는 폴리우레탄 금형을 생성합니다. 다양한 설계 반복을 사용할 수 있습니다 8,9,10,11,12,13,14,15.
- 현재 반복에서는 표준 96웰 플레이트 형식으로 맞춤 장착되고 바닥에 얇은(1/16인치) 투명 폴리머 멤브레인 층으로 둘러싸인 12개의 미세유체 장치 장치가 있는 2mm 두께의 PDMS 기능 레이어로 구성되도록 미세유체 장치를 설계합니다(그림 1A).
- 개별 조직 단위가 겔 로딩 입구(L1) 및 출구(L2), 압력 조절기(PR)16 및 양쪽에 있는 2개의 매체 입구 및 출구(M1-M2, M3-M4; 그림 1B).
- 미세유체 채널을 가로질러 정수압(10mm H2O)을 설정하기 위한 중간 저장소 역할을 하는 단일 웰 내에 각 입구와 출구를 배치합니다. 외부 채널로 혈관 네트워크 문합을 허용하려면 50μm 너비의 통신 공극(상단 6개, 하단 6개)을 통해 미세유체 채널을 조직 챔버에 연결합니다.
알림: 미세유체 저항기는 혈관 네트워크가 완전히 형성되면 내강이 되는 조직 챔버를 가로질러 5mm H2O 간질 압력 구배를 생성합니다 8,10. 후속 절차는 완전히 조립된 고처리량 플레이트로 시작됩니다.
그림 1. 미세유체 플랫폼 설계. (A) 플랫폼 어셈블리의 회로도는 바닥이 없는 96웰 플레이트에 접착되고 얇은 투명 폴리머 멤브레인으로 밀봉된 12개의 장치 장치가 있는 PDMS 기능 레이어를 보여줍니다. 각 장치 장치는 플레이트의 웰 열을 차지합니다. 빨간색 윤곽선으로 표시된 단일 장치 장치는 (B)에 세부 정보와 함께 표시됩니다. (B) 한 장치 장치의 개략도는 96웰 플레이트의 1웰 내에 위치한 단일 조직 챔버와 세포-매트릭스 혼합물이 도입될 수 있도록 입구 및 출구(L1-L2) 구멍이 펀칭된 2개의 로딩 포트를 보여줍니다. 중간 입구 및 출구(M1-M2, M3-M4)는 구멍이 뚫려 있으며 매체 저장소 역할을 하는 웰 내에 배치됩니다. 다양한 양의 배지는 분리된 미세유체 채널을 통해 조직 챔버 전체에 정수압 구배를 형성합니다. 압력 조절기(PR) 장치는 로딩 용이성을 높이기 위해 겔 파열 밸브 역할을 합니다. 장치의 깊이는 200μm이고 조직 챔버는 2mm x 6mm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. 적재 전 준비 사항
- 세포 배양
- 제조업체의 권장 사항에 따라 가습된 37°C 및 5%CO2 인큐베이터에서 세포를 유지합니다.
- 형질도입된 EC, NHLF 또는 기타 섬유아세포/기질 세포의 플레이트 T75 플라스크와 원하는 암세포를 적재하기 3-4일 전에 제조업체 및 사용자 프로토콜에 의해 알려진 밀도로 적재합니다. 이 프로토콜의 경우 각 세포 유형에 대해 플라스크당 1 x 106 개의 세포를 플레이트합니다. Endothelial Growth Media 2 (EGM2) complete media의 배양 EC, 10 % FBS의 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)의 NHLF 및 세포 유형에 따라 적절한 배지의 암세포.
- 2-3일마다 각 배지를 공급하여 세포를 유지하고 형광 현미경으로 세포를 시각화하여 transduction 또는 labeling 효율을 재확인합니다. 로딩 당일에 EC가 80%-100% 합류점인지 확인하고 NHLF는 70%-80%에서 하위 합류점인지 확인합니다.
- 피브리노겐의 제조
- 피브리노겐 응고 비율을 고려하여 원하는 농도(일반적으로 5-8mg/mL는 강력한 혈관 네트워크 형성을 지원함)로 피브리노겐 용액을 준비합니다. 다음 방정식으로 필요한 피브리노겐의 양을 계산하십시오.
피브리노겐(mg) = (부피(mL)) x (농도(mg/mL))/ (응고 %) - 피브리노겐을 튜브를 부드럽게 튕겨서 37°C로 데운 적절한 부피의 내피 기저 배지 2(EBM2)에 녹입니다(소용돌이 치지 않음). 피브리노겐이 용액에 완전히 들어가도록 37°C 수조에서 배양합니다. 중요한 것은 완전한 매체를 사용하지 않는 것입니다.
- 0.22μm 필터가 있는 제균 필터 피브리노겐 용액과 원하는 부피로 부분 표본(일반적으로 마이크로 원심분리 튜브당 400μL).
참고: 다른 매트릭스 단백질(예: 콜라겐, 피브로넥틴 또는 라미닌)은 피브리노겐 혼합물에 스파이크될 수 있습니다.
- 피브리노겐 응고 비율을 고려하여 원하는 농도(일반적으로 5-8mg/mL는 강력한 혈관 네트워크 형성을 지원함)로 피브리노겐 용액을 준비합니다. 다음 방정식으로 필요한 피브리노겐의 양을 계산하십시오.
3. 샘플 로딩
알림: 로딩은 시간에 민감하며 최적의 결과를 얻으려면 약 1.5-1.75시간 이내에 시작(셀 리프팅)에서 완료(장치에 미디어 추가)를 완료해야 합니다. 각 단계는 사용자가 추적할 수 있도록 제안된 타이머와 함께 표시됩니다.
- 재료 준비(적재 당일)
- 37°C 수조에 10-15분 동안 다음을 넣습니다. 세포, 세포 해리 시약, 배지(예: EGM2, DMEM) 세척을 위한 Hank의 균형 염 용액(HBSS) 또는 인산염 완충 식염수(PBS)
- 사용할 준비가 될 때까지 다음 시약을 4°C 냉장고에 보관하십시오: 트롬빈, 라미닌(4°C에서 밤새 해동).
- 피브리노겐 분취액을 실온에서 해동합니다. 1.5μL의 트롬빈 분취액을 장치 단위당 하나의 튜브를 사용하여 500μL 미세 원심분리기 튜브에 준비합니다. 로딩을 용이하게 하기 위해 트롬빈 부분 표본이 각 튜브의 바닥에 있는지 확인하십시오.
- UV 멸균 고처리량 플레이트를 로딩 전에 최소 30분 동안 데시케이터에 넣어 미세유체역학에 갇힌 공기를 제거합니다.
- 셀 준비(타이머 시작 = 0분에 시작)
- 현미경으로 세포를 4배 배율로 관찰하여 밀도와 형질도입 효율을 확인합니다.
- 각 T75 플라스크를 5mL의 HBSS로 2회 세척하고 완전히 흡입합니다. 각 플라스크에 해리 시약 1mL를 넣고 37°C, 5%CO2 에서 1-2분 동안 배양합니다.
- 손바닥으로 플레이트를 가볍게 두드리며 모든 셀이 들어 올려졌는지 확인합니다.
- 플라스크에서 세포를 9mL의 적절한 배지로 세척하고 15mL 원뿔형으로 모읍니다. 세포 계수를 위해 작은 부분 표본을 즉시 제거하십시오.
- 세포를 300 x g 에서 4°C에서 3-5분 동안 원심분리합니다. 세포를 원심분리하는 동안 세포를 계산합니다. EC 또는 NHLF의 합류 T75 플라스크는 최소 2 x 106 세포를 생산해야 합니다.
- 원심분리 후 배지를 흡입하고 펠릿을 1 x 106 cells/mL 농도의 적절한 배지에 재현탁시킵니다. 세포를 얼음 위에 두십시오.
- 세포 및 피브리노겐 혼합물의 준비(타이머 = 20분에 시작)
- 얼마나 많은 장치를 로드할지 결정하고, 피펫팅 손실을 고려하여 1-2를 더하고, 장치당 필요한 세포/피브리노겐 혼합물의 부피를 곱합니다. 이는 장치 구성에 따라 다르지만 이 문서에 제시된 장치 설계의 경우 장치당 6μL가 필요합니다.
- 각 세포 유형의 농도는 실험적으로 결정되어야 합니다. 시작점의 경우 약 7 x 106 cells/mL 농도에서 EC를 로드하고 3.5 x 106 cells/mL 농도에서 NHLF를 로드합니다. 암세포의 농도는 성장 속도에 따라 상당히 달라질 수 있지만 일반적으로 0.5-2 x 106 cells/mL 범위 내에 있습니다. 이 방정식을 사용하여 필요한 셀 수를 계산합니다.
필요한 세포 수 = (피브린의 부피(μL))/1000μL x (세포 농도) - 1 x 106 cells/mL의 농도로 세포를 재현탁하고 다음 방정식을 사용하여 필요한 세포의 부피를 결정합니다.
필요한 세포 부피(μL) = (필요한 세포 수)/1000 - 원뿔형 튜브에 EC, NHLF 및 암세포(VMT만 해당)를 각각 혼합하고 4°C에서 3-5분 동안 300 x g 의 원심분리기를 사용합니다.
- 회전 후 조심스럽게 매체를 흡입하고 펠릿 근처에 남아 있는 매체를 피펫으로 제거합니다. 부드럽지만 철저하게 펠릿을 계산된 양의 피브리노겐에 다시 현탁시키고 기포가 생기지 않도록 각별히 주의하십시오. 얼음 위에 보관하십시오.
- 멸균된 플레이트와 트롬빈 분취액을 조직 배양 후드에 넣습니다.
- 장치 로딩(타이머 = 30-35분에 시작)
- P20 피펫을 사용하여 세포/피브린 혼합물에서 6μL 부피의 피펫을 추출합니다. 균일한 셀 현탁액을 보장하기 위해 혼합물을 위아래로 최소 5배 피펫으로 고정해야 합니다. 응고를 늦추기 위해 혼합물을 얼음 위에 두십시오.
- 피펫 팁을 튜브 바닥의 트롬빈 부분 표본에 직접 넣어 세포/피브린을 트롬빈 튜브 하나에 부드럽게 혼합합니다. 즉시 기포가 유입되지 않도록 주의하면서 위아래로 최소 2회 피펫을 피핑합니다. 피브린은 트롬빈과 혼합되면 응고되기 시작하므로 빠르지만 의도적으로 3.4.3단계를 완료합니다. 및 3.4.4. 피펫 팁의 피브린 겔 전(~3초).
- 고처리량 플레이트를 비스듬히 들어 올리고 피펫 팁을 장치 로딩 포트(L1 또는 L2) 중 하나에 빠르게 삽입합니다. 회로도는 그림 2A 를 참조하십시오.
- 피펫 플런저를 부드럽고 유동적인 동작으로 첫 번째 스톱까지 밀어 세포/피브린 혼합물을 조직 챔버에 주입합니다. 젤이 챔버를 완전히 통과하는지 확인하십시오.
참고: 이 단계에서 너무 많은 압력을 가하면 조직 챔버의 상단 및/또는 하단에 있는 미세유체 채널로 겔이 파열될 수 있습니다. - 피펫 팁을 제거하거나, 피펫 플런저를 풀거나, 피펫을 건드리지 않고 플레이트를 조직 배양 후드에 평평하게 다시 부드럽게 놓습니다. 손으로 P20에서 피펫 팁을 비틀어 제거하고 로딩 포트 구멍에 그대로 둡니다. 이젝터 버튼을 사용하여 팁을 제거하면 너무 많은 압력이 가해질 수 있으므로 사용하지 마십시오.
- 나머지 장치에 대해 3.4.1-3.4.5단계를 진행합니다.
- 로딩이 완료되면 플레이트를 조직 배양 후드에 방해받지 않고 2분 동안 그대로 두십시오.
- 피펫 팁을 부드럽게 비틀어 로딩 포트에서 당겨 제거합니다. 접시의 뚜껑을 교체합니다.
- 겔이 완전히 중합될 수 있도록 37°C 인큐베이터에서 전체 플레이트를 15-20분 동안 배양합니다.
- 배양 후 현미경으로 각 장치 장치를 확인하십시오. 그림 2B-C와 같이 세포가 기포 없이 챔버 전체에 고르게 분포되어 있고 조직 챔버와 미세유체 채널 사이에 명확하게 보이는 겔 계면이 있는지 확인합니다.
- 라미닌을 사용한 채널 코팅(타이머 = 45-50분에 시작)
- 겔이 완전히 고체가 된 후 미세유체 채널에 라미닌을 도입하여 혈관 문합을 촉진합니다.
- P20을 사용하여 4μL의 라미닌을 장치의 각 미세유체 채널(상단 및 하단)에 도입합니다. 피펫 팁을 M1 또는 M3에 삽입하고 라미닌이 전체 상단 채널을 코팅하는지 확인한 다음 M2 또는 M4에 대해 반복하여 전체 하단 채널을 코팅하도록 하면서 라미닌을 천천히 배출합니다.
- 압력 조절기 반대쪽에서 라미닌을 피펫팅하여 방향을 결정하여 충분한 압력이 통과할 수 있도록 합니다. 그러나 라미닌이 한쪽에서 쉽게 이동하지 않으면 한쪽에서 팁을 제거하고 반대쪽에서 라미닌을 밀어 넣습니다. 피펫의 두 번째 스톱으로 이동(즉, 플런저를 끝까지 밀기)은 전체 채널을 통해 라미닌을 밀어내기에 충분한 압력을 생성해야 할 수 있습니다.
- 미디어 입구/출구에서 팁을 조심스럽게 제거합니다. P20의 이젝터 버튼을 사용하지 마십시오.
- 각 장치에 대해 3.5.1-3.5.4단계를 반복하고 플레이트를 37°C, 5% CO2 에서 10분 동안 배양합니다.
- 미디어 추가(타이머 = 약 1시간 10분에 시작)
- 275μL의 EGM2 complete 배지를 A와 B 또는 G와 H열에 있는 웰의 결합되지 않은 배지 저장소에 추가합니다. 이것은 높은 쪽이 될 것이며, 압력 조절기 반대쪽의 웰을 시작하기 위해 높은 볼륨으로 만들어 방향을 결정해야 합니다. 미디어는 중력에 의해 높은 쪽에서 밀려날 것입니다.
- P200 피펫을 사용하여 275μL의 EGM2가 들어 있는 웰의 배지 입구/출구에 75μL의 배지를 주입합니다. 팁을 미디어 입구 구멍에 삽입하고 미디어가 채널을 통해 이동하고 반대쪽에서 거품이 올라오는 것을 관찰하면서 미디어를 천천히 배출합니다.
- 피펫 팁을 제거하고 팁의 나머지 매체를 매체 저장소로 밀어 넣어 높은 쪽의 총 부피가 350μL가 되도록 합니다.
- 각 장치 장치, 상단 및 하단 채널에 대해 3.6.1-3.6.3단계를 반복합니다.
- 위에서 설명한 방향에 따라 A와 B 또는 G와 H행의 낮은 쪽, 웰을 완전히 덮기 위해 50μL의 매체를 추가합니다. 우물 바닥을 덮고 있는 균일한 매체 층이 있는지 확인하십시오. 그림 2D 에서 저장소의 매체 부피를 보여주는 개략도를 참조하십시오.
- 기포 제거(로딩 후)
알림: 기포 제거는 각 장치의 적절한 흐름을 보장하기 위한 중요한 단계입니다. 2일째가 되면 내피 세포와 섬유아세포가 흐름에 반응하여 늘어나기 시작합니다(그림 2E).- 모든 배지가 추가되면 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 1-2시간 동안 플레이트를 배양한 후 채널 또는 배지 입구/출구에 기포가 있는지 확인합니다.
- 현미경으로 배지 채널의 기포를 시각화하고 75μL의 배지를 채널에 재도입하여 기포를 배출합니다.
- 중간 입구/출구의 기포를 눈으로 시각화합니다. P200 피펫을 사용하여 플런저를 아래로 누르고 팁을 구멍에 삽입한 다음 플런저를 들어 올려 기포를 당겨 기포를 빼내어 중간 입구와 출구에 갇힌 기포를 제거합니다.
그림 2. 장치 로딩 개략도. (A) P20 피펫을 사용하여 세포/피브린 혼합물을 로딩 포트 중 하나를 통해 각 장치 장치의 조직 챔버로 주입합니다. (B) 명시야 현미경 사진은 VMT를 형성하기 위해 EC, 섬유아세포 및 암세포가 로드된 미세유체 장치를 보여줍니다. 스케일 바 = 500 μm. (C) B에 있는 장치의 형광 현미경 사진으로 EC는 빨간색으로, 종양은 청록색으로, 섬유아세포는 파란색으로 표시됩니다. (D) 개략도는 정수압 수두를 생성하기 위해 높은 쪽에 350μL, 낮은 쪽에 50μL의 저장소에 매체를 추가하는 것을 보여줍니다. (E) VMT 배양 2일차는 섬유아세포와 EC가 혈관 네트워크를 형성하기 위해 늘어나기 시작하는 것을 보여줍니다. 스케일 바 = 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
4. 장치 유지 관리 및 실험적 응용 프로그램
- 유지 관리 및 약물 치료
참고: 시스템의 흐름을 유지하려면 낮은 쪽에서 높은 쪽으로 또는 그 반대로 매체의 부피를 피펫팅하여 정수압을 매일 재설정하여 높은 쪽의 총 부피가 350μL로 유지되도록 해야 합니다. VMO 또는 VMT 설정 2일차 이후 매일 흐름 방향이 전환됩니다. 추가 유지 관리 및 치료 세부 정보는 아래에 나와 있습니다.- 혈관이 완전히 확립될 때까지(5-6일) EGM2가 완료된 상태에서 격일로 배지를 교체합니다. 오래된 배지를 완전히 흡입하고 고압 웰(350μL) 및 저압 웰(50μL)을 교체합니다.
참고: 최적화된 배지 제형의 실험적 결정은 종종 EGM2에 특정 성분을 50:50 혼합 또는 첨가하는 다른 세포 유형에 대해 수행할 수 있습니다. - 혈관 네트워크가 형성되고 조직이 완전히 발달하면(4-7일) 실험에 장치를 사용하기 전에 덱스트란 관류 테스트를 수행합니다(4.2.1단계). 조직실에 충분한 관류가 있는 장치만 사용하십시오.
- 치료제를 사용한 실험의 경우 치료가 시작되는 날 각 장치의 모든 형광 채널에서 이미지를 촬영합니다. 이것은 기준선으로 사용됩니다.
- 원하는 농도로 희석된 약물이 포함된 새 배지로 배지를 교체하여 원하는 치료제로 장치를 치료합니다. 제조업체의 권장 사항에 따라 적절한 차량에서 약물을 희석하되 배지에서 0.01% DMSO를 초과하지 않도록 합니다.
- 원하는 시간(일반적으로 48시간이지만 약동학을 통해 알 수 있음) 동안 장치를 약물에 노출시킵니다.
- 각 장치의 모든 채널을 원하는 시간 간격으로 이미지화하여 치료 반응을 모니터링합니다. 실험 기간 동안 4.1.1단계에 표시된 대로 플레이트를 유지합니다.
- 실험이 완료되면 표백제를 제거하고 생물학적 위험 용기에 넣고 면역 형광 염색을 위해 4% PFA로 고정하거나(4.3단계) 살아있는 세포 또는 RNA 분리를 위해 수확합니다(4.4단계).
- 혈관이 완전히 확립될 때까지(5-6일) EGM2가 완료된 상태에서 격일로 배지를 교체합니다. 오래된 배지를 완전히 흡입하고 고압 웰(350μL) 및 저압 웰(50μL)을 교체합니다.
- 관류 분석
- 덱스트란의 관류
참고: 혈관 투과성/개통성은 다양한 분자량(40kD, 70kD 또는 150kD)의 형광 표지된 덱스트란으로 혈관 네트워크를 관류하여 결정할 수 있습니다. FITC- 또는 로다민-덱스트란은 EC의 형광 라벨에 따라 사용할 수 있습니다.- 관류 전에 빈 장치의 유체 채널 또는 챔버 내에 몇 μL의 덱스트란을 추가하여 FITC 또는 로다민 채널의 적절한 노출을 결정합니다. 현미경 소프트웨어를 사용하여 픽셀 강도의 히스토그램을 표시함으로써 노출 시간을 채도 수준 바로 아래로 설정하여 고강도 값의 눈에 띄는 집중 없이 균일하게 분포된 픽셀을 특징으로 하는 동적 범위를 보장합니다.
- 형광 덱스트란 채널에 있는 모든 장치의 배경 이미지를 포함하여 관심 채널에 있는 모든 장치의 현미경 사진을 찍어 배경에 대해 보정합니다. 위에서 결정한 것과 동일한 노출을 사용하고 정량화를 위해 일관된 이미지를 보장하기 위해 이미지 프레임의 중앙에 조직 챔버를 정렬합니다.
- 1x DPBS에서 5mg/mL 농도의 FITC-덱스트란 또는 로다민-덱스트란의 주요 스톡을 준비합니다. 이 스톡은 4 °C에서 보관할 수 있습니다.
- 작업 원료를 준비하려면 5mg/mL 스톡을 EGM2의 최종 농도 50μg/mL로 희석합니다.
- 저장소의 배지를 최대 부피의 절반으로 희석된 덱스트란 용액으로 교체합니다(175μL를 조직 챔버의 상단 또는 하단 채널의 높은 쪽과 하나의 웰에 넣음). 결합되지 않은 높은 쪽에는 덱스트란 없이 175μL의 신선한 EGM2가 있고 낮은 쪽의 우물에는 각각 50μL만 있도록 다른 웰의 배지를 교체합니다.
참고: 덱스트란은 미세유체 채널(상단 또는 하단)의 한쪽에만 첨가하여 염료가 고압 쪽을 통해 혈관 베드로 들어가고 저압 쪽으로 이동하는 것을 시각화할 수 있도록 해야 합니다. - 현미경으로 형광 덱스트란이 혈관 네트워크를 통해 흐르는 것을 관찰합니다. 이것은 일반적으로 배지 저장소에 염료를 첨가한 후 약 2분 이내에 발생합니다.
- 형광 덱스트란 채널(및 원하는 경우 다른 채널)의 이미징을 시작합니다. 이것은 T = 0 시점입니다. 여러 시점(일반적으로 10분마다) 또는 단일 끝점 이미지에서 추가 이미지를 촬영합니다.
- 세포의 관류
참고: 암 면역학 연구를 위한 림프구 또는 대식세포와 전이 연구를 위한 암세포를 포함하여 연구 설계에 따라 다양한 세포 유형이 혈관을 통해 관류될 수 있습니다. 세포는 시간 경과에 따른 추적을 용이하게 하기 위해 형광 라벨링되어야 합니다.- 세포를 관류하기 최소 2시간 전에 위에서 설명한 대로 모든 장치에서 덱스트란 관류를 수행합니다. 이 단계는 세포를 추가하기 전에 혈관 개통을 결정하는 데 중요합니다.
- 관류할 세포에 적합한 카메라 노출을 결정합니다. 현미경으로 볼 작은 세포 샘플을 채취하고 해당 형광 마커의 노출 시간을 설정합니다. 노출 시간을 채도 바로 아래로 설정합니다.
- 형광 덱스트란 채널에 있는 모든 장치의 배경 이미지를 포함하여 관심 채널에 있는 모든 장치의 현미경 사진을 찍어 배경에 대해 보정합니다. 4.2.2.1단계에서 결정한 것과 동일한 노출을 사용합니다.
- 관류를 위해 세포를 채취하기 전에 덱스트란이 조직 챔버에서 완전히 확산되었는지 확인합니다. 관심 있는 세포를 수집하고 계산합니다.
- 세포를 적절한 밀도로 EGM2에 재현탁시킵니다. 예를 들어, T 세포는 일반적으로 혈액 내 농도를 모방하기 위해 약 1 x 106 cells/mL로 추가됩니다.
알림: EC는 미디어 구성에 민감하지만 대부분의 다른 미디어와의 혼합을 최대 50%까지 견딜 수 있습니다. 미리 테스트하십시오. - 각 장치의 높은 쪽에 있는 하나의 웰에 175μL의 셀 현탁액을 추가하고 다른 웰에 175μL의 EGM2 complete를 추가합니다. 낮은 쪽에서는 50μL의 EGM2 complete media를 양쪽 웰에 추가합니다.
- 현미경으로 형광 세포가 혈관 네트워크를 통해 흐르는 것을 관찰합니다. 이는 일반적으로 배지 저장소에 세포를 추가한 후 약 2분 이내에 발생합니다.
- 세포 흐름이 확립되면 형광 세포 채널(및 원하는 경우 다른 채널)의 이미징을 시작합니다. 이것은 T = 0 시점입니다. 스터디 설계에 따라 여러 시점 또는 단일 끝점 이미지에서 추가 이미지를 촬영합니다. 예를 들어, 10분마다 이미징하면 주기적인 세포 이동을 추적하기 위해 고해상도 시간 과정 또는 6-12시간마다 생성됩니다.
- 덱스트란의 관류
- 면역형광(IF) 염색
- 우물에서 매체를 흡입합니다. 200μL의 4% PFA를 각 장치 장치의 높은 쪽에 있는 양쪽 웰에 추가하고 50μL를 낮은 쪽에 추가합니다. PFA가 실온에서 15분 또는 4°C에서 30분 동안 챔버를 통해 흐르도록 합니다.
- 배양 중에 웰당 500μL의 1x PBS가 있는 24웰 플레이트를 준비합니다. 각 장치를 염색하는 데 필요한 웰 수를 계산합니다.
- 웰에서 PFA를 완전히 제거합니다. 플레이트를 거꾸로 뒤집고 멤브레인의 플라스틱 지지대를 조심스럽게 제거합니다.
알림: IF 염색은 멤브레인과 장치를 제거하지 않고도 현장에서 수행할 수 있습니다. 이를 위해 VMO/VMT를 통해 시약을 관류하여 염색 단계를 수행하고 각 배양 단계의 지속 시간을 약 6배 늘립니다. - 매우 부드럽고 조심스럽게 장치의 기능층에서 하단 멤브레인 층을 벗겨내어 양쪽 모서리를 잡고 느리고 부드러운 동작으로 아래로 당겨 조직 챔버를 노출시킵니다. 대부분의 조직은 조직 챔버에 남아 있어야 합니다. 그림 3A를 참조하십시오.
- 면도날이나 메스를 사용하여 그림 3B와 같이 형상 레이어를 완전히 절단하고 각 개별 장치 장치 주위에 작은 직사각형을 자를 수 있도록 충분한 힘을 가합니다.
- 피처 레이어와 웰 플레이트 사이에 주걱을 쐐기로 고정합니다. 피처 레이어 아래에 부드러운 압력을 가하여 웰 플레이트에서 조직 챔버가 포함된 전체 피처 레이어를 조심스럽게 제거합니다.
- 조직이 들어있는 각 직사각형 PDMS 특징층 조각을 PBS가 들어 있는 단일 웰에 뒤집어 놓습니다.
- 모든 장치가 웰에 들어가면 플레이트를 부드러운 로커에 5분 동안 놓고 웰에서 PBS를 흡입한 다음 500μL의 새 PBS로 교체하여 PBS로 세척합니다. 총 3회 세탁을 반복합니다.
- 각 웰에서 PBS를 흡인하고 PBS에서 500μL의 0.5% Triton-X로 조직을 투과시키며, 부드러운 로커에서 각각 10분 동안 2회 투과시킵니다. 투과성 용액을 제거합니다.
- 장치당 0.1% Triton-X에 500μL의 10% 혈청을 넣고 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 차단합니다.
- 1차 항체를 0.1% Triton-X의 3% 혈청에 원하는 농도와 용량으로 희석합니다. 차단 용액을 제거하고 각 웰의 바닥을 완전히 덮고 장치 조직의 자유로운 이동을 허용하기에 충분한 1차 항체 용액을 추가합니다(~200μL). 투명 필름으로 플레이트를 덮으십시오.
- 4 °C에서 밤새 흔들어 접시를 배양합니다. 다음 날, 장치 티슈가 들어 있는 플레이트를 실온으로 되돌립니다(~15분).
- 각 웰에서 1차 항체 용액을 흡인하고 500μL의 PBS로 챔버를 세척하며, 부드러운 로커에서 각각 5분 동안 3회 세척합니다.
- 원하는 농도의 0.1% Triton-X에 있는 3% 혈청에 2차 항체 200μL를 추가합니다. 어두운 곳에서 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 접시를 배양합니다.
- 2차 항체 용액을 흡인하고 PBS로 3회, 각각 5분씩 부드럽게 흔들어 세척합니다. 어둠 속에서 흔들면서 10분 동안 0.1% Triton-X에 1x DAPI 용액을 추가합니다.
- 핀셋을 사용하여 플레이트에서 얼룩진 티슈가 포함된 직사각형 장치 컷아웃을 제거하고 종이 타월 위에 티슈 면이 위로 향하게 놓습니다.
- 몇 μL(~10μL)의 페이드 방지 용액을 각 챔버와 커버슬립에 직접 피펫팅하고 기포가 생기지 않도록 주의합니다. 어두운 곳에서 실온에서 밤새 챔버에서 안티페이드를 경화시킨 다음 이미징을 진행합니다.
- 분자 분석을 위한 조직 및 세포 분리
알림: 각 고처리량 플레이트에는 수확 시점에 따라 약 1-2 x 105 개의 셀이 포함됩니다. 전체 세포와 수확 중 잠재적 손실을 설명하기 위해 실험 반복 횟수를 조정합니다.- 단일 세포 분석
- 각 웰에서 배지를 흡입하고 장치 층이 위를 향하도록 고처리량 플레이트를 반전시킵니다.
- 멤브레인의 플라스틱 지지대를 제거합니다. PDMS 하단 멤브레인을 장치의 피처 레이어에서 매우 부드럽고 조심스럽게 벗겨내어 양쪽 모서리를 잡고 느리고 부드러운 동작으로 아래로 당겨 조직 챔버를 노출시킵니다.
- 멤브레인은 적절한 접착으로도 제거할 수 있습니다. 대부분의 조직은 멤브레인을 제거한 후 조직 챔버에 남아 있어야 합니다. 그러나 멤브레인에 일부가 붙어 있으면 멤브레인 자체에 대해 아래 단계를 따르십시오.
- 각 장치 장치를 500μL의 HBSS 또는 PBS로 세척하십시오. 각 장치 장치에 100μL의 해리 시약을 추가하고 장치 위에 물방울로 놓습니다. 플레이트를 37°C 인큐베이터에 5분 동안 다시 넣습니다.
- 분해 후 P200 피펫을 사용하여 조직 챔버를 위아래로 피펫하고 해리 시약에서 조직을 수집합니다. 피펫 팁을 각 장치에서 앞뒤로 움직여 조직을 완전히 제거하고 500μL의 EGM2가 있는 15mL 원뿔형으로 모아 해리 시약을 중화합니다.
- 조직 챔버에서 남아 있는 세포를 완전히 제거하려면 각 장치 장치에 500μL의 EGM2를 추가하고 P200 피펫으로 세척합니다.
- 제거된 조직이 포함된 분해액을 300 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 단일 세포와 전체 조직을 펠트합니다.
- 배지를 조심스럽게 흡입하고 HBSS의 1mg/mL(200U/mL) 콜라겐분해효소 IV형, 0.1mg/mL 히알루로니다아제 V형 및 200U/mL DNAse IV형 500μL를 조직에 추가합니다.
- 부드럽게 재현탁한 후 용액을 실온에서 2분 동안 그대로 두었다가 다시 부드럽게 피펫팅하여 겔을 해리합니다.
- 분해 혼합물을 10mL의 EGM2로 세척하고 300 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 1% BSA 또는 HSA가 있는 1x DPBS에서 세포를 재현탁시키고 200 x g 에서 1분 동안 회전하여 사전 습윤된 70μm 필터를 통과시킵니다.
- 세포를 계수하고 최종 농도가 μL당 1000개 세포가 되도록 부피를 조정합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 FACS, 유세포 분석 또는 단일 세포 RNA 염기서열분석에 적용할 수 있습니다.
- 전체 조직에서 RNA 분리
- 위의 4.4.1.1 및 4.4.1.2단계를 따릅니다.
- 노출된 각 조직 챔버에 약 10μL의 RNA 용해 완충액을 추가하여 완충액이 조직 위에 직접 고이도록 합니다. 총 100μL 이상의 RNA 용해 완충액을 사용하지 마십시오.
- 실온에서 3분간 배양합니다. P20을 사용하여 각 장치 장치를 위아래로 피펫하고 필요한 경우 피펫 팁을 사용하여 조직 챔버에서 잔류 물질을 긁어냅니다.
- 가능한 한 많은 용해 완충액을 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 옮깁니다. 4.4.2.2.-4.4.2.3단계를 반복합니다. 나머지 장치를 위해 샘플을 1.5mL 튜브에 넣습니다.
- 키트 또는 시약에 따라 RNA 분리에 대한 제조업체의 지침을 따르십시오.
- 단일 세포 분석
그림 3. 면역염색을 위한 플랫폼 준비. (A) 상단에 멤브레인 층이 있는 완전히 조립된 장치 플랫폼의 개략도. 멤브레인을 제거하려면 외부 층의 각 모서리를 안정적이고 부드러운 동작으로 조심스럽게 아래로 당깁니다. (B) 멤브레인 층이 완전히 제거되면 칼날, 메스 또는 칼을 사용하여 조직 자체가 잘리지 않도록 주의하면서 각 장치 장치의 조직 챔버 주위에 직사각형을 자릅니다. 그런 다음 주걱을 각 직사각형 아래에 쐐기로 고정하여 플레이트에서 제거하고 각 장치를 염색을 위해 PBS가 있는 24웰 플레이트의 단일 웰에 놓을 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Representative Results
여기에 설명된 프로토콜에 따라 VMO 및 VMT는 상업적으로 구매한 EC, NHLF 및 VMT의 경우 삼중음성 유방암 세포주 MDA-MB-231을 사용하여 확립되었습니다. 확립된 VMO는 또한 전이를 모방하기 위해 암세포와 관류되었습니다. 각 모델에서 공동 배양 5일째까지 혈관 네트워크는 조직 챔버를 가로지르는 중력 구동 흐름에 반응하여 자체 조립되어 영양분, 치료제, 암 또는 면역 세포를 기질 틈새로 전달하는 것과 같은 생체 내 전달을 위한 통로 역할을 합니다(그림 4). VMO는 그림 4A (배양 0일차)와 같이 mCherry 표지 EC를 조직 챔버에 도입하여 세포가 고르게 분포되도록 하여 처음 확립되었습니다. VMO 배양 2일째에 EC가 늘어나고 루멘화되기 시작하고(그림 4B), 4일째에 EC는 외부 미세유체 채널과 문합되어 연속적인 혈관 네트워크를 형성합니다(그림 4C). 혈관이 문합을 형성하고 외부 채널을 라이닝한 후 VMO 조직에 70kD FITC-덱스트란을 관류하여 혈관 개통을 확인했습니다(그림 4D). FITC-덱스트란을 정수압이 가장 높은 배지 저장소에 주입하고 화살표로 표시된 대로 고압 측에서 저압 측으로 마이크로 용기를 통해 조직 챔버를 가로질러 관류하도록 했습니다. VMO에서 FITC-dextran은 혈관 누출을 최소화하면서 15분 이내에 미세혈관 네트워크를 완전히 관류하여 단단한 혈관 장벽 기능을 확인했습니다(그림 4E). 그런 다음 MDA-MB-231 세포를 VMO에 관류하여 세포가 내피 내막에 부착되고(그림 4F) 관류 후 24시간 이내에 혈관 외 공간으로 유출되어 조직 챔버 내에 여러 개의 미세 전이를 형성했습니다(그림 4G). 도립 컨포칼 현미경에서 4x 및 10x 공기 대물렌즈로 50ms마다 타임랩스 현미경 형광 이미지를 촬영하여 미세혈관을 통해 관류되는 암세포를 실시간으로 관찰했습니다(보충 동영상 1, 보충 동영상 2).
VMO에서 T 세포는 45분 동안 세포 외 공간으로 증발하는 것을 볼 수 있습니다(그림 4H-I). T 세포 유출을 실시간으로 관찰하기 위해 15분마다 150μm 깊이의 z-stack을 획득하기 위해 컨포칼 현미경으로 타임 랩스 형광 현미경 사진을 촬영했습니다(보충 비디오 3). 그림 4J에서 볼 수 있듯이 MDA-MB-231 VMT는 완전히 형성되고 누출되지 않는 혈관을 가진 T 세포(노란색)로 관류되었으며, 그 중 다수는 혈관 벽(화살촉; 그림 4K, 보충 비디오 4, 보충 비디오 5). 이러한 결과는 선행 연구 8,9,10,11,12,13,14,15에 더하여 각각 면역학 및 면역 종양학 연구를 위한 VMO 및 VMT 플랫폼의 유용성을 입증합니다.
그림 4. MDA-MB-231 VMT 및 VMO에 대한 대표적인 결과입니다. (A) 조직 챔버에 세포를 로딩한 직후 0일째의 VMO. EC는 빨간색으로 표시됩니다. 스케일 바 = 500 μm. (B) VMO 배양 2일째가 되면 EC는 흐름에 반응하여 늘어나기 시작합니다. (C) VMO 4일차는 혈관 네트워크가 외부 미세유체 채널과 문합되고 혈관이 거의 성숙했음을 보여줍니다. (D) VMO 네트워크는 배양 5일차에 완전히 관류되고 특허를 받습니다. 빨간색, 70kD FITC-dextran 녹색으로 표시된 용기. 흐름의 방향은 화살표로 표시됩니다. 스케일 바 = 500 μm. (E) 관류된 VMO의 확대/축소 보기. 스케일 바 = 100 μm. (F) MDA-MB-231(청록색)은 E에 표시된 것과 동일한 VMO 네트워크를 통해 관류되며, 시간 0에서 암세포가 내피 혈관 내벽(화살촉)에 부착되었습니다. 척도 막대 = 100 μm. (G) 24시간까지 MDA-MB-231 세포는 세포외 공간으로 유출되어 혈관 틈새 내에 여러 개의 미세 전이를 확립합니다. 스케일 바 = 100μm. (H) 타임 랩스 컨포칼 형광 현미경은 45분 동안 VMO(I) 내의 마이크로 용기를 통해 T 세포 유출을 보여줍니다. 화살촉은 사치된 지역을 나타냅니다. 척도 막대 = 50μm. (J) 삼중음성 유방암 세포주 MDA-MB-231은 VMT에 확립되고 5일째에 관류됩니다. 스케일 바 = 500μm. 혈관 네트워크는 관류 후 15분(삽입, 눈금 막대 = 100μm)에 최소한의 누출을 보여줍니다. (K) MDA-MB-231 VMT(B와 동일)는 T 세포(노란색)와 함께 관류되며 T 세포의 여러 영역이 혈관 벽(화살촉)에 부착됩니다. 스케일 바 = 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 영상 1. VMO에서 난소암 세포의 관류. 혈관 네트워크(빨간색)를 통해 관류되고 1분 동안 50ms마다 4x 대물렌즈로 이미징된 COV362 세포(청록색)의 타임 랩스 형광 현미경. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 영상 2. VMO에서 삼중 음성 유방암 세포의 관류. MDA-MB-231 세포(청록색)의 타임 랩스 형광 현미경 검사는 혈관 네트워크(빨간색)를 통해 관류되고 30초 동안 50ms마다 10x 대물렌즈로 이미지화됩니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 동영상 3. VMO의 T 세포 관류. 타임 랩스 컨포칼 형광 현미경은 45분 동안 VMO 내의 마이크로 용기를 통한 T 세포 유출 과정을 캡처했습니다. Z 스택 이미지는 2μm의 단계 크기와 150μm의 깊이로 15분마다 획득되었습니다. 혈관은 빨간색이고 T 세포는 노란색입니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 영상 4. VMT의 T 세포 관류. 4x 대물렌즈에서 MDA-MB-231 VMT를 통해 관류된 T 세포의 타임 랩스 형광 현미경. 이미지는 30초 동안 50ms마다 획득되었습니다. T 세포는 노란색, MDA-MB-231은 청록색, vessels/EC는 빨간색으로 표시됩니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 동영상 5. T 세포-VMT 관류의 확대/축소 보기. T 세포가 관류된 MDA-MB-231 VMT의 확대 10배 보기( 보충 비디오 4 참조). 이미지는 30초 동안 50ms마다 획득되었습니다. T 세포는 노란색, MDA-MB-231은 청록색, vessels/EC는 빨간색으로 표시됩니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
신체의 거의 모든 조직은 혈관을 통해 영양분과 산소를 공급받기 때문에 체 외에서 사실적인 질병 모델링 및 약물 스크리닝에 중요한 구성 요소입니다. 또한, 여러 악성 종양 및 질병 상태는 혈관 내피 기능 장애와 과투과성으로 정의된다3. 특히, 암에서 종양 관련 혈관 조직은 종종 관류가 잘 되지 않고, 파괴되고, 누출되어 종양에 대한 치료 및 면역 세포 전달에 장벽으로 작용합니다. 또한 혈관 구조는 암세포가 멀리 떨어진 조직에 씨앗을 뿌리기 위해 전이될 수 있는 통로 역할을 하며, 암세포의 성장과 전파를 더욱 촉진하면서 면역 반응을 약화시키는 세포 간 통신을 촉진합니다. 이러한 현상은 혈관 틈새가 치료 내성 및 암 진행에서 중요한 역할을 하고 전임상 연구 중에 종양 미세환경을 정확하게 모델링해야 할 필요성을 강조합니다. 그러나 표준 in vitro 모델 시스템은 적절한 기질 및 혈관 구성 요소를 포함하지 못하거나 동적 흐름 조건을 통합하지 못합니다. 현재 모델 시스템의 이러한 단점을 해결하기 위해 생리학적 종양학 연구를 위한 살아있는 관류된 인간 미세 종양(VMT)의 형성을 지원하는 잘 특성화된 미세생리학적 시스템을 구축하는 방법이 제시되었습니다. 중요한 것은 VMT가 비정상적인 종양 관련 혈관 및 종양-기질 상호 작용의 주요 특성을 모델링하여 생체 모방 질환 모델링 및 치료 효능 테스트에 이상적이라는 것입니다10.
사용 편의성을 위해 이 플랫폼은 외부 펌프나 밸브가 필요하지 않으며, 96웰 플레이트 형식으로 표준 배양 장비 및 워크플로우에 맞게 조정할 수 있습니다. 또한, 뚜렷한 생물학적 질문을 해결하기 위한 다양한 장치 반복과 확립된 조직 및 환자별 구획이검증되었습니다 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 . 이 플랫폼은 다양한 세포 유형을 통합하여 거의 모든 장기 또는 조직 특이적 용도에 맞게 조정할 수 있지만, 최적의 파종 밀도와 공동 배양 조건을 결정하기 위해 다양한 세포 농도에서 VMO/VMT 내에서 세포의 성장 및 혈관 생성 능력을 먼저 테스트해야 합니다. 혈관 구조를 확립하기 위해 CD31+ 세포를 선택하여 인간 내피 콜로니 형성 세포 유래 내피 세포(ECFC-EC)를 상업적으로 구입하거나 제대혈에서 갓 분리할 수 있습니다. 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)는 VMO/VMT 내에서 혈관 구조를 확립하는 데에도 사용할 수 있으며 상업적으로 구입하거나 탯줄에서 갓 분리할 수 있습니다. 또한, 유도만능줄기세포-유래 내피세포(iPSC-EC)가 플랫폼에서 성공적으로 시험되어, 완전한 자가유래 시스템(18)의 가능성을 열었다. 상업적으로 유래된 섬유아세포(혈관 생성 가능성을 위한 표준, 정상 인간 폐 섬유아세포)는 VMO/VMT에서 잘 작동하며, 일부 1차 유래 기질 세포 집단도 통합되거나 치환될 수 있습니다. 원발성 종양은 단일 세포, 스페로이드, 오가노이드 또는 종양 덩어리로 VMT에 도입될 수 있습니다. 매트릭스 조성은 콜라겐, 라미닌, 피브로넥틴 또는 심지어 탈세포화된 조직 매트릭스를 이용한 스파이킹을 포함하여 실험적 필요에 따라 변형될 수 있다19.
이 프로토콜에는 일반적인 문제를 방지하기 위해 특별한 주의가 필요한 몇 가지 중요한 단계가 포함되어 있습니다(그림 5). 로딩 중에는 신중한 피펫팅을 통해 세포/피브린 슬러리가 균일하게 혼합되고 조직 챔버에 원활하게 주입되도록 합니다(그림 5A). 부분 로딩을 방지하기 위해 겔을 챔버로 완전히 배출하기 위해 적절한 압력을 가합니다(그림 5B). 전체 조직 챔버를 가로지르는 세포/피브린 슬러리를 시각화하는 것은 완전한 챔버 충전을 보장하는 데 필요하며 장치 장치 뒤에 장갑을 낀 손가락을 배치하여 용이하게 할 수 있습니다. 세포/피브린 혼합물이 미세유체 채널로 파열되는 것을 방지하기 위해 마이크로피펫 플런저를 너무 세게 누르지 마십시오(그림 5C). 피펫팅 중에 기포가 유입되지 않도록 주의하여 조직 발달 및 다운스트림 Application에 대한 간섭을 방지해야 합니다(그림 5D). 적절한 혼합 및 로딩 속도는 일관성 없는 응고 영역을 방지하는 데 중요하며(그림 5E), 피펫 팁을 조기에 제거하면 챔버의 겔이 손상될 수도 있습니다(그림 5F). 연습 로딩은 사용자가 절차의 시간 제한 요소와 로딩 단계에 익숙해지도록 하는 것이 좋습니다. 또한, 미세유체 채널에 라미닌을 적절하게 도입하는 것은 EC 이동, 외부 채널을 통한 문합 및 영양 전달을 위한 연속적이고 관류성 네트워크 형성에 매우 중요합니다. 채널 라이닝이 불완전하거나 없으면 관류 결과가 좋지 않고 VMO/VMT를 사용할 수 없게 됩니다.
그림 5. 로딩과 관련된 일반적인 실수. (A) 미세유체 장치 장치가 결함 없이 적절하게 로드되었습니다. (B) 세포/피브린 혼합물이 챔버에 완전히 도입되지 않아 부분 로딩이 발생했습니다. (C) 로딩 중에 너무 많은 압력이 가해져 겔이 미세유체 채널로 파열되어 흐름이 차단됩니다. (D) 피펫팅하는 동안 챔버 내에서 세포/피브린 혼합물에 유입된 기포. (E) 세포/피브린 혼합물의 부적절한 혼합 또는 느린 로딩으로 인해 응고에 불일치가 발생합니다. (F) 겔이 충분히 굳기 전에 로딩 포트에서 피펫 팁을 제거하면 조직 챔버에서 세포/피브린 혼합물이 파괴됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
분석을 위한 강력하고 표준화된 워크플로우는 상당한 양의 이미징 데이터를 생성하기 때문에 VMO/VMT 연구에서 매우 중요합니다. VMO/VMT에 대한 이미지 처리 및 분석 방법은 이전에 8,9,10,11,12,13에서 설명했습니다. 종양 정량 분석의 경우, 종양 세포를 나타내는 컬러 채널의 형광 강도는 ImageJ/Fiji(National Institute of Health)20 또는 CellProfiler(Broad Institute)21와 같은 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 측정됩니다. 종양 현미경 이미지의 임계값은 형광 종양 영역을 선택하도록 설정되며, 평균 형광 강도는 해당 영역 내에서 측정됩니다. 종양의 총 형광 강도는 형광 영역과 평균 강도의 곱으로 계산되며, 실험 기간 동안 장치당 종양 성장의 접힘 변화를 얻기 위해 기준선 값(전처리)으로 정규화됩니다. 혈관 정량 분석과 관련하여 AngioTool(National Cancer Institute)22, ImageJ/Fiji 매크로 스크립트 또는 REAVER23과 같은 MATLAB 소프트웨어를 사용하여 총 혈관 길이, 종말점 수, 접합부 수, 평균 혈관 길이, 용기 직경, 평균 열성 및 혈관 백분율 면적을 정량화할 수 있습니다. 머신러닝 알고리즘은 혈관 이미지를 자동으로 분석하기 위한 워크플로우에 통합되어 혈관 조직을 효과적으로 파괴하는 화합물을 식별할 수 있다(24). 관류 이미지는 세포외 공간 영역 내에서 형광 강도의 변화를 측정하고 투과성 계수10을 계산하여 분석합니다. 미세혈관 네트워크 내부의 내강 유동의 유한 요소 시뮬레이션은 COMSOL Multiphysics25를 사용하여 수행할 수 있습니다. 표준화된 분석 방법의 구현은 VMT 연구에서 생성된 방대한 양의 데이터에서 의미 있는 통찰력을 추출하는 데 매우 중요합니다.
여기에 설명된 프로토콜을 통해 사용자는 VMO/VMT 플랫폼을 활용하여 종양 성장/진행, 종양 전이, 종양 내 T 세포 역학, 화학 요법 및 항혈관 신생 치료에 대한 종양 반응을 포함한 종양 생물학의 여러 측면을 연구할 수 있습니다. 생리학적으로 관련된 면역 종양학 연구를 가능하게 하기 위해 갓 분리된 T 세포가 미세혈관을 통해 관류하고, 내피 세포 장벽을 가로질러 외주하고, 조직 구조로 이동하는 방법을 입증했습니다. 타임 랩스 현미경 컨포칼 이미징은 다른 모델 시스템으로는 쉽게 시각화할 수 없는 T 세포 유출을 포함하여 공간적으로 무작위적이고 시간적으로 빠른 이벤트를 볼 수 있는 도구로 제시되었습니다. 또한, 화학요법제, 저분자/티로신 키나아제 억제제, 단클론 항체(예: 항-PD1 및 베바시주맙), 항혈관신생 화합물 및 혈관 안정제를 포함한 여러 유형의 항종양제를 VMT에서 테스트한 바 있으며, 종양 및 관련 기질 모두를 표적으로 하는 다양한 종류의 약물을 테스트하는 데 플랫폼을 사용할 수 있는 방법을 강조했습니다8. 9,10,11,12,13입니다. 플랫폼에서 유출물을 수집하여 다양한 사이토카인과 엑소좀을 분석할 수 있습니다. 향후 연구에서 VMT 플랫폼은 개별 환자 수준에서 T 세포 매개 공격에 대한 종양 세포의 민감도를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 결론적으로, VMT는 유연하고 강력한 플랫폼이며, 혈관 및 기질 구성 요소의 리모델링이 종양 진행의 핵심인 종양 생물학 연구에 이상적인 플랫폼입니다.
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Disclosures
CCWH는 Aracari Biosciences, Inc.의 지분을 보유하고 있으며, 이 회사는 이 논문에 설명된 기술의 버전을 상용화하고 있습니다. 이 약정의 조건은 이해 상충 정책에 따라 University of California, Irvine에서 검토하고 승인했습니다. 다른 이해 상충은 없습니다.
Acknowledgments
설명된 절차에 귀중한 의견을 제시해 주신 Christopher Hughes 박사 연구실 구성원과 플랫폼 설계 및 제작에 도움을 주신 Abraham Lee 박사 연구실의 협력자에게 감사드립니다. 이 작업은 UG3/UH3 TR002137, R61/R33 HL154307, 1R01CA244571, 1R01 HL149748, U54 CA217378(CCWH) 및 TL1 TR001415 및 W81XWH2110393(SJH)의 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabrication | |||
| (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane, 95% | Sigma-Aldrich | 175617-100G | |
| Greiner Bio-One μClear Bottom 96-well Polystyrene Microplates | Greiner Bio-One | 655096 | |
| Methanol ≥99.8% ACS | VWR Chemicals BDH | BDH1135-1LP | |
| MILTEX Sterile Disposable Biopsy Punch with Plunger, 1mm diameter, | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
| PDMS membrane | PAX Industries | HT-6240 | |
| Plasma Cleaner PDC-001 | Harrick Plasma | N/A | |
| Smooth-Cast 385 | Smooth-On | N/A | |
| SP Bel-Art Lab Companion Clear Polycarbonate Cabinet Style Vacuum Desiccator | Bel-Art | F42400-4031 | |
| Standard Lids with Condensation Rings, 96-well plate | VWR | 82050-827 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow | 4019862 | |
| Cell culture/Loading | |||
| BioTek Lionheart FX Automated Microscope | Agilent | CYT5MFAW | |
| CELLvo Human Endothelial Progenitor Cells | StemBioSys | N/A | |
| Collagen I, rat tail | Enzo Life Sciences | ||
| Collagenase from Clostridium histolyticum (type 4) | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Corning Hank’s Balanced Salt Solution, 1X without calcium and magnesium | Corning | 21-021-CV | |
| Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | 10013CV | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Neta Scientific | SIAL-341573 | |
| Fibronectin human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (70kDa) | Sigma-Aldrich | FD70S-1G | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Hyaluronidase from sheep testes (type 4) | Sigma-Aldrich | H6254 | |
| Laminin Mouse Protein | Gibco | 23017015 | |
| Leica TCS SP8 | Leica | N/A | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| NHLF – Normal Human Lung Fibroblasts | Lonza | CC-2512 | |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | N/A | |
| Paraformaldehyde 4% in 0.1M Phosphate BufferSaline, pH 7.4 | Electron Microscopy Sciences | 15735-90-1L | |
| PBMCs - Peripheral blood mononuclear cells | Lonza | CC-2702 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Avantor Seradigm | 97068-091 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P10144 | |
| Quick-RNA Microprep Kit | Zymo Research | R1051 | |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T4648 | |
| Triton X-100 (Electrophoresis), | Fisher BioReagents | BP151-100 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Gibco | 12605028 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
| Vasculife | Lifeline Cell Technology | LL-0003 |
References
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