Summary
Detta protokoll effektiviserar produktionen av retrovirala vektorer och transduktion av murina T-celler, vilket underlättar effektiv generering av CAR-T-celler från möss.
Abstract
Konstruerade cellterapier som använder chimära antigenreceptorer (CAR)-T-celler har uppnått anmärkningsvärd effektivitet hos individer med hematologiska maligniteter och genomgår för närvarande utveckling för behandling av olika solida tumörer. Hittills har den preliminära utvärderingen av nya CAR-T-cellsprodukter främst skett i xenografttumörmodeller med immundefekta möss. Detta tillvägagångssätt väljs för att underlätta framgångsrik engraftment av humana CAR-T-celler i experimentell miljö. Syngena musmodeller, där tumörer och CAR-T-celler härstammar från samma musstam, gör det dock möjligt att utvärdera nya CAR-teknologier inom ramen för ett funktionellt immunsystem och en omfattande tumörmikromiljö (TME). Protokollet som beskrivs här syftar till att effektivisera processen för CAR-T-cellgenerering hos möss genom att presentera standardiserade metoder för retroviral transduktion och ex vivo T-cellsodling. Metoderna som beskrivs i detta protokoll kan tillämpas på andra CAR-konstruktioner utöver de som används i denna studie för att möjliggöra rutinmässig utvärdering av nya CAR-teknologier i immunkompetenta system.
Introduction
Adoptiva T-cellsterapier som uttrycker chimära antigenreceptorer (CAR) har revolutionerat området för cancerimmunterapi genom att utnyttja kraften i det adaptiva immunsystemet för att specifikt rikta in sig på och eliminera antigenpositiva cancerceller1. Även om framgången för CAR-T-cellterapier riktade mot B-cellsmaligniteter har validerats kliniskt, är prekliniska studier utförda i djurmodeller fortfarande avgörande för utvecklingen av nya CAR-terapier riktade mot solida tumörer. Begränsad klinisk effekt har dock hittills visats i solida tumörindikationer, och det blir alltmer uppenbart att enskilda prekliniska modeller inte exakt förutsäger farmakodynamiken och den kliniska effekten av ett levande läkemedel 2,3. Därför har forskare börjat utöka den prekliniska studien av CAR-T-cellprodukter till att omfatta parallella bedömningar i xenograft- och syngena modeller av cancer hos människa respektive murin.
Till skillnad från xenograftmodeller, där mänskliga tumörer och T-celler transplanteras in i möss med immunbrist, möjliggör syngena modeller undersökning av CAR-T-cellssvar i samband med ett funktionellt immunsystem. Specifikt tillhandahåller immunkompetenta möss som bär på syngena tumörer ett system för att studera interaktionen mellan adoptivt överförda T-celler och kontextspecifika miljöer - inklusive tumörassocierade makrofager (TAM) och regulatoriska T-celler (Tregs) som är kända för att undertrycka T-cellsfunktion i tumörmikromiljön (TME)4,5,6. Dessutom erbjuder syngena modeller ytterligare en plattform för att bedöma on-target, off-tumor toxicitet och CAR-T-cellinteraktion med värdfaktorer som kan leda till ytterligare toxicitet, inklusive cytokinfrisättningssyndrom7.
Trots dessa fördelar är antalet syngena CAR-T-cellsstudier fortfarande begränsat. Syngena modeller kräver autolog modifiering av CAR-T-celler från samma musstam och utgör därför en ytterligare utmaning på grund av bristen på metodik för effektiv murin T-cellstransduktion och ex vivo-expansion 2,8. Detta protokoll beskriver metoderna för att uppnå stabilt CAR-uttryck genom produktion av retrovirala vektorer och optimerad T-cellstransduktion. En schematisk bild av hela processen visas i figur 1. Användningen av detta tillvägagångssätt visar effektiv retroviral transduktion av murina CAR-T-celler och uppnående av högt CAR-uttryck utan behov av viruskoncentration genom ultracentrifugering. Strategier för att ändra antigenspecificiteten hos CAR-konstruktionen diskuteras utöver samuttryck av ytterligare transgener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes med godkännande från Institutional Animal Care and Use Committee (Columbia University, protokollen AC-AABQ5551 och AC-AAAZ4470) med 6-8 veckor gamla BALB/c- eller CF57BL/6-möss som vägde mellan 20-25 g. Djuren erhölls från en kommersiell källa (se materialförteckning). Detta protokoll är uppbyggt kring "dagarna efter aktivering" av murina T-celler, och virusproduktionen börjar på dag -2. Retrovirus kan förvaras vid -80 °C efter initial produktion, och för framtida användning av detta protokoll kan man börja med steg 2, T-cellsisolering och aktivering på dag 0.
1. Produktion av retrovirala vektorer
OBS: Virusprodukterna har gjorts replikationsdefekta genom separation av förpackningsgenerna i två separata plasmider (se materialtabell), vilket kraftigt minskar sannolikheten för rekombinationshändelser och oavsiktlig produktion av replikationskompetent virus.
- Förbered Phoenix Eco-celler en dag före transfektion (dag -2 procedur).
- Platta ca 1 x 107 celler i en 15 cm TC-behandlad platta eller T150-odlingskolv med 30 ml odlingsmedium (Phoenix Eco-odlingsmedium, se tabell 1).
- Inkubera över natten vid 37 °C. Efter 18-24 timmar bör cellerna vara cirka 70 % sammanflytande och jämnt fördelade för att säkerställa ett högt virusutbyte utan överväxt.
OBS: För optimala resultat, använd celler med låg passage och passera dem dagen före plätering för virusproduktion. Låt inte Phoenix Eco-celler växa över under rutinodling.
- Bered transfektblandningen som innehåller lipofektions- och förstärkarreagens, pCL-Eco (Gag/Pol) och pMSCV-expressionsplasmid (pMSCV_PGK_mGFP28z) i reducerade serummedier (se materialtabell) (procedur dag -1).
OBS: Samtransfektion bör utföras i förhållandet 1:1 mellan pMSCV och pCL-Eco.- Förbered rör A: Späd 105 μl av transfektionsreagenset i 3,75 ml reducerat serummedium per 15 cm tallrik och blanda noggrant genom att virvla eller pipettera upp och ner.
- Förbered rör B: Späd pMSCV-expressionsplasmid (21 μg) och pCL-Eco (21 μg) med 90 μl förstärkarreagens till 3,75 ml reducerat serummedium per 15 cm platta. Blanda väl genom att pipettera upp och ner.
OBS: Om du genererar flera virala produkter, ställ in en masterblandning som innehåller pCL-Eco och förstärkarreagenset. - Tillsätt rör A till rör B och blanda ordentligt genom att pipettera. Inkubera i 10-20 minuter i rumstemperatur, vilket ger en total volym på cirka 7,5 ml.
- Ta försiktigt bort 10 ml cellodlingsmedia från Phoenix Eco-plattan/-plattorna och tillsätt hela volymen av transfektionsblandningen till det återstående mediet genom att luta plattan och pipettera droppvis. Sätt tillbaka cellerna i en inkubator för 37 °C.
- Byt media på transfekterade Phoenix Eco-celler 16-20 timmar efter transfektion (dag 0-procedur).
- Serum och β-merkaptoetanol (2-ME, se materialtabell) är fritt från murint T-cellsmedium (mTCM-virusskörd, enligt tabell 1) till 37 °C med hjälp av ett vatten- eller pärlbad.
- Ta försiktigt bort Phoenix Eco-odlingsmediet genom att luta plattan och placera pipettspetsen i det nedre hörnet, använd om möjligt ett vakuum. Undvik att övertorka cellerna.
- Tillsätt försiktigt det uppvärmda mTCM-virala skördemediet vid sidan av den lutande plattan genom att pipettera 30 ml på den långsammaste inställningen. Sätt tillbaka cellerna i en inkubator för 37 °C.
OBS: Detta steg kan få Phoenix Eco-celler att lossna från plattan och minska virala titrar. Förvärmda medier och skonsam pipettering minimerar störningar.
- Skörda den virala supernatanten 48 timmar efter transfektion (procedur dag 1).
- Skörda den virala supernatanten och filtrera den genom 0,45 μm PVDF-filter (se materialförteckning) för att avlägsna celler och skräp. Alikvot och frys viruset vid -80 °C eller gå direkt till dag 1 i steg 3 om du använder färskt virus.
- Bestäm virustitern (transducerande enheter/ml) genom flödescytometri, som tidigare beskrivits9. Det här steget är valfritt.
- Bestäm virustitern genom småskalig transduktion av 1 x 105 aktiverade murina T-celler i icke-vävnadskultur (TC)-behandlade 96-brunnsplattor, förbelagda med retronektin (se materialtabell) och laddade med trefaldiga seriespädningar av retroviral supernatant i en slutlig volym av 100 μL mTCM-viralt skördemedium.
OBS: Se steg 2 och steg 3 nedan för detaljerade instruktioner om T-cellsisolering, aktivering och transduktion. - Bestäm CAR-ytuttryck 4-5 dagar efter transduktion med flödescytometri.
- Beräkna virustitern enligt formeln10: (N x F x D)/V, där N är antalet celler som transducerats, F är frekvensen av CAR-positiva celler, D är utspädningsfaktorn och V är transduktionsvolymen i ml för att erhålla transduktionsenheter (TU)/ml.
OBS: Viral titer kan minska vid frysning/upptining; Därför bestäms viral titer idealiskt på fryst och därefter tinat virus.
- Bestäm virustitern genom småskalig transduktion av 1 x 105 aktiverade murina T-celler i icke-vävnadskultur (TC)-behandlade 96-brunnsplattor, förbelagda med retronektin (se materialtabell) och laddade med trefaldiga seriespädningar av retroviral supernatant i en slutlig volym av 100 μL mTCM-viralt skördemedium.
2. Isolering av mus-T-celler
- Isolera och aktivera murina T-celler (dag 0-procedur).
OBS: Dessa steg kan utföras vid rumstemperatur (RT) eller 4 °C och bör utföras i en steril miljö.- Skörda mjälten från musstammen av intresse (t.ex. Balb/c, C57BL/6) enligt tidigare beskrivning11 och erhåll en encellssuspension genom mekanisk dissociation.
- Använd baksidan av en steril spruta och krossa mjälten/mjältarna genom en 70-100 μm cellsil till ett 50 ml koniskt rör.
- Efter att ha lagt sprutan åt sidan, tvätta silen med 5 ml T-cellsisoleringsbuffert (fosfatbuffrad koksaltlösning, PBS, kompletterad med 2 % fetalt bovint serum, FBS).
- Upprepa mäskningssteget och tvätta silen en gång till med 5 ml T-cellsisoleringsbuffert. Höj den slutliga volymen till 50 ml med T-cellsisoleringsbuffert.
- Räkna levande celler med hjälp av en manuell hemocytometer eller en automatisk cellräknare genom att späda i förhållandet 1:20 och sedan blanda vid 1:1 med trypanblått.
- Pelletera cellerna genom centrifugering i 10 minuter vid 450 x g, vid 4 °C (eller RT), och suspendera mjältcellerna vid 1 x 108/ml om du använder det rekommenderade T-cellsisoleringssatsen (se materialförteckning).
OBS: Mjältocyter kan silas igen genom en 40-70 μm sil i detta skede för att avlägsna klumpar.
- Isolera CD3 + T-celler genom negativt urval enligt tillverkarens instruktioner (se materialförteckning). Efter magnetisk separering överförs isolatet till ett 15 ml koniskt rör och utför en slutlig mätning av levande celler.
- Pelletera de isolerade T-cellerna genom centrifugering i 10 minuter vid 450 × g, vid 4 °C (eller RT), och återsuspendera dem vid 1 × 106/ml i mTCM-aktiveringsmedium (tabell 1).
- Aktivera T-celler genom att tillsätta murina anti-CD3/anti-CD28 monoklonala antikroppsbelagda magnetiska pärlor (se materialtabell) i förhållandet 25 μL/1 x 106 T-celler och 100 E/ml IL-2.
- Placera cellerna i en inkubator vid 37 °C och låt dem stå över natten.
OBS: På grund av T-cellernas ringa storlek kan ett mer exakt levande T-cellsantal uppnås genom att späda i förhållandet 1:10-1:20 och blanda vid 1:1 med trypanblått för manuell räkning med hjälp av en hemocytometer. Renheten kan bestämmas genom flödescytometri genom färgning av celler med en fluorescerande konjugerad αCD3-antikropp. Varje mjälte kommer att ge mellan 7-10 x 106 T-celler beroende på musens ålder och stam.
3. Transduktion av mus-T-celler
- Förbered plattorna för transduktion (procedur dag 0).
- Täck obehandlade sterila 24-hålsplattor med 0,5 ml humant fibronektintransduktionsförstärkarreagens (se materialtabell) vid en slutlig koncentration på 20–40 μg/ml genom spädning i steril PBS och förvara vid 4 °C över natten.
OBS: Detta steg kan också utföras på dag 1 genom att belägga obehandlade 24-brunnsplattor med transduktionsreagenset och inkubera dem i rumstemperatur i 2 timmar.
- Täck obehandlade sterila 24-hålsplattor med 0,5 ml humant fibronektintransduktionsförstärkarreagens (se materialtabell) vid en slutlig koncentration på 20–40 μg/ml genom spädning i steril PBS och förvara vid 4 °C över natten.
- Utför T-cellstransduktion (dag 1-procedur).
- Förbered den förbelagda plattan för transduktion. Avlägsna transduktionsreagenset från varje brunn på den förbelagda 24-hålsplattan och blockera med en motsvarande volym sterilfiltrerat PBS + 2 % bovint serumalbumin (BSA) (0,5 ml) i 30 minuter vid RT.
- Tvätta en gång med 0,5-1 ml PBS.
- Tillsätt 0,5–1 ml rent retrovirus från steg 1 eller utspätt baserat på virustiter till varje förbelagd brunn och centrifugera i 90 minuter vid 2 000 x g och 32 °C.
- Tillsätt 1 ml aktiverade T-celler till varje virusbelastad brunn och centrifugera i 10 minuter vid 450 x g och 32 °C. Återför cellerna till en 37 °C inkubator över natten.
- 24 timmar efter transduktion, avlägsna 1-1,5 ml cellodlingsmedia och ersätt det med 1-1,5 ml mTCM-complete och 10 ng/ml rekombinant humant IL-7 och IL-15 (se materialförteckning). Återföra cellerna till en inkubator vid 37 °C (procedur dag 2).
OBS: Under ex vivo-odling måste 10 ng/ml cytokiner tillsättas till odlingen var 48:e timme, och T-celler bör inte spädas mer än 1 x 106/ml. - 48 timmar efter transduktionen, överför celler från transduktionsplattan till en ny platta med 24 eller 6 brunnar och återför cellerna till en inkubator med 37 °C (procedur dag 3).
OBS: T-cellviabiliteten kan förbättras genom att överföra celler 24 timmar till 2 dagar efter transduktion, beroende på startförmåga för T-cellsviabilitet och virustiter. - Avpärla T-cellerna och bekräfta CAR-uttrycket (procedur dag 5-6).
- Suspendera cellerna noggrant igen för att dissociera aktiverade T-celler från de αCD3/CD28-belagda kulorna (se materialtabell) och placera cellsuspensionen på en magnet i 30 s. Överför cellsuspensionen till önskat ex vivo-odlingskärl och lägg tillbaka den i en inkubator vid 37 °C.
OBS: T-celler kan odlas i odlingskolvar eller djupbrunnsodlingsplattor. Det rekommenderas att plätera minst 5 x 106 T-celler i 30 ml mTCM-komplett medium per brunn i en djup brunn på en platta i 6-hålsformat (se materialförteckning). - Bestäm CAR-uttryck genom flödescytometri8.
Anmärkning: GFP-CAR-uttrycket bestämdes genom inkubation med 100 ng/ml renad GFP. Inkorporering av en N-terminal epitoptagg kommer att underlätta upptäckten av alternativa CAR-konstruktioner.
- Suspendera cellerna noggrant igen för att dissociera aktiverade T-celler från de αCD3/CD28-belagda kulorna (se materialtabell) och placera cellsuspensionen på en magnet i 30 s. Överför cellsuspensionen till önskat ex vivo-odlingskärl och lägg tillbaka den i en inkubator vid 37 °C.
- Utför ex vivo-odling av CAR-T-celler (procedur dag 7-10).
- Under ex vivo-odling bibehålls cellerna genom att 50 % av odlingsmediet avlägsnas och ersättas med färskt mTCM-complete + 2 x 10 ng/ml IL-7 och IL-15 var 48:e timme.
OBS: Murina CAR-T-celler är redo för användning i nedströmsapplikationer 7 dagar efter aktivering och bör inte kryokonserveras på grund av dålig livskraft efter upptining.
- Under ex vivo-odling bibehålls cellerna genom att 50 % av odlingsmediet avlägsnas och ersättas med färskt mTCM-complete + 2 x 10 ng/ml IL-7 och IL-15 var 48:e timme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet som beskrivs här syftar till att standardisera processen för murin T-cellstransduktion för generering av CAR-T-celler från möss. Figur 1 ger en detaljerad beskrivning av de olika stegen. Processen börjar med produktion av retrovirala vektorer via samtransfektion av virala komponenter till Phoenix Eco-celler. Figur 2 ger en bild av den optimala densiteten hos Phoenix Eco-celler på transfektionsdagen. Isolerade T-celler aktiveras sedan 24 timmar efter transfektionen, eller "dag 0" i detta protokoll, som förberedelse för transduktion på dag 1. Efter transduktion odlas CAR-T-celler i närvaro av rekombinant humant IL-7 och IL-15 för att uppnå tillräcklig veckexpansion samtidigt som stamcellernas minnespopulationer bevaras.
Användningen av det rekommenderade murina T-cellsisoleringskitet (se materialtabell) med detta protokoll ger T-cellsrenhet på <98 % före transduktion, bestämt med flödescytometri (figur 3A). Dessutom kan reproducerbara CAR-uttryckshastigheter på 65–75 % uppnås med hjälp av detta protokoll och den retrovirala pMSCV-vektorn modifierad för att uttrycka CAR-konstruktionen från en PGK-promotor (figur 3B,C). Bestämning av retroviral titer avslöjar titrar på upp till ~2 x 107 TU/ml och CAR-uttryck på 74 % med 1/3av den virala supernatanten skördad efter samtransfektion av pMSCV med pCL-Eco (tilläggsfigur 1).
Slutligen leder ex vivo-odling med 10 ng/ml IL-7 och IL-15 till cirka 15-faldig expansion, vilket resulterar i ~150 x 106 T-celler vid dag 10 efter aktivering från en enda mjälte (Figur 3D). Odling med IL-7 och IL-15 leder till jämförbara CD8+ och CD4+ T-cellsfrekvenser (Figur 3E) och bevarade stamcellsminnespopulationer bestämda med CD62L+CD44-uttryck efter 10 dagars ex vivo-odling (Figur 3F).
Bild 1: Översikt över protokollet. Övre panelen: En schematisk översikt över protokollets tidslinje. Bottenpanel: Steg-för-steg-instruktioner för retroviral vektorproduktion och mus T-cellstransduktion. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Optimal celltäthet för transfektion. Ljusfältsmikroskopibild av Phoenix Eco-celler med optimal densitet före transfektion med pMSCV och pCL-Eco. Fångad med ett 10x objektiv. Skalstapel = 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Produktion av CAR-T-celler i musmuser och ex vivo-odling. A) Flödescytometridiagram som visar frekvensen av BALB/c CD3+-celler efter murin T-cellsisolering. (B) Schematisk representation av den retrovirala pMSCV-vektorn som används för GFP-CAR-uttryck i murina T-celler. C) Histogram med flödescytometri som visar uttryck av CAR-ytan på T-celler från möss efter inkubation med renad sfGFP. UT, otransducerad. (D) Veckexpansion av CAR-T-celler vid dag 10 efter aktivering och odling med rekombinant humant IL-17 och IL-15. Cirka 8 x 106 murina T-celler aktiverades före transduktion och nådde cirka 1,28 x 108 dag 10 efter aktivering. E) Flödescytometridiagram som visar frekvensen av CD8+ och CD4+ CAR-T-celler dag 10 efter aktivering. (F) Flödescytometridiagram som visar frekvensen av CD8+ T-cellminnespopulationer bestämda med CD62L- och CD44-ytuttryck. Stamcellsminne (TSCM) kännetecknas av CD62L+CD44-, centralminne (TCM) av CD62L+CD44+ och effektorminne (TEM) av CD62L-CD44+. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Formulering av cellodlingsmedier. Formuleringsdetaljer för cellodlingsmedier som används i protokollet. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Kompletterande figur 1: CAR-ytuttryck och retrovirala titrar. (A) Histogram för flödescytometri som visar uttryck av CAR-ytan på BALB/c T-celler efter inkubation med renad sfGFP. Retrovirus genererades genom transfektering av Phoenix Eco-celler med pMSCV_PGK_mGFP28z i kombination med pCL-Eco och pMD2.G (I), pCL-Eco (II) eller ensamma (III). T-celler transducerades med utspätt retrovirus enligt indikation. B) Retrovirala titrar bestämda genom CAR-ytuttryck av transducerade T-celler. Transduktionsenheter (TU)/ml beräknades med formeln: (N∙F∙D)/V, där N är antalet transducerade celler (1 x 105), F är frekvensen av CAR+ -celler, D är utspädningsfaktorn och V är transduktionsvolymen i ml (0,2 ml). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 1: vektorsekvens för pMSCV-uttryck. Sekvensen av GFP28z CAR och flankerande sekvenser (kursiv) i pMSCV-expressionsvektorn, med NotI- och BamHI-enzymställen markerade i blått. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver de steg och reagenser som krävs för retroviral transduktion av murina T-celler för att generera CAR-T-celler för in vivo-studier . Optimering av retrovirala transduktionsförhållanden ger robust CAR-uttryck utan behov av viruskoncentration genom ultracentrifugering eller ytterligare reagenser. Det finns dock flera ändringar som kan tillämpas på den här metoden.
Även om detta protokoll beskriver exempelgenerering av en GFP-specifik CAR, kan dessa metoder anpassas för att generera CAR-T-celler från möss som riktar sig mot alla extracellulära antigener av intresse. Den pMSCV_PGK retrovirala vektorn som används i denna studie möjliggör effektiv frisättning av den GFP-specifika nanosekvensen genom enzymatisk nedbrytning med NotI och BamHI och kan ersättas med en användardefinierad antigenigenkänningsdomän såsom en scFv-, nanokropps- eller ligandbindande domän (tilläggsfil 1). För att underlätta bedömningen av alternativa CAR-uttryck rekommenderas att CAR utformas med en N-terminal epitoptagg, såsom Myc (EQKLISEEDL) eller Flag (DYKDDDDK), som kan detekteras med hjälp av fluorescerande konjugerade antikroppar12. Dessutom visar den aktuella studien att en enda transgen produceras; Införlivandet av självklyvande peptider (2A-sekvenser) eller interna ribosomingångsställen (IRES) skulle dock möjliggöra samproduktion av flera transgener, inklusive ytterligare teknik för att förbättra T-cellsfunktionen in vivo 8,13,14.
Även om detta protokoll utvecklades för att eliminera behovet av specialutrustning genom att utelämna ultracentrifugering (24 000 x g, 2 timmar, 4 °C), är det värt att notera att koncentrationen av den virala supernatanten kan uppnå högre virala titrar och minska den virusvolym som krävs för att uppnå högt CAR-uttryck8. Detta protokoll effektiviserar dessutom produktionen av retrovirala vektorer genom att uppnå reproducerbart höga virala titrar (~2 x 107 TU/ml) och stabilt CAR-uttryck utan behov av viral titerbestämning före användning. Men förutom att underlätta standardisering kan bestämning av virustiter före T-cellstransduktion också öka T-cellernas viabilitet genom att minska potentiell toxicitet orsakad av onödigt höga viruskoncentrationer10,15.
Tillskott med IL-7 och IL-15 rekommenderas för att främja T-cellsexpansion och bevara T-cellsminnespopulationer; Rekombinant humant IL-2 kan dock användas som ett alternativ för att minska antalet nödvändiga reagenser för ex vivo-odling 16,17,18,19. De metoder för CAR-T-cellsgenerering som beskrivs här är dock fortfarande begränsade av den relativt dåliga expansionen av murina T-celler. De åtgärder för att förbättra T-cellernas viabilitet som diskuterats ovan skulle dock kunna förbättras ytterligare genom att inkludera ytterligare tillskott och 2-ME i mTCM-odlingsmediet under hela transduktionsprocessen20. Även om dessa modifieringar kan förbättra T-cellsexpansionen från 15-faldigt till upp till 20-faldigt20, kan de resultera i lägre transduktionseffektivitet och minskat CAR-uttryck.
I slutändan möjliggör produktionen av murina CAR-T-celler utvecklingen av syngena modeller för att utvärdera CAR-T-cellernas funktion i ett intakt immunsystem - vilket underlättar en kontextspecifik bedömning av deras styrka, hållbarhet och säkerhet. Modeller på möss med immunbrist möjliggör viktiga prekliniska studier av en human T-cellsprodukt riktad mot ett humant tumörantigen. Kombinationen av dessa komplementära modellsystem kommer att vara oumbärlig för att förstå komplexiteten i CAR-T-cellbiologi, optimera nya CAR-designer och i slutändan översätta prekliniska fynd till effektiva kliniska terapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter har deklarerats.
Acknowledgments
Vi tackar L. Brockmann för kritisk granskning av manuskriptet. Detta arbete stöddes av NIH 1R01EB030352 och UL1 TR001873.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μm filters | MilliporeSigma | SLHVR33RS | |
| 1 mL syringe | Fisher Scientific | 14-955-450 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-135 | |
| 10 mL syringe | BD | 14-823-16E | |
| 100 μm strainer | Corning | 07-201-432 | |
| 15 cm TC treated cell culture dishes | ThermoFisher Scientific | 130183 | |
| 15 mL conical tubes | Falcon | 14-959-70C | |
| 40 μm strainer | Corning | 07-201-430 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 14-959-49A | |
| 70 μm strainer | Corning | 07-201-431 | |
| Attune NxT Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | ||
| BALB/C, 6-8 week old | Jackson Laboratory | 651 | |
| B-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| Bovine Serum Albumin | GOLDBIO | A-420-500 | |
| DMEM Medium | Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium | Gibco | 14-190-250 | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12-321-D | |
| EasySep Magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse T cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19851 | |
| FACS buffer | BD | BDB554657 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | MT35011CV | |
| GlutaMAX | Gibco | 35-050-061 | |
| G-Rex6 | Wilson Wolf | 80240M | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15-630-080 | |
| Human recombinant IL-15 | Miltenyi Biotec | 130-095-765 | |
| Human recombinant IL-2 | Miltenyi Biotec | 130-097-748 | |
| Human recombinant IL-7 | Miltenyi Biotec | 130-095-363 | |
| Lipofectamine 3000 | Invitrogen | L3000008 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140-050 | |
| Mouse Anti-CD3 BV421 | Biolegend | 100228 | |
| Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads | Gibco | 11-453-D | |
| Mouse Anti-CD4 BV605 | BD | 563151 | |
| Mouse Anti-CD44 APC | Biolegend | 103011 | |
| Mouse Anti-CD62L PE-Cy7 | Tonbo | SKU 60-0621-U025 | |
| Mouse Anti-CD8 APC-Cy7 | Tonbo | SKU 25-0081-U025 | |
| Nikon Ti2 with Prime 95B camera | Nikon | ||
| Non-treated 24 well plates | CytoOne | CC7672-7524 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31-985-062 | |
| pCL-Eco | Addgene | #12371 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution | Gibco | 15-070-063 | |
| Phoenix Eco cells | ATCC | CRL-3214 | |
| pMDG.2 | Addgene | #12259 | |
| pMSCV_PGK_GFP28z | N/A | Produced by R.LV. | |
| Purified sfGFP | N/A | Produced by R.LV. | |
| RetroNectin ('transduction reagent') | Takara Bio | T100B | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875 | |
| Serological pipette 10 mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Serological pipette 25 mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
| Serological pipette 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11-360-070 | |
| TC-treated 24 well plates | Corning | 08-772-1 | |
| Trypan blue | Gibco | 15-250-061 |
References
- June, C. H., Sadelain, M.
- Duncan, B. B., Dunbar, C. E., Ishii, K. Applying a clinical lens to animal models of car-t cell therapies. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 17-31 (2022).
- Hou, A. J., Chen, L. C., Chen, Y. Y. Navigating CAR-T cells through the solid-tumour microenvironment. Nat Rev Drug Discov. 20 (7), 531-550 (2021).
- Campesato, L. F., et al. Blockade of the ahr restricts a treg-macrophage suppressive axis induced by l-kynurenine. Nat Commun. 11 (1), 4011 (2020).
- Kaneda, M. M., et al. Pi3kgamma is a molecular switch that controls immune suppression. Nature. 539 (7629), 437-442 (2016).
- Hyrenius-Wittsten, A., Roybal, K. T. Paving new roads for cars. Trends Cancer. 5 (10), 583-592 (2019).
- Giavridis, T., et al. CAR T cell-induced cytokine release syndrome is mediated by macrophages and abated by il-1 blockade. Nat Med. 24 (6), 731-738 (2018).
- Lanitis, E., et al. Optimized gene engineering of murine CAR-T cells reveals the beneficial effects of il-15 coexpression. J Exp Med. 218 (2), e20192203 (2021).
- Lambeth, C. R., White, L. J., Johnston, R. E., De Silva, A. M. Flow cytometry-based assay for titrating dengue virus. J Clin Microbiol. 43 (7), 3267-3272 (2005).
- Agarwal, S., Wellhausen, N., Levine, B. L., June, C. H. Production of human crispr-engineered CAR-T cells. J Vis Exp. 169, e62299 (2021).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Sterile Tissue Harvest. , JoVE, Cambridge, MA. (2023).
- Giordano-Attianese, G., et al. A computationally designed chimeric antigen receptor provides a small-molecule safety switch for t-cell therapy. Nat Biotechnol. 38 (4), 426-432 (2020).
- Kuhn, N. F., et al. Cd40 ligand-modified chimeric antigen receptor T cells enhance antitumor function by eliciting an endogenous antitumor response. Cancer Cell. 35 (3), 473-488.e6 (2019).
- Jin, C., Ma, J., Ramachandran, M., Yu, D., Essand, M. CAR T cells expressing a bacterial virulence factor trigger potent bystander antitumour responses in solid cancers. Nat Biomed Eng. 6 (7), 830-841 (2022).
- Kurachi, M., et al. Optimized retroviral transduction of mouse T cells for in vivo assessment of gene function. Nat Protoc. 12 (9), 1980-1998 (2017).
- Jafarzadeh, L., Masoumi, E., Fallah-Mehrjardi, K., Mirzaei, H. R., Hadjati, J. Prolonged persistence of chimeric antigen receptor (CAR) T cell in adoptive cancer immunotherapy: Challenges and ways forward. Front Immunol. 11, 702 (2020).
- Elkassar, N., Gress, R. E. An overview of IL-7 biology and its use in immunotherapy. J Immunotoxicol. 7 (1), 1-7 (2010).
- Osinalde, N., et al. Simultaneous dissection and comparison of IL-2 and IL-15 signaling pathways by global quantitative phosphoproteomics. Proteomics. 15 (2-3), 520-531 (2015).
- Eremenko, E., et al. An optimized protocol for the retroviral transduction of mouse CD4 T cells. STAR Protoc. 2 (3), 100719 (2021).
- Lewis, M. D., et al. A reproducible method for the expansion of mouse CD8+ T lymphocytes. J Immunol Methods. 417, 134-138 (2015).
