Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

طريقة فعالة وسريعة لوضع العلامات وتحليل كبيبات الماوس

Published: February 9, 2024 doi: 10.3791/65973
Automatic Translation
1,2, 2, 1, 2, 2, 1,2, 3
1Key Laboratory of Transplant Engineering and Immunology, NHFPC, West China Hospital, Sichuan University, 2Core Facility of West China Hospital, Sichuan University, 3Regenerative Medicine Research Center, West China Hospital, Sichuan University

Summary

تقدم هذه الدراسة مجموعة سهلة الاستخدام وكاملة وبسيطة من الطرق لتسمية وتحليل الكبيبات من كليتي الفئران التي تم تطهيرها من CUBIC. يمكن الحصول على بيانات مثل رقم الكبيبة وحجمها بسهولة وموثوقية باستخدام إيزوثيوسيانات الفلوريسئين (FITC) -Dextran ، أو الفحص المجهري الفلوري للصفائح الضوئية (LSFM) ، أو الفحص المجهري البؤري المشترك والبرامج مثل Imaris.

Abstract

الكبيبات هي وحدات أساسية في الكلى. ومن ثم ، فإن دراسة الكبيبات أمر محوري لفهم وظائف الكلى وعلم الأمراض. يوفر التصوير البيولوجي معلومات بديهية. وبالتالي ، من الأهمية بمكان تسمية الكبيبات ومراقبتها. ومع ذلك ، فإن طرق مراقبة الكبيبات المستخدمة حاليا تتطلب عمليات معقدة ، وقد تفقد النتائج تفاصيل التسمية أو المعلومات ثلاثية الأبعاد (3D). تم استخدام كوكتيلات تصوير الدماغ الواضحة والخالية من العوائق وتقنية مسح الأنسجة بالتحليل الحسابي (CUBIC) على نطاق واسع في أبحاث الكلى ، مما يسمح باكتشاف أكثر دقة وعمق اكتشاف أعمق. وجدنا أنه يمكن تمييز كبيبات الفئران بسرعة وفعالية عن طريق حقن الوريد الذيل للوزن الجزيئي المتوسط FITC-Dextran متبوعا بطريقة المقاصة المكعبة. يمكن مسح كلية الفأر التي تم تطهيرها بواسطة مجهر ضوئي (أو مجهر متحد البؤر عند تقطيعها) للحصول على أكوام صور ثلاثية الأبعاد لجميع الكبيبات في الكلية بأكملها. يمكن بسهولة رقمنة إشارات الكبيبات وتحليلها لقياس عدد الكبيبات وحجمها وتواترها.

Introduction

عدد وحجم الكبيبات مهمة جدا لتشخيص وعلاج أمراض الكلى المختلفة1،2،3،4،5. المعيار الذهبي لتقدير عدد الكبيبات هو تركيبة التشريح المادي / المجزأ. ومع ذلك ، تتطلب هذه الطريقة كواشف ومعدات خاصة ، مما يجعلها بطيئة ومكلفة6،7،8،9. توفر الخزعة ثروة من المعلومات ، ولكن من الواضح أن هذه الطريقة مناسبة فقط للتقديرات التقريبية10,11. كما تستخدم تقنيات التصوير الطبي ، بما في ذلك التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) والتصوير المقطعي المحوسب (CT) والأشعة السينية ، على نطاق واسع في الكشف عن الكبيبات12،13،14،15 ، ولكن هذه التقنيات تتطلب أدوات ضخمة. كما استخدمت طرق جديدة ، مثل مطياف الكتلة التصويري16 للتصوير بالامتزاز / التأين بالليزر بمساعدة المصفوفة (MALDI) أو طريقة المقطعالسميك والرقيق 17 ، في الكشف عن الكبيبات ، على الرغم من أنها لا تزال مملة وشاقة.

بمساعدة تقنيات الشفافية ، من الممكن مراقبة أعماق أعمق والحصول على معلومات أكثر ثراء واكتمالا من الأنسجة السميكة أو حتى الأعضاء الكاملة18،19،20،21،22،23. لذلك ، تم استخدام تقنيات الشفافية على نطاق واسع في أبحاث الكلى24. وتشارك أيضا مراقبة والكشف عن الكبيبات في الكلى تطهيرها. ومع ذلك ، فإن هذه المقالات المنشورة إما أشارت لفترة وجيزة فقط إلى الكشف عن الكبيبات25 أو استخدمت طرق وضع العلامات التي يصعب تحقيقها مثل المعدلة وراثيا26 ، أو الأصباغ المنتجة ذاتيا13 ، أو حضانة الأجسام المضادة عالية التركيز27 لتسمية الكبيبات. بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من أن الدراسات قد حللت الكبيبات في الكلى التي تم تطهيرها ، إلا أن التحليلات كانت دائما محدودة13 أو اعتمدت على خوارزميات التحليل التي أنشأها المؤلفون أنفسهم26.

لقد أظهرنا سابقا طريقة أكثر ملاءمة لتسمية الكبيبات في كلى الفئران28. باستخدام Imaris ، وجدنا أنه يمكن الحصول بسرعة على عدد الكبيبات وتكرارها وحجمها. وبالتالي ، نقدم هنا مجموعة من الطرق التي يسهل الوصول إليها وشمولية ومبسطة لتسمية وتحليل كبيبات كلى الفئران.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم استخدام الفئران البالغة C57BL / 6 (6 أسابيع من العمر ، 25-30 جم) في هذه الدراسة. تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا للوائح المحلية لرعاية وأخلاقيات التجارب. تمت الموافقة على الدراسة من قبل مستشفى غرب الصين التابع للجنة أخلاقيات البحوث الطبية الحيوية بجامعة سيتشوان.

1. وضع العلامات الكبيبات وإعداد الأنسجة

  1. وضع العلامات الكبيبات
    1. قم بإذابة FITC-dextran (10 مجم) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) بنسبة 1: 1 (1 مجم: 1 مل) لتحضير محلول مسبار العمل.
      ملاحظة: يمكن تخزين حل العمل في 4 °C لمدة 1 شهر.
    2. ضع الماوس C57 في مثبت وريد ذيل الماوس. بلل الشاش بالماء الساخن ، لف الشاش حول الجزء الأوسط من ذيل الماوس ، وقم بتسخين الذيل لمدة 1 دقيقة.
    3. امسح ذيل الماوس بنسبة 75٪ من الإيثانول حتى تظهر عروق الذيل اليمنى واليسرى.
    4. ارسم 100 ميكرولتر من محلول مسبار العمل باستخدام حقنة أنسولين سعة 1 مل وقم بحقن المحلول ببطء في وريد ذيل الفأر.
    5. بعد الحقن ، دع محلول المسبار يدور لمدة 30 دقيقة. السماح للفئران بالتحرك بحرية في أقفاصها.
    6. بمجرد تحقيق الدورة الدموية الكافية ، قم بتخدير الفئران بعمق عن طريق الحقن داخل الصفاق لبنتوباربيتال الصوديوم (1٪ ، 60-80 ميكروغرام / كجم).
  2. أخذ عينات الكلى وتثبيتها
    1. ثبت الفئران المخدرة على اللوحة التشريحية في وضع ضعيف. تأمين الكفوف مع الشريط الطبي.
    2. بعد تحضير الجلد ، القتل الرحيم للفئران بجرعة مميتة من بنتوباربيتال الصوديوم (1٪ ، 10 مجم / كجم).
    3. قم بعمل شق في منتصف البطن لكشف تجويف البطن.
    4. كشف الكلى وإزالتها بمشرط ومقص في غطاء الدخان. قم بإزالة الغلاف الكلوي برفق.
    5. اجمع الكلى وثبتها في 4٪ بارافورمالدهايد (PFA) عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
    6. اغسل العينات باستخدام PBS ثلاث مرات 1 ساعة لكل منها مع الاهتزاز في درجة حرارة الغرفة (RT).
    7. تحضير الكلى للفحص المجهري.
      1. شريحة الكلى للفحص المجهري متحد البؤر: قطع الكلى إلى شرائح بسمك 1 مم باستخدام مصفوفة الدماغ (1 مم فولاذ ، 40-75 جم) لتوحيد سمك الشريحة. انقل الشرائح إلى 4٪ PFA واستمر في التثبيت عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
      2. الكلى الكاملة للفحص المجهري للصفائح الخفيفة: ثبت الكلى في 4٪ PFA عند 4 درجات مئوية لمدة 48 ساعة.

2. المقاصة

  1. إعداد الكاشف
    1. تحضير كاشف CUBIC-L عن طريق خلط 10٪ (بالوزن / الوزن) N-butyldiethanolamine ، 10٪ (بالوزن / الوزن) Triton X-100 و 80٪ ddH2O.
    2. تحضير كاشف CUBIC-R عن طريق خلط 45٪ (بالوزن / الوزن) مضاد للحرارة ، 30٪ (بالوزن / الوزن) نيكوتيناميد ، 0.5٪ (حجم / حجم) N-butyldiethanolamine و 24.5٪ ddH2O. تأكد من أن المحلول يحتوي على درجة حموضة 9.6-9.8 ومعامل انكسار (RI) يبلغ 1.522.
      ملاحظة: يستخدم CUBIC-L لإزالة الدهون ، ويستخدم CUBIC-R لمطابقة معامل الانكسار.
  2. إجراءات المقاصة
    1. اجمع عينات الكلى في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل ثم قم بمسحها في CUBIC-L مع الاهتزاز عند 60 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية. استبدل CUBIC-L كل 4 ساعات (لشرائح الكلى) أو كل 24 ساعة (لكلية كاملة) حتى تحقيق شفافية بصرية مرضية.
      ملاحظة: تستغرق هذه العملية 1 يوم لشرائح الكلى و 5 أيام لكلية كاملة.
    2. اغسل العينات ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني مع اهتزاز لطيف في RT لمدة 1 ساعة لكل منهما.
    3. ضع CUBIC-R على العينات ، مع هز العينات عند 37 درجة مئوية ، 60 دورة في الدقيقة لمدة 6 ساعات.
    4. مراقبة العينات التي تم تطهيرها مباشرة أو تخزينها في أنابيب سوداء مملوءة ب CUBIC-R في RT لمدة 1 أسبوع.

3. الحصول على الصور

  1. التصوير البؤري
    ملاحظة: صور عينات الكلى المقطعة باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر (العدسات: هدف Plan Apo λ 4× / 0.2 N1 أو هدف Plan Apo VC 10× / 0.45 DIC N1). التقط صورا كبيرة (على سبيل المثال ، 6052 ميكرومتر × 6052 ميكرومتر لشريحة الكلى) باستخدام مكدسات z.
    1. قم بتشغيل المجهر متحد البؤر بالتسلسل التالي: طاقة الليزر ، مفتاح التحكم متحد البؤر ، الكمبيوتر ، المجهر ، والأجهزة متحدة البؤر. بعد إجراء الاختبار الذاتي ، قم بتشغيل البرنامج البؤري.
    2. حدد العدسة المناسبة. قم بإزالة العينة من كاشف CUBIC-R ، وضعها في الطبق متحد البؤر ، وقم بتغطيتها لمنع كاشف CUBIC-R من الجفاف.
    3. انقل العينة إلى منتصف مجال الرؤية واضبط المستوى البؤري حتى يتم التركيز عليه.
    4. تطبيق إعادة البناء ثلاثية الأبعاد (الخطوة 3.1.4.1) وإعادة بناء الصورة الكبيرة (الخطوات 3.1.4.2-3.1.4.3).
      1. إعادة بناء 3D (متحد التركيز): قم بتبديل مستوى التكبير في اتجاه واحد حتى لا يكون هناك مضان مرئي ؛ يتم تعريف هذا الموقف على أنه الجزء العلوي. بعد ذلك ، قم بتبديل مستوى التكبير / التصغير في الاتجاه المعاكس حتى لا يظهر أي مضان ؛ يتم تعريف هذا الموقف على أنه القاع. انقر فوق الزر "تشغيل " في الزاوية السفلية اليمنى من مربع الحوار لبدء المسح.
      2. إعادة بناء الصورة الكبيرة (متحدة التركيز): انقل مجال الرؤية إلى منتصف العينة، وقم بتعيين الموضع الحالي كمركز. حدد حقل عرض 2 × 2.
      3. في واجهة ND متعددة الوظائف، حدد مكدس Z لإعادة بناء الصور الكبيرة وتعيين خيارات مختلفة في اللوحة. ثم اضغط على يجري butto n لبدء المسح.
  2. التصوير المجهري الفلوري للصفائح الضوئية (LSFM)
    ملاحظة: تخيل الكلى بأكملها باستخدام مجهر مضان بورقة ضوئية (العدسة: EC Plan-Neofluar 5x / 0.16 (متوسط n = 1.529) الهدف).
    1. إرفاق العينة (LSFM):
      1. قم بلصق الكلية الشفافة بمحول تثبيت العينة وانتظر حتى يتم ربط الكلية بإحكام.
      2. انقع الكلى في صندوق العينات وادفع حاوية العينة إلى نظام المجهر. أغلق الفتحة.
    2. المراقبة والمسح الضوئي (LSFM):
      1. في واجهة تحديد الموقع ، انقل العينة إلى موضع مراقبة مناسب. قم بالتبديل إلى واجهة الاستحواذ ، واضبط المسار البصري ، وحدد ليزر 488 نانومتر ، LBF 405/488/561/640 ، كتلة مرشح التقسيم البصري SBS LP 490 ، حدد الكاميرا 2 ، وقم بتغيير اللون الزائف إلى اللون الأخضر.
      2. املأ قيمة إزاحة Z اليسرى/اليمنى المسجلة سابقا في القائمة الفرعية للقناة . حدد أصغر تكبير/تصغير (0.36) وقم بضبطه للحصول على أقصى قدر من الوضوح.
    3. أوجد حد X\Y والنطاق Z للعضو بأكمله. اضبط شدة الليزر ووقت التعرض (يفضل أن يكون أقل من 10 مللي ثانية) ، وانقر فوق تشغيل للبدء.
    4. إذا كان النسيج كبيرا جدا ، فقم بدمج صورتين أو أكثر مع خياطة الصورة. افتح الملف الذي تم التقاطه باستخدام برنامج الفحص المجهري (هنا ، ZEISS ZEN 3.7). حدد المعالجة > الطريقة > خياطة معلمة > الطريقة > تطبيق لإكمال خياطة الصورة.

4. معالجة البيانات والقياس الكمي

ملاحظة: قم بمعالجة مكدسات الصور باستخدام برنامج Imaris (تحليل الصور) ، باستخدام وظيفة Surface لتسمية الكبيبات وإجراء التحليل.

  1. عدد الكبيبات
    1. استيراد الصور الكبيرة (الفحص المجهري متحد البؤر) أو الصور المخيطة (الفحص المجهري للصفائح الضوئية) إلى برنامج تحليل الصور.
    2. افتح الملفات في برنامج تحليل الصور. انقر فوق الزر Surface لإنشاء جهاز Surface جديد. اتبع الدليل الموجود في الجزء السفلي الأيسر من الشاشة.
      1. انقر فوق الزر التالي (زر السهم الأيمن) دون تحديد أي شيء.
      2. ضع علامة في المربع قبل خيار Smooth وأدخل رقما مناسبا (على سبيل المثال ، 14.5) للتحكم في تفاصيل Surface. حدد طرح الخلفية في العتبة واملأ المربع بمتوسط القطر التقريبي للكبيبات. انقر فوق الزر التالي .
      3. اضبط إذا لزم الأمر ، وانقر فوق الزر "التالي ". حدد النطاق المناسب وانقر فوق الزر التالي لإنشاء Surface.
    3. انقر فوق تصفية ، ثم إضافة زر لإضافة كروية لتصفية الكائنات غير الكروية. انقر فوق الزر تكرار لنسخ هذا السطح الجديد.
    4. انقر فوق الزر "إحصائيات " ، ثم انقر فوق الزر "عام " ؛ سيقدم البرنامج عدد الكبيبات على أنه العدد الإجمالي للسطح.
  2. حجم الكبيبات
    1. إنشاء سطح الكبيبات على النحو الوارد أعلاه.
    2. عند اكتمال Surface، انقر زر التحديد لتحديد الكائنات المستهدفة وتقديم حجم كل كائن. انقر فوق الزر حفظ ، وقم بتصدير الإحصائيات إلى جدول بيانات لمزيد من التحليل.
  3. حجم الشريحة أو الكلية الكاملة
    1. استيراد الصور الكبيرة (الفحص المجهري متحد البؤر) أو الصور المخيطة (الفحص المجهري للصفائح الضوئية) إلى برنامج تحليل الصور.
    2. افتح الملفات في برنامج تحليل الصور. انقر فوق الزر Surface لإنشاء جهاز Surface جديد. اتبع الدليل الموجود في الجزء السفلي الأيسر من الشاشة.
      1. انقر فوق الزر التالي (زر السهم الأيمن) دون تحديد.
      2. ضع علامة في المربع قبل خيار Smooth وأدخل رقما مناسبا (على سبيل المثال، 50) للتحكم في تفاصيل Surface. حدد الكثافة المطلقة في العتبة. انقر فوق الزر التالي .
      3. اضبط Surface حتى يغطي الأنسجة بالكامل، وانقر فوق الزر التالي . انقر فوق الزر التالي لإنشاء Surface.
    3. انقر فوق الزر تحديد لتحديد سطح النسيج بأكمله وتقديم حجم النسيج. انقر على الزر حفظ لتصدير الإحصاءات إلى جدول بيانات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

توفر هذه الدراسة طريقة بسيطة وفعالة لوضع العلامات وتحليل الكبيبات في كلى الفئران.

يمكن تمييز الكبيبات (الأوعية الدموية) بشكل جيد عن طريق حقن FITC-Dextran داخل الأوعية الدموية. بعد عملية المقاصة ، أصبحت الكلية شفافة (الشكل 1 أ) ، ويمكن ملاحظة الكبيبات بوضوح باستخدام الفحص المجهري للصفائح الضوئية (الشكل 1 ب) أو الفحص المجهري متحد البؤر (الشكل 1 ج). يتميز الفحص المجهري البؤري بعمق مسح محدود ، لذلك يجب تقطيع الكلى إلى شرائح بسمك 1 مم تقريبا. إذا تم استخدام مجهر ورقة الضوء ، يمكن فحص الكلى بأكملها مباشرة.

مع الإشارات الواضحة ، كان من السهل حساب عدد الكبيبات. في الواقع ، كان وضع العلامات فعالا لدرجة أنه يمكن حساب الكبيبات بالعين المجردة. يمكن أيضا قياس حجم الكبيبات مباشرة. بالطبع ، سرعت برامج مثل Imaris هذه العملية بشكل كبير. باستخدام وظيفة السطح ، يمكن اختيار جميع الكبيبات في شريحة الكلى (الشكل 2) ، أو في كلية كاملة (الشكل 3) ، أو في شريط (الشكل 4) ، ويمكن الحصول على عدد وحجم الكبيبات مباشرة (الشكل 2C ، الشكل 3C ، الشكل 4C). يمكن أيضا قياس حجم المنطقة المختارة (الشكل 2B ، الشكل 3B ، الشكل 4B) ، لذلك يمكن حساب نسبة حجم الكبيبات وتواترها في منطقة معينة أو في الكلية بأكملها (الشكل 2D ، الشكل 3D ، الشكل 4D). يمكن اختيار منطقة من الكلى لإجراء العمليات الحسابية في مناطق محددة. قدمنا شريطا مشابها للخزعة. يمكن أيضا الحصول على عدد وحجم وتواتر الكبيبات في الشريط بسهولة (الشكل 4).

كما هو موضح في الأشكال ، فإن النتائج المقدمة في هذه الدراسة هي (N = رقم ، F = تردد ، V = حجم ، V (a) = متوسط الحجم ، V (t) = الحجم الكلي):

Nالكبيبات في شريحة = 1128 ، Nالكبيبات في الكلى الكاملة = 14006 ، Fالكبيبي في شريحة = 65 لكل مم3 ، Fالكبيبي في الكلى الكاملة = 105 لكل مم3 ،V إجمالي الكبيبات في شريحة /شريحة V = 2.24٪ ، Vالكلي الكبيبات في الكلى الكاملة /V الكلى = 5.54٪ ، V (a) الكبيبات في شريحة = 373654 ميكرومتر3 ، V (a) الكبيبات في الكلى الكاملة = 521627 ميكرومتر3 ، V (t) الكبيبات في شريحة = 421481724 ميكرومتر3 ، V (t) الكبيبات في الكلى الكاملة = 7305386256 ميكرومتر3 (الشكل 2D ، الشكل 3D).

Nالكبيبات في الشريط = 63 ، Fالكبيبات في الشريط = 72 لكل مم3 ، Vإجمالي الكبيبات في الشريط /الشريط V = 2.23٪ ، V (a) الكبيبات في الشريط = 307698 ميكرومتر3 ، V (t) الكبيبات في الشريط = 19384977 ميكرومتر3 (الشكل 4D).

Figure 1
الشكل 1: شفافية أنسجة الكلى والكبيبات الموصوفة ب FITC-dextran. أ: الكلى قبل العلاج بالشفافية وبعده. ب: صورة كلية كاملة تم فحصها باستخدام LSFM. (ج) صورة شريحة من الكلى الممسوحة ضوئيا بالمجهر متحد البؤر (يسار: 4x، يمين: 10x). شريط المقياس = 300 ميكرومتر (4x ، متحد التركيز) ؛ شريط المقياس = 100 ميكرومتر (10x ، متحد التركيز). شريط المقياس = 700 ميكرومتر (5x ، تكبير 0.36 ، LSFM). تم تصنيف الكبيبات مع FITC-Dextran. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: الوظيفة السطح المطبق على شريحة الكلى الممسوحة ضوئيا متحدة البؤر. (أ) يتكون سطح الشريحة وجميع الكبيبات. الوردي = الكبيبات ، الأزرق = خارج سطح شريحة الكلى ، الأخضر = التسمية الأصلية للأوعية (الكبيبات وبعض الأوعية الكبيرة). شريط المقياس = 300 ميكرومتر. (B) عند تحديد سطح الشريحة (يسار) أو الكبيبات (يمين) (ستتحول الكائنات المحددة إلى اللون الأصفر) ، يمكن الحصول على البيانات مباشرة (يبرز المربع المنقط حيث يعرض البيانات). (ج) يمكن الحصول مباشرة على عدد الكبيبات، وحجم كل كبيبة، وحجم الكبيبات الكلية، وكذلك حجم الشريحة. (د) يمكن إجراء مزيد من التحليل للبيانات المصدرة بحيث يمكن حساب الحساب، مثل متوسط حجم الكبيبات ونسبة حجم الكبيبات والمساحة المختارة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: الوظيفة السطح المطبق على LSFM مسح الكلية الكاملة. أ: يتكون سطح الكلية بأكملها وجميع الكبيبات. الوردي = الكبيبات ، الأزرق = خارج سطح الكلية بأكملها ، الأخضر = التسمية الأصلية للأوعية (الكبيبات وبعض الأوعية الكبيرة). شريط المقياس = 1000 ميكرومتر. (B) عند تحديد سطح الكلية (يسار) أو الكبيبات (يمين) (ستتحول الكائنات المحددة إلى اللون الأصفر) ، يمكن الحصول على البيانات مباشرة (يبرز المربع المنقط حيث يعرض البيانات). (ج) يمكن الحصول مباشرة على عدد الكبيبات، وحجمها، وعدد الكبيبات، وكذلك حجم الكلى. (د) يمكن إجراء مزيد من التحليل للبيانات المصدرة حتى يمكن حساب الحساب، مثل متوسط حجم الكبيبات ونسبة حجم الكبيبات والكلية بأكملها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: الوظيفة السطح المطبق على شريط الكلى المحدد. (أ) يتكون سطح الشريط وجميع الكبيبات. الوردي = الكبيبات ، الأزرق = خارج سطح شريط الكلى ، الأخضر = التسمية الأصلية للأوعية (الكبيبات وبعض الأوعية الكبيرة). شريط المقياس = 150 ميكرومتر. (ب) عند تحديد سطح الشريط (يسار) أو الكبيبات (يمين) (ستتحول الكائنات المحددة إلى اللون الأصفر) ، يمكن الحصول على البيانات مباشرة (يبرز المربع المنقط حيث يعرض البيانات). (ج) يمكن الحصول مباشرة على عدد الكبيبات، وحجم كل كبيبة، وحجم الكبيبات الكلية، وكذلك حجم الشريط. (د) يمكن إجراء مزيد من التحليل للبيانات المصدرة بحيث يمكن حساب الحساب، مثل متوسط حجم الكبيبات ونسبة حجم الكبيبات والمساحة المختارة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يمكن تصنيف تقنيات إزالة الأنسجة إلى 3 أو 4 مجموعات29،30،31. تم تطبيق إزالة الأنسجة القائمة على المذيبات العضوية (على سبيل المثال ، DISCO و PEGASOS) ، وتنظيف الأنسجة المائية (على سبيل المثال ، CUBIC) ، وتطهير الأنسجة بتضمين الهيدروجيل (على سبيل المثال ، CLARITY) في تطهير الكلى 25،26،28،32. CUBIC ، كما أوضحنا ، يعمل بشكل أفضل عندما يتم تمييز الكبيبات (الأوعية) ب FITC-Dextran. بالإضافة إلى ذلك ، تتمتع CUBIC بعملية تشغيل أكثر ملاءمة نسبيا ولا تتطلب أكثر من العدسات المجهرية العادية27 ، حيث لا تحتاج العينات المعالجة إلى نقعها في الكواشف العضوية33. ومع ذلك ، فإن طرق التخليص المختلفة وطرق تسمية السفن لها مزاياها وعيوبها ؛ قد يحتاج الباحثون إلى تجربة مناهج مختلفة لتلبية احتياجاتهم الخاصة.

لاحظت الدراسات السابقة أنه يمكن تسمية الكبيبات في الكلى التي تم تطهيرها عندما تم تصنيف الأوعية الدموية في الكلى13،25،26،28. لا يزال هناك حاجة إلى مزيد من التحقيق في تفسير شامل لهذه الظاهرة ، ولكن يمكن استنتاج أن طريقة وضع العلامات الجيدة لنظام الأوعية الدموية تقوم أيضا بتسمية الكبيبات بشكل فعال. بناء على النتائج التجريبية ، نوصي بالحقن داخل الأوعية الدموية ل FITC-Dextran بوزن جزيئي متوسط (مثل 150 كيلو دالتون). ومع ذلك ، نظرا لأن وضع العلامات يعتمد على الدورة الدموية ، فقد تفشل هذه الطريقة في تسمية الكبيبات عندما تفتقر إلى الدورة الدموية.

يسمح LSFM بمراقبة الأنسجة على نطاق واسع ، مما يجعله أكثر ملاءمة للكشف عن كبيبات الكلى الكاملة. ومع ذلك ، قد لا تتوفر المجاهر ذات الألواح الضوئية في كل مختبر. لذلك ، نحن نقدم مجموعة بديلة من البروتوكولات باستخدام المجاهر البؤرية العادية. على الرغم من أن الكلى تحتاج إلى تقطيعها إلى أقسام متعددة ، إلا أن الحصول على بيانات مثل عدد الكبيبات وحجمها في الكلية بأكملها أمر ممكن. إلى جانب ذلك ، يوفر الفحص المجهري متحد البؤر حجما أصغر من البيانات ، وهو أكثر ملاءمة لمعالجة البيانات.

يوفر Imaris إخراج البيانات المباشر. ومع ذلك ، يجب توخي الحذر لمطابقة الإشارة التناظرية مع الإشارة الأصلية عن كثب. بالإضافة إلى ذلك ، قد يستغرق البرنامج وقتا طويلا لمعالجة الملفات الكبيرة ، مما قد يكون محبطا. طالما يمكن تسمية الكبيبات وتصورها بوضوح ، فهناك أكثر من حل فريد لتحليل البيانات. يمكن للباحثين من مختبرات مختلفة العمل مع برامجهم ولغات البرمجة المألوفة الخاصة بهم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن جميع المؤلفين عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

تم دعم هذه الدراسة بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82204951) وبرنامج سيتشوان للعلوم والتكنولوجيا (2020JDRC0102).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% PFA Biosharp 7007171800 Fixation reaagen
502 Glue  Deli 7146 For fixing the kidney to the sample fixing adapter 
Antipyrine Aladdin A110660 Clearing reagent
Brain Matrix RWD Life Science 1mm 40-75 Tissue slicing
Confocal microscopy Nikon A1plus Image acquisition
FITC-Dextran Sigma-Aldrich FD150S Labeling reagent
Light sheet fluorescence microscopy  Zeiss Light sheet 7  Image acquisition
Mice Ensiweier Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25–30 g) 
N-Butyldiethanolamine Aladdin B299095 Clearing reagent
Nicotinamide Aladdin N105042 Clearing reagent
Pentobarbital Natriumsalz Sigma-Aldrich P3761
Tail vein fixator JINUOTAI JNT-FS35 Fix the mouse for vail injection
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 Clearing reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoy, W. E., et al. Nephron number, glomerular volume, renal disease and hypertension. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 17 (3), 258-265 (2008).
  2. Bertram, J. F., Douglas-Denton, R. N., Diouf, B., Hughson, M. D., Hoy, W. E. Human nephron number: implications for health and disease. Pediatric Nephrology. 26 (9), 1529-1533 (2011).
  3. Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. The Anatomical Record. 232 (2), 194-201 (1992).
  4. Rasch, R. Prevention of diabetic glomerulopathy in streptozotocin diabetic rats by insulin treatment. Kidney size and glomerular volume. Diabetologia. 16 (2), 125-128 (1979).
  5. Puelles, V. G., et al. Glomerular number and size variability and risk for kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (1), 7-15 (2011).
  6. Bertram, J. F., et al. Why and how we determine nephron number. Pediatric Nephrology. 29, 575-580 (2014).
  7. Bertram, J. F., Soosaipillai, M. C., Ricardo, S. D., Ryan, G. B. Total numbers of glomeruli and individual glomerular cell types in the normal rat kidney. Cell and Tissue Research. 270 (1), 37-45 (1992).
  8. Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
  9. Bertram, J. F. Analyzing renal glomeruli with the new stereology. International Review of Cytology. 161, 111-172 (1995).
  10. Lødrup, A. B., Karstoft, K., Dissing, T. H., Pedersen, M., Nyengaard, J. R. Kidney biopsies can be used for estimations of glomerular number and volume: a pig study. Virchows Archiv. 452 (4), 393-403 (2008).
  11. Lane, P. H., Steffes, M. W., Mauer, S. M. Estimation of glomerular volume: a comparison of four methods. Kidney International. 41 (4), 1085-1089 (1992).
  12. Baldelomar, E. J., Charlton, J. R., deRonde, K. A., Bennett, K. M. In vivo measurements of kidney glomerular number and size in healthy and Os(/+) mice using MRI. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 317 (4), F865-F873 (2019).
  13. Huang, J., et al. A cationic near infrared fluorescent agent and ethyl-cinnamate tissue clearing protocol for vascular staining and imaging. Scientific Reports. 9 (1), 521 (2019).
  14. Beeman, S. C., et al. Measuring glomerular number and size in perfused kidneys using MRI. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (6), F1454-F1457 (2011).
  15. Basgen, J. M., Steffes, M. W., Stillman, A. E., Mauer, S. M. Estimating glomerular number in situ using magnetic resonance imaging and biopsy. Kidney International. 45 (6), 1668-1672 (1994).
  16. Prentice, B. M., Caprioli, R. M., Vuiblet, V. Label-free molecular imaging of the kidney. Kidney International. 92 (3), 580-598 (2017).
  17. Sanden, S. K., Wiggins, J. E., Goyal, M., Riggs, L. K., Wiggins, R. C. Evaluation of a thick and thin section method for estimation of podocyte number, glomerular volume, and glomerular volume per podocyte in rat kidney with Wilms' tumor-1 protein used as a podocyte nuclear marker. Journal of the American Society of Nephrology. 14 (10), 2484-2493 (2003).
  18. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  19. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  20. Lloyd-Lewis, B., et al. Imaging the mammary gland and mammary tumours in 3D: optical tissue clearing and immunofluorescence methods. Breast Cancer Research. 18 (1), 127 (2016).
  21. Ren, Z., et al. CUBIC-plus: An optimized method for rapid tissue clearing and decolorization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 568, 116-123 (2021).
  22. Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
  23. Matsumoto, K., et al. Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling. Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).
  24. Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).
  25. Zhu, J., et al. Optimal combinations of fluorescent vessel labeling and tissue clearing methods for three-dimensional visualization of vasculature. Neurophotonics. 9 (4), 045008 (2022).
  26. Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
  27. Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  28. Bai, L., et al. A simple and effective vascular network labeling method for transparent tissues of mice. Journal of Biophotonics. 16 (7), e202300042 (2023).
  29. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  30. Kolesová, H., Olejníčková, V., Kvasilová, A., Gregorovičová, M., Sedmera, D. J. I. Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development. Iscience. 238 (2), 489-507 (2021).
  31. Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
  32. Du, H., Hou, P., Zhang, W., Li, Q. Advances in CLARITY-based tissue clearing and imaging. Experimental and Therapeutic. 16 (3), 1567-1576 (2018).
  33. Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 89, e51382 (2014).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 204 ،
طريقة فعالة وسريعة لوضع العلامات وتحليل كبيبات الماوس
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bai, L., Wu, Y., Dai, W., Shi, Q.,… More

Bai, L., Wu, Y., Dai, W., Shi, Q., Wu, L., Zhang, J., Zheng, L. An Efficient and Fast Method for Labeling and Analyzing Mouse Glomeruli. J. Vis. Exp. (204), e65973, doi:10.3791/65973 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter