Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Helmonterad avbildning för att visualisera och kvantifiera perifer linsstruktur, cellmorfologi och organisation

Published: January 19, 2024 doi: 10.3791/66017
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2, 1,3
1Department of Biological Sciences, University of Delaware, 2School of Optometry and Vision Science Program, Indiana University, 3Department of Biomedical Engineering, University of Delaware
* These authors contributed equally

Summary

De aktuella protokollen beskriver nya helfattningsavbildningar för visualisering av perifera strukturer i den okulära linsen med metoder för bildkvantifiering. Dessa protokoll kan användas i studier för att bättre förstå förhållandet mellan linsstrukturer i mikroskala och linsutveckling/funktion.

Abstract

Ögonlinsen är en genomskinlig flexibel vävnad som ändrar sin form för att fokusera ljus från olika avstånd på näthinnan. Bortsett från ett basalmembran som omger organet, kallat kapseln, är linsen helt cellulär och består av ett monolager av epitelceller på den främre halvklotet och en bulkmassa av linsfiberceller. Under hela livet förökar sig epitelceller i den groende zonen vid linsens ekvator, och ekvatoriella epitelceller migrerar, förlängs och differentieras till nybildade fiberceller. Ekvatoriella epitelceller förändrar väsentligt morfologin från slumpmässigt packade kullerstensformade celler till inriktade hexagonformade celler som bildar meridionala rader. Nybildade linsfiberceller behåller den sexkantiga cellformen och förlängs mot de främre och bakre polerna och bildar ett nytt skal av celler som läggs ovanpå tidigare generationer av fibrer. Lite är känt om de mekanismer som driver den anmärkningsvärda morfogenesen av linsepitelceller till fiberceller. För att bättre förstå linsens struktur, utveckling och funktion har nya avbildningsprotokoll utvecklats för att avbilda perifera strukturer med hjälp av hela fästen av okulära linser. Här visas metoder för att kvantifiera kapseltjocklek, epitelcellarea, cellkärnarea och form, meridional radcellordning och packning samt fibercellbredder. Dessa mätningar är viktiga för att belysa de cellulära förändringar som uppstår under livslång linstillväxt och förstå de förändringar som uppstår med ålder eller patologi.

Introduction

Den okulära linsen är en flexibel, genomskinlig vävnad som ligger i ögats främre region och som fungerar för att finfokusera ljuset på näthinnan. Linsens förmåga att fungera kan delvis tillskrivas dess intrikata arkitektur och organisation 1,2,3,4,5,6. Runt linsvävnaden finns kapseln, ett basalmembran som är nödvändigt för att upprätthålla linsens struktur och biomekaniska egenskaper 7,8,9. Själva linsen är helt cellulär och består av två celltyper: epitelceller och fiberceller. Epitelskiktet består av ett monolager av kuboidala celler som täcker den främre halvklotet av linsen10. Under hela livet förökar sig epitelcellerna och migrerar längs linskapseln mot linsekvatorn. Främre epitelceller är vilande och kullerstensbelagda i tvärsnitt, och nära linsekvatorn förökar sig epitelceller och börjar genomgå differentieringsprocessen till nya fiberceller11,12. Ekvatoriella epitelceller omvandlas från slumpmässigt packade celler till organiserade meridionala rader med hexagonformade celler. Den sexkantiga cellformen bibehålls på basalsidan av dessa differentierande celler medan den apikala sidan drar ihop sig och förankras vid linsens stödpunkt eller modiolus 4,13,14,15. När de ekvatoriella epitelcellerna börjar förlängas till nybildade fiberceller, migrerar cellernas apikala spetsar längs den apikala ytan av främre epitelceller mot den främre polen medan de basala spetsarna rör sig längs linskapseln mot den bakre polen. Nya generationer av fiberceller överlagrar tidigare generationer av celler och skapar sfäriska skal av fibrer. Under cellförlängnings- och mognadsprocessen förändrar fibercellerna väsentligt sin morfologi 11,12,16. Dessa fiberceller utgör huvuddelen av linsmassan 11,12,16,17,18.

De molekylära mekanismerna som bidrar till att etablera intrikata linsmikrostrukturer, cellmorfologi och unik cellulär organisation är inte helt kända. Dessutom är linskapselns och cellstrukturens bidrag till linsens övergripande funktion (transparens, förändring av linsformen) oklart. Dessa samband klarläggs dock med hjälp av ny avbildningsmetodik och kvantitativa bedömningar av linsens strukturella och cellulära egenskaper 2,4,19,20,21,22. Nya protokoll för att avbilda hela linser som möjliggör visualisering av linskapseln, epitelceller och perifera fiberceller med hög rumslig upplösning har utvecklats. Detta inkluderar metodik för att kvantifiera kapseltjocklek, cellstorlek, cellkärnstorlek och cirkularitet, meridional radordning, fibercellpackning och fibercellbredder. Dessa visualiserings- och bildkvantifieringsmetoder möjliggör djupgående morfometrisk undersökning och har fördelar jämfört med andra visualiseringsmetoder (avbildning av platta fästen eller vävnadssnitt) genom att bevara den övergripande 3D-vävnadsstrukturen. Dessa metoder har gjort det möjligt att testa nya hypoteser och kommer att möjliggöra fortsatta framsteg i förståelsen av linscellers utveckling och funktion.

För följande experiment använder vi vildtyps- och Rosa26-tdTomato-möss tandemdimer-Tomat (B6.129(Cg)-Gt(ROSA) (tdTomato)23 (Jackson Laboratories) i C57BL/6J-bakgrunden mellan 6 och 10 veckor, av båda könen. tdTomato-mössen möjliggör visualisering av cellulära plasmamembran i levande linser via uttryck av tdTomato-protein smält till N-terminal 8-aminosyrorna i ett muterat MARCKS-protein som riktar sig mot plasmamembranet via N-terminal myristylation och interna cystein-palmitoyleringsställen23. Vi använder också NMIIAE1841K/E1841K-möss 24 som ursprungligen erhållits från Dr. Robert Adelstein (National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD). Som beskrivits tidigare20 är NMIIAE1841K/E1841K-möss i FvBN/129SvEv/C57Bl6-bakgrund som har förlust av CP49-pärlstav intermediärt filamentprotein (bibehåller mogen fibercellmorfologi och hela linsens biomekanik), återkorsade med C57BL6/J-vildtypsmöss. Vi screenade avkomman för förekomst av den vilda CP49-allelen.

Konfokal avbildning utfördes på ett konfokalfluorescensmikroskop med laserskanning med 20x (NA = 0,8, arbetsavstånd = 0,55 mm, 1x zoom), 40x (NA = 1,3 oljeobjektiv, arbetsavstånd = 0,2 mm, 1x zoom) eller 63x (NA = 1,4 oljeobjektiv, arbetsavstånd = 0,19 mm, 1x zoom) förstoring. Alla bilder togs med hjälp av en nålhålsstorlek, som är en determinant för optisk sektionstjocklek, till 1 Airy Unit (de resulterande optiska tjocklekarna anges i figurförklaringar). Bilderna bearbetades på Zen Software. Bilderna exporterades till .tif format och importerades sedan till FIJI ImageJ Software (imageJ.net).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Möss hålls i University of Delawares djuranläggning, som hålls i en patogenfri miljö. Alla djurförsök, inklusive avlivning genom inandning av CO2 , utfördes i enlighet med godkända djurprotokoll från University of Delaware Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Förberedelse och avbildning av hela objektivfattningen

  1. Fixering av objektiv för helfattningsavbildning
    1. Efter eutanasi ska ögon och dissekeras som tidigare beskrivits25. Efter dissektion, överför linserna omedelbart till färsk 1x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS; 1,1 mM KH2PO4, 155 mM, NaCl, 3,0 mM Na2HPO 4-7H2O; pH 7,4) vid rumstemperatur.
      OBS: Cellulär morfologi kan förändras om linser förvaras i PBS under en längre tid, därför rekommenderas det att fixera omedelbart inom ~10 minuter efter dissektion.
    2. För helmonterad avbildning av linsens främre region, fixera hela linser genom att sänka ner i 0.5 ml nygjord 4 % paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS i ett mikrocentrifugrör vid rumstemperatur. Efter 30 min, tvätta linserna 3x (5 min per tvätt) med 1x PBS. Fortsätt till steg 1.2 eller förvara i 1x PBS vid 4 °C. Fasta linser kan förvaras i upp till 5 dagar.
    3. För helmonterad avbildning av linsens ekvatorialområde, fixera hela linser genom att sänka ner i 0.5 ml nygjord 4 % PFA i 1x PBS i ett mikrocentrifugrör vid rumstemperatur. Efter 1 h, tvätta linserna 3x (5 min per tvätt) med 1x PBS. Gå vidare till steg 1.3 eller förvara i 1x PBS vid 4 °C. Fasta linser kan förvaras i upp till 5 dagar.
  2. Hela fästet av främre linsområdet (fast eller live)
    1. För helmonterad avbildning av fasta objektiv, fortsätt till steg 1.2.3.
    2. För helmonterad avbildning av levande linser, överför linserna till en brunn med en 48-hålsplatta som innehåller 1 ml Medium 199 (fenolrödfri) som innehåller 1 % antibiotika/antimykotika. Inkubera linserna vid 37 °C och 5 % CO2 fram till avbildning. Före avbildning, inkubera linserna i en lösning som innehåller fluorescerande märkt vetegroddagglutinin (WGA-640, 1:500) och Hoechst 33342 (1:500) i Medium 199 i minst 10 minuter. Gå vidare till steg 1.5.
    3. För att färga linskapsel, F-aktin och kärnor i fasta linser, placera linserna i en 500 μL lösning innehållande WGA-640 (1:500), rhodamin-falloidin (1:50) och Hoechst 33342 (1:500) i permeabiliserings-/blockeringsbuffert (1x PBS innehållande 0.3 % Triton, 0.3 % bovint serumalbumin (Fraktion V) och 3 % getserum) i ett mikrocentrifugrör. Fläckar linserna vid 4 °C över natten.
    4. Efter inkubation över natten, tvätta linserna 3x (5 min per tvätt) med 1 ml 1x PBS. Gå vidare till bildlinser.
    5. För att stabilisera den fasta linsen för konfokal avbildning, skapa linsimmobiliseringsdivots i agaros på en bildskål som tidigare beskrivits21 (figur 1).
      1. Värm och blanda försiktigt 2 % agaros i PBS med hjälp av en mikrovågsugn tills lösningen är flytande. Pipettera 250 μL flytande 2 % agaros i en glasbottenskål (Figur 1A) och platta till agarosen över skålen med ett flexibelt plasttäcke (Figur 1B). När agarosen har svalnat och stelnat helt, ta bort täckglaset med en pincett med fin spets (Figur 1C) och använd en 3 mm biopsistans för att skapa ett hål i agaros i mitten av skålen (Figur 1D).
      2. Ta bort överflödig agaros med en ömtålig torkduk (Figur 1E). Håll agarosmögel hydratiserat med 1x PBS och håll vid 4 °C fram till användning. Agarosformar har framgångsrikt lagrats i upp till 1 vecka.
    6. Använd en embryopincett och överför försiktigt den levande eller fasta linsen till divoten i agarosen (figur 1F), som innehåller ~2 ml 1x PBS (fast lins) eller fenolrödfritt medium 199 (levande lins), och placera sedan skålen på ett inverterat mikroskop stage. För att bekräfta att linsen är placerad med det främre området vänt mot objektivet, visualisera kärnfärgning. Om inga kärnor observeras kan den bakre regionen vara vänd mot målet.
    7. För att invertera linsen, använd böjd pincett och vrid försiktigt linsen ~180° så att den främre regionen är vänd mot objektivet. Ta bilder med hjälp av ett konfokalmikroskop.
    8. För visualisering av linskapslar, ta z-stack-bilder med ett 40x-objektiv med en stegstorlek på 0,3 μm. Ta den första bilden före ytan på linskapseln (indikeras av WGA-färgning) och den sista bilden efter epitelcellernas apikala yta. För att visualisera epitelceller, ta z-stackbilder med ett 63x objektiv med en stegstorlek på 0,3 μm för visualisering av linsepitelceller.
      OBS: Dessa mikroskopparametrar möjliggör adekvat tredimensionell (3D) rekonstruktion av bilder, vilket är avgörande för bildkvantifiering av kapseltjocklek eller epitelcellarea. Det är också möjligt att avbilda suturer i levande lins-tdTomat-linser genom att avbilda förbi epitelcellens monolager som tidigare beskrivits4.
  3. Linsens ekvatoriella epitel och fibercellsfärgning
    1. Placera fasta linser i en 0.5 ml lösning av rhodamin-falloidin (1:300), WGA-640 (1:250) och Hoechst 33342 (1:500) i permeabiliserings-/blockeringslösning (3 % BSA, 3 % getserum och 0.3 % Triton) i ett mikrocentrifugrör. Förvaras vid 4 °C över natten.
    2. Efter inkubation över natten, tvätta linserna 3x i 1ml 1x PBS (5 min per tvätt).
    3. Skapa lins immobilisering agaroskilar som tidigare beskrivits 4,10.
      1. Kortfattat, skapa agaroskilar i glasbottnade skålar (FD35-100, WPI) genom att hälla ~5-6 ml smält 2% agaros i 1x PBS i skålar (Figur 2A). När agarosen stelnar (Figur 2B), skapa en triangulär divot med ett vasst blad (Figur 2C). Ta bort agaroskilen och lägg 1 ml 1x PBS i agarosskålen (Figur 2D).
      2. Aspirera upp eventuell kvarvarande agaros som kan finnas kvar efter att ha klippt agarosen. Flera kilar kan skapas per maträtt för att passa flera olika storlekar av linser (visas inte). För att förvara agarosformen, placera 1 ml 1x PBS på agarosformen och håll vid 4 °C. Kilar kan förvaras i upp till 1 vecka.
    4. Använd en böjd pincett och placera linsen i en agaroskil som innehåller 1 ml 1x PBS och justera så att linsens ekvatorialområde är vänt nedåt på mikroskopglaset ovanför det konfokala objektivet (Figur 2E-F). För att bekräfta att ekvatorialregionen är i fokus, visualisera kärnor och se till att kärnorna är inriktade i rader vid ekvatorn. De ekvatoriella epitelcellerna kan också identifieras eftersom de är oregelbundet packade och formade. Dessutom är de meridionala radcellerna exakt inriktade och sexkantiga, vilket indikeras av F-aktinfärgning vid cellmembranen.
    5. Om kärnorna i synfältet är slumpmässigt packade, är den främre sidan av linsen vänd mot objektivet. Om kärnor inte kan observeras, är den bakre sidan av linsen troligen vänd mot objektivet. Om linsen inte sitter på ekvatorn, rikta om linsen och använd den böjda pincetten för att rotera linsen tills de exakt inriktade kärnorna vid linsens ekvator observeras.
    6. Avbilda linsens ekvatoriella epitel och fiberceller med hjälp av ett laserskannande konfokalmikroskop (20x objektiv, NA = 0,8, stegstorlek 0,5 μm och/eller 40x oljeobjektiv, NA = 1,3, stegstorlek 0,4 μm). Rotera bilderna före z-stack-samlingen, där ekvatoriella epitelceller är överst, följt av meridional rad och fiberceller precis nedanför.

2. Metodik för bildanalys

  1. Mätning av linskapselns tjocklek
    1. Använd z-stackbilder som erhållits med ett 40x objektiv (0,3 μm stegstorlek) av antingen levande tdTomato-linser märkta med WGA eller fasta linser märkta med WGA och rho-falloidin, få en optisk 2D-projektion i XZ-vyn av 3D-rekonstruktionen och spara i .tif format. Bearbeta bilder med Zen-programvara.
    2. Öppna XZ-segmentbilder (.tif) i FIJI ImageJ-programvaran.
    3. För att mäta linskapselns tjocklek, använd den raka linjefunktionen (avbildad i figur 3A,B). Ställ in linjebredden till 50 pixlar genom att välja Redigera > Alternativ > Linjebredd. Denna linjebredd bestämdes empiriskt för att ge ett högt signal-brusförhållande med mikroskopinställningarna. Optimal linjebredd kan skilja sig åt på andra mikroskop/mikroskopinställningar eller när du använder linser från andra arter. Dra sedan en linje från kapselns övre yta till under epitelcellernas basala region.
    4. Spara raden som ett intresseområde genom att trycka på Ctrl + T.
    5. Dela upp kanaler i flikar för bild, färg och delade kanaler.
    6. Mät intensiteten längs linjen för kapselkanalen genom att trycka på Ctrl + K.
    7. I ett kalkylblad ritar du intensitetsvärden som en funktion av avståndet och bestämmer intensitetstopparna för kapseln och F-aktinet, som representerar kapselytan respektive basalregionen av epitelceller. På x-axeln är linjeavståndet.
    8. Beräkna sedan kapseltjockleken genom att bestämma avståndet mellan kapsel- och epitelfluorescerande intensitetstoppar (Figur 3C, D).
  2. Analys av cellområden
    1. Använd z-stackbilder erhållna med en 63x objektivlins (NA = 1,4; 0,3 μm stegstorlek) på levande tdTomato-linser eller fasta linser märkta med falloidin, analysera en XY-vyskiva från en z-stack konfokalbild som motsvarar var den mellersta (laterala) regionen av epitelceller är i fokus. Observera att de laterala membranen är synliga med hjälp av tdTomato-membranfärgämnet eller genom att visualisera falloidin som finns vid de laterala cellmembranen.
      OBS: På grund av linsens krökning (som ses i en XZ-vy; Figur 4A-C) kommer inte alla epitelceller att vara i fokus i bilden. Epitelets mellersta region motsvarar den region där både cellens laterala membran (Figur 4D-E) och kärnor (Figur 4G-I) är i fokus.
    2. Exportera bilden som en .tif och öppna den i FIJI ImageJ.
    3. Om du vill ställa in skalan i FIJI ImageJ för analys använder du linjeverktyget för att skapa en linje som är lika lång som ett skalstreck från den konfokala bilden.
    4. Anteckna linjens pixellängd och skalstapelns längd. Gå till Analysera på verktygsfältsmenyn och välj Ange skala. Ange antalet pixlar som är linjens längd i Avstånd i pixlar och i Känt avstånd anger du den kända längden på skalstapeln.
    5. Använd tdTomato- eller rodamin-falloidinfärgningen som en indikation på cellgränser och skissera manuellt en population av celler som är i fokus i bilden med hjälp av polygonverktyget. Spåra endast celler där laterala membran är synliga (figur 4E) och undvik att spåra delvis synliga celler (dvs. i kanten av bilderna). Spara ROI genom att trycka på Ctrl+T. Gå till Redigera på verktygsfältsmenyn och välj Rensa utanför. Mät nu den totala cellytan (ROI) genom att trycka på Ctrl + M i FIJI ImageJ.
    6. Beräkna den genomsnittliga cellarean genom att dividera ROI-arean med det totala cellantalet. Ett enkelt sätt att bestämma antalet celler är att räkna antalet kärnor. Gå till kärnkanalen (blå). På ROI-menyn väljer du den sparade ROI-konturen för celler (bild 4G). Rensa utanför avkastningen genom att gå till Redigera och sedan klicka på Rensa utanför (bild 4H). Använd flerpunktsverktyget för att räkna kärnorna genom att klicka på enskilda kärnor.
  3. Cellulär kärnarea och formanalys
    1. För analys av kärnornas area och form, analysera en optisk sektion av XY-planet view från en konfokalbild av en z-stack konfokalbild som motsvarar där den mellersta (laterala) regionen av tdTomatepitelceller är i fokus. Analysera en z-stack från en konfokalbild där kärnområdet är störst (figur 5A); Detta representerar den mellersta delen av kärnorna.
      OBS: Observera att på grund av linsens krökning kommer inte alla kärnor att vara i fokus, vilket kan ses i XZ view (Figur 4G och Figur 5A).
    2. Välj en delpopulation av kärnor som är i fokus och spara en ROI.
    3. Använd funktionen Clear Outside . Använd verktyget för val på fri hand (fjärde menyknappen från vänster) och spåra noggrant kärnornas gränser i ROI (figur 5B). Spara varje nukleär spårning i ROI-fönstret genom att trycka på Ctrl+T. Rita bara kärnor där de kompletta kärnorna kan ses, och kärnorna inte vidrör varandra.
    4. När alla kärnor är konturerade, mät enskilda cellers kärnarea och form (dvs. cirkularitet) genom att trycka på Ctrl+M.
    5. Kopiera och klistra in data i ett kalkylblad och beräkna den genomsnittliga kärnkraftsarean och cirkulariteten (figur 5C).
  4. Meridional radepitelial packning
    1. För att mäta meridional radstörning, ta bilder med ett 20x objektiv (0.5 μm stegstorlek).
    2. Identifiera linsens stödpunkt/modiolus på bilder. Stödpunkten är den region där de apikala spetsarna på långsträckta epitelceller drar ihop sig för att bilda en ankarpunkt under initial fibercellsdifferentiering och förlängning vid ekvatorn. Identifiera stödpunkten baserat på ljus F-aktinintensitet (indikerad med pilspets i XZ-vyn i figur 6A; indikerad med en röd streckad linje i figur 6B) och förändring i cellulär organisation i en enda optisk sektion vid XY-vyn.
      OBS: Dessutom är F-aktinfärgning av både de basala och apikala regionerna av epitelceller synliga ovanför stödpunkten, medan endast den basala regionen av de långsträckta cellerna är synlig under stödpunkten (Figur 6A). Epitelcellerna ovanför stödpunkten är oregelbundet packade och tenderar att bilda rosetter, medan fibercellerna under stödpunkten är arrangerade i parallella rader, vilket indikeras av ljus F-aktinfärgning vid membranet (Figur 6B).
    3. När stödpunkten har identifierats hos 2 månader gamla möss, välj den enda optiska sektionen ~4,5-5 μm perifer till stödpunkten (mot linskapseln) i XY-planet. Detta avstånd väljs baserat på observationen att alla kärnor i meridionala radceller hos 2 månader gamla möss är i fokus när de är ~5 μm perifera till stödpunkten. Spara den enda optiska delen (.tif). Öppna avbildningen på FIJI.
      OBS: Denna analys har endast utförts på 2 månader gamla möss och därför kan man inte dra slutsatsen om detta avstånd förändras med åldern.
    4. Innan du utför bildanalys, ställ in skalan på μm i ImageJ med steg 2.2.2.
    5. Rita manuellt upp hela meridionala radregioner med hjälp av frihandslinjeverktyget (intresseområde/ROI) genom att identifiera kärninriktning, som visas i figur 7A. Spara ROI genom att trycka på Ctrl+T. Gå till Redigera på verktygsfältsmenyn och välj Rensa utanför. Mät den totala cellytan (ROI) genom att trycka på Ctrl + M i FIJI ImageJ.
    6. Identifiera eventuella oordningsområden som indikeras av F-aktinfärgning genom att skissera med hjälp av frihandslinjeverktyget i FIJI ImageJ. Kriterier för oordnade områden inkluderar förgrening av rader, oregelbunden packning och feljustering av rader (figur 7B), som visades tidigare20.
    7. Mät det konturerade oordnade området/lappen genom att trycka på Ctrl + M i FIJI ImageJ. Summera det totala oordnade området i ett kalkylblad.
    8. Dividera det totala oordnade området med ROI-området och multiplicera sedan med 100 för att få ett procentuellt oordnat område. Om ingen störning observeras, sätt ett värde på 0 % för det störda området.
  5. Meridional rad antal intilliggande celler
    1. För att mäta antalet intilliggande celler, använd F-aktinfärgade bilder tagna med 40x oljeobjektiv (0.4 μm stegstorlek).
    2. Identifiera ett optiskt snitt (XY-plan) vid meridionala radcellernas basala område inåt från linskapseln där F-aktin är anrikat runt hela omkretsen av meridionala radceller, alla meridionala radceller är i fokus och befinner sig i samma plan.
    3. Räkna antalet intilliggande celler som varje meridional radcell har (figur 8). Mät den genomsnittliga procentandelen celler med sex intilliggande celler i ett kalkylblad.
      OBS: Bestäm antalet intilliggande celler med ett 20x-mål. Det är dock betydligt lättare att observera hexagonformen med ett 40x objektiv.
  6. Bildanalys av ekvatoriella fiberceller
    1. Ta konfokala bilder av rhodaminfalloidinfärgade linser med ett 20x objektiv (0,5 μm stegstorlek).
    2. Identifiera stödpunkten enligt anvisningarna i steg 2.4.2. När stödpunkten har identifierats, välj en enda optisk sektion. För standardiseringsändamål och för att jämföra mellan linser, kvantifiera fibercellbredder ~10 μm inåt från stödpunkten i XY-planet (figur 9A).
    3. Exportera råbilder till FIJI ImageJ. I FIJI ImageJ, rita en linje (vanligtvis ~300-400 μm lång) över flera intilliggande fiberceller för att mäta avståndet mellan F-aktinfärgade toppar (linjeskanningsanalys; Figur 9A; rosa linje).
    4. Få den fluorescerande intensiteten över linjeskanningsavståndet i FIJI genom att trycka på Ctrl+K. Exportera sedan data till kalkylbladet för att beräkna avståndet mellan topparna (exempel visas i figur 9A-B). Detta motsvarar fibercellernas bredder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Främre linskapsel, epitelcellområde och kärnområde
För att analysera linskapselns tjocklek färgade vi linskapslar, antingen i levande eller fasta linser, med WGA. Vi identifierade linsepitelceller genom att märka membran med tdTomat i levande linser (Figur 2A), eller via rodamin-falloidinfärgning för F-aktin vid cellmembranen i fasta linser (Figur 2B). I en ortogonal (XZ) projektion gör färgning för WGA och tdTomato/rhodamin-falloidin det möjligt för oss att utföra topp-till-topp-linjeskanningsanalys av fluorescensintensitet. Den stora toppen i WGA-kanalen indikerar kapselytan medan den stora toppen i tdTomato/rhodamine-phalloidin-kanalen indikerar den basala regionen av epitelceller. Genom att beräkna avståndet mellan dessa toppar kan vi få kapseltjocklek. Linjeskanningsanalysen visar att kapslar från en 9 veckor gammal levande mus hade en tjocklek på 11,2 μm, och kapslar från en 9 veckor gammal mus fast lins hade en tjocklek på 12,5 μm. Dessa observerade kapseltjocklekar är representativa för tidigare fynd 2,4.

Helmonterad avbildning av tdTomato-märkta transgena muslinser (eller rhodamin-falloidinfärgade linser; visas inte) möjliggör livevisualisering av epitelcellmorfologi. Den ortogonala (XZ) projektionen ger en sidovy av linsepitelcellen, medan den plana (XY) vyn vid de laterala regionerna möjliggör visualisering av epitelpolygonformen. I friska linser ser vi inga mellanrum mellan cellerna. Vi kan beräkna den genomsnittliga cellarean genom att spåra en population av celler i en bild och dividera arean med antalet celler inom ROI. Antalet celler bestäms genom att räkna antalet Hoechst-färgade kärnor i en given ROI. Analysen visar en genomsnittlig cellarea på 260μm2 vilket är i linje med tidigare studier 2,4.

Hoechst-färgning av kärnor gör det också möjligt att undersöka linsepitelcellens kärnmorfometri i epitelceller. De ortogonala (XZ) projektionerna möjliggör en sidovy av kärnor. Den plana (XY) vyn visar kärnornas cirkulära/ellipsoida former. Spårning av kärnor gör det möjligt att beräkna enskilda cellers kärnarea och andra formparametrar som cirkularitet. Analysen visar en genomsnittlig kärnarea på 64μm2 med en genomsnittlig cirkularitet på 0,8. Cirkularitetsvärden nära 1 indikerar en perfekt cirkel, medan värden som närmar sig 0 indikerar en mer långsträckt morfologi.

Ekvatoriell epitelcellspackning, fibercellsexkantig packning och fibercellbredder
Den plana (XY) bilden av linsens ekvatorialregion visar sexkantiga och regelbundet packade linsepitelceller som konvergerar vid stödpunkten. Stödpunkten är där de apikala spetsarna på förlängande epitelceller drar ihop sig för att bilda en ankarpunkt under initial fibercellsdifferentiering och förlängning vid ekvatorn 4,13,14,15 (figur 6B, indikerad med en röd streckad linje). Stödpunkten kan lokaliseras baserat på ökad F-aktinfärgning som bildar en kontinuerlig linje som separerar de ekvatoriella epitelcellerna och fibercellerna (Figur 6B, röd streckad linje). F-aktinfärgningen vid cellmembranen visar också förändringar i cellformen, där cellerna under stödpunkten är exakt inriktade och ordnade i parallella rader (figur 6). Cellkärnor är också inriktade under stödpunkten.

För att visualisera linsens meridionala radepitelceller och fiberceller väljs en bild 4,5-5 μm perifer om stödpunkten (mot linskapseln) i XY-planet, där den basala regionen av meridionala radceller är synlig, som beskrivits tidigare20. För att mäta meridional radstörning ritas ett intresseområde (ROI) (Figur 7A; gul ruta). Arean av ROI i vildtypslinsbilden är 15 833 μm2. Eftersom det inte finns någon observerbar störning är störningsprocententage 0. Den kritiska roll som icke-muskelmyosin IIA (NMIIA) spelar i cellernas sexkantiga packning med möss med en NMIIA-E1841K-mutation har tidigare beskrivits20. Figur 7A visar en representativ NMIIAE1841K/E1841K-linsens ekvatorialbild för att visa meridional radcellsstörning. Den meridionala radens ROI var 20 757 μm2. Därefter spårades den totala arean av oordnade fläckar. Den totala oordningsarean var 3 185μm2. Den beräknade procentandelen oordning bestämdes till 15,3 % (oordnad yta x 100/total ROI; Figur 7B). Denna procentuella störning ligger inom intervallet i en tidigare studie20.

Därefterpåvisades en undersökning av hexagonal packning i meridionala radceller av vildtyp. Eftersom F-aktin anrikas runt hela omkretsen av meridionala radceller och vid alla sex hörnen i de basala regionerna av cellmembran i linser av vildtyp (dvs. NMIIA+/+), användes F-aktinfärgning för att bedöma cellformer och packningsorganisation. I representativ bild 1 märktes celler och antalet intilliggande celler runt varje cell räknades. I bild 1 har alla tio cellerna sex intilliggande celler, vilket tyder på att dessa celler är ordnade i en bikakepackningsorganisation (figur 8). Däremot har åtta av tio celler (80 % av cellerna) sex intilliggande celler i bild 2 som indikerar att cellerna är oregelbundet packade (figur 8).

Slutligen, för att mäta fibercellens bredd, undersöktes de perifera fibercellerna som ligger ~10 μm inåt från stödpunkten i fasta vildtypslinser märkta med rhodamin-falloidin (Figur 9A)2,4. Observera att det också är möjligt att mäta fibercellbredder med levande tdTomato-möss, men signalen från linser som är heterozygota för tdTomato tenderar att vara svag vid ekvatorialregionerna. Därför rekommenderas att använda möss som är homozygota för tdTomato eftersom de har visat sig ha starkare fluorescens (visas inte). Avståndet mellan de F-aktinfärgade cellgränserna med hjälp av linjeskanningsanalys mättes som beskrivits tidigare för att indikera fibercellbredd 2,4 (figur 9B). Denna analys visade att det genomsnittliga interpeakavståndet i vildtypslinser är 11,45 ± 2,11 μm (N=117 fiberceller från 4 olika muslinsbilder, figur 9B).

Figure 1
Figur 1: Steg för att skapa agarosdivot för att immobilisera linsen under bildbehandling. (A) Använd en glasbottenskål och pipettera 2 % agaros. (B) Platta till med ett flexibelt täckglas och (C) när det har svalnat, ta bort det med en fin spetspincett. (D) För torven, skapa ett hål med hjälp av en 3 mm biopsistans. (E) Aspirera kvarvarande agaros, skölj med PBS, torka av ytan med en luddfri servett. (F) Montera försiktigt hela linsen i divot. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Steg för att skapa agarosdivot för avbildning av linsens ekvatoriella epitel och fiberceller. (A) Häll 2 % smält agaros i vävnadsodlingsskålen. (B) Kyl agarosen i rumstemperatur tills den stelnar helt. (C) Skapa en triangulär divot med ett vasst blad. (D) Lägg 1 ml 1x PBS i vävnadsodlingsskålen. (E) Placera den dissekerade linsen i kilen med (F) linsen uppställd på ekvatorn fastkilad mellan agarosväggarna (röd pil). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Bestämning av linskapselns tjocklek. Sagittal (X, Z-planvy) optiska snitt från rekonstruktioner av konfokala z-stackar av (A) levande och (B) fasta linskapslar. Fluorescerande intensitet av linjeskanning av (C) levande och (D) fasta linser visar en enda WGA (grön) topp som motsvarar kapselns övre yta och det basala området av epitelceller (röda) intill kapseln. Avståndet mellan de två topparna mäts för att kvantifiera kapselns tjocklek. Bilder tagna med ett 40x oljeobjektiv med ett 1 luftigt enhetshål som resulterar i optiska sektioner på 1,0 μm och 1,2 μm i tdTomato/Rhodamine-Phalloidin- respektive WGA-kanalerna. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Kvantifiering av epitelcellarea. (A) X, Z-plan vy av linsepitelcellerna markerade med (B) tdTomat för cellmembran och (C) Hoechst för kärnor. (D) X, Y-plan vy av den mellersta regionen av linsepitelceller. (E) tdTomato-signalen används som en guide för att definiera ett intresseområde som motsvarar en grupp celler som är i fokus. (F) Arealen för det avgränsade området fastställs. G) Hoechst-färgning för kärnor används för att bestämma antalet celler inom det definierade området. (H) Antalet kärnor räknas med hjälp av (I) FIJI ImageJ:s flerpunktsverktyg. För att beräkna den genomsnittliga cellarealen, dividera den totala arean av det definierade området av intresse med det totala antalet celler. Bilder tagna med ett 63x oljeobjektiv med ett 1 luftigt enhetshål som resulterar i optiska sektioner på 0,7 μm och 1,0 μm i Hoechst- respektive tdTomato-kanalerna. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Bestämning av kärnans area och form. (A) XY-plansvy av kärnornas mittområde. (B) Ett område av intresse där kärnor är i fokus definierades. Kärnor inom ROI beskrivs. (C) Arean och cirkulariteten hos kärnorna i enskilda celler tabellerades och medelvärden för area och cirkularitet beräknades. Bilder tagna med ett 63x oljeobjektiv med ett 1 luftigt enhetshål, vilket resulterar i en optisk sektion på 0,7 μm i Hoechst-kanalen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Identifiering av linsens stödpunkt. F-aktin och kärnor kan användas för att identifiera stödjepunkten och meridionala rader. (A) XZ-vy visar anrikad falloidinfärgning för F-aktin som motsvarar stödpunkten. (B) En optisk XY-plansvy med linsens stödpunkt i fokus. Hoechst-färgning för kärnor visar att kärnorna ovanför stödpunkten är oregelbundet packade medan kärnorna under stödpunkten är exakt inriktade (överst till höger). Falloidinfärgning för F-aktin visar att cellerna ovanför stödpunkten är oregelbundet formade medan cellerna under stödpunkten är packade i parallella rader (nederst till vänster). Den röda streckade linjen visar platsen för stödpunkten. Bilder tagna med ett 20x objektiv med ett 1 luftigt enhetshål som resulterar i optiska sektioner på 1,5 μm, 2,0 μm och 2,2 μm i Hoechst-, Rhodamine-Phalloidin- respektive WGA-640-kanalerna. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 7
Figur 7: Bestämning av meridional radstörning. (A) Enstaka XY-planvy optisk sektion av vildtyps- och NMIIAE1841K/E1841K meridionala radceller ~5 μm från stödpunkten (mot linskapseln). Hela de meridionala radcellerna är konturerade i blått baserat på kärninriktning. F-aktin (röd) färgning i vildtypslins visar att meridionala radceller är exakt inriktade utan tecken på störning (0%). En representativ ordnad region i vildtyp är markerad (orange). I linser med oordnade celler skisserar vi de oordnade regionerna (gula). (B) Hög förstoring av ordnat område från vildtyp (orange ruta i A). (C) Hög förstoring av oordnade områden som visar olika typer av oordning inklusive (I) förgrening av rader, (II) oregelbunden cellform och förlust av bikakepackning och (III) felinriktning av rader. Bilder från NMIIAE1841K/E1841K-linsen visar 15,3 % meridional radcellsstörning. Bilder tagna med ett 20x-objektiv med ett 1 luftigt enhetshål som resulterar i optiska sektioner på 1,5 μm och 2,0 μm i Hoechst- respektive Rhodamine-Phalloidin-kanalerna. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 8
Figur 8: Analys av linsens meridionala radcellsbikakepackning. A) Enstaka optiska XY-snitt av meridionala radceller färgade med rodaminfalloidin för F-aktin. Bilder med låg förstoring (övre panelen), visar cellerna som utvärderas (numrerade i rosa). Området som är markerat i gult förstoras (nedre panelen). De gula romerska siffrorna är antalet intilliggande celler. Bild 1 visar celler som alla är sexkantiga till formen, var och en med 6 intilliggande celler. Bild 2 har oregelbundenheter med cellnummer 1 och 5 som har 5 respektive 7 intilliggande celler. (B) Data registreras och tabelleras med den procentuella andelen sexkantiga celler som beräknas. Bilder tagna med ett 40x objektiv med ett 1 luftigt enhetshål som resulterar i en optisk sektion på 1,0 μm i Rhodamine-Phalloidin-kanalen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 9
Figur 9: Analys av fibercellbredder. (A) En optisk XY-vy av linsens fiberceller ~10 μm in från stödpunkten. Cellerna färgades med rhodamin-falloidin för visualisering av F-aktin vid cellmembranen. En linje (rosa; streck) dras över ett antal fiberceller. B) Representativ linjeskanning av F-aktinintensiteter som en funktion av avståndet. Mellantoppsavståndet representerar fibercellens bredd. Bilder tagna med ett 40x-objektiv med ett 1 luftigt enhetshål som resulterar i en optisk sektion på 1,0 μm i Rhodamine-Phalloidin-kanalerna. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De beskrivna protokollen möjliggör visualisering med hög rumslig upplösning av perifera linsstrukturer och celler vid linsens främre och ekvatoriella regioner. I denna studie visades metoder för visualisering av perifera strukturer med hjälp av intakta (levande eller fasta) linser där den övergripande 3D-linsarkitekturen bevaras. Dessutom tillhandahölls enkla metoder för morfometrisk kvantitativ analys med hjälp av offentligt tillgänglig FIJI ImageJ-programvara. Hela monteringsvisualiserings- och kvantifieringsmetoderna har använts i tidigare studier. Dessa metoder gjorde det möjligt för oss att förstå responsen hos den främre kapseln och cellerna på linsformförändring eller åldrande 2,4. Dessa metoder har också använts för att undersöka ekvatoriell fibercellsexpansion på grund av linsformförändring eller åldrande 2,4 och för att bestämma NMIIA:s roll i att etablera exakta hexagonala former och perifer fibercellorganisation20.

Helmonterad avbildning möjliggör hög rumslig upplösning en ansiktsavbildning av linsstrukturen. Vid det främre linsområdet är helmonterad avbildning fördelaktig för platt avbildning genom att förhindra skador som kan förändra kapselstrukturens integritet och/eller epitelcellulär morfologi. Dessutom bevaras gränssnittet mellan epitelceller och fiberceller. Denna metod ger fördelar jämfört med visualisering av linssektioner eftersom ansiktsavbildning ger större rumslig upplösning och möjliggör analys av epitelcellarea och kärnområde/form i det valda området (dvs. mittlateralt, som visas här) eller andra regioner av celler. Dessutom gör avbildningsmetoderna det möjligt att kvantifiera morfologiska egenskaper vid specifika punkter längs linsens ekvatoriella regioner, vilket möjliggör visualisering av sexkantiga former, meridional radcellspackning, stödjepunkt och fibercellbredder, vilket inte skulle vara lätt att uppnå via avbildningsfärgade linssektioner på grund av brist på rumslig upplösning och vävnadsförvrängning som kan uppstå under snittning.

De beskrivna protokollen gör det också möjligt att avbilda levande linser för att spåra specifika linsstrukturer och celler över tid. Protokollet för live-linsavbildning var avgörande i en tidigare studie, där upprepade mätningar av kapseltjocklek och epitelcellarea från en subpopulation av celler från samma lins före och efter linskompression för att inducera linstillplattning utfördes4. Det bestämdes att linskompression inducerade en minskning av kapseltjockleken och en ökning av epitelcellarea. På grund av den stora variationen i kapseltjocklek och epitelcellarea mellan enskilda linser och storleken på effekterna på dessa parametrar som orsakas av linskompression, skulle det vara svårt att upptäcka skillnader om en oberoende mätdesign användes (dvs. att jämföra enskilda icke-komprimerade linser med enskilda komprimerade linser). Med hjälp av live-avbildningsmetoderna har helmonterad avbildning på levande muslinser som endogent uttrycker LifeACT-GFP26 för att visualisera F-aktin i epitelceller22, vilket möjliggör spårning av F-aktinreorganisation i levande epitelceller, genomförts.

Medan de beskrivna protokollen utvecklades för avbildning av muslinser och kan anpassas för att visualisera linsstrukturer hos andra arter, är färgningsprotokollen för att visualisera linsens både främre och ekvatoriella perifera strukturer i andra gnagarlinser (råtta, marsvin) såväl som i andra däggdjurslinser (ko, makak och människa; data visas inte). Visualisering av strukturer i större glas kräver längre fixering (4 % PFA, på is, 4 timmar), blockering (1 timme) och färgning (över natten, 4 °C). Värt att notera är att avbildningen i olika arter endast utfördes på fasta linser. Live-avbildning av linser från andra arter kan vara utmanande eftersom live-avbildningsprotokollet använder linser från transgena möss som uttrycker fluorogena proteiner. Därför kan denna avbildning utesluta avbildningslinser av andra arter där genetiska modifieringar inte är vanliga. Vi har dock kunnat genomföra livevisualisering av linsepitelcellmembran eller F-aktin genom att förfärga muslinser med den lipofila sonden, FM4-64 eller en F-aktinbindande prob, SiR-Jasplakinolide (SiR-aktin), respektive (visas inte). Det kan vara möjligt att använda sådana sonder för att avbilda levande linser från andra arter. Försiktighet måste dock iakttas vid användning av sådana sonder för att undvika effekter utanför målet. till exempel kan SiR-Jasplakinolide leda till förändrad F-aktindynamik27. En annan begränsning med färgningsmetoderna, oavsett om det gäller levande eller fasta linser, är att sådana sonder har begränsad penetration. Därför är avbildning begränsad till perifera regioner. Det är möjligt att avbilda inre regioner (dvs. djupfiberceller) med hjälp av linser från tdTomato transgena möss4, som återigen förlitar sig på det transgena uttrycket av fluorogena proteiner. Uttrycket måste också vara tillräckligt högt för ljusa signaler i djupfiberceller.

Icke desto mindre har de beskrivna protokollen möjliggjort effektiv morfologisk kvantifiering av perifera linsegenskaper 2,4,20. Kvantifieringsmetoderna är effektiva och använder öppen källkod, allmänt tillgänglig FIJI ImageJ-programvara. Manuella spårningsverktyg användes för att identifiera intressanta regioner, men det kan vara möjligt att automatisera identifieringen av intressanta regioner. Automatisering kan vara så enkelt som att tillämpa fluorescerande trösklar för att förbättra kontrasten för FIJI ImageJ-baserad identifiering av särskilda strukturer (dvs. kärngränser) eller mer komplexa maskininlärningsalgoritmer för att upptäcka cellformskillnader (dvs. oregelbundna epitel- eller fibercellformer). Mer komplex analys kan kräva antingen specialiserade plugins eller bildbehandlingsprogram. Specialiserade plugins eller programvara kan också göra det möjligt att erhålla volymetriska morfologiska 3D-mått från förvärvade z-stackar. Sammantaget, medan de beskrivna kvantifieringsmetoderna är lättillgängliga, kostnadseffektiva och lämpliga för många användbara utfallsmått 2,4,20, kan bildprotokollplattformen, i kombination med sofistikerad mjukvaruanalys, ge en mängd ytterligare morfologiska mätningar för framtida studier.

Linsen är en invecklad biologisk vävnad med specialiserade funktioner som är beroende av plats- och djupberoende geometrier hos cellerna och deras tillhörande strukturer. Att använda de avbildningsprotokoll och kvantifieringsmetoder som demonstreras här kommer att möjliggöra en större förståelse för hur linsstrukturer och linsens komplexa organisation etableras. Dessutom kommer avbildningsprotokollen och kvantifieringsmetoderna att hjälpa till att avgränsa sambanden mellan linsens struktur och funktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av National Eye Institute Grant R01 EY032056 till CC och R01 EY017724 till VMF, samt National Institute of General Medical Sciences under anslagsnummer P20GM139760. STI stöddes av NIH-NIGMS T32-GM133395 som en del av Chemistry-Biology Interface predoktorala utbildningsprogram och av ett University of Delaware Graduate Scholars Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3 mm Biopsy Punch Acuderm Inc NC9084780
Agarose Apex BioResearch Products 20-102GP
Antimycotic/Antibiotic Cytiva SV30079.01
Bovine Serum Albumin (Fraction V) Prometheus 25-529
Delicate task wipes Kimwipe
Glass bottomed dish (Fluorodish) World Precision International FD35-100
Hoescht 33342 Biotium 40046
Laser scanning confocal Microscope 880 Zeiss
MatTek Imaging Dish MatTek Life Sciences P35G-1.5-14
Paraformaldehyde  Electron Microscopy Sciences 100503-917
PBS GenClone 25-507B
Phenol red-free medium 199 Gibco 11043023
Rhodamine-Phalloidin Thermo Fisher 00027
Triton X100 Sigma-Aldrich 11332481001
WGA-640 Biotium CF 640R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gokhin, D. S., et al. Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens. PLoS One. 7 (11), e48734 (2012).
  2. Cheng, C., et al. Age-related changes in eye lens biomechanics, morphology, refractive index and transparency. Aging (Albany NY). 11 (24), 12497-12531 (2019).
  3. Cheng, C., et al. Tropomodulin 1 regulation of actin is required for the formation of large paddle protrusions between mature lens fiber cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (10), 4084-4099 (2016).
  4. Parreno, J., Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The effects of mechanical strain on mouse eye lens capsule and cellular microstructure. Mol Biol Cell. 29 (16), 1963-1974 (2018).
  5. Sindhu Kumari, S., et al. Role of Aquaporin 0 in lens biomechanics. Biochem Biophys Res Commun. 462 (4), 339-345 (2015).
  6. Martin, J. B., et al. Arvcf dependent adherens junction stability is required to prevent age-related cortical cataracts. Front Cell Dev Biol. 10, 840129 (2022).
  7. Danysh, B. P., Duncan, M. K. The lens capsule. Exp Eye Res. 88 (2), 151-164 (2009).
  8. Mekonnen, T., et al. The lens capsule significantly affects the viscoelastic properties of the lens as quantified by optical coherence elastography. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1134086 (2023).
  9. Fincham, E. F. The function of the lens capsule in the accommodation of the eye. Trans Optical Society. 30 (3), 101 (1929).
  10. Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The lens actin filament cytoskeleton: Diverse structures for complex functions. Exp Eye Res. 156, 58-71 (2017).
  11. Bassnett, S., Sikic, H. The lens growth process. Prog Retin Eye Res. 60, 181-200 (2017).
  12. Sikic, H., Shi, Y., Lubura, S., Bassnett, S. A full lifespan model of vertebrate lens growth. R Soc Open Sci. 4 (1), 160695 (2017).
  13. Cheng, C., Ansari, M. M., Cooper, J. A., Gong, X. EphA2 and Src regulate equatorial cell morphogenesis during lens development. Development. 140 (20), 4237-4245 (2013).
  14. Sugiyama, Y., Akimoto, K., Robinson, M. L., Ohno, S., Quinlan, R. A. A cell polarity protein aPKClambda is required for eye lens formation and growth. Dev Biol. 336 (2), 246-256 (2009).
  15. Zampighi, G. A., Eskandari, S., Kreman, M. Epithelial organization of the mammalian lens. Exp Eye Res. 71 (4), 415-435 (2000).
  16. Lovicu, F. J., Robinson, M. L. Development of the Ocular Lens. , Cambridge University Press. (2011).
  17. Kuszak, J. R., Zoltoski, R. K., Sivertson, C. Fibre cell organization in crystalline lenses. Exp Eye Res. 78 (3), 673-687 (2004).
  18. Cvekl, A., Ashery-Padan, R. The cellular and molecular mechanisms of vertebrate lens development. Development. 141 (23), 4432-4447 (2014).
  19. Vu, M. P., Cheng, C. Preparation and immunofluorescence staining of bundles and single fiber cells from the cortex and nucleus of the eye lens. J Vis Exp. (196), e65638 (2023).
  20. Islam, S. T., Cheng, C., Parreno, J., Fowler, V. M. Nonmuscle myosin IIA regulates the precise alignment of hexagonal eye lens epithelial cells during fiber cell formation and differentiation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (4), 20 (2023).
  21. Patel, S. D., Aryal, S., Mennetti, L. P., Parreno, J. Whole mount staining of lenses for visualization of lens epithelial cell proteins. MethodsX. 8, 101376 (2021).
  22. Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Front Cell Dev Biol. 10, 983178 (2022).
  23. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  24. Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238-250 (2012).
  25. Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: Strain and morphometric analyses. J Vis Exp. (111), e53986 (2016).
  26. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  27. Lukinavicius, G., et al. Fluorogenic probes for live-cell imaging of the cytoskeleton. Nat Methods. 11 (7), 731-733 (2014).

Tags

Biologi nummer 203
Helmonterad avbildning för att visualisera och kvantifiera perifer linsstruktur, cellmorfologi och organisation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Emin, G., Islam, S. T., King, R. E., … More

Emin, G., Islam, S. T., King, R. E., Fowler, V. M., Cheng, C., Parreno, J. Whole Mount Imaging to Visualize and Quantify Peripheral Lens Structure, Cell Morphology, and Organization. J. Vis. Exp. (203), e66017, doi:10.3791/66017 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter