Summary
Die Anwendung von Trägerschichten auf kryogene Elektronenmikroskopie-Gitter (KryoEM) kann die Partikeldichte erhöhen, Wechselwirkungen mit der Luft-Wasser-Grenzfläche begrenzen, strahlinduzierte Bewegungen reduzieren und die Verteilung der Partikelorientierungen verbessern. In diesem Artikel wird ein robustes Protokoll für die Beschichtung von KryoEM-Gittern mit einer Monoschicht aus Graphen beschrieben, um die Vorbereitung von Kryoproben zu verbessern.
Abstract
Bei der kryogenen Elektronenmikroskopie (KryoEM) werden gereinigte Makromoleküle auf ein Gitter aufgebracht, das eine löchrige Kohlenstofffolie trägt. Die Moleküle werden dann getupft, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, und schnell in einer etwa 20-100 nm dicken Schicht aus glasartigem Eis eingefroren, die über etwa 1 μm breite Folienlöcher schwebt. Die resultierende Probe wird mittels kryogener Transmissionselektronenmikroskopie abgebildet und nach der Bildverarbeitung mit geeigneter Software können nahezu atomar aufgelöste Strukturen bestimmt werden. Trotz der weit verbreiteten Akzeptanz der KryoEM bleibt die Probenvorbereitung ein schwerwiegender Engpass in den Arbeitsabläufen der KryoEM, wobei die Anwender oft auf Herausforderungen stoßen, die mit dem schlechten Verhalten von Proben im schwebenden Glaseis zusammenhängen. In jüngster Zeit wurden Methoden entwickelt, um KryoEM-Gitter mit einer einzigen kontinuierlichen Schicht aus Graphen zu modifizieren, die als Stützfläche fungiert, die oft die Partikeldichte im abgebildeten Bereich erhöht und Wechselwirkungen zwischen Partikeln und der Luft-Wasser-Grenzfläche reduzieren kann. Hier stellen wir detaillierte Protokolle für die Anwendung von Graphen auf KryoEM-Gitter und für die schnelle Bewertung der relativen Hydrophilie der resultierenden Gitter zur Verfügung. Darüber hinaus beschreiben wir eine EM-basierte Methode, um das Vorhandensein von Graphen zu bestätigen, indem wir sein charakteristisches Beugungsmuster visualisieren. Schließlich demonstrieren wir den Nutzen dieser Graphenträger, indem wir eine Dichtekarte mit einer Auflösung von 2,7 Å eines Cas9-Komplexes unter Verwendung einer reinen Probe in relativ niedriger Konzentration schnell rekonstruieren.
Introduction
Die kryogene Einzelpartikel-Elektronenmikroskopie (KryoEM) hat sich zu einer weit verbreiteten Methode zur Visualisierung biologischer Makromoleküle entwickelt1. Angetrieben von Fortschritten bei der direkten Elektronendetektion 2,3,4, der Datenerfassung5 und den Bildverarbeitungsalgorithmen 6,7,8,9,10 ist die KryoEM nun in der Lage, 3D-Strukturen mit nahezu atomarer Auflösung einer schnell wachsenden Anzahl von Makromolekülenzu erzeugen 11. Darüber hinaus können Benutzer durch die Nutzung der Einzelmolekülnatur des Ansatzes mehrere Strukturen aus einer einzigen Probe 12,13,14,15 bestimmen, was das Versprechen unterstreicht, die generierten Daten zum Verständnis heterogener Strukturensembles 16,17 zu verwenden. Trotz dieser Fortschritte gibt es nach wie vor Engpässe bei der Gittervorbereitung von Kryoproben.
Für die strukturelle Charakterisierung mittels KryoEM sollten biologische Proben gut in wässriger Lösung dispergiert und dann durch einen Prozess namens Vitrifikation18,19 schockgefroren werden. Das Ziel ist es, Partikel in einer gleichmäßig dünnen Schicht aus verglastem Eis einzufangen, die über regelmäßig verteilte Löcher hängt, die normalerweise in eine Schicht aus amorphem Kohlenstoff geschnitten sind. Diese gemusterte amorphe Kohlenstofffolie wird von einem TEM-Gitter getragen, das ein Netz aus Kupfer- oder Goldstützstäben trägt. In Standardarbeitsabläufen werden die Gitter vor dem Auftragen der Probe durch eine Glimmentladungsplasmabehandlung hydrophil gemacht. Überschüssige Flüssigkeit wird mit Filterpapier abgetupft, so dass die Proteinlösung einen dünnen Flüssigkeitsfilm über die Löcher bilden kann, der beim Eintauchen leicht vitrifiziert werden kann. Zu den allgemeinen Herausforderungen gehören die Lokalisierung von Partikeln an der Luft-Wasser-Grenzfläche (AWI) und die anschließende Denaturierung 20,21,22 oder die Annahme bevorzugter Orientierungen 23,24,25, die Anhaftung der Partikel an der Kohlenstofffolie, anstatt in die Löcher zu wandern, sowie die Clusterbildung und Aggregation der Partikel innerhalb der Löcher26. Eine ungleichmäßige Eisdicke ist ein weiteres Problem. Dickes Eis kann aufgrund erhöhter Elektronenstreuung zu einem höheren Hintergrundrauschen in den Schliffbildern führen, während extrem dünnes Eis größere Partikel ausschließen kann27.
Um diesen Herausforderungen zu begegnen, wurde eine Vielzahl dünner Trägerfilme verwendet, um Gitteroberflächen zu beschichten, so dass Partikel auf diesen Trägern ruhen können und im Idealfall Wechselwirkungen mit der Luft-Wasser-Grenzfläche vermieden werden. Graphenträger haben sich als sehr vielversprechend erwiesen, zum Teil aufgrund ihrer hohen mechanischen Festigkeit in Verbindung mit ihrem minimalen Streuquerschnitt, der das von der Trägerschicht28 hinzugefügte Hintergrundsignal reduziert. Neben seinem minimalen Beitrag zum Hintergrundrauschen weist Graphen auch eine bemerkenswerte elektrische und thermische Leitfähigkeitauf 29. Es hat sich gezeigt, dass mit Graphen und Graphenoxid beschichtete Gitter eine höhere Partikeldichte, eine gleichmäßigere Partikelverteilung30 und eine geringere Lokalisierung zum AWI22 aufweisen. Darüber hinaus bietet Graphen eine Trägeroberfläche, die weiter modifiziert werden kann, um: 1) die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Gitteroberfläche durch Funktionalisierung31, 32, 33 abzustimmen; oder 2) Kopplungsverbindungsmittel, die die Affinitätsreinigung von Proteinen von Interesse erleichtern 34,35,36.
In diesem Artikel haben wir ein bestehendes Verfahren zur Beschichtung von KryoEM-Gittern mit einer einzigen gleichmäßigen Schicht aus Graphen30 modifiziert. Die Modifikationen zielen darauf ab, die Netzhandhabung im gesamten Protokoll zu minimieren, mit dem Ziel, die Ausbeute und Reproduzierbarkeit zu erhöhen. Darüber hinaus diskutieren wir unseren Ansatz zur Bewertung der Wirksamkeit verschiedener UV/Ozon-Behandlungen, um Gitter vor dem Eintauchen hydrophil zu machen. Dieser Schritt bei der KryoEM-Probenvorbereitung mit graphenbeschichteten Gittern ist von entscheidender Bedeutung, und wir haben festgestellt, dass unsere einfache Methode zur Quantifizierung der relativen Hydrophilie der resultierenden Gitter nützlich ist. Mit diesem Protokoll demonstrieren wir den Nutzen der Verwendung von Graphen-beschichteten Gittern zur Strukturaufklärung, indem wir eine hochauflösende 3D-Rekonstruktion von katalytisch inaktivem S. pyogenes Cas9 im Komplex mit Guide-RNA und Ziel-DNA erstellen.
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Protocol
1. Herstellung von CVD-Graphen
- Bereiten Sie die Graphenätzlösung wie unten beschrieben vor.
- 4,6 g Ammoniumpersulfat (APS) in 20 ml Wasser in molekularer Qualität in einem 50-ml-Becherglas für eine 1-m-Lösung auflösen und mit Aluminiumfolie abdecken. Lassen Sie APS vollständig auflösen, während Sie mit Schritt 1.2 fortfahren.
- Bereiten Sie einen Abschnitt CVD-Graphen für die Methylmethacrylat-Beschichtung (MMA) vor. Schneiden Sie vorsichtig einen quadratischen Abschnitt CVD-Graphen ab. Übertragen Sie das Quadrat in ein Deckglas (50 mm x 24 mm) in einer sauberen Petrischale und decken Sie es während des Transports zum Spin Coater ab.
HINWEIS: Ein Quadrat von 18 mm x 18 mm sollte 25-36 graphenbeschichtete Gitter ergeben.
2. Beschichtung von CVD-Graphen mit MMA
- Stellen Sie die Einstellungen des Spin Coaters auf einen Hochgeschwindigkeitsschleudergang von 60 s bei 2.500 U/min ein. Legen Sie das CVD-Graphen vorsichtig auf das entsprechend dimensionierte Spannfutter.
HINWEIS: Im Idealfall ragt das CVD-Graphen 1-2 mm über den Rand des ausgewählten Spannfutters hinaus, um ein Ansaugen von MMA in das Vakuumsystem zu verhindern. - Drücken Sie die Take/Absorb-Taste , um die Vakuumpumpe einzuschalten und das CVD-Graphen am Spannfutter zu befestigen. Tragen Sie MMA auf die Mitte des CVD-Graphenquadrats auf, schließen Sie den Deckel und drücken Sie sofort die Start/Stopp-Taste . Für ein 18 mm x 18 mm großes Quadrat CVD-Graphen sind 40 μl MMA ausreichend.
- Sobald das Schleudern gestoppt ist, schalten Sie die Vakuumpumpe aus und holen Sie das MMA-beschichtete CVD-Graphen vorsichtig mit einer Pinzette heraus. Drehen Sie das CVD-Graphen so um, dass die MMA-beschichtete Seite nach unten zeigt, und legen Sie es wieder auf das Deckglas.
3. Plasmaätzen der Graphenrückseite
- CVD-Graphen auf dem Deckglas in den Glimmentlaß überführen und 30 s lang bei 25 mA mit einer Pinzette mit flacher Spitze entladen.
- Legen Sie das CVD-Graphen auf dem Deckglas zurück in die Petrischale und decken Sie es während des Transports zum Kupferätzbereich ab. Die MMA-Beschichtung schützt die Graphenschicht auf der Oberseite vor dem Plasmaätzen.
4. Schneiden von MMA-beschichteten CVD-Graphenquadraten in Gittergröße
- Verwenden Sie zwei Pinzetten, um das CVD-Graphenquadrat zu stützen. Achten Sie auf die Ausrichtung des CVD-Graphenquadrats, halten Sie die MMA-Seite nach oben, während Sie an der Pinzette befestigt sind (KRITISCH).
- Schneiden Sie CVD-Graphen in ca. 3 mm x 3 mm große Quadrate. Verwenden Sie für diesen Schritt zwei Sätze umgekehrter Pinzetten, um das CVD-Graphenquadrat mit der rechten Seite nach oben zu halten und in Position zu verankern, und um auch die Kante eines 3 mm x 3 mm großen Quadrats zu halten, nachdem Sie es vom Rest des Quadrats abgeschnitten haben.
5. Auflösen von Kupfersubstrat aus MMA-beschichtetem CVD-Graphen
- Jedes 3 mm x 3 mm große Quadrat vorsichtig in der APS-Lösung schwimmen lassen. Nehmen Sie Kontakt mit der Oberfläche der APS-Lösung auf, bevor Sie jedes Quadrat loslassen. Kippen Sie das Becherglas so, dass jedes Quadrat in einem flachen Winkel in die Lösung gelegt werden kann. Dadurch wird sichergestellt, dass das Quadrat nicht einsinkt.
- Becherglas mit Alufolie abdecken und über Nacht bei 25 °C inkubieren.
6. Entfernen von MMA/Graphen-Filmen aus APS
- Verwenden Sie ein Deckglas mit den Maßen 12 mm x 50 mm und extrahieren Sie die MMA/Graphen-Quadrate aus APS, indem Sie das Deckglas vorsichtig senkrecht in das APS eintauchen und dann das Deckglas seitlich verschieben, so dass es an einem schwimmenden MMA/Graphen-Quadrat anliegt.
- Entfernen Sie das Deckglas vorsichtig und stellen Sie sicher, dass das Quadrat beim Entfernen vollständig an der Seite des Deckglases haftet.
- MMA/Graphen-Quadrate 20 Minuten lang in ein sauberes 50-ml-Becherglas geben, das mit Wasser in molekularer Qualität gefüllt ist. Tauchen Sie das Deckglas mit einem MMA/Graphen-Quadrat, das vertikal befestigt ist, vorsichtig in das Wasser und stellen Sie sicher, dass sich das Deckglas bei der Wechselwirkung mit der Wasseroberfläche vom Deckglas löst. Wiederholen Sie den Vorgang für alle MMA/Graphen-Quadrate.
7. Anhaften von Graphen an Gittern
- Tauche mit einer Pinzette vorsichtig ein Gitter senkrecht ins Wasser, wobei die Kohlenstoffseite zu einem schwimmenden MMA/Graphen-Quadrat zeigt. Sobald Sie mit dem Quadrat in Kontakt gekommen sind, entfernen Sie das Gitter vorsichtig und stellen Sie sicher, dass das Quadrat beim Entfernen vollständig an der Kohlenstoffseite des Gitters haftet. Minimieren Sie die seitliche Bewegung des Gitters, wenn es in Wasser eingetaucht ist, um eine Beschädigung der Gitterquadrate zu vermeiden (KRITISCH).
- Legen Sie die Gitter auf ein sauberes Deckglas mit der MMA/Graphen-Seite nach oben und lassen Sie sie 1 bis 2 Minuten an der Luft trocknen. Deckglas Graphen/MMA-beschichtete Gitter mit einer Pinzette mit flacher Spitze auf eine auf 130 °C eingestellte Heizplatte übertragen.
- Mit der Oberseite einer Petrischale abdecken und 20 Minuten inkubieren lassen. Vom Herd nehmen und 1 bis 2 Min. auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
VORSICHT: Seien Sie vorsichtig, da die Petrischale extrem heiß sein wird.
8. MMA mit Aceton auflösen
- Füllen Sie das gesamte Deckglas in eine Petrischale, die mit 15 ml Aceton gefüllt ist. 30 Min. inkubieren.
- Mit einer sauberen serologischen Glaspipette wird Aceton, in dem die Gitter inkubiert wurden, in einen Abfallbehälter überführt. Geben Sie vorsichtig 15 ml frisches Aceton mit einer sauberen serologischen Glaspipette in die Petrischale. 30 Min. inkubieren.
- Wiederholen Sie diese Waschschritte für insgesamt 3 Acetonwäschen.
9. Entfernen von Restaceton mit Isopropanol
- Nach 3 Acetonwäschen Aceton entfernen und mit einer sauberen serologischen Glaspipette durch 15 ml Isopropanol ersetzen. 20 Min. inkubieren.
- Wiederholen Sie dies 3x für insgesamt 4 Isopropanol-Wäschen. Entfernen Sie vorsichtig die Gitter von Isopropanol und trocknen Sie sie mit einer Pinzette an der Luft auf einem sauberen Deckglas.
HINWEIS: Isopropanol-Reste können das Lösen von Gittern aus der Pinzette erschweren. Das Herstellen eines Kontakts zwischen dem Gitter und dem sauberen Deckglas, bevor das Gitter von der Pinzette gelöst wird, kann dieses Problem lindern. - Verdampfen Sie organische Reststoffe, indem Sie das Deckglas mit graphenbeschichteten Gittern 10 Minuten lang auf eine auf 100 °C eingestellte Heizplatte übertragen. Auf Raumtemperatur abkühlen lassen und bis zur Verwendung unter Vakuum lagern.
10. UV/Ozon-Behandlung von Graphen-beschichteten Gittern
- Platzieren Sie die Gitter mit einer umgekehrten Pinzette vorsichtig in einen sauberen Beleuchtungsbereich eines UV/Ozon-Reinigers, wobei die graphenbeschichtete Seite nach oben zeigt.
- Schieben Sie den Beleuchtungsbereich nach unten und schalten Sie das Gerät ein. Drehen Sie den Zeitregler auf die vorgesehene Behandlungszeit, um mit der UV/Ozon-Behandlung der Gitter zu beginnen.
HINWEIS: Die Behandlungsdauer ist ein einstellbarer Parameter, wobei eine übermäßige Behandlung das Gitter beschädigen kann. Han et al.30 empfehlen eine 10-minütige UV/Ozon-Behandlung, und wir haben auch festgestellt, dass eine 10-minütige Behandlung ausreicht. In Schritt 12 finden Sie eine Anleitung zum Einstellen dieser Behandlungszeit. - Fahren Sie direkt mit dem Eintauchen einer KryoEM-Probe auf die behandelten Gitter fort, indem Sie die Tauchschritte befolgen, wie in Koh et al.37 beschrieben.
ANMERKUNG: Atmosphärische Kohlenwasserstoffe können sich nach der UV/Ozon-Behandlung auf der Gitteroberfläche anreichern und die Hydrophobizität der Graphenoberfläche erhöhen38,39. Um dies zu vermeiden, tauchen Sie die UV/Ozon-behandelten Gitter sofort ein. Es kann vorteilhaft sein, UV/Ozon-Gitter in Chargen zu behandeln, z. B. UV/Ozon sechs Gitter zu behandeln und diese sechs Gitter sofort einzutauchen, dann eine zweite Charge von Gittern mit UV/Ozon zu behandeln, gefolgt von Eintauchen der zweiten Charge.
11. Aufnahme eines Beugungsbildes
- Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop gut abgestimmt ist und eine parallele Beleuchtung eingerichtet ist, und stellen Sie die endgültige Defokussierung auf -0,2 μm ein.
- Setzen Sie den Leuchtstoffschirm und die Strahlblende vollständig ein. Wechseln Sie in den Beugungsmodus, um Beugungspunkte deutlich zu visualisieren.
- Erfassen Sie ein Bild mit einer CCD-Kamera und werten Sie es mit einer Bildanalysesoftware aus.
ANMERKUNG: Die am leichtesten zu beobachtenden und identifizierbaren Beugungsflecken, die von einer Graphen-Monolage erzeugt werden, sind 6 Flecken, die einer Ortsfrequenz von 2,13 Å entsprechen. Verwenden Sie ein Messwerkzeug, um den Abstand von der Mitte des gebeugten Strahls zu einem dieser Beugungspunkte in reziproken Einheiten abzuschätzen. Insbesondere 2,13 Å
0,47 Å-1.
0,47 Å-1.12. Bewertung der Gitterhydrophilie
- Bereiten Sie das Imaging-Setup vor. Suchen Sie einen Telefonständer, eine Tischbildfläche, ein Telefon mit Kamera, ein Deckglas und eine Paraffinfolie. Die hier gezeigten Bilder wurden mit einem Telefonständer und einer Tischbildfläche aufgenommen, die mit den bereitgestellten .stl-Dateien in 3D gedruckt wurden, was zu leichter reproduzierbaren und quantifizierbaren Kontaktwinkelmessungen führte (Ergänzende Abbildung 1A).
- Legen Sie ein Deckglas auf die flache Oberfläche, schneiden Sie dann ein Quadrat von 1 cm x 1 cm Paraffinfolie ab und legen Sie es auf das Deckglas. Legen Sie das Telefon auf den Telefonständer und richten Sie es so aus, dass sich die Kamera in der Ebene mit dem Deckglas befindet. Sichern Sie das Telefon in dieser Position mit Gummibändern (Ergänzende Abbildung 1B). Nehmen Sie ein Beispielfoto auf, um zu überprüfen, ob die Kamera auf die Bildoberfläche ausgerichtet ist.
- Legen Sie direkt nach der UV/Ozon-Behandlung von graphenbeschichteten Gittern ein einzelnes Gitter auf das Quadrat der Paraffinfolie auf dem Deckglas. Stellen Sie sicher, dass die Graphenseite nach oben zeigt. Geben Sie mit einer Pipette einen 2 μl Wassertropfen in die Mitte der Gitteroberfläche und machen Sie sofort ein Foto.
HINWEIS: Wiederholen Sie diesen Schritt nach: i) gewünschten Intervallen der UV/Ozon-Behandlung, um eine ausreichende Behandlungsdauer zu bestimmen; oder ii) gewünschte Zeitintervalle nach der UV/Ozon-Behandlung, um zu messen, wie lange die Gitteroberfläche nach der Behandlung ihren hydrophilen Charakter beibehält. - Berechnen Sie Kontaktwinkel aus Fotos, indem Sie sie in ImageJ43 importieren und das Kontaktwinkel-Plugin verwenden.
13. Einzelpartikelanalyse des komplexen dCas9-Datensatzes
HINWEIS: Die gesamte in diesem Protokoll beschriebene Bildverarbeitung wurde mit cryoSPARC Version 4.2.1 durchgeführt.
- Vorverarbeiten von Filmen mit den Aufträgen "Patch Motion Correction" und "Patch CTF Estimation". Führen Sie die Partikelauswahl mit dem Blob-Auswahlauftrag durch, indem Sie einen kugelförmigen Blob mit einem Durchmesser von 115 Å bis 135 Å verwenden.
- Extrahieren Sie Partikel mit dem Auftrag Extrahieren aus Schliffbildern, wobei der normalisierte Korrelationskoeffizient (NCC) und die Leistungsschwellen verwendet werden, was zu etwa 200-300 Partikeln pro Mikroskopbild führt. Beachten Sie, dass geeignete Schwellenwerte und die daraus resultierende Partikelzahl variieren können, und Benutzer sollten die Pickqualität anhand einer Reihe von Schliffbildern überprüfen, um geeignete Bedingungen zu identifizieren.
- Führen Sie anfängliche Rekonstruktionen mit mehreren Klassen mithilfe des Ab-initio-Rekonstruktionsauftrags durch, für den drei Klassen erforderlich sind. Zwei der drei Klassen werden wahrscheinlich Nicht-Cas9-Partikel enthalten, einschließlich Oberflächenverunreinigungen. Wählen Sie für die weitere Verarbeitung die Klasse aus, die dCas9 ähnelt.
HINWEIS: Zusätzliche Runden der Multiklassen-Ab-initio-Rekonstruktion oder der heterogenen Verfeinerung können angewendet werden, um den Partikelstapel weiter zu verfeinern. - Führen Sie die 3D-Verfeinerung mit dem Auftrag "Ungleichmäßige Verfeinerung" durch und wählen Sie Standardparameter aus. Schätzen Sie die Auflösung der Rekonstruktion mithilfe der Validierungs- (FSC) und ThreeDFSC-Aufträge unter Verwendung der Karten und Masken aus der endgültigen 3D-Verfeinerung.
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Representative Results
Die erfolgreiche Herstellung von graphenbeschichteten KryoEM-Gittern unter Verwendung der hier beschriebenen Ausrüstung (Abbildung 1) und des Protokolls (Abbildung 2) führt zu einer Monoschicht aus Graphen, die die Folienlöcher bedeckt, was durch ihr charakteristisches Beugungsmuster bestätigt werden kann. Um die Proteinadsorption an die Graphenoberfläche zu fördern, kann die Oberfläche durch UV/Ozon-Behandlung hydrophil gemacht werden, indem sauerstoffhaltige funktionelle Gruppen installiert werden. Kohlenwasserstoffverunreinigungen in der Luft können jedoch bereits 5 Minuten nach der UV/Ozon-Behandlung an der Graphenoberfläche adsorbieren und diesem Effekt entgegenwirken 38,39. Wichtig ist, dass sowohl die Dauer der UV/Ozon-Behandlung als auch die Zeit zwischen der Behandlung und dem Eintauchen die Probenqualität beeinflussen können. Wir demonstrieren diese Effekte mit einer einfachen Methode zur Beurteilung des hydrophilen Charakters des beschichteten Gitters anhand des Oberflächenkontaktwinkels (Abbildung 3; siehe Schritt 12).
Um die Verwendung von Graphenträgern in der Einzelpartikel-KryoEM zu demonstrieren, haben wir eine katalytisch inaktive RNA-gesteuerte DNA-Endonuklease S. pyogenes Cas9 (H10A; C80S; C574S; H840A)40 im Komplex mit sgRNA und Ziel-DNA zu Graphen-beschichteten Gittern, sammelte einen KryoEM-Datensatz aus diesen Gittern und führte eine Einzelpartikelanalysedurch 7. Graphenbeschichtete Gitter enthielten durchweg ~300 Partikel pro mikroskopischer Aufnahme bei einer Vergrößerung von 0,654 Å/pix unter Verwendung eines 300-keV-Mikroskops, das mit einem K3-Direktelektronendetektor ausgestattet war (Abbildung 4A-E). Eine 8-stündige Datenerfassungssitzung mit einer Bühnenneigung von +18° ergab 2.963 Filme und 324.439 Partikel in einem endgültigen kuratierten Stapel. Unter Verwendung dieser Partikel erzeugten wir eine 3D-Rekonstruktion, die nach Verfeinerung eine Dichtekarte mit einer geschätzten Auflösung von 2,7 Å und einer angemessenen Winkelabtastung ergab, um anisotrope Artefakte zu vermeiden (Abbildung 5). Ein atomares Modell (PDB 6o0z)41 wurde an diese Karte angedockt und mit ISOLDE42 verfeinert. Die Reste R63-L82 dieses angepassten Atommodells sind mit der verfeinerten KryoEM-Dichtekarte dargestellt, die die aufgelöste Seitenkettendichte hervorhebt (Abbildung 5B). Beim Vergleich der gleichen Probe und Konzentration (250 ng/μl), die auf identische Gitter ohne Graphen angewendet wurden, wurden keine Partikel beobachtet (Abbildung 4F,G). Diese Beobachtung unterstreicht die Wirksamkeit des Graphenträgers bei der Visualisierung von Partikeln aus niedrig konzentrierten Proben.
Abbildung 1: Benötigte Ausrüstung. Laborgeräte und -werkzeuge, die für die Herstellung von Graphengittern unter Verwendung des in diesem Artikel beschriebenen Protokolls erforderlich sind. Artikel und deren Menge werden angezeigt und entsprechend beschriftet. Zu den erforderlichen Reagenzien, die nicht aufgeführt sind, gehören: CVD-Graphen, Methylmethacrylat EL-6 (MMA), Ammoniumpersulfat (APS), Aceton, Isopropanol, Ethanol, Wasser in molekularer Qualität. Zu den erforderlichen Instrumenten, die nicht abgebildet sind, gehören: Spin Coater, Glow Disloader, Heizplatte, Vakuum-Exsikkator und Thermometer. Alle erforderlichen Artikel sind in der Materialtabelle aufgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Schematische Darstellung des Herstellungsprozesses von Graphengittern. Graphen wird mit einem Spin Coater mit einer dünnen Schicht aus Methylmethacrylat EL-6 (MMA) beschichtet (Schritt 2). Graphen auf der gegenüberliegenden Seite der Kupferfolie wird durch Plasmaätzen entfernt (Schritt 3). Ammoniumpersulfat (APS) wird dann verwendet, um das Kupfer wegzuätzen (Schritte 4-5). Die MMA-Graphen-Folie wird auf die Gitteroberfläche gelegt (Schritt 6-7). Schließlich wird MMA während einer Reihe von Wäschen mit organischen Lösungsmitteln gelöst (Schritte 8-9). Die über den Pfeilen angegebenen Schritte entsprechen den nummerierten Schritten, die im Abschnitt "Protokolle" beschrieben sind. Diese Methode wurde von Han et al.30 übernommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Bewertung der Hydrophilie der Gitteroberfläche in Abhängigkeit von der Dauer der UV/Ozon-Behandlung und der verstrichenen Nachbehandlungszeit. (A) Gemessene Kontaktwinkel, aufgetragen in Abhängigkeit von der Behandlungsdauer. Verringerte Kontaktwinkel sind konsistent mit erhöhter Hydrophilie (unbehandeltes Gitter: 78°; 20 min: 37°). Die Kontaktwinkel wurden mit Bild J43 gemessen. (B) Gemessene Kontaktwinkel, aufgetragen in Abhängigkeit von der Zeit, Nachbehandlung (0 min: 45°; 60 min: 74°). Das im Zeitverlauf nach der Behandlung gemessene Gitter wurde 12 Minuten lang mit UV/Ozon behandelt, wie durch ein Sternchen gekennzeichnet. Jede Messung nach der Behandlung wurde auf demselben Gitter durchgeführt, wobei die Probe zwischen den Messungen durch Dochtung entfernt wurde. Es wird erwartet, dass die gemessenen spezifischen Kontaktwinkel in Abhängigkeit von den Umgebungsbedingungen im Labor variieren, und wir empfehlen den Anwendern, ähnliche Experimente in ihren Labors durchzuführen, um geeignete Bedingungen zu ermitteln. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentative Bilder von graphenbeschichteten und unbeschichteten Kontrollgittern. (A-C) Repräsentative Atlas-, Gitterquadrat- und Folienlochbilder von graphenbeschichteten löchrigen Kohlenstoffgittern, aufgenommen mit einem 300 keV-Mikroskop, das mit einem K3-Direktelektronendetektor ausgestattet ist. (D) KryoEM-Aufnahme von S. pyogenes dCas9 im Komplex mit sgRNA und Ziel-DNA (Komplex bei einer Konzentration von 250 ng/μl) auf einem graphenbeschichteten löchrigen Kohlenstoffgitter. (E) Beugungsbild aus dem Raster, abgebildet in Panels (A-D). Der orangefarbene Pfeil zeigt eine Position an, die einer Ortsfrequenz von 2,13 Å entspricht. Eine identische Probe wie in Tafel (D) wurde auf (F) UV/Ozon-Behandlung und (G) Glühen entladene löchrige Kohlenstoffgitter ohne Graphen angewendet. Die angezeigten KryoEM-Mikroskopaufnahmen sind repräsentativ für jedes Gitter und zeigen keine Partikel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: CryoEM-Rekonstruktion eines Cas9-Komplexes aus graphenbeschichteten Gittern. (A) CryoEM-Dichtekarte aus der 3D-Rekonstruktion des S. pyogenes dCas9 im Komplex mit sgRNA und Ziel-DNA. (B) Reste R63-L82 aus einem angepassten Modell werden innerhalb der semitransparenten KryoEM-Dichte dargestellt, wobei eine Teilmenge der sichtbaren Seitenketten markiert ist. (C) Fourier-Shell-Korrelation (FSC)-Kurven der unmaskierten, locker und eng maskierten Karten. (D) Histogramm und gerichtetes FSC-Diagramm basierend auf der 3DFSC-Methode23. Weitere Informationen finden Sie in Abbildung 2 und Schritt 13. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1: Kontaktwinkel-Abbildungsständer. (A) Ein 3D-gedrucktes Kamerastativ und eine Tischhalterung, um die Kamera in einer Position zu befestigen, die die Kamera in der Ebene mit dem Deckglas ausrichtet. (B) Das Gitter wird auf das Deckglas auf ein 1 cm x 1 cm großes quadratisches Stück Paraffinfolie gelegt. Die abgebildete Halterung wurde mit den mitgelieferten .stl-Dateien (Supplementary Coding File 1 und Supplementary Coding File 2) 3D-gedruckt und kann leicht an die meisten Geräte angepasst werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Bildverarbeitungs-Workflow. Verarbeitungs-Workflow für den dCas9-Komplex. Auftragsnamen, Auftragsdetails und nicht standardmäßige Parameter (kursiv) werden angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Codierungsdatei 1: Stereolithographie-CAD-Dateien im STL-Format werden bereitgestellt, um den 3D-Druck des Kamerastativs (camera_stand_v1.stl) zu erleichtern. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Codierungsdatei 2: Stereolithographie-CAD-Dateien im STL-Format werden bereitgestellt, um den 3D-Druck der Tischhalterung (slide_mount_v1.stl) zu erleichtern .
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Discussion
Die CryoEM-Probenvorbereitung bringt eine Vielzahl technischer Herausforderungen mit sich, wobei die meisten Arbeitsabläufe erfordern, dass Forscher zerbrechliche Gitter manuell mit äußerster Sorgfalt manipulieren, um sie nicht zu beschädigen. Darüber hinaus ist die Zugänglichkeit einer Probe für die Vitrifikation unvorhersehbar; Partikel interagieren häufig mit der Luft-Wasser-Grenzfläche oder mit der festen Trägerfolie, die die Gitter überlagert, was dazu führen kann, dass Partikel bevorzugte Orientierungen annehmen oder nicht in die Abbildungslöcher eindringen, es sei denn, es werden sehr hohe Proteinkonzentrationen angewendet24. Die Überlagerung von löchrigen KryoEM-Gittern mit einer kontinuierlichen Monoschicht aus Graphen hat sich als äußerst vielversprechend erwiesen, um die Partikelverteilung auf mikroskopischen Aufnahmen zu verbessern, die Partikelanzahl bei niedrigen Konzentrationen zu erhöhen und bevorzugte Orientierungen zu reduzieren, die durch Wechselwirkungen an der Luft-Wasser-Grenzfläche verursacht werden30.
Eine Einschränkung bestehender Graphen-Beschichtungsprotokolle für KryoEM-Gitter sind die umfangreichen manuellen Manipulationen, die für den Beschichtungsprozess erforderlich sind, was die Qualität beeinträchtigen und die Variabilität von Gitter zu Gitter erhöhen kann. In dieser Arbeit beschreiben wir leichte Modifikationen eines bestehenden Protokolls zur Beschichtung von KryoEM-Gittern mit einer Monoschicht ausGraphen 30.
Zu den kritischen Schritten innerhalb dieses Protokolls gehören die Beschichtung von CVD-Graphen mit MMA, die Auflösung des CVD-Graphen-Kupfersubstrons in APS und die Anwendung von Graphen auf KryoEM-Gitter. Wir haben das ursprüngliche Protokoll modifiziert, um die manuellen Manipulationen der beschichteten Gitter zu minimieren, indem wir die Lösungsmittel innerhalb derselben Petrischale austauschen, anstatt die Gitter für jeden Waschschritt einzeln zu handhaben und in einen neuen Lösungsmittelbehälter zu übertragen, wodurch die Ausbeute an intakten, qualitativ hochwertigen, graphenbeschichteten Gittern erhöht werden soll. Obwohl wir uns bemüht haben, die Manipulation von Graphen-beschichteten Gittern auf ein Minimum zu reduzieren, erkennen wir an, dass die manuelle Anwendung einzelner Graphenquadrate auf KryoEM-Gitter von Natur aus eine Herausforderung darstellt und dass eine gewisse Variabilität von Gitter zu Gitter zu erwarten ist.
Graphenbeschichtete Gitter erfordern in der Regel eine UV/Ozon-Behandlung, um die Oberfläche für die Probenanwendung hydrophil zu machen. Die Dauer der UV/Ozon-Behandlung und die Zeit, die nach der Behandlung und vor dem Eintauchen verstrichen ist, können sich auf die Hydrophilie des Gitters und letztendlich auf die Probenqualität auswirken. Zusätzlich zum Gitterherstellungsprotokoll beschreiben wir eine Technik zur Beurteilung der Gitterhydrophilie nach UV/Ozon-Behandlung. Bei dem Verfahren wird der Oberflächenkontaktwinkel einer aufgetragenen Probe als Indikator für den hydrophilen Charakter des beschichteten Gitters20,44 verwendet. Es werden Entwürfe für den kostengünstigen 3D-Druck einer benutzerdefinierten Gitterbildhalterung bereitgestellt, die eine einfache Handykamera verwendet, um den Kontaktwinkel der Oberfläche zu schätzen.
Abschließend beschreiben wir die Ergebnisse, die durch die Verwendung dieses Protokolls zur Bestimmung der 2,7 Å KryoEM-Struktur der katalytisch inaktiven RNA-gesteuerten DNA-Endonuklease, S. pyogenes Cas9 im Komplex mit sgRNA und Ziel-DNA40, erzielt wurden. In Abwesenheit von Graphen wurden in den verwendeten komplexen Konzentrationen (250 ng/μl) keine Partikel in Folienlöchern beobachtet. Im Gegensatz dazu enthielten graphenbeschichtete Gitter Partikel mit hoher Dichte, was eine einfache 3D-Rekonstruktion einer hochauflösenden Karte aus 2.961 Mikroaufnahmen ermöglichte. Zusammengenommen unterstreichen diese Daten den Wert der Anwendung von Graphen-Monoschichten auf KryoEM-Gitter für die Einzelpartikelanalyse.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Konflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Die Proben wurden in der CryoEM Facility in MIT.nano mit Mikroskopen präpariert und abgebildet, die dank der Arnold and Mabel Beckman Foundation erworben wurden. Kontaktwinkel-Bildgebungsgeräte wurden im MIT Metropolis Maker Space gedruckt. Wir danken den Laboren von Nieng Yan und Yimo Han sowie den Mitarbeitern von MIT.nano für ihre Unterstützung bei der Einführung dieser Methode. Insbesondere danken wir Dr. Guanhui Gao und Dr. Sarah Sterling für ihre aufschlussreichen Diskussionen und ihr Feedback. Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse R01-GM144542, 5T32-GM007287 und NSF-CAREER-Zuschüsse 2046778 unterstützt. Die Forschung im Davis-Labor wird von der Alfred P. Sloan Foundation, dem James H. Ferry Fund, der MIT J-Clinic und der Whitehead Family unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250 mL beaker (3x) | Fisher | 02-555-25B | |
| 50 mL beaker (2x) | Corning | 1000-50 | |
| Acetone | Fisher | A949-4 | |
| Aluminum foil | Fisher | 15-078-292 | |
| Ammonium persulfate | Fisher | (I17874 | |
| Coverslips 50 mm x 24 mm | Mattek | PCS-1.5-5024 | |
| CVD graphene | Graphene Supermarket | CVD-Cu-2x2 | |
| easiGlow discharger | Ted-Pella | 91000S | |
| Ethanol | Millipore-Sigma | 1.11727 | |
| Flat-tip tweezers | Fisher | 50-239-60 | |
| Glass cutter | Grainger | 21UE26 | |
| Glass petri plate and cover | VWR | 75845-544 | |
| Glass serological pipette | Fisher | 13-676-34D | |
| Grid Storage Case | EMS | 71146-02 | |
| Hot plate | Fisher | 07-770-108 | |
| Isopropanol | Sigma | W292907 | |
| Kimwipe | Fisher | 06-666 | |
| Lab scissors | Fisher | 13-806-2 | |
| Methyl-Methacrylate EL-6 | Kayaku | MMA M310006 0500L1GL | |
| Molecular grade water | Corning | 46-000-CM | |
| Negative action tweezers (2x) | Fisher | 50-242-78 | |
| P20 pipette | Rainin | 17014392 | |
| P200 pipette | Rainin | 17008652 | |
| Parafilm | Fisher | 13-374-12 | |
| Pipette tips | Rainin | 30389291 | |
| Quantifoil grids with holey carbon | EMS | Q2100CR1 | |
| Spin coater | SetCas | KW-4A | with chuck SCA-19-23 |
| Straightedge | ULINE | H-6560 | |
| Thermometer | Grainger | 3LRD1 | |
| UV/Ozone cleaner | BioForce | SKU: PC440 | |
| Vacuum desiccator | Thomas Scientific | 1159X11 | |
| Whatman paper | VWR | 28297-216 |
References
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