Summary
Este protocolo describe el establecimiento de un modelo ex vivo tridimensional (3D) de la interacción entre la célula cancerosa y el epiplón. El modelo proporciona una plataforma para dilucidar los mecanismos protumorales dentro del nicho adiposo y para probar nuevas terapias.
Abstract
El cáncer de ovario es la neoplasia maligna ginecológica más mortal. El epiplón desempeña un papel clave en la provisión de un microambiente de apoyo a las células de cáncer de ovario metastásico, así como señales inmunomoduladoras que permiten la tolerancia tumoral. Sin embargo, tenemos modelos limitados que imitan de cerca la interacción entre las células de cáncer de ovario y los tejidos ricos en tejido adiposo. Para comprender mejor los mecanismos celulares y moleculares por los cuales el epiplón proporciona un microambiente protumoral, desarrollamos un modelo único ex vivo en 3D de la interacción entre la célula cancerosa y el epiplón. Utilizando epiplón humano, podemos cultivar células de cáncer de ovario dentro de este microambiente rico en tejido adiposo y controlar los factores responsables del crecimiento tumoral y la regulación inmunitaria. Además de proporcionar una plataforma para el estudio de este microambiente tumoral rico en adiposo, el modelo proporciona una excelente plataforma para el desarrollo y la evaluación de nuevos enfoques terapéuticos para atacar las células cancerosas metastásicas en este nicho. El modelo propuesto es fácil de generar, económico y aplicable a investigaciones traslacionales.
Introduction
El cáncer de ovario es la neoplasia maligna ginecológica más mortal en todo el mundo1. El riesgo de por vida de desarrollar este cáncer es de aproximadamente 1 en 70, con una mediana de edad de diagnóstico de 63 años2. Las neoplasias malignas primarias de ovario se clasifican histológicamente como epiteliales o no epiteliales. Los cánceres epiteliales de ovario (COE) representan más del 90% de los tumores, y el subtipo más común es el carcinoma seroso de alto grado (HGSC), que representa aproximadamente el 70-80% de los COE. En la actualidad, no existen métodos de cribado eficaces para detectar la enfermedad de forma precoz. Por lo tanto, la mayoría de los pacientes son diagnosticados en una etapa avanzada (es decir, la Fédération Internationale de Gynécologie et d'Obstétrique [FIGO] etapa III o IV) después de que el cáncer se ha diseminado por toda la cavidad peritoneal2.
El tratamiento estándar de primera línea es la cirugía citorreductora para extirpar toda la enfermedad macroscópica visible, seguida de quimioterapia adyuvante basada en platino para destruir cualquier enfermedad microscópica residual. Si bien ha habido muchos avances en el tratamiento del cáncer de ovario en las últimas dos décadas, aproximadamente el 70% de las pacientes con enfermedad avanzada recaerán dentro de los 3 años posterioresal tratamiento. Dado el mal pronóstico general de estos pacientes, los esfuerzos de investigación traslacional en curso y futuros en EOC tienen como objetivo identificar biomarcadores para la detección temprana, prevenir la metástasis, mejorar las terapias actuales para evadir la resistencia y desarrollar nuevos tratamientos personalizados contra el cáncer.
La metástasis generalizada dentro de la cavidad peritoneal y su quimiorresistencia asociada son dos de las principales limitaciones para la mejora del tratamiento de las pacientes con cáncer de ovario 4,5. El epiplón, una estructura grasosa parecida a un delantal que cuelga desde el estómago sobre los intestinos, es un sitio principal de metástasis de cáncer de ovario 6,7. Además de su función como barrera física, se ha demostrado que el epiplón tiene capacidades regenerativas y angiogénicas y posee actividades inmunitarias, que en conjunto promueven la vascularización, aceleran la cicatrización de heridas y limitan la infección8. Contiene una alta concentración de células madre que pueden diferenciarse en varios tipos de células y pueden ayudar a reparar los tejidos dañados. El epiplón puede inflamarse en respuesta a una lesión o infección, lo que desencadena la migración de las células inmunitarias al sitio dela lesión. Estas células inmunitarias liberan factores de crecimiento y otras moléculas que ayudan a promover la reparación y regeneración del tejido dañado. Las células inmunitarias, como los macrófagos, los linfocitos y las células plasmáticas, localizadas en el epiplón son estructuras conocidas como "manchas lechosas", que se encargan de detectar y atacar a los patógenos y de regular la inmunidad peritoneal. También se ha demostrado que el epiplón desempeña un papel en la inducción de la tolerancia inmunitaria10, que es la capacidad del sistema inmunitario para tolerar los autoantígenos y no atacar los tejidos sanos. Sin embargo, las mismas actividades relacionadas con el sistema inmunitario también están involucradas en las respuestas patológicas, como el crecimiento de tumores de epiplón, la metástasis y el escape de la vigilancia inmune 9,11. Estudios previos de nuestro laboratorio y de otros han demostrado un papel único y activo del microambiente adiposo en la inhibición de las respuestas inmunes antitumorales y en la adquisición de quimiorresistencia12,13,14. Desafortunadamente, tenemos información limitada sobre los mecanismos celulares y moleculares por los cuales el epiplón proporciona un microambiente protumoral.
Para comprender mejor las interacciones entre las células cancerosas y el epiplón, se desarrolló un sistema de cultivo en 3D que consiste en células de cáncer de ovario humano y explantes de epiplón derivados de pacientes. El protocolo descrito aquí representa un nuevo modelo ex vivo de carcinomatosis peritoneal. Este modelo imita la progresión natural de la tumorigénesis del cáncer de ovario en este tejido rico en adiposo. El modelo propuesto es fácil de generar, económico y potencialmente aplicable a las investigaciones traslacionales en la investigación del cáncer de ovario.
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Protocol
El siguiente protocolo de investigación fue revisado y aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la Universidad Estatal de Wayne. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes antes de la cirugía. La figura 1 ilustra los tres pasos generales de este protocolo.
1. Preparación del tejido del epiplón humano
- Preparar medios de cultivo de epiplón (DMEM/F12 + 10% de suero fetal bovino + 1% de penicilina-estreptomicina) y conservar a 4 °C. Alícuota 30-40 mL de este medio en un tubo cónico estéril de 50 mL o en un recipiente de muestras quirúrgicas.
- Obtener muestras quirúrgicas de una biopsia de epiplón o de una cirugía de omentectomía. Sumerja la muestra estéril en un medio de cultivo de epiplón inmediatamente después de la extracción en el quirófano. Si el flujo de trabajo no lo permite, coloque la muestra en un medio de cultivo de epiplón lo antes posible. Transfiera la muestra colocándola en hielo y guárdela a 4 °C hasta su procesamiento.
NOTA: El tamaño de la muestra de epiplón extraída determinará la cantidad de tejido trabajable. - Procese la muestra de epiplón dentro de 1-2 h después de la recolección utilizando una campana de flujo laminar. Asegúrese de que todos los materiales y herramientas estén estériles o esterilizados.
- Retire el epiplón del recipiente de recolección y transfiéralo a una placa de cultivo de 100 mm. Sumerja la muestra en 1 solución salina tamponada con fosfato (1 PBS) y lave suavemente la muestra para eliminar cualquier coágulo de sangre o desecho.
- Cortar el tejido en trozos (0,5 cm x 0,5 cm o 100-200 mg; Figura 2A) utilizando unas tijeras quirúrgicas pequeñas o un bisturí de 10-15 mm. Use pinzas quirúrgicas pequeñas para ayudar a manipular el tejido y evitar aplastar el epiplón. Si se utilizó un dispositivo de energía para extirpar quirúrgicamente la muestra de epiplón, evite usar el tejido distorsionado en el borde sellado.
- Coloque cada pieza de epiplón cortada en pocillos individuales de una placa de cultivo de 24 pocillos y llene los pocillos con 500 μL de medio de cultivo de epiplón o hasta un volumen que sea suficiente para cubrir el epiplón sin permitir que la pieza de epiplón flote sobre el piso del pocillo (Figura 2B).
- Almacenar los trozos de epiplón en medios de cultivo frescos a 4 °C hasta que estén listos para la inyección.
2. Preparación de células de cáncer de ovario
- Cultivar células de cáncer de ovario humano en un matraz de cultivo de 75cm2 a 37 °C y 5% de CO2 a al menos 75% de confluencia el día de la recolección del epiplón.
NOTA: Este protocolo utiliza células de cáncer de ovario humano OCSC1-F2 mCherry positivas descritas anteriormente15,16,17,18. Se puede modificar a cualquier línea celular cancerosa marcada con una señal de fluorescencia. - Prepare las células dentro de una campana de flujo laminar inmediatamente después de la recolección de la muestra de epiplón. Asegúrese de que todos los materiales y herramientas estén estériles o esterilizados.
- Añadir 10 ml de 1x PBS estéril al matraz de cultivo y lavar las células meciendo suavemente el matraz. Retire el PBS 1x y luego agregue 3 ml de tripsina-EDTA al 0,05%.
- Meca suavemente el matraz de cultivo para cubrir todas las células y, a continuación, colóquelo en una incubadora (37 °C y 5% de CO2) durante no más de 5 minutos. Golpee el matraz de cultivo para separar completamente las células y luego neutralice la tripsina agregando 3 ml de medio de cultivo de epiplón.
- Mezcle la suspensión celular pipeteando y luego transfiera la suspensión a un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar la suspensión durante 5 min a 1.200 x g a 24 °C. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo celular en 6 ml de medio de cultivo de epiplón fresco.
- Cuente las células con un hemacitómetro. Diluir la suspensión celular a al menos 100.000 células por cada 100-200 μL de suspensión. Este es el volumen de inyección en cada pieza cortada de epiplón.
- Transfiera un número adecuado de células a un nuevo matraz de cultivo para continuar el paso de las células.
3. Inyección de células de cáncer de ovario
- Use una jeringa de 1 ml para extraer la suspensión celular y luego coloque una aguja de 26 G. No extraiga la suspensión celular con la aguja, ya que esto puede fragmentar las células.
- Use unas pinzas quirúrgicas pequeñas para levantar un pedazo de epiplón cortado. Transfiera el epiplón a un plato estéril de trabajo separado para facilitar la inyección. Perforar suavemente el epiplón con la punta de la aguja e inyectar un pequeño volumen de suspensión celular en el tejido (Figura 2C).
- Repita la inyección en varias áreas de epiplón hasta un volumen total de al menos 100 μL o 100.000 células. Tenga en cuenta que gran parte de la suspensión celular puede parecer que se acumula alrededor del espécimen. Si existe preocupación con respecto a la calidad de la inyección, repita la inyección o inyecte un volumen mayor de suspensión celular en la muestra.
- Regrese las muestras de epiplón inyectadas a cada pocillo de una placa de cultivo de 24 pocillos. Tenga en cuenta que el volumen de los medios de cultivo de epiplón está a un nivel que cubre el epiplón sin permitir que flote. Manipule con cuidado la placa y colóquela dentro de una incubadora (37 °C y 5% de CO2).
- OPCIONAL: Use Matrigel (matriz de membrana basal) para suspender el tejido del epiplón en una matriz sólida para permitir una inyección más fácil y una administración de suspensión celular más concentrada.
- Descongelar la matriz de la membrana basal a 4 °C y mezclar en una proporción de 1:1 con medios de cultivo de epiplón inmediatamente antes de su uso. Almacenar la mezcla de la matriz de membrana basal en hielo o a 4 °C hasta la inyección. Llene los pozos vacíos con suficiente mezcla de matriz de membrana basal para sumergir un trozo cortado de epiplón.
- Coloque las muestras en la mezcla de matriz de membrana basal y luego coloque la placa de cultivo de 24 pocillos en una incubadora (37 °C y 5% de CO2) durante 20 min. Una vez que la mezcla se haya solidificado, continúe con la inyección como se describió anteriormente.
- Confirme que la inyección se ha realizado correctamente mediante imágenes fluorescentes. Asegúrese de que se visualice una raya de señal fluorescente en los sitios de inyección (Figura 2D). Tenga en cuenta que el número real de células adheridas al epiplón después de la inyección es impredecible.
4. Cocultivo de epiplón humano y células de cáncer de ovario
- Cambie el medio cada 48-72 h añadiendo 500-2000 μL de medio de cultivo de epiplón fresco. No pipetee los medios directamente sobre el tejido del epiplón, ya que esto puede desplazar las células cancerosas. Tenga en cuenta que si el color del medio cambia a amarillo, cambie el medio.
NOTA: La frecuencia del cambio de medio dependerá del volumen de medios utilizados y de la trayectoria de crecimiento de las células cancerosas. Una vez que las células cancerosas han sembrado el epiplón, ya no es importante si el fragmento de epiplón está flotando o no. - OPCIONAL: Si se utilizara una matriz de membrana basal, la matriz normalmente se disolvería en el momento del primer cambio de medio.
- Monitorear el crecimiento de los tumores de cáncer de ovario mediante imágenes fluorescentes. La frecuencia de las imágenes queda a discreción del investigador. Anticipe la evidencia de tumores pequeños a los 14 días (Figura 3A-C). Los resultados pueden variar dependiendo de la calidad de la inyección.
- Finalice el experimento en función del punto de conexión del experimento.
NOTA: Se ha observado crecimiento tumoral e integridad del tejido epiplático después de 50 días.
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Representative Results
El establecimiento exitoso de células de cáncer de ovario en especímenes de epiplón fue evidente alrededor del día 14 (Figura 3A-C). Se prepararon e inyectaron al menos 24 réplicas por espécimen recolectado para permitir una mayor experimentación. El crecimiento tumoral se monitorizó mediante la toma de imágenes fluorescentes (Figura 3D,E). Las imágenes tuvieron que ser interpretadas cuidadosamente, ya que una monocapa de células cancerosas también crecía en el fondo de cada pocillo que no estaba adherida al epiplón. Preferimos tomar imágenes del epiplón cuando estaba suspendido en el medio para evitar la superposición de señales fluorescentes con la monocapa de células cancerosas.
La ausencia de una señal fluorescente en el día 14 puede considerarse como inyecciones fallidas. Se observó que las células cancerosas se diseminaban inicialmente por la superficie del epiplón durante los primeros 7 días, pero con el tiempo se congregaban para formar tumores (Figura 3A-D). Una medida indirecta de la carga tumoral entre las muestras fue la velocidad a la que los medios de cultivo de epiplón cambiaron de color de rojo a amarillo (Figura 3F). Utilizamos imágenes fluorescentes, revisión histológica e inspección macroscópica para confirmar el crecimiento tumoral y la viabilidad del tejido omental después de 50 días de cocultivo (Figura 4).
Figura 1: Ilustración de los pasos generales del protocolo. (A) Paso 1: Preparación del epiplón; (B) Paso 2: inyección de células cancerosas; (C) Paso 3: establecimiento del microambiente de células cancerosas y epiplón. (Figura preparada en BioRender.com). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Preparación e inyección de células cancerosas en el epiplón . (A) El epiplón se corta en trozos de 1x1 cm. (B) Cada pieza se coloca en un pocillo de una placa de 24 pocillos y se cubre con 500 μL de medio. (C) Inyección de células cancerosas en piezas de epiplón. (D) Se observa una veta de células cancerosas fluorescentes después de la inyección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imágenes representativas después de 14 y 25 días de co-cultivo. (A-C) Imágenes representativas después de 14 días de co-cultivo: (A) fase, (B) canal mCherry, (C) fusionado. (D-E) Imágenes representativas después de 25 días de co-cultivo. (F) El cambio en el color del medio de rosa a amarillo es una indicación de la inyección exitosa de células cancerosas y el establecimiento de un cocultivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Morfología macroscópica y tinción de hematoxilina y eosina (H&E). (A,B) Morfología macroscópica representativa de los cocultivos en el día 50; Las flechas apuntan a los sitios de crecimiento de las células de cáncer de ovario mCherry+. (C,D) Tinción representativa de H&E de cocultivos en el día 50. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Utilizando este protocolo, se desarrolló un modelo preclínico de carcinomatosis peritoneal para el cáncer de ovario utilizando una combinación de técnicas básicas in vitro y ex vivo. Se observó un crecimiento tumoral progresivo a lo largo de 50 días de cocultivo después de sembrar muestras de epiplón con células de cáncer de ovario humano mCherry+ OCSC1-F2. Este método fue desarrollado y optimizado a través de varios ensayos experimentales utilizando diferentes especímenes de epiplón. El crecimiento exitoso del tumor dependía de la calidad del epiplón, la viabilidad de las células cancerosas y la eficacia de la inyección. En este informe, solo utilizamos las células mCherry+ OCSC1-F2 y las líneas de cáncer de ovario humano mCherry+ R182 previamente reportadas en varias publicaciones 12,15,16,17,18,19,20,21,22. Utilizando estas dos líneas celulares con diferentes tiempos de duplicación (16 h para OCSC1-F2 y 36 h para R182), se observó una diferencia en el tiempo para lograr el crecimiento logarítmico dentro del tejido omental. Sin embargo, tuvimos éxito en el establecimiento de ambas líneas celulares en el sistema de cocultivo.
La comunicación eficiente entre los investigadores, los coordinadores de investigación y los equipos quirúrgicos fue fundamental para la recolección y el procesamiento de las muestras de epiplón. El investigador identificó a los candidatos al protocolo, los coordinadores de la investigación obtuvieron el consentimiento de los pacientes antes de la cirugía y el investigador recogió las muestras del quirófano. Dado este flujo de trabajo, el cronograma del investigador tuvo que ser flexible, ya que muchos factores del lado del paciente que afectaban la recolección eran impredecibles (p. ej., cirugía cancelada, hora de la cirugía cambiada, epiplón inadecuado o no extirpado). La visualización directa y la selección de tejidos desde el quirófano garantizaron la integridad de las muestras, la esterilidad quirúrgica y el procesamiento oportuno. Inicialmente, la recolección de especímenes se delegó a los coordinadores de investigación; Sin embargo, después de recolectar algunas muestras, notamos que el tiempo de procesamiento se retrasó (es decir, >4 h) y la calidad del epiplón fue muy inferior (p. ej., el tejido estaba en trozos). En un ensayo experimental, el tejido del epiplón se almacenó a 4 °C durante 48 h antes de la inyección porque las células cancerosas no estaban listas a tiempo. Todavía se observó un crecimiento tumoral similar, pero esta secuencia no se repitió, ya que se sabe que los cambios de temperatura afectan el microambiente tumoral (TME).
Antes de la recolección de la muestra, era importante tener suficientes células cancerosas confluentes de acuerdo con el cronograma de la cirugía. Debido a que el número de especímenes recolectados cada mes variaba, no siempre se mantuvieron cultivos activos de células de cáncer de ovario. Las células congeladas se descongelaron con al menos 1 semana de antelación, se sembraron siguiendo un protocolo estándar y luego se pasaron las células al menos una vez para garantizar la viabilidad. Las líneas celulares utilizadas en este protocolo fueron relativamente resistentes; Sin embargo, todavía encontramos casos en los que las células no se habían recuperado el día de la cirugía y no se podían inyectar. En este estudio, no hubo ningún intento de inyectar células cancerosas que tuvieran menos del 50 % de confluentes. Los retrasos posteriores relacionados con la preparación de las células se mitigaron mediante el uso de una buena técnica estéril y la división de las células en proporciones para mantener la confluencia en función del programa de recolección de muestras previsto. Limitamos el protocolo a solo dos líneas celulares cancerosas marcadas con fluorescencia, pero es importante tener en cuenta que también se podrían utilizar otras líneas celulares cancerosas establecidas o células cancerosas primarias sin proteínas fluorescentes.
Por último, la tasa de crecimiento tumoral se correlacionó con la confluencia de células cancerosas adyacentes y dentro de los adipocitos inmediatamente después de la inyección. Esto se determinó tomando imágenes fluorescentes de todos los especímenes de epiplón después de la inyección. En comparación con la inoculación de células tumorales de órganos sólidos o tejidos subcutáneos, la inyección de células cancerosas en el tejido del epiplón fue más difícil. La estructura suelta y la consistencia grasa del epiplón impiden que el tejido retenga eficazmente los volúmenes de suspensión celular sin fugas. Cuando se utilizó una aguja más pequeña (es decir, de 30 G o más estrecha) para inyectar, hubo preocupación por la fragmentación celular a medida que disminuía la proliferación celular. Probamos varias técnicas de inyección, números de células y volúmenes de suspensión celular y encontramos resultados consistentes con el protocolo descrito anteriormente. Al mismo tiempo, reconocemos que es probable que tales variaciones en el protocolo produzcan resultados similares dada la naturaleza maligna de las células. La adición de Matrigel facilitó el paso de inyección, ya que la matriz extracelular retuvo mejor la suspensión celular; sin embargo, este método es más costoso y no produjo consistentemente una mayor carga tumoral en las muestras. En general, era raro que alguno de los especímenes de epiplón no desarrollara tumores, pero el número de tumores y la velocidad de crecimiento variaban.
Este modelo simuló una característica distintiva de la tumorigénesis del cáncer de ovario mediante la replicación de metástasis tempranas en tejidos peritoneales ricos en tejido adiposo. Este protocolo permite la variación sin necesidad de habilidad, es fácil de replicar y genera un sistema con potencial valor traslacional. En comparación con los modelos in vitro y ex vivo existentes en cáncer de ovario, el método descrito aquí combina varias técnicas para producir un modelo que conserva la arquitectura tumoral y la EMT durante una larga vida útil. Además, observamos que cuando un espécimen de epiplón con múltiples tumores se transfirió a un nuevo pocillo y se cultivó con epiplón libre de cáncer (es decir, no inyectado), el epiplón naïve se sembró con células cancerosas en un plazo de 7 días. Este hallazgo sugiere que los tumores replicados conservan el potencial metastásico a través de la transición epitelio-mesenquimatoso. No se identificaron modelos similares de cáncer de ovario en la bibliografía que cultivaran biopsias de tejido durante períodos prolongados de tiempo. Este enfoque está respaldado por un hallazgo previo de que las células mesoteliales aisladas del epiplón de ratón podrían cultivarse durante más de 30 pasadas después de la recolección23.
El modelo descrito en este estudio se puede emplear para comprender mejor el efecto de la interacción directa entre las células de cáncer de ovario y las células dentro del epiplón rico en tejido adiposo. Las células cancerosas se pueden disociar de los tejidos del epiplón y obtenerse para el análisis transcriptómico o inmunohistoquímico (IHC). Además, las células se pueden utilizar para estudios de respuesta a fármacos.
Las principales limitaciones de este modelo son que el número de tumores, la tasa de crecimiento tumoral y la ubicación de los tumores eran impredecibles. La falta de estandarización y variación entre las muestras podría limitar la aplicación de este modelo. También hicimos varias observaciones que requerirán un examen más detenido durante el desarrollo de este protocolo. Por ejemplo, las réplicas de "control" en un experimento no estaban realmente libres de cáncer, ya que el paciente fue diagnosticado posteriormente con micrometástasis de epiplón; sin embargo, los tumores no inyectados permanecieron viables durante todo el período experimental. Las aplicaciones futuras de este modelo incluirán estudios moleculares de la EMT durante la tumorigénesis temprana, la manipulación de la EMT mediante la inyección de células inmunitarias y las investigaciones de respuesta a fármacos. En resumen, creemos que el modelo preclínico descrito aquí se sumará al repertorio de herramientas de investigación existentes y ayudará a dilucidar los mecanismos moleculares de la EMT en el cáncer de ovario.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este estudio está financiado en parte por la Fundación Janet Burros Memorial. Agradecemos a las pacientes y al Departamento de Oncología Ginecológica del Instituto Oncológico Karmanos por la recolección de muestras de epiplón. También reconocemos al Biobanco y al Núcleo de Ciencias Correlativas del Instituto Oncológico Karmanos por la coordinación del reclutamiento de pacientes y la preparación de las diapositivas de patología. El Biobanco y el Núcleo de Ciencias Correlativas están financiados en parte por la subvención P30 del Centro de los NIH CA22453 al Instituto de Cáncer Karmanos de la Universidad Estatal de Wayne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | 25300054 | |
| 1 mL Insulin Syringe with 26 G detachable needle | BD | 329652 | |
| 10 mL Serological Pipets | CELLTREAT | 229010B | |
| 100 mm Tissue Culture Dish | Fisherbrand | FB012924 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | CELLTREAT | 229411 | |
| 24 Well Cell Culture Plate | Costar | 3524 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | CELLTREAT | 229421 | |
| 75 cm2 Tissue Culture Flask | CELLTREAT | 229341 | |
| Corning Cell Counter | Corning | 9819000 | |
| Cytation 5 imager | Biotek | ||
| DMEM/F12 (1:1) (1x), +L-Glutamine, +2.438 g/L Sodium Bicarbonate | Gibco | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified | Gibco | 1043028 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | Basement membrane matrix |
| No. 10 Stainless Steel Disposable Scalpel | Integra-Miltex | 4410 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1x) | Gibco | 10010023 | |
| Revolve microscope | Echo |
References
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