ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
כאן אנו מציגים שילוב של הגבלת חולדות יעילה ושיטות ניקור ורידים תת-קרקעיות המאפשרות איסוף דם מהיר, בטוח וחוזר בחולדות ללא הרדמה.
Abstract
ישנן מספר שיטות מבוססות לקבלת דגימות דם חוזרות מחולדות, כאשר השיטות הנפוצות ביותר הן דגימת ורידים צידיים בזנב ללא הרדמה ודגימת ורידים ג'וגולריים בהרדמה. עם זאת, רוב השיטות הללו דורשות סיוע וציוד הרדמה ולעיתים מציבות קשיים מבחינת איסוף הדם או האיכות הירודה של דגימות הדם. בנוסף, שיטות איסוף דם אלה גוזלות זמן ומשאבי אנוש משמעותיים כאשר נדרשת דגימת דם חוזרת למספר רב של חולדות. מחקר זה מציג טכניקה לדגימת דם חוזרת בחולדות לא מורדמות על ידי אדם מיומן יחיד. דגימות דם משביעות רצון מאוד ניתן להשיג על ידי ניקוב הווריד subclavian. השיטה הדגימה שיעור הצלחה כולל מרשים של 95%, עם זמן חציוני של 2 דקות בלבד מריסון החולדות ועד להשלמת איסוף הדם. יתר על כן, ביצוע איסוף דם רצוף בטווח המיועד אינו גורם נזק לחולדות. שיטה זו שווה לקדם לאיסוף הדם, במיוחד במחקרים פרמקוקינטיים בקנה מידה גדול.
Introduction
חולדות הן אחת מחיות הניסוי הנפוצות ביותר, וישנן דרכים רבות להשיג דגימות דם. עבור ניסויים הכוללים איסוף דם יחיד בשלב הסיום, כמות מספקת של דם ניתן להשיג באמצעות ניקוב לב או איסוף דם אבי העורקים הבטני1. עם זאת, מחקרים מסוימים דורשים איסוף דם חוזר מחולדות לצורך בדיקת דם שגרתית או ביוכימית, במיוחד במחקרי פרמקוקינטיקה וטוקסיקולוגיה, שבהם נדרשת איסוף דם חוזר כדי לקבוע את הספיגה, ההפצה והמטבוליזם של תרופות2.
כיום, למרות שאיסוף דם וורידי זנב היא השיטה הנפוצה ביותר לדגימת דם מחולדות, למרות שאינה דורשת הרדמה, שיטה זו יכולה להיות מאתגרת לאיסוף חוזר, ונפח הדם שנאסף קטן יחסית 3,4. בנוסף, למרות שניתן לאסוף דם מהוורידים הספנוס והפין , כמות הדם המתקבלת מוגבלת, והרדמה נדרשת 1,5. יתר על כן, דגימות דם שנאספו ממקלעת הוורידים התת-לסתית, כמו גם ורידים תת-לשוניים, ג'וגולריים וסובקלאביים מספקים דגימות באיכות גבוהה יותר, אך בדרך כלל דורשים הרדמה או סיוע של מספר אנשים 1,6,7,8,9. לבסוף, איסוף דם רטרו-אורביטלי בסינוסים/תעלה לא רק מצריך הרדמה, אלא גם עלול לגרום לפציעה ולחץ לחולדות9.
איכות דגימות הדם המתקבלות בדרך כלל מוורידים ראשיים היא בדרך כלל ברמה הגבוהה ביותר1. כיום, מחקרים מסוימים מצאו כי מיקרו-דגימה רציפה דרך הווריד הצווארי היא שיטה מתאימה מאוד למחקר טוקסיקולוגי בחולדות, אם כי שיטה זו דורשת בדרך כלל צנתור ורידים ג'וגולרי 10,11,12. לכן, כדאי לבחון כיצד להשיג דגימות דם באיכות גבוהה בהתאם לעיקרון 3R של מחקר בבעלי חיים ללא התערבות כירורגית. מטרת המחקר הייתה להציג שיטה לשאיבה יעילה של דם מהווריד הסובקלאבי בחולדות. טכניקה זו מאפשרת איסוף מהיר של דגימות משביעות רצון באמצעות הליך של אדם אחד ללא צורך בהרדמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקר זה דבק בהנחיות המפורטות במהדורה השמינית של המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה13. המחקר קיבל אישור מוועדת האתיקה של בית החולים השני של אוניברסיטת לאנז'ו ותועד בהתאם להנחיות ARRIVE 2.014. 12-16 חולדות וויסטאר בריאות (שישה זכרים במשקל 290-330 גרם ושש נקבות במשקל 250-280 גרם) בגילאי 12-16 שבועות שוכנו במעבדת בעלי החיים GLP באוניברסיטת לאנז'ו במשך 3 ימים לפני הניסוי בפועל. כלובי החולדות בהם נעשה שימוש היו מסוג R5, בגודל 545 מ"מ x 395 מ"מ x 200 מ"מ, וצוידו בחומר מצע אוטוקלאבי. לכל החולדות ניתנה גישה בלתי מוגבלת הן למזון והן למים. המעבדה שמרה על לחות ממוצעת של 25%, טמפרטורה ממוצעת של 24 מעלות צלזיוס ומחזור אור לסירוגין בין היום ללילה (7:00 בבוקר/19:00). בסיום המחקר, כל בעלי החיים עברו המתת חסד הומנית באמצעות מנת יתר של איזופלורן. למידע מקיף על החומרים והמכשירים בהם נעשה שימוש במחקר זה, עיין בטבלת החומרים.
1. חישוב גודל מדגם ובחירת בעלי חיים
- בחר את משוואת המשאבים בשיטה15 כדי להעריך את גודל מדגם בעלי החיים באמצעות משוואה (1).
E = המספר הכולל של בעלי חיים − מספר כולל של קבוצות (1)
כאשר E היא מידת חופש הניתוח של השונות (ANOVA) ונעה בין 10 ל -20.
הערה: במחקר זה, 12 בעלי חיים חולקו לשתי קבוצות A ו - B (שלושה זכרים ושלוש נקבות בכל קבוצה). - הגדר את התוצאה העיקרית של מחקר זה כשיעור ההצלחה וצריכת הזמן של דגימת דם חוזרת על ידי אדם יחיד.
- הגדירו את מדדי התוצאה המשניים כשינויים במשקל גוף החולדה, צריכת מזון ומים, וכן שכיחות תופעות לוואי (כגון שברים בעצם הבריח, המטומות תת עוריות, דלקת ריאות ותמותה).
- להגדיר דגימת דם מוצלחת כעונה על הקריטריונים הבאים: 1) פחות משלושה נקבים לאיסוף דם יחיד; 2) זמן כולל (מריסון חולדות ועד השלמת איסוף הדם) שלא יעלה על 5 דקות; ו-3) השגת נפח הדם הממוקד תוך קבלת פלזמה שקופה. ראו בכל חריגה מקריטריונים אלה כשל דגימה.
2. ריסון בעלי חיים ואיסוף דם
הערה: דגימות דם מחולדות מקבוצה A ו-B נאספו על ידי שני חוקרים מנוסים, ששניהם לקחו לפחות 100 דגימות דם. דגימות דם נאספו משתי קבוצות החולדות במשך 96 פעמים במשך 4 ימים. שיטת איסוף דם זו אינה דורשת הרדמה או אמצעי ריסון נוספים עבור החולדות. עם זאת, זה דורש טכניקות טיפול מיומנות.
- בשעה 8:00 בבוקר ביום שלפני דגימת הדם (יום 1), הקצו כל חולדה לכלוב האישי שלה בזמן שקילת המזון והמים שלה. לאחר מכן, בקשו מחוקר נוסף, עיוור למדידות, לרשום את משקל החולדות, צריכת המזון וצריכת המים שלהן בכל יום בשעה 8:00 בבוקר מהיום הראשון ואילך.
- כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, תחילה לשאוב דם בשעה 10:00 בבוקר ולאחר מכן בשעה 22:00 בכל יום, לאסוף 0.15 מ"ל של דם לסירוגין מן הוורידים subclavian משני הצדדים.
הערה: כמות הדם שיש לאסוף נקבעה לפי הנפח המרבי שהחולדה בעלת המשקל הנמוך ביותר יכלה לסבול תוך שבוע. - שוטפים מזרק בנתרן הפרין (25 U/mL) ומחטאים את מקום ההזרקה באלכוהול.
- לטפו בעדינות את עורה האחורי של החולדה וצבטו את צווארה שוב ושוב כדי לעזור לחולדה להירגע (סרטון 1).
- בעזרת האגודל והאצבע המורה של היד הלא דומיננטית, אחזו והרימו את עור הצוואר של החולדה בחוזקה (איור 1A ווידאו 1).
- בעזרת קואורדינציה מהיד הדומיננטית, השתמשו בשלוש האצבעות ובכף היד הנותרות כדי לאבטח את העור האחורי של החולדה ולשתק את הגפיים הקדמיות שלה (איור 1B,C ווידיאו 2).
הערה: אם החולדה מתנגדת או נאבקת, ניתן לחזור על הליך זה מספר פעמים כדי לעזור לחולדה להתרגל לטיפול. השלבים הבאים הם המפתח לאיסוף דם מוצלח. - בעזרת האצבע המורה של היד הלא דומיננטית, דחפו בעדינות כלפי מטה את עור ראשה של החולדה בעוד האצבעות האחרות, יחד עם כף היד, מסייעות לסובב כלפי חוץ את מפרק הכתף. במהלך התהליך הזה, השתמשו ביד הדומיננטית כדי להאריך באופן מלא את מפרק הכתף של החולדה (איור 1D-F ווידאו 2).
- אחזו בחולדה בחוזקה ביד הלא דומיננטית כדי ליישר את ראשה וגופה של החולדה בקו ישר (איור 1G,H). לאחר מכן, השתמשו ביד הדומיננטית כדי לאתר את מיקום עצם הבריח ולאשר את מיקום הניקוב (איור 1I, וידאו 2 ווידאו 3).
הערה: גילוח החולדה אינו הכרחי. באיור 1, הגילוח נעשה רק כדי להראות את תנוחת עצם הבריח והניקוב במידה רבה יותר. כאשר מרסנים חולדות, במיוחד חולדות >350 גרם, מתן אפשרות לחולדה להניח את רגליה על משטח מוצק יעזור לתמוך במשקל גופם. בנוסף, על המשנן לעקוב אחר קצב הנשימה של כל חולדה בזמן איסוף הדם כדי לוודא שהריסון אינו הדוק מדי, מה שעלול לגרום למצוקה נשימתית. - החזקת המזרק במקביל לגוף החולדה ביד הדומיננטית, כאשר קצה המחט פונה כלפי מעלה וסולם המזרק לכיוון הנסיין, שומרים על זווית של כ-15 מעלות עם קו האמצע של גוף החולדה. הכניסו את המחט 0.5 ס"מ מתחת לחריץ עצם הבריח (בצומת של השליש הפרוקסימלי של עצם הבריח ועצם החזה), וודאו שהמחט נשארת מקבילה לגוף החולדה (איור 1J ווידאו 3).
הערה: יש להקדיש תשומת לב מיוחדת לזווית ולעומק החדרת המחט כדי למנוע פירסינג בכלי הדם או גרימת נזק בשוגג לכלי דם סמוכים. - משכו מעט בעדינות את המזרק כדי ליצור לחץ שלילי, המלווה לעיתים קרובות בתחושה מוחשית של פריצת דרך עם הכניסה לכלי הדם (בולט במיוחד במהלך איסוף הדם הראשוני). שמרו על תנוחה זו ואספו 0.1-1.0 מ"ל דם במהירות קבועה לפי הצורך (בהתאם להנחיות IACUC של כ-4-5.3 מ"ל/ק"ג דם בשבוע1) (איור 1K ווידאו 3).
- אם אין דם בעת הניקוב, נסה לכוונן בעדינות את הזווית והעומק של המחט או סובב בעדינות את המזרק (וידאו 3). אם שלושה ניסיונות רצופים באותו צד לא צלחו, עצור את כל הדימום ולאחר מכן עבור לצד הנגדי עבור הנקב.
הערה: מומלץ לנקב במהירות דרך העור כדי למנוע מהחולדה להיאבק עקב אי נוחות. - מרחו צמר גפן נגד המוסטאזיס והחזירו את החולדה לכלוב שלה (סרטון 4).
- לעבד את דגימות הדם בהתאם לדרישות הניסוי.
3. עיבוד דגימות דם
- יש להשליך את מחט המזרק למיכל חד. העבר את הדם שנאסף לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל שנשטף בעבר עם הפרין. הכניסו את הצינור לצנטריפוגה, כוונו אותה לטמפרטורה של 4°C ו-1,200 x g, וצנטריפוגה למשך 10 דקות להפרדת פלזמה. מעבירים את הסרום באמצעות פיפטה פסטר 1.0 מ"ל לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה נקי ומאחסנים אותו ב -80 מעלות צלזיוס.
הערה: כדי למנוע המוליזה כתוצאה מלחץ, הסר את קצה המחט בעת הצורך. במהלך שאיפת פלזמה, הימנע ציור תאי דם מתחתית הצינור. לעיתים, פני השטח של המזרק עשויים לאסוף פרוות חולדה; היזהר לא לאפשר כל פרווה להיכנס הצינור, כפי שהוא יכול להוביל קרישה.
4. ניתוח סטטיסטי
- להציג את כל הנתונים כממוצע ± סטיית תקן ולבדוק אותם להומוגניות של שונות.
- השתמש במבחן המדויק של פישר כדי להשוות את שיעורי ההצלחה בין קבוצות.
- השתמש במבחן t עצמאי בן שני מדגמים כדי להשוות את האמצעים הכוללים בין שתי הקבוצות.
- השתמש בניתוח שונות (ANOVA) למדידות רציפות כגון זמן דגימת דם, משקל גוף, צריכת מזון וצריכת מים. ניקח בחשבון את P < 0.05 מובהק סטטיסטית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דגימות פלזמה באיכות גבוהה מציגות גוון, בהירות ושקיפות בצבע צהוב-בהיר, ללא כל גוון אדום או קרישה, כפי שמתואר באיור 2A. איור 2B מראה המוליזה (צד שמאל) או קרישה (צד ימין) כתוצאה מפרוצדורות לא נאותות, בהתאמה. במהלך 96 מפגשי איסוף דם בתוך 4 ימים, זמני איסוף הדם היחידים הממוצעים לקבוצות A ו - B היו 119.87 ± 33.62 שניות ו- 123.28 ±- 30.96 שניות, בהתאמה. לא נמצא הבדל משמעותי בזמני איסוף הדם בין שתי הקבוצות על בסיס יומי (t = 0.66, P = 0.54, טבלה 1). זמני איסוף הדם האישיים הקצרים ביותר היו 78 שניות ו-89 שניות, בהתאמה.
מספר הניסיונות הממוצע הדרוש לאיסוף דם יחיד מוצלח היה 1.21 ו-1.17 בקבוצות A ו-B, בהתאמה. לא היה הבדל משמעותי במספר הניסיונות בין שתי הקבוצות (t = 0.58, P = 0.60, טבלה 2). שיעורי ההצלחה הכוללים היו 93.8% (45/48) ו-95.8% (46/48) בקבוצות A ו-B, בהתאמה, ללא הבדל משמעותי בשיעורי ההצלחה הכוללים בין שתי הקבוצות (P > 0.05, לוח 1). לא היה הבדל משמעותי בזמן איסוף הדם בקבוצה B בכל נקודת זמן. בקבוצה A, זמן איסוף הדם ביום השני היה קצר מזה שביום הרביעי (105.75 ± 14.22 שניות לעומת 144.5 ± 25.45 שניות, t = 12.39, P < 0.01; טבלה 1) . נוסף על כך, יותר ניסיונות וזמני ניקוב ארוכים יותר מצביעים לעתים קרובות על שיעורי כישלון גבוהים יותר (איור 3A-C). ביום השלישי נתקלה קבוצה ב' בכשל אחד המיוחס להמוליזה. ביום הרביעי, קבוצה A נתקלה בשלושה כישלונות: אחד בגלל המוליזה והשניים האחרים בגלל חוסר יכולת להשיג דגימות דם. קבוצה B חוותה גם כישלון אחד עקב חוסר היכולת להשיג דגימת דם.
במהלך 4 ימי תצפית רצופים, שתי קבוצות החולדות הראו עלייה יציבה במשקל. צריכת המים והמזון נותרה קבועה יחסית בקרב חולדות מאותו המין. לאורך כל תהליך איסוף הדם לא היו מקרים של תמותת חולדות, וגם לא נצפו סיבוכים משמעותיים, כמו למשל שברים בעצם הבריח, דלקת ריאות או המטומות של אתרי ניקוב (איור 3D-F וטבלה 3).
איור 1: שיטות קיבוע ואיסוף דם של הווריד הסובקלאבי בחולדות. (A-H) מניפולציה של קיבוע; (I) מיקום עצם הבריח ואתר איסוף הדם; (J-L) תהליך איסוף הדם והמוסטאזיס. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: דגימות דם שנאספו בהצלחה וללא הצלחה. (A) דגימות דם אופייניות ופלזמה מבודדת; (B) דגימות דם המוליזות (משמאל) וקרושות (מימין) לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
תרשים 3: הערכת היעילות והבטיחות של איסוף הדם. (א) זמן איסוף הדם הממוצע ליום; (ב) מספר ממוצע של נקבים ביום; (ג) שיעורי ההצלחה והכישלון של איסוף הדם בשתי הקבוצות; (D-F) שינויים במשקל הגוף, בצריכת המזון ובצריכת המים במהלך איסוף הדם בשתי קבוצות החולדות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: אנטומיה של כלי צוואר של חולדות. (A) מבנים אנטומיים שטחיים; (B) מבנים אנטומיים עמוקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| קבוצה | זמן | זמן איסוף דם ממוצע | |||
| יום 1 | יום 2* | יום 3 | יום 4 | ||
| A | 10:00 AM | 92.83 ± 7.38 | 100.9 ± 17.36 | 117.83 ± 12.02 | 146.6 ± 24.76 |
| 22:00 | 108.67 ± 10.86 | 111.00 ± 6.95 | 158.33 ± 60.47 | 142.40 ± 25.96 | |
| זמן ממוצע | 100.75 ± 12.20 | 105.75 ± 14.22 | 138.08 ± 48.07 | 144.5 ± 25.45 | |
| אחוזי הצלחה | 100% (12/12) | 100% (12/12) | 100% (12/12) | 75% (9/12) | |
| שיעור הצלחה כולל | 93.8% (45/48) | ||||
| זמן ממוצע כולל | 119.87 ± 33.62 | ||||
| B | 10:00 AM | 98.17 ± 7.24 | 110.17 ± 14.33 | 123.67 ± 30.99 | 147.2 ± 17.47 |
| 22:00 | 106.00 ± 14.35 | 126.67 ± 17.12 | 123.17 ± 17.50 | 165.67 ± 49.70 | |
| זמן ממוצע | 102.08 ± 12.02 | 118.42 ± 17.82 | 123.92 ± 25.16 | 157.27 ± 39.63 | |
| אחוזי הצלחה | 100% (12/12) | 100% (12/12) | 91.7% (11/12) | 91.7% (11/12) | |
| שיעור הצלחה כולל | 95.8% (46/48) | ||||
| זמן ממוצע כולל | 123.28 ± 30.96 | ||||
טבלה 1: זמני איסוף הדם ושיעורי ההצלחה של שתי קבוצות החולדות. * זמן איסוף הדם של היום השני היה פחות מזה של היום הרביעי בקבוצה A (t = 12.39 P < 0.01).
| קבוצה | זמן | מספר ממוצע של נקבים | |||
| יום 1 | יום 2 | יום 3 | יום 4 | ||
| A | 10:00 AM | 1 | 1 | 1 | 1.67 |
| 22:00 | 1 | 1 | 1.33 | 1.67 | |
| ממוצע | 1 | 1 | 1.17 | 1.67 | |
| ממוצע כללי | 1.21 | ||||
| B | 10:00 AM | 1 | 1 | 1.17 | 1.5 |
| 22:00 | 1.17 | 1 | 1.17 | 1.33 | |
| ממוצע | 1.08 | 1 | 1.17 | 1.42 | |
| ממוצע כללי | 1.17 | ||||
טבלה 2: מספר ממוצע של נקבים לאיסוף דם בחולדות.
| מין | קבוצה | משקל (גרם) | צריכת מזון (g) | צריכת מים (גרם) | |||||||||
| יום 1 | יום 2 | יום 3 | יום 4 | יום 1 | יום 2 | יום 3 | יום 4 | יום 1 | יום 2 | יום 3 | יום 4 | ||
| ♀ | A | 260 ± 7.5 | 267.7 ± 6.3 | 271 ± 5.4 | 278 ± 6.5 | 13.4 ± 0.79 | 13.5 ± 0.93 | 14.0 ± 0.29 | 14.5 ± 0.77 | 38.5 ± 0.36 | 37.1 ± 0.77 | 39.3 ± 0.70 | 39.6 ± 0.12 |
| B | 262 ± 12.8 | 268.3 ± 14.0 | 272.7 ± 9.4 | 279 ± 7.0 | 13.2 ± 0.45 | 12.4 ± 0.52 | 13.7 ± 0.26 | 23.0 ± 0.56 | 38.6 ± 0.73 | 38.1 ± 0.65 | 39.3 ± 0.91 | 38.8 ± 1.79 | |
| ט/ש | 0.35 | 0.09 | 0.38 | 0.23 | 2.44 | 1.22 | 2.34 | 1.12 | 0.43 | 0.76 | 0.00 | 0.71 | |
| ערך P מתואם | >0.99 | >0.99 | >0.99 | >0.99 | 0.68 | 0.98 | 0.71 | 0.99 | >0.99 | >0.99 | >0.99 | >0.99 | |
| ♂ | A | 313.7 ± 12.0 | 325.7 ± 9.1 | 329 ± 14.2 | 340 ± 15.6 | 15.6 ± 0.64 | 16.1 ± 0.08 | 15.7 ± 0.70 | 15.6 ± 0.73 | 22.2 ± 0.62 | 43.8 ± 0.9 | 43.3 ± 1.0 | 25.3 ± 1.1 |
| B | 311 ± 16.4 | 322.3 ± 18.0 | 330.4 ± 17.6 | 342 ± 17.9 | 15.4 ± 0.74 | 15.7 ± 0.85 | 19.8 ± 0.33 | 19.8 ± 0.86 | 27.6 ± 0.37 | 21.6 ± 1.27 | 44.3 ± 0.76 | 22.2 ± 0.99 | |
| q | 1.50 | 1.88 | 0.94 | 1.13 | 2.34 | 1.85 | 2.10 | 1.97 | 1.90 | 3.57 | 1.24 | 1.82 | |
| ערך P מתואם | 0.94 | 0.86 | >0.99 | 0.99 | 0.71 | 0.87 | 0.79 | 0.83 | 0.86 | 0.33 | 0.98 | 0.88 | |
טבלה 3: שינויים במשקל הגוף היומי, בצריכת המזון ובצריכת המים של חולדות.
סרטון 1: הרגעה וטיפול בחולדות. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.
סרטון 2: נהלי ריסון של חולדות. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.
סרטון 3: הליך איסוף הדם לחולדות. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.
סרטון 4: דחיסה המוסטטית באתר הניקוב. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
למרות שאיסוף דם של ורידים בזנב הוא השיטה הנפוצה ביותר לדגימת דם חוזרת בחולדות, הוא עשוי להיות מושפע מתרופות הרדמה, ובשל גודלו הקטן של וריד הזנב, כמות הדם שניתן לאסוף במקרה אחד מוגבלת, מה שמוביל למשך איסוף דם ארוך יותר 4,5. למרות שמערכות ספקטרומטריית מסה דו-צדדית (MS/MS) בעלות ביצועים גבוהים בשילוב עם מיקרו-דגימה נימית (CMS) של ורידי זנב חולדה יכולות להפחית את כמות הדם המשמשת בחולדות11, לא כל המוסדות מצוידים בציוד יקר זה. דגימת דם מקלעת הרטרובולבר/סינוס גורמת לעיתים קרובות לחרדה וכאב בחולדות, ופעולה לא נכונה עלולה אף לפגוע בראייה ובבריאות של חולדות. לכן, שיטה זו אינה מומלצת לדגימת דם בחולדות9.
הווריד התת-קלאבי ממוקם בין שריר החזה הראשי לשריר הדלטואיד של החולדה ומתנקז לווריד הצוואר בשליש עצם הבריח הפנימית (איור 4). במחקר של יאנג ואחרים, שיעור ההצלחה של איסוף דם מהווריד הסובקלאבי בחולדות תחת הרדמה היה כ -90% על ידי מפעיל מיומן, שהזמן המינימלי שלו מתחילתו ועד סופו של הניקוב היה 65 s7. במחקר של וואנג ועמיתיו, דגימות דם נאספו מהווריד הסובקלבי של החולדה באמצעות גישה אנכית. למרות שהשיטה שלהם לא כללה הרדמה, היא דרשה שיתוף פעולה של שני פרטים כדי להגביל את החולדה6 בצורה בטוחה. פרוטוקול מחקר זה מראה יתרון טוב של איסוף דם. פרוטוקול זה אינו דורש מכשירי ריסון מיוחדים או מתקן הרדמה. עם טיפול נכון, חולדות בדרך כלל מפגינות התנגדות מינימלית. הזמן החציוני מריסון החולדות ועד להשלמת איסוף הדם היה 2 דקות בלבד, והשיג שיעור הצלחה כולל מרשים של 95%. שיטה זו חוסכת משמעותית במשאבי אנוש ומפחיתה את הזמן הנדרש לאיסוף הדם. יתר על כן, דגימות הפלזמה המתקבלות ברורות ושקופות, עם התרחשות מינימלית של המוליזה ואירועי קרישה, ובכך למזער את חזרת הניסוי. מיומנות בטכניקה זו חשובה במיוחד לניהול ניסויים פרמקוקינטיים וטוקסיקולוגיים בקנה מידה גדול של חולדות הדורשים איסוף דם חוזר.
במחקר שלנו, ההתרחשות העיקרית של אי ספיקת דם הייתה ביום הרביעי, מה שעשוי להיות קשור לנזק ורידי שנגרם על ידי ניקובים חוזרים. נקבים חוזרים ונשנים עלולים להוביל לפגיעה בדופן כלי הדם ולעורר תגובה דלקתית, הגורמת לקיר כלי הדם להתעבות ולהתקשות, ואף לגרום להיצרות כלי הדם. אם המוסטזיס אינו מספיק לאחר ניקוב, הדם אקסטרווסציה יכול לגרום עוד בצקת רקמות ודלקת, לאחר מכן מוביל להיווצרות של רקמת צלקת. רקמות צלקת אלו קשות לחדירה ויכולות גם למשוך ולגרום לכלי הדם לשנות את מיקומם, כל אלה מקשים על איתור כלי הדם וניקובם. במחקר שלנו, מזרק 26G (0.45 מ"מ) שימש לאיסוף דם, וזה בסדר יחסית לורידים אנושיים אבל עדיין גורם נזק ניכר לורידי חולדות. עדות לכך היא תחושת החדירה הברורה כאשר המחט עוברת דרך כלי הדם במהלך שאיבת הדם הראשונה, אשר פוחתת ככל שמספר שאיבות הדם עולה, עם זמני איסוף דם ארוכים יותר ושיעורי כישלון גבוהים יותר. לכן, אנו ממליצים להשתמש במחט אינסולין עדינה יותר לאיסוף הדם, ויש להפעיל לחץ מתאים לאחר איסוף הדם כדי למנוע היווצרות המטומה, ויש לבצע שאיבות דם חלופיות כדי לאפשר תיקון ורידי מספיק. מניסיוננו, פלבוטומיסט מיומן היטב יכול להשתמש במחט 26G כדי לשאוב דם מהוורידים התת-קלאביים הדו-צדדיים של אותה חולדה 8-10 פעמים בתוך 24 שעות, עם מרווח ממוצע של 2-3 שעות בין כל שאיבת דם. עם זאת, המספר המרבי של שאיבות דם שחולדה יכולה לסבול, תקופת ההחלמה ומחזור שאיבת הדם עשויים להיות מושפעים ממד המחט שבו נעשה שימוש, מרווחי שאיבת הדם הנדרשים בניסויים שונים ומיומנותו של הפלבוטומיסט. גורמים אלה צריכים להיחקר עוד יותר במחקר עתידי. עבור דגימת דם אינטנסיבית הנדרשת לניסויים פרמקוקינטיקה עדיף לאסוף דם לסירוגין מן הוורידים subclavian שמאל וימין. במקרים בהם הוא באמת אינו זמין, ניתן להשלים שיטות אחרות של איסוף דם.
משקל גוף, צריכת מים וצריכת מזון הם המדדים הבסיסיים והפשוטים ביותר להערכת המצב הבריאותי של חולדות16. מחקר מוקדם הראה כי איסוף דם דרך הווריד הצווארי של פחות מ -0.9 מ"ל ליום לא השפיע על המודינמיקה של חולדות ולא הביא לירידה משמעותית במשקל. עם זאת, כאשר איסוף הדם עולה על 1.5 מ"ל, זה יכול להוביל לירידה במשקל17. במחקר שנערך על ידי Yokoya et al., מיקרו-דגימה חוזרת מווריד הצוואר (50 μL בכל פעם, 6-7x בתוך 24 שעות) לא השפיעה על משקל הגוף של חולדה או על צריכת מזון10. בנוסף, אופן איסוף הדם עשוי להשפיע על משקל הגוף וצריכת המזון של חולדות. במחקר קודם שהשתמש באיסוף דם ורידים תת-לשוני, איסוף של 24 שעות של 0.5-1.0 מ"ל דם ביום הראשון הביא לירידה במשקל הגוף של חולדות ולירידה בצריכת המזון, אם כי הירידה במשקל לא הייתה משמעותית18. במחקר זה, משקל הגוף של החולדות עדיין עלה בהתמדה במהלך תקופת איסוף הדם, ולא היו שינויים משמעותיים בצריכת המזון והמים, סיבוכים הקשורים לאיסוף הדם ומוות של החולדות, מה שמצביע על כך ששיטה זו בטוחה ואמינה.
חשוב להדגיש כי הסתגלות החולדות לתהליך הריסון לפני ביצוע איסוף הדם עשויה להפחית את הלחץ בחולדה ולשפר את אחוזי ההצלחה של איסוף הדם. קיבוע לקוי וחשיפה לא מספקת לורידים עלולים להוביל לכשלים באיסוף הדם ואף לגרום לקרע ורידים מקומי עקב מאבקן של החולדות בכאבים. במקרים קלים יותר, זה יכול לגרום להמטומות תת עוריות בולטות, בעוד במקרים חמורים, זה עלול להוביל למוות חולדות. יתר על כן, קיבוע לקוי עלול להוביל לכך שחולדות יברחו ויגרמו נזק לפרטים. לכן, אנו ממליצים בחום לשלוט בטכניקת הטיפול ביסודיות לפני שממשיכים בהליך איסוף הדם. יתר על כן, חשוב להיות זהירים עם הכוח המופעל על סיבוב כלפי חוץ של מפרק הכתף, שכן לחץ מוגזם עלול להוביל לשברים בעצם הבריח אצל החולדה.
מגבלה של מחקר זה היא שלא הערכנו באופן שיטתי את השינויים בסטרס הנגרמים על ידי שיטת איסוף דם זו בחולדות על ידי מדידת השינויים ברמת הקורטיקוסטרון או על ידי ניטור בצד הכלוב, אשר צריך להיחקר במחקר עתידי. מגבלה נוספת של מאמר זה היא היעדר שיטות איסוף דם חלופיות כבקרה. השוואות עם שיטות איסוף דם אחרות על יתרונותיהן וחסרונותיהן יטופלו במחקר עתידי. בסך הכל, מחקר זה מציג שיטה לאיסוף דם של אדם יחיד מחולדות ללא צורך בהרדמה. גישה זו מציעה אמצעי פשוט, מהיר ובטוח לקבלת דגימות דם מחולדות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין אינטרסים כספיים או לא פיננסיים רלוונטיים לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי Cuiying Plan Project של בית החולים השני של אוניברסיטת Lanzhou (מענק מס '. PR0121015) ומעבדת המפתח המחוזית של גאנסו לחקר מחלות מערכת השתן (מענק מס' 0412D2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.75% normal saline | Gansu Fuzheng Pharmaceutical Technology Co., Ltd. | —— | Prepared heparin sodium solution |
| 1 mL Pasteur pipette | Biosharp | BS-XG-01-NS | Blood collection |
| 1 mL syringe (26 G, 0.45 mm x 12 mm) | Shinva Medical Instrument Co.,Ltd. | 0.45*12RWLB | Blood collection |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Biosharp | BS-15-M | Blood storage and collection |
| 75% medical alcohol | Shandong Lircon Medical Technology Co., Ltd. | —— | Disinfection of rat blood collection site |
| Centrifuge tube holder | Biosharp | BS-05/15-SM60 | —— |
| Electronic scale | Shanghai PUCHUN Measure Instrument Co., Ltd. | JE1002 | Weigh |
| Heparin sodium injection | Hebei Changshan Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd. | —— | Rinse the syringe and EP tube; dilute with normal saline to 25 U/mL |
| Low temperature centrifuge | HuNan Xiang Yi Centrifuge Instrument Co., Ltd. | H1750R | Separation of serum |
References
- UCSF Office of Research Institutional Animal Care and Use Program. Blood collection: The rat IACUC Guideline. , https://iacuc.ucsf.edu/sites/g/files/tkssra751/f/wysiwyg/GUIDELINE%20-%20Blood%20Collection%20-%20Rat.pdf (2022).
- Hattori, N., Takumi, A., Saito, K., Saito, Y. Effects of serial cervical or tail blood sampling on toxicity and toxicokinetic evaluation in rats. The Journal of Toxicological Sciences. 45 (10), 599-609 (2020).
- Liu, X., et al. Modified blood collection from tail veins of non-anesthetized mice with a vacuum blood collection system and eyeglass magnifier. Journal of Visualized Experiments. (144), e65513 (2019).
- Zou, W., et al. Repeated blood collection from tail vein of non-anesthetized rats with a vacuum blood collection system. Journal of Visualized Experiments. (130), e55852 (2017).
- Charlès, L., et al. Modified tail vein and penile vein puncture for blood sampling in the rat model. Journal of Visualized Experiments. (196), e65513 (2023).
- Wang, L., et al. Repetitive blood sampling from the subclavian vein of conscious rat. Journal of Visualized Experiments. (180), e63439 (2022).
- Yang, H., et al. Subclavian vein puncture as an alternative method of blood sample collection in rats. Journal of Visualized Experiments. (141), e58499 (2018).
- Tochitani, T., et al. Effects of microsampling on toxicity assessment of hematotoxic compounds in a general toxicity study in rats. The Journal of Toxicological Sciences. 47 (7), 269-276 (2022).
- Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S., Sørensen, D. B. A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare. Laboratory Animals. 52 (3), 253-264 (2018).
- Yokoyama, H., et al. Lack of toxicological influences by microsampling (50 µL) from jugular vein of rats in a collaborative 28-day study. The Journal of Toxicological Sciences. 45 (6), 319-325 (2020).
- Korfmacher, W., et al. Utility of capillary microsampling for rat pharmacokinetic studies: Comparison of tail-vein bleed to jugular vein cannula sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 76, 7-14 (2015).
- Lu, W., et al. Microsurgical skills of establishing permanent jugular vein cannulation in rats for serial blood sampling of orally administered drug. Journal of Visualized Experiments. (178), e63167 (2021).
- National Research Council of the National Academies, Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th edition, National Research Council, Washington D.C., USA. https://grants.nih.gov/grants/olaw/guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf (2011).
- Perciedu Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: updated guidelines for reporting animal research. The Journal of Physiology. 598 (18), 3793-3801 (2020).
- Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 4 (4), 303-306 (2013).
- Turner, P. V., Pang, D. S., Lofgren, J. L. A review of pain assessment methods in laboratory rodents. Comparative Medicine. 69 (6), 451-467 (2019).
- Kurata, M., Misawa, K., Noguchi, N., Kasuga, Y., Matsumoto, K. Effect of blood collection imitating toxicokinetic study on rat hematological parameters. The Journal of Toxicological Sciences. 22 (3), 231-238 (1997).
- Zeller, W., Weber, H., Panoussis, B., Bürge, T., Bergmann, R. Refinement of blood sampling from the sublingual vein of rats. Laboratory Animals. 32 (4), 369-376 (1998).
Tags
החודש ב-JoVE גיליון 201 חולדה וריד תת-קלאבי דגימת דםErratum
Formal Correction: Erratum: Subclavian Vein Blood Sampling in Conscious Rats
Posted by JoVE Editors on 03/21/2024.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Subclavian Vein Blood Sampling in Conscious Rats. The Discussion section was updated.
The third paragraph in the Discussion section was updated from:
In this study, the failure of blood sampling mainly occurred on day 4, which may be related to repeated punctures causing damage to the veins. During the first blood sampling, there was a noticeable sensation of penetration as the needle pierced the blood vessel. As the number of blood samples increased, this sensation diminished, prolonging blood collection and increasing the failure rate. Therefore, after each blood collection, local pressure hemostasis is necessary to promote vascular repair and prevent local hematoma formation. It is also recommended to try a finer needle, such as an insulin needle, for blood collection. Once puncture fails on one side, the puncture site should be applied with compression and the rat should be allowed to rest for a few minutes before changing to the contralateral side for blood collection. For intensive blood sampling required for pharmacokinetics experiments, it is better to alternately collect blood from the left and right subclavian veins. In cases where it is truly unavailable, other methods of blood collection may be complemented.
to:
In our study, the main occurrence of blood draw failure was on day 4, which might be related to the venous damage caused by repeated punctures. Repeated punctures can lead to damage of the vascular wall and provoke an inflammatory response, causing the vascular wall to thicken and harden, and even induce vascular narrowing. If hemostasis is inadequate after puncture, the extravasated blood can further cause tissue edema and inflammation, subsequently leading to the formation of scar tissue. These scar tissues are tough to penetrate and can also pull and cause blood vessels to shift position, all of which make the blood vessels more difficult to locate and puncture. In our study, a 26G syringe (0.45mm) was used for blood collection, which is fine relative to human veins but still causes considerable damage to rat veins. This is evidenced by the clear sensation of penetration when the needle passes through the vessel during the first blood draw, which diminishes as the number of blood draws increases, with longer blood collection times and higher failure rates. Therefore, we recommend using a finer insulin needle for blood collection, and adequate pressure should be applied after blood collection to prevent hematoma formation, and alternate blood draws should be performed to allow sufficient venous repair. In our experience, a well-trained phlebotomist can use a 26G needle to alternately draw blood from the bilateral subclavian veins of the same rat 8-10 times within 24 hours, with an average interval of 2-3 hours between each blood draw. However, the maximum number of blood draws a rat can tolerate, the recovery period, and the blood draw cycle may be influenced by the needle gauge used, the blood draw intervals required by different experiments, and the proficiency of the phlebotomist. These factors need to be further explored in future research. For intensive blood sampling required for pharmacokinetics experiments, it is better to alternately collect blood from the left and right subclavian veins. In cases where it is truly unavailable, other methods of blood collection may be complemented.
