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Summary
यहाँ हम प्रभावी चूहे प्रतिबंध और subclavian नस पंचर विधियों है कि तेजी से सक्षम का एक संयोजन प्रस्तुत करते हैं, सुरक्षित, और संज्ञाहरण के बिना चूहों में दोहराया रक्त संग्रह.
Abstract
चूहों से बार-बार रक्त के नमूने प्राप्त करने के लिए कई स्थापित तरीके हैं, जिनमें सबसे अधिक नियोजित तरीके संज्ञाहरण के बिना पार्श्व पूंछ नस नमूनाकरण और संज्ञाहरण के साथ जुगुलर नस का नमूना है। हालांकि, इनमें से अधिकांश विधियों में सहायता और संवेदनाहारी उपकरण की आवश्यकता होती है और कभी-कभी रक्त संग्रह या रक्त के नमूनों की खराब गुणवत्ता के मामले में कठिनाइयां पैदा होती हैं। इसके अलावा, रक्त संग्रह के इन तरीकों में महत्वपूर्ण समय और मानव संसाधनों का उपभोग होता है जब बड़ी संख्या में चूहों के लिए बार-बार रक्त के नमूने की आवश्यकता होती है। यह अध्ययन एक एकल कुशल व्यक्ति द्वारा गैर-संवेदनाहारी चूहों में दोहराए जाने वाले रक्त के नमूने के लिए एक तकनीक प्रस्तुत करता है। सबक्लेवियन नस को पंचर करके अत्यधिक संतोषजनक रक्त के नमूने प्राप्त किए जा सकते हैं। विधि रक्त संग्रह के पूरा करने के लिए चूहे संयम से केवल 2 मिनट की एक औसत समय के साथ, 95% की एक प्रभावशाली समग्र सफलता दर का प्रदर्शन किया. इसके अलावा, निर्दिष्ट सीमा के भीतर लगातार रक्त संग्रह करने से चूहों को कोई नुकसान नहीं होता है। यह विधि रक्त संग्रह के लिए प्रचार करने लायक है, विशेष रूप से बड़े पैमाने पर फार्माकोकाइनेटिक अध्ययनों में।
Introduction
चूहे सबसे आम प्रयोगात्मक जानवरों में से एक हैं, और रक्त के नमूने प्राप्त करने के कई तरीके हैं। समापन चरण में एकल रक्त संग्रह से जुड़े प्रयोगों के लिए, हृदय पंचर या उदर महाधमनी रक्त संग्रह1 के माध्यम से पर्याप्त मात्रा में रक्त प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि, कुछ अध्ययनों में नियमित रक्त या जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए चूहों से बार-बार रक्त संग्रह की आवश्यकता होती है, विशेष रूप से फार्माकोकाइनेटिक्स और विष विज्ञान अध्ययनों में,जहां दवाओं के अवशोषण, वितरण और चयापचय को निर्धारित करने के लिए बार-बार रक्त संग्रह की आवश्यकता होती है।
वर्तमान में, हालांकि पूंछ नस रक्त संग्रह चूहों से रक्त के नमूने के लिए सबसे आम तरीका है, संज्ञाहरण की आवश्यकता नहीं होने के बावजूद, इस विधि दोहराया संग्रह के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है, और एकत्र रक्त की मात्रा अपेक्षाकृत छोटे 3,4 है. इसके अतिरिक्त, हालांकि रक्त saphenous और penile नसों से एकत्र किया जा सकता है, प्राप्त रक्त की मात्रा सीमित है, और संज्ञाहरण 1,5 की आवश्यकता है. इसके अलावा, सबमांडिबुलर शिरापरक प्लेक्सस से एकत्र किए गए रक्त के नमूने, साथ ही साथ सब्लिंगुअल, जुगुलर और सबक्लेवियन नसों में उच्च गुणवत्ता वाले नमूने प्रदान करते हैं, लेकिन आमतौर पर संज्ञाहरण या कई व्यक्तियों की सहायता की आवश्यकता होती है 1,6,7,8,9. अंत में, रेट्रो-ऑर्बिटल साइनस/नहर रक्त संग्रह न केवल संज्ञाहरण की आवश्यकता है, लेकिन यह भी संभावित रूप से चूहों 9 के लिए चोट और तनाव पैदा करसकता है.
आमतौर पर प्रमुख नसों से प्राप्त रक्त के नमूनों की गुणवत्ता आम तौर पर उच्चतम मानक1 की होती है। वर्तमान में, कुछ अध्ययनों में पाया गया है कि गले की नस के माध्यम से निरंतर microsampling चूहों में विषैले अनुसंधान के लिए एक बहुत ही उपयुक्त विधि है, हालांकि इस विधि आमतौर पर जुगुलर नस कैथीटेराइजेशन10,11,12की आवश्यकता है. इसलिए, यह पता लगाने योग्य है कि सर्जिकल हस्तक्षेप के बिना पशु अनुसंधान के 3R सिद्धांत के अनुसार उच्च गुणवत्ता वाले रक्त के नमूने कैसे प्राप्त करें। इस अध्ययन का उद्देश्य चूहों में सबक्लेवियन नस से रक्त को कुशलतापूर्वक निकालने के लिए एक विधि प्रस्तुत करना था। यह तकनीक संज्ञाहरण की आवश्यकता के बिना एकल-व्यक्ति प्रक्रिया के माध्यम से संतोषजनक नमूनों के तेजी से संग्रह को सक्षम बनाती है।
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Protocol
इस अध्ययन ने प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड के 8 वें संस्करण में उल्लिखित दिशानिर्देशों का पालन किया13. अनुसंधान लान्चो विश्वविद्यालय दूसरे अस्पताल की आचार समिति से अनुमोदन प्राप्त किया और आगमन दिशा निर्देशों 2.014 के पालन में प्रलेखित किया गया था. बारह स्वस्थ Wistar चूहों (छह वजन 290-330 ग्राम और छह महिलाओं वजन 250-280 ग्राम) 12-16 सप्ताह की आयु वास्तविक प्रयोग से पहले 3 दिनों के लिए Lanzhou विश्वविद्यालय के जीएलपी पशु प्रयोगशाला में समायोजित किया गया. उपयोग किए गए चूहे के पिंजरे R5 प्रकार के थे, जिनकी माप 545 मिमी x 395 मिमी x 200 मिमी थी, और आटोक्लेव बिस्तर सामग्री से सुसज्जित थे। सभी चूहों को भोजन और पानी दोनों के लिए अप्रतिबंधित पहुंच प्रदान की गई थी। प्रयोगशाला ने 25% की औसत आर्द्रता, 24 डिग्री सेल्सियस का औसत तापमान और एक प्रकाश चक्र बनाए रखा जो दिन और रात (7:00 पूर्वाह्न / 7:00 बजे) के बीच वैकल्पिक था। अध्ययन के समापन पर, सभी जानवरों को आइसोफ्लुरेन के ओवरडोज का उपयोग करके मानवीय रूप से इच्छामृत्यु दी गई थी। इस अध्ययन में नियोजित सामग्रियों और उपकरणों के बारे में व्यापक जानकारी के लिए, कृपया सामग्री की तालिका देखें।
1. नमूना आकार गणना और पशु चयन
- समीकरण (1) का उपयोग करके पशु नमूना आकार का अनुमान लगाने के लिए संसाधन समीकरण विधि15 चुनें।
E = जानवरों की कुल संख्या − समूहों की कुल संख्या (1)
जहां ई विचरण (एनोवा) के विश्लेषण की स्वतंत्रता की डिग्री है और 10 से 20 तक है।
नोट: इस अध्ययन में, 12 जानवरों को दो समूहों ए और बी (तीन पुरुषों और प्रति समूह तीन महिलाओं) में विभाजित किया गया था। - इस अध्ययन के प्राथमिक परिणाम को एक व्यक्ति द्वारा बार-बार रक्त के नमूने की सफलता दर और समय की खपत के रूप में परिभाषित करें।
- चूहे के शरीर के वजन, भोजन और पानी के सेवन में परिवर्तन के साथ-साथ प्रतिकूल घटनाओं (जैसे हंसली फ्रैक्चर, चमड़े के नीचे हेमटॉमस, न्यूमोथोरैक्स और मृत्यु दर) की घटनाओं के रूप में माध्यमिक परिणाम उपायों को परिभाषित करें।
- निम्नलिखित मानदंडों को पूरा करने के रूप में सफल रक्त नमूने को परिभाषित करें: i) एकल रक्त संग्रह के लिए तीन से कम पंचर; ii) कुल समय (चूहे के संयम से रक्त संग्रह के पूरा होने तक) 5 मिनट से अधिक नहीं; और iii) स्पष्ट प्लाज्मा प्राप्त करते समय लक्षित रक्त की मात्रा प्राप्त करना। इन मानदंडों से किसी भी विचलन को नमूना विफलता पर विचार करें।
2. पशु संयम और रक्त संग्रह
नोट: समूह ए और बी चूहों से रक्त के नमूने दो अनुभवी शोधकर्ताओं द्वारा एकत्र किए गए थे, जिनमें से दोनों ने कम से कम 100 रक्त नमूने खींचे थे। 4 दिनों के दौरान कुल 96 बार चूहों के दोनों समूहों से रक्त के नमूने एकत्र किए गए थे। इस रक्त संग्रह विधि चूहों के लिए संज्ञाहरण या अतिरिक्त संयम उपकरणों की आवश्यकता नहीं है. हालांकि, इसके लिए निपुण हैंडलिंग तकनीकों की आवश्यकता होती है।
- रक्त के नमूने (दिन 1) से पहले दिन सुबह 8:00 बजे, प्रत्येक चूहे को उसके व्यक्तिगत पिंजरे में सौंपें, जबकि उसके भोजन और पानी का वजन किया जाता है। फिर, एक और शोधकर्ता है, माप के लिए अंधा है, चूहों के वजन, भोजन की खपत, और 1 दिन से हर दिन सुबह 8:00 बजे पानी का सेवन रिकॉर्ड करता है।
- इस प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए, पहले 10:00 AM पर रक्त ड्रा और फिर 10:00 PM प्रत्येक दिन, दोनों पक्षों पर subclavian नसों से वैकल्पिक रूप से रक्त के 0.15 एमएल इकट्ठा.
नोट: एकत्र किए जाने वाले रक्त की मात्रा अधिकतम मात्रा से निर्धारित की गई थी जो सबसे कम वजन वाला चूहा एक सप्ताह के भीतर सहन कर सकता था। - सोडियम हेपरिन (25 यू / एमएल) के साथ एक सिरिंज फ्लश करें और शराब के साथ इंजेक्शन साइट कीटाणुरहित करें।
- धीरे चूहे की पीठ की त्वचा स्ट्रोक और चूहे आराम (1 वीडियो) मदद करने के लिए बार-बार उसकी गर्दन चुटकी.
- गैर प्रमुख हाथ के अंगूठे और तर्जनी का प्रयोग, पकड़ और चूहे की गर्दन की त्वचा मजबूती से (चित्रा 1 ए और वीडियो 1) उठा.
- प्रमुख हाथ से समन्वय के साथ, शेष तीन उंगलियों और गैर प्रमुख हाथ की हथेली का उपयोग करने के लिए चूहे की पीठ की त्वचा सुरक्षित और उसके सामने के अंगों (चित्रा 1 बी, सी और वीडियो 2) स्थिरीकरण.
नोट: यदि चूहा प्रतिरोध करता है या संघर्ष करता है, तो चूहे को हैंडलिंग के आदी होने में मदद करने के लिए इस प्रक्रिया को कई बार दोहराया जा सकता है। सफल रक्त संग्रह के लिए निम्नलिखित कदम महत्वपूर्ण हैं। - गैर-प्रमुख हाथ की तर्जनी का उपयोग करके, चूहे के सिर की त्वचा पर धीरे से नीचे धकेलें, जबकि हथेली के साथ अन्य उंगलियां, कंधे के जोड़ को बाहरी रूप से घुमाने में सहायता करती हैं। इस प्रक्रिया के दौरान, पूरी तरह से चूहे के कंधे के जोड़ (चित्रा 1 डी-एफ और वीडियो 2) का विस्तार करने के लिए प्रमुख हाथ का उपयोग करें।
- चूहे के सिर और शरीर को एक सीधी रेखा में संरेखित करने के लिए गैर-प्रमुख हाथ से चूहे को मजबूती से पकड़ें (चित्र 1G,H)। फिर, हंसली की स्थिति का पता लगाने और पंचर साइट (चित्रा 1I, वीडियो 2, और वीडियो 3) की पुष्टि करने के लिए प्रमुख हाथ का उपयोग करें।
नोट: चूहे शेविंग आवश्यक नहीं है. चित्रा 1 में, शेविंग केवल हंसली और पंचर स्थिति को अधिक हद तक दिखाने के लिए किया गया था। चूहों को रोकते समय, विशेष रूप से चूहों >350 ग्राम, चूहे को ठोस सतह पर अपने पैरों को आराम करने की अनुमति देने से उनके शरीर के वजन का समर्थन करने में मदद मिलेगी। इसके अतिरिक्त, संचालक को रक्त एकत्र करते समय प्रत्येक चूहे की श्वसन दर की निगरानी करनी चाहिए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि संयम बहुत तंग नहीं है, जिससे श्वसन संकट हो सकता है। - प्रमुख हाथ में चूहे के शरीर के समानांतर सिरिंज पकड़े हुए, सुई टिप ऊपर की ओर और प्रयोगकर्ता की ओर सिरिंज पैमाने का सामना करना पड़ के साथ, चूहे के शरीर की midline के साथ एक लगभग 15 डिग्री कोण बनाए रखने. हंसली पायदान (हंसली और उरोस्थि के समीपस्थ तीसरे के जंक्शन पर) के नीचे 0.5 सेमी सुई डालें, सुनिश्चित करें कि सुई चूहे के शरीर (चित्रा 1J और वीडियो 3) के समानांतर रहता है.
नोट: रक्त वाहिका भेदी या आसन्न जहाजों को अनजाने में नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए सुई सम्मिलन के कोण और गहराई पर विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए। - धीरे एक नकारात्मक दबाव बनाने के लिए थोड़ा सिरिंज वापस लेने, अक्सर रक्त वाहिका (विशेष रूप से प्रारंभिक रक्त संग्रह के दौरान उच्चारण) में प्रवेश करने पर सफलता की एक स्पष्ट सनसनी के साथ. इस स्थिति को बनाए रखें और आवश्यकतानुसार स्थिर गति से 0.1-1.0 एमएल रक्त एकत्र करें (प्रति सप्ताहलगभग 4-5.3 एमएल/किलोग्राम रक्त के IACUC दिशानिर्देशों का पालन करते हुए) (चित्र 1K और वीडियो 3)।
- पंचर पर कोई खून नहीं है, तो धीरे कोण और सुई की गहराई को समायोजित करने की कोशिश करें या धीरे सिरिंज (3 वीडियो) बारी बारी से. यदि एक ही तरफ लगातार तीन प्रयास असफल होते हैं, तो सभी रक्तस्राव को रोकें और फिर पंचर के लिए विपरीत दिशा में स्विच करें।
नोट: त्वचा के माध्यम से स्विफ्ट पंचर असुविधा के कारण संघर्ष से चूहे को रोकने के लिए सलाह दी जाती है। - रक्तस्तम्भ के लिए एक कपास झाड़ू लागू करें और अपने पिंजरे (4 वीडियो) के लिए चूहे वापसी.
- प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार रक्त के नमूनों की प्रक्रिया।
3. रक्त नमूना प्रसंस्करण
- एक शार्प कंटेनर में सिरिंज सुई का निपटान। एकत्रित रक्त को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जो पहले हेपरिन के साथ धोया गया था। ट्यूब को एक अपकेंद्रित्र में रखें, इसे 4 डिग्री सेल्सियस और 1,200 x ग्राम पर सेट करें, और प्लाज्मा को अलग करने के लिए 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र करें। एक साफ microcentrifuge ट्यूब में एक 1.0 एमएल पाश्चर विंदुक का उपयोग कर सीरम स्थानांतरण और -80 डिग्री सेल्सियस पर यह दुकान.
नोट: दबाव के कारण हेमोलिसिस को रोकने के लिए, आवश्यक होने पर सुई की नोक को हटा दें। प्लाज्मा आकांक्षा के दौरान, ट्यूब के नीचे से रक्त कोशिकाओं को खींचने से बचें। कभी-कभी, सिरिंज की सतह चूहे के फर को इकट्ठा कर सकती है; ध्यान रखें कि किसी भी फर को ट्यूब में प्रवेश न करने दें, क्योंकि इससे थक्के बन सकते हैं।
4. सांख्यिकीय विश्लेषण
- सभी आँकड़ों को माध्य ± मानक विचलन के रूप में प्रस्तुत करें और विचरण की एकरूपता के लिए उनका परीक्षण करें।
- समूहों के बीच सफलता दर की तुलना करने के लिए फिशर के सटीक परीक्षण का उपयोग करें।
- दो समूहों के बीच समग्र साधनों की तुलना करने के लिए दो-नमूना स्वतंत्र टी-टेस्ट का उपयोग करें।
- रक्त के नमूने के समय, शरीर के वजन, भोजन का सेवन, और पानी की खपत जैसे निरंतर माप के लिए विचरण (एनोवा) के विश्लेषण का उपयोग करें। P < 0.05 सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण पर विचार करें।
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Representative Results
उच्च गुणवत्ता वाले प्लाज्मा नमूने एक हल्के पीले रंग का रंग, स्पष्टता, और पारदर्शिता, किसी भी लाल रंग या थक्के से रहित, चित्रा 2 ए में दर्शाया के रूप में प्रदर्शन. चित्रा 2 बी क्रमशः अनुचित प्रक्रियाओं के परिणामस्वरूप हेमोलिसिस (बाईं ओर) या जमावट (दाईं ओर) दिखाता है। 4 दिनों के भीतर 96 रक्त संग्रह सत्रों के दौरान, समूह A और B के लिए औसत एकल रक्त संग्रह समय क्रमशः 33.62 सेकंड ± 119.87 और 30.96 सेकंड ± 123.28 था। दैनिक आधार पर दो समूहों के बीच रक्त संग्रह के समय में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था (टी = 0.66, पी = 0.54, तालिका 1)। सबसे छोटा व्यक्तिगत रक्त संग्रह समय क्रमशः 78 और 89 एस था।
एक सफल एकल रक्त संग्रह के लिए आवश्यक प्रयासों की औसत संख्या क्रमशः समूह ए और बी के लिए 1.21 और 1.17 थी। दो समूहों (टी = 0.58, पी = 0.60, तालिका 2) के बीच प्रयासों की संख्या में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था। समूह ए और बी के लिए समग्र सफलता दर क्रमशः 93.8% (45/48) और 95.8% (46/48) थी, जिसमें दो समूहों के बीच समग्र सफलता दर में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था (पी > 0.05, तालिका 1)। प्रत्येक समय बिंदु पर समूह बी में रक्त संग्रह के समय में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था। समूह A में, दूसरे दिन रक्त संग्रह का समय चौथे दिन (105.75 ± 14.22 सेकंड बनाम 144.5 ± 25.45 सेकंड, t = 12.39, P < 0.01; तालिका 1) का उपयोग कर सकते हैं इसके अतिरिक्त, अधिक प्रयास और लंबे समय तक पंचर समय अक्सर उच्च विफलता दर(चित्रा 3ए-सी)का संकेत मिलता है. तीसरे दिन, ग्रुप बी को हेमोलिसिस के लिए जिम्मेदार एक विफलता का सामना करना पड़ा। चौथे दिन, ग्रुप ए को तीन विफलताओं का सामना करना पड़ा: एक हेमोलिसिस के कारण और अन्य दो रक्त के नमूने प्राप्त करने में असमर्थता के कारण। समूह बी ने रक्त का नमूना प्राप्त करने में असमर्थता के कारण एक विफलता का भी अनुभव किया।
अवलोकन के लगातार 4 दिनों के दौरान, चूहों के दोनों समूहों ने स्थिर वजन प्रदर्शित किया। एक ही लिंग के चूहों के बीच पानी और भोजन का सेवन अपेक्षाकृत स्थिर रहा। पूरे रक्त संग्रह प्रक्रिया के दौरान, चूहे की मृत्यु दर का कोई उदाहरण नहीं था, न ही हंसली फ्रैक्चर, न्यूमोथोरैक्स, या पंचर साइट हेमटॉमस (चित्रा 3 डी-एफ और तालिका 3) जैसे कोई महत्वपूर्ण जटिलताएं देखी गईं।
चित्रा 1: चूहों में सबक्लेवियन नस के निर्धारण और रक्त संग्रह के तरीके। (ए-एच) निर्धारण का हेरफेर; (I) कॉलरबोन और रक्त संग्रह स्थल का स्थान; (जे-एल) रक्त संग्रह और हेमोस्टेसिस की प्रक्रिया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: सफलतापूर्वक और असफल रूप से रक्त के नमूने एकत्र किए गए। (ए) विशिष्ट रक्त के नमूने और पृथक प्लाज्मा; (बी) हेमोलिज्ड (बाएं) और जमा हुआ (दाएं) रक्त के नमूने कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: रक्त संग्रह की प्रभावशीलता और सुरक्षा का मूल्यांकन। (ए) प्रति दिन रक्त संग्रह का औसत समय; (बी) प्रति दिन पंक्चर की औसत संख्या; (ग) दोनों समूहों में रक्त संग्रह की सफलता और विफलता दर क्या है; (डीएफ) चूहों के दोनों समूहों में रक्त संग्रह के दौरान शरीर के वजन, भोजन का सेवन और पानी के सेवन में परिवर्तन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: चूहे की गर्दन वाहिकाओं की शारीरिक रचना। (ए) सतही शारीरिक संरचनाएं; (बी) गहरी शारीरिक संरचनाएं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| समूह | समय | औसत रक्त संग्रह समय (ओं) | |||
| दिन 1 | दिन 2* | दिन 3 | दिन 4 | ||
| एक | 10:00 पूर्वाह्न | 92.83 ± 7.38 | 100.5 ± 17.36 | 117.83 ± 12.02 | 146.6 ± 24.76 |
| 10:00 अपराह्न | 108.67 ± 10.86 | 111.00 ± 6.95 | 158.33 ± 60.47 | 142.40 ± 25.96 | |
| औसत समय | 100.75 ± 12.20 | 105.75 ± 14.22 | 138.08 ± 48.07 | 144.5 ± 25.45 | |
| सफलता दर | 100% (12/12) | 100% (12/12) | 100% (12/12) | 75% (9/12) | |
| कुल मिलाकर सफलता दर | 93.8% (45/48) | ||||
| कुल मिलाकर औसत समय | 119.87 ± 33.62 | ||||
| जन्म | 10:00 पूर्वाह्न | 98.17 ± 7.24 | 110.17 ± 14.33 | 123.67 ± 30.99 | 147.2 ± 17.47 |
| 10:00 अपराह्न | 106.00 ± 14.35 | 126.67 ± 17.12 | 123.17 ± 17.50 | 165.67 ± 49.70 | |
| औसत समय | 102.08 ± 12.02 | 118.42 ± 17.82 | 123.92 ± 25.16 | 157.27 ± 39.63 | |
| सफलता दर | 100% (12/12) | 100% (12/12) | 91.7% (11/12) | 91.7% (11/12) | |
| कुल मिलाकर सफलता दर | 95.8% (46/48) | ||||
| कुल मिलाकर औसत समय | 123.28 ± 30.96 | ||||
तालिका 1: चूहों के दो समूहों के रक्त संग्रह का समय और सफलता दर। *दूसरे दिन का रक्त संग्रह समय समूह A में चौथे दिन की तुलना में कम था (t = 12.39 P < 0.01)।
| समूह | समय | पंचर की औसत संख्या | |||
| दिन 1 | दिन 2 | दिन 3 | दिन 4 | ||
| एक | 10:00 पूर्वाह्न | 1 | 1 | 1 | 1.67 |
| 10:00 अपराह्न | 1 | 1 | 1.33 | 1.67 | |
| औसत निकालना | 1 | 1 | 1.17 | 1.67 | |
| कुल मिलाकर औसत | 1.21 | ||||
| जन्म | 10:00 पूर्वाह्न | 1 | 1 | 1.17 | 1.5 |
| 10:00 अपराह्न | 1.17 | 1 | 1.17 | 1.33 | |
| औसत निकालना | 1.08 | 1 | 1.17 | 1.42 | |
| कुल मिलाकर औसत | 1.17 | ||||
तालिका 2: चूहों में रक्त संग्रह के लिए पंचर की औसत संख्या।
| लिंग | समूह | वजन (छ) | भोजन का सेवन (छ) | पानी का सेवन (छ) | |||||||||
| दिन 1 | दिन 2 | दिन 3 | दिन 4 | दिन 1 | दिन 2 | दिन 3 | दिन 4 | दिन 1 | दिन 2 | दिन 3 | दिन 4 | ||
| ♀ | एक | 260 ± 7.5 | 267.7 ± 6.3 | 271 ± 5.4 | 278 ± 6.5 | 13.3 ± 0.79 | 13.5 ± 0.93 | 14.0 ± 0.29 | 14.0 ± 0.77 | 23.9 ± 0.36 | 23.1 ± 0.77 | 24.4 ± 0.70 | 24.6 ± 0.12 |
| जन्म | 262 ± 12.8 | 268.3 ± 14.0 | 272.7 ± 9.4 | 279 ± 7.0 | 14.4 ± 0.45 | 13.9 ± 0.52 | 14.7 ± 0.26 | 14.3 ± 0.56 | 23.6 ± 0.73 | 23.7 ± 0.65 | 24.4 ± 0.91 | 24.1 ± 1.79 | |
| टी/क्यू | 0.35 | 0.09 | 0.38 | 0.23 | 2.44 | 1.22 | 2.34 | 1.12 | 0.43 | 0.76 | 0.00 | 0.71 | |
| समायोजित पी मान | >0.99 | >0.99 | >0.99 | >0.99 | 0.68 | 0.98 | 0.71 | 0.99 | >0.99 | >0.99 | >0.99 | >0.99 | |
| ♂ | एक | 313.7 ± 12.0 | 325.7 ± 9.1 | 329 ± 14.2 | 340 ± 15.6 | 15.9 ± 0.64 | 16.2 ± 0.08 | 15.7 ± 0.70 | 15.9 ± 0.73 | 26.2 ± 0.62 | 27.2 ± 0.9 | 26.9 ± 1.0 | 25.3 ± 1.1 |
| जन्म | 311 ± 16.4 | 322.3 ± 18.0 | 330.7 ± 17.6 | 342 ± 16.9 | 15.3 ± 0.74 | 15.7 ± 0.85 | 15.1 ± 0.33 | 15.3 ± 0.86 | 27.1 ± 0.37 | 25.6 ± 1.27 | 27.5 ± 0.76 | 26.2 ± 0.99 | |
| प्रश्न | 1.50 | 1.88 | 0.94 | 1.13 | 2.34 | 1.85 | 2.10 | 1.97 | 1.90 | 3.57 | 1.24 | 1.82 | |
| समायोजित पी मान | 0.94 | 0.86 | >0.99 | 0.99 | 0.71 | 0.87 | 0.79 | 0.83 | 0.86 | 0.33 | 0.98 | 0.88 | |
तालिका 3: चूहों के दैनिक शरीर के वजन, भोजन का सेवन और पानी के सेवन में परिवर्तन।
वीडियो 1: चूहों को शांत करना और संभालना। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
वीडियो 2: चूहों के लिए निरोधक प्रक्रियाएं। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
वीडियो 3: चूहों के लिए रक्त संग्रह प्रक्रिया. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
वीडियो 4: पंचर साइट पर हेमोस्टैटिक संपीड़न। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
हालांकि पूंछ नस रक्त संग्रह चूहों में दोहराया रक्त नमूना के लिए सबसे आम तरीका है, यह संज्ञाहरण दवाओं से प्रभावित हो सकता है, और पूंछ नस के छोटे आकार के कारण, रक्त की मात्रा है कि एक ही उदाहरण में एकत्र किया जा सकता है सीमित है, एक लंबे समय तक रक्त संग्रह अवधि 4,5 के लिए अग्रणी. हालांकि उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) -टेंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस / एमएस) सिस्टम चूहे की पूंछ नसों के केशिका माइक्रोसैंपलिंग (सीएमएस) के साथ संयुक्त चूहों11 में उपयोग किए जाने वाले रक्त की मात्रा को कम कर सकते हैं, सभी संस्थान इस महंगे उपकरण से लैस नहीं हैं। रेट्रोबुलबार प्लेक्सस / साइनस से रक्त का नमूना अक्सर चूहों में चिंता और दर्द का कारण बनता है, और अनुचित संचालन चूहों की दृष्टि और स्वास्थ्य को भी नुकसान पहुंचा सकता है। इसलिए, चूहों9 में रक्त के नमूने के लिए इस विधि की सिफारिश नहीं की है.
सबक्लेवियन नस चूहे के पेक्टोरलिस प्रमुख और डेल्टॉइड मांसपेशी के बीच स्थित होती है और आंतरिक हंसली (चित्रा 4) के एक तिहाई पर जुगुलर नस में जाती है। यांग एट अल द्वारा किए गए अध्ययन में, संज्ञाहरण के तहत चूहों में सबक्लेवियन नस से रक्त संग्रह की सफलता दर एक कुशल ऑपरेटर द्वारा लगभग 90% थी, जिसका पंचर की शुरुआत से अंत तक न्यूनतम समय 65 एस7 था। वांग एट अल के अध्ययन में, एक ऊर्ध्वाधर दृष्टिकोण का उपयोग करके चूहे सबक्लेवियन नस से रक्त के नमूने एकत्र किए गए थे। यद्यपि उनकी विधि में संज्ञाहरण शामिल नहीं था, लेकिन चूहेको सुरक्षित रूप से प्रतिबंधित करने के लिए दो व्यक्तियों के सहयोग की आवश्यकता थी 6. यह अध्ययन प्रोटोकॉल रक्त संग्रह का एक अच्छा लाभ दिखाता है। इस प्रोटोकॉल को किसी विशेष संयम उपकरण या संज्ञाहरण सुविधा की आवश्यकता नहीं है। उचित हैंडलिंग के साथ, चूहे आमतौर पर न्यूनतम प्रतिरोध प्रदर्शित करते हैं। चूहे के संयम से रक्त संग्रह के पूरा होने तक का औसत समय केवल 2 मिनट था, जो 95% की प्रभावशाली समग्र सफलता दर प्राप्त कर रहा था। यह विधि मानव संसाधनों का काफी संरक्षण करती है और रक्त संग्रह के लिए आवश्यक समय को कम करती है। इसके अलावा, प्राप्त प्लाज्मा नमूने स्पष्ट और पारदर्शी हैं, हेमोलिसिस और थक्के की घटनाओं की न्यूनतम घटना के साथ, इस प्रकार प्रयोग पुनरावृत्ति को कम करते हैं। इस तकनीक में प्रवीणता बड़े पैमाने पर चूहे pharmacokinetics और विष विज्ञान प्रयोगों दोहराए जाने रक्त संग्रह की आवश्यकता के प्रबंधन के लिए विशेष रूप से मूल्यवान है.
हमारे अध्ययन में, रक्त ड्रा विफलता की मुख्य घटना 4 दिन थी, जो बार-बार पंचर के कारण शिरापरक क्षति से संबंधित हो सकती है। बार-बार पंचर संवहनी दीवार को नुकसान पहुंचा सकते हैं और एक भड़काऊ प्रतिक्रिया को भड़का सकते हैं, जिससे संवहनी दीवार मोटी और कठोर हो सकती है, और यहां तक कि संवहनी संकुचन भी प्रेरित करती है। यदि पंचर के बाद हेमोस्टेसिस अपर्याप्त है, तो अतिरिक्त रक्त ऊतक शोफ और सूजन का कारण बन सकता है, बाद में निशान ऊतक के गठन के लिए अग्रणी होता है। इन निशान ऊतकों को घुसना कठिन होता है और रक्त वाहिकाओं को स्थिति बदलने के लिए खींच और पैदा कर सकता है, ये सभी रक्त वाहिकाओं को खोजने और पंचर करने में अधिक कठिन बनाते हैं। हमारे अध्ययन में, रक्त संग्रह के लिए एक 26G सिरिंज (0.45 मिमी) का उपयोग किया गया था, जो मानव नसों के सापेक्ष ठीक है लेकिन फिर भी चूहे की नसों को काफी नुकसान पहुंचाता है। यह प्रवेश की स्पष्ट अनुभूति से स्पष्ट होता है जब सुई पहले रक्त ड्रॉ के दौरान पोत से गुजरती है, जो रक्त ड्रॉ की संख्या बढ़ने के साथ कम हो जाती है, लंबे समय तक रक्त संग्रह समय और उच्च विफलता दर के साथ। इसलिए, हम रक्त संग्रह के लिए एक महीन इंसुलिन सुई का उपयोग करने की सलाह देते हैं, और हेमेटोमा गठन को रोकने के लिए रक्त संग्रह के बाद पर्याप्त दबाव लागू किया जाना चाहिए, और पर्याप्त शिरापरक मरम्मत की अनुमति देने के लिए वैकल्पिक रक्त ड्रॉ किया जाना चाहिए। हमारे अनुभव में, एक अच्छी तरह से प्रशिक्षित फ्लेबोटोमिस्ट 24 घंटे के भीतर 8-10 बार एक ही चूहे के द्विपक्षीय सबक्लेवियन नसों से वैकल्पिक रूप से रक्त खींचने के लिए 26G सुई का उपयोग कर सकता है, प्रत्येक रक्त ड्रॉ के बीच 2-3 घंटे के औसत अंतराल के साथ। हालांकि, रक्त ड्रॉ की अधिकतम संख्या एक चूहे को सहन कर सकती है, वसूली अवधि, और रक्त ड्रॉ चक्र का उपयोग सुई गेज से प्रभावित हो सकता है, विभिन्न प्रयोगों द्वारा आवश्यक रक्त ड्रॉ अंतराल और फ्लेबोटोमिस्ट की प्रवीणता। भविष्य के अनुसंधान में इन कारकों का और पता लगाने की आवश्यकता है। फार्माकोकाइनेटिक्स प्रयोगों के लिए आवश्यक गहन रक्त नमूने के लिए, वैकल्पिक रूप से बाएं और दाएं सबक्लेवियन नसों से रक्त एकत्र करना बेहतर होता है। ऐसे मामलों में जहां यह वास्तव में अनुपलब्ध है, रक्त संग्रह के अन्य तरीकों को पूरक किया जा सकता है।
शरीर के वजन, पानी की खपत, और भोजन का सेवन चूहों16 के स्वास्थ्य की स्थिति का आकलन करने के लिए सबसे बुनियादी और सीधा संकेतक हैं. एक प्रारंभिक अध्ययन से पता चला था कि प्रति दिन 0.9 एमएल से कम की गले की नस के माध्यम से रक्त संग्रह चूहों के हेमोडायनामिक्स को प्रभावित नहीं करता था और इसके परिणामस्वरूप कोई महत्वपूर्ण वजन कम नहीं होता था। हालांकि, जब रक्त संग्रह 1.5 एमएल से अधिक हो जाता है, तो यह वजनघटाने 17 का कारण बन सकता है। योकोया एट अल द्वारा अध्ययन में, गले नस (50 माइक्रोन हर बार, 24 घंटे के भीतर 6-7x) से दोहराया microsampling चूहे शरीर के वजन या भोजन का सेवन10 को प्रभावित नहीं किया. इसके अलावा, रक्त संग्रह का तरीका शरीर के वजन और चूहों के भोजन के सेवन को प्रभावित कर सकता है। सब्बलिंगुअल नस रक्त संग्रह का उपयोग करते हुए पिछले अध्ययन में, पहले दिन 0.5-1.0 एमएल रक्त के 24 घंटे संग्रह के परिणामस्वरूप चूहे के शरीर के वजन में कमी आई और भोजन का सेवन कम हो गया, हालांकि वजन घटाने महत्वपूर्ण18 नहीं था। इस अध्ययन में, चूहों के शरीर के वजन अभी भी रक्त संग्रह अवधि के दौरान लगातार वृद्धि हुई है, और वहाँ भोजन और पानी के सेवन, रक्त संग्रह से संबंधित जटिलताओं, और चूहों की मौत में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं थे, यह दर्शाता है कि इस विधि सुरक्षित और विश्वसनीय है.
यह रक्त संग्रह प्रदर्शन करने से पहले संयम प्रक्रिया के लिए चूहों acclimating की संभावना चूहे में तनाव कम हो जाएगा और रक्त संग्रह की सफलता दर में सुधार होगा कि जोर देने के लिए महत्वपूर्ण है. अपर्याप्त निर्धारण और अपर्याप्त नस जोखिम रक्त संग्रह विफलताओं के लिए नेतृत्व कर सकते हैं और यहां तक कि स्थानीय नस टूटना चूहों के कारण कारण ' दर्द में संघर्ष. हल्के मामलों में, इसके परिणामस्वरूप ध्यान देने योग्य चमड़े के नीचे हेमटॉमस हो सकता है, जबकि गंभीर मामलों में, इससे चूहे की मौत हो सकती है। इसके अलावा, खराब निर्धारण से चूहे बच सकते हैं और व्यक्तियों को नुकसान पहुंचा सकते हैं। इसलिए, हम दृढ़ता से रक्त संग्रह प्रक्रिया के साथ आगे बढ़ने से पहले हैंडलिंग तकनीक में महारत हासिल करने की सलाह देते हैं। इसके अलावा, कंधे के जोड़ को बाहरी रूप से घुमाने के लिए लागू बल से सतर्क रहना महत्वपूर्ण है, क्योंकि अत्यधिक दबाव से चूहे में हंसली के फ्रैक्चर हो सकते हैं।
इस अध्ययन की एक सीमा यह है कि हमने कॉर्टिकोस्टेरोन स्तर में परिवर्तन को मापकर या पिंजरे-साइड मॉनिटरिंग द्वारा चूहों में इस रक्त संग्रह विधि द्वारा प्रेरित तनाव में परिवर्तनों का व्यवस्थित रूप से मूल्यांकन नहीं किया, जिसे भविष्य के अनुसंधान में पता लगाने की आवश्यकता है। इस लेख की एक और सीमा नियंत्रण के रूप में वैकल्पिक रक्त संग्रह विधियों की अनुपस्थिति है। उनके फायदे और नुकसान के लिए अन्य रक्त संग्रह विधियों के साथ तुलना भविष्य के अनुसंधान में संबोधित की जाएगी। कुल मिलाकर, यह अध्ययन संज्ञाहरण की आवश्यकता के बिना चूहों से एकल-व्यक्ति रक्त संग्रह के लिए एक विधि का परिचय देता है। यह दृष्टिकोण चूहों से रक्त के नमूने प्राप्त करने का एक सीधा, तेज़ और सुरक्षित साधन प्रदान करता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कोई प्रासंगिक वित्तीय या गैर-वित्तीय हित नहीं हैं।
Acknowledgments
इस अध्ययन को लान्चो विश्वविद्यालय के दूसरे अस्पताल (अनुदान सं। PR0121015) और मूत्र प्रणाली रोग अनुसंधान की गांसु प्रांतीय कुंजी प्रयोगशाला (अनुदान संख्या 0412D2)।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.75% normal saline | Gansu Fuzheng Pharmaceutical Technology Co., Ltd. | —— | Prepared heparin sodium solution |
| 1 mL Pasteur pipette | Biosharp | BS-XG-01-NS | Blood collection |
| 1 mL syringe (26 G, 0.45 mm x 12 mm) | Shinva Medical Instrument Co.,Ltd. | 0.45*12RWLB | Blood collection |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Biosharp | BS-15-M | Blood storage and collection |
| 75% medical alcohol | Shandong Lircon Medical Technology Co., Ltd. | —— | Disinfection of rat blood collection site |
| Centrifuge tube holder | Biosharp | BS-05/15-SM60 | —— |
| Electronic scale | Shanghai PUCHUN Measure Instrument Co., Ltd. | JE1002 | Weigh |
| Heparin sodium injection | Hebei Changshan Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd. | —— | Rinse the syringe and EP tube; dilute with normal saline to 25 U/mL |
| Low temperature centrifuge | HuNan Xiang Yi Centrifuge Instrument Co., Ltd. | H1750R | Separation of serum |
References
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इस महीने में JoVE अंक 201 चूहा सबक्लेवियन नस रक्त का नमूनाErratum
Formal Correction: Erratum: Subclavian Vein Blood Sampling in Conscious Rats
Posted by JoVE Editors on 03/21/2024.
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An erratum was issued for: Subclavian Vein Blood Sampling in Conscious Rats. The Discussion section was updated.
The third paragraph in the Discussion section was updated from:
In this study, the failure of blood sampling mainly occurred on day 4, which may be related to repeated punctures causing damage to the veins. During the first blood sampling, there was a noticeable sensation of penetration as the needle pierced the blood vessel. As the number of blood samples increased, this sensation diminished, prolonging blood collection and increasing the failure rate. Therefore, after each blood collection, local pressure hemostasis is necessary to promote vascular repair and prevent local hematoma formation. It is also recommended to try a finer needle, such as an insulin needle, for blood collection. Once puncture fails on one side, the puncture site should be applied with compression and the rat should be allowed to rest for a few minutes before changing to the contralateral side for blood collection. For intensive blood sampling required for pharmacokinetics experiments, it is better to alternately collect blood from the left and right subclavian veins. In cases where it is truly unavailable, other methods of blood collection may be complemented.
to:
In our study, the main occurrence of blood draw failure was on day 4, which might be related to the venous damage caused by repeated punctures. Repeated punctures can lead to damage of the vascular wall and provoke an inflammatory response, causing the vascular wall to thicken and harden, and even induce vascular narrowing. If hemostasis is inadequate after puncture, the extravasated blood can further cause tissue edema and inflammation, subsequently leading to the formation of scar tissue. These scar tissues are tough to penetrate and can also pull and cause blood vessels to shift position, all of which make the blood vessels more difficult to locate and puncture. In our study, a 26G syringe (0.45mm) was used for blood collection, which is fine relative to human veins but still causes considerable damage to rat veins. This is evidenced by the clear sensation of penetration when the needle passes through the vessel during the first blood draw, which diminishes as the number of blood draws increases, with longer blood collection times and higher failure rates. Therefore, we recommend using a finer insulin needle for blood collection, and adequate pressure should be applied after blood collection to prevent hematoma formation, and alternate blood draws should be performed to allow sufficient venous repair. In our experience, a well-trained phlebotomist can use a 26G needle to alternately draw blood from the bilateral subclavian veins of the same rat 8-10 times within 24 hours, with an average interval of 2-3 hours between each blood draw. However, the maximum number of blood draws a rat can tolerate, the recovery period, and the blood draw cycle may be influenced by the needle gauge used, the blood draw intervals required by different experiments, and the proficiency of the phlebotomist. These factors need to be further explored in future research. For intensive blood sampling required for pharmacokinetics experiments, it is better to alternately collect blood from the left and right subclavian veins. In cases where it is truly unavailable, other methods of blood collection may be complemented.
