ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Her presenterer vi en kombinasjon av effektive rotterestriksjoner og punkteringsmetoder i subklaviske vener som muliggjør rask, sikker og gjentatt blodoppsamling hos rotter uten bedøvelse.
Abstract
Det finnes flere etablerte metoder for å ta gjentatte blodprøver fra rotter, der de mest brukte metodene er lateral prøvetaking av haleårer uten bedøvelse og prøvetaking av halsvene med anestesi. Imidlertid krever de fleste av disse metodene hjelp og bedøvelsesutstyr og utgjør noen ganger vanskeligheter når det gjelder blodinnsamling eller dårlig kvalitet på blodprøver. I tillegg forbruker disse metodene for blodinnsamling betydelig tid og menneskelige ressurser når gjentatt blodprøvetaking er nødvendig for et stort antall rotter. Denne studien presenterer en teknikk for repeterende blodprøvetaking hos ikke-bedøvede rotter av en enkelt dyktig person. Meget tilfredsstillende blodprøver kan tas ved punktering av vena subclavia. Metoden viste en imponerende total suksessrate på 95%, med en mediantid på bare 2 minutter fra rottesikring til fullføring av blodinnsamling. Videre forårsaker det ingen skade på rottene å utføre påfølgende blodsamlinger innenfor det angitte området. Denne metoden er verdt å fremme for blodinnsamling, spesielt i store farmakokinetiske studier.
Introduction
Rotter er et av de vanligste forsøksdyrene, og det er mange måter å få tak i blodprøver på. For eksperimenter som involverer en enkelt blodsamling i sluttfasen, kan en tilstrekkelig mengde blod oppnås gjennom hjertepunktering eller abdominal aorta blodinnsamling1. Noen studier krever imidlertid gjentatt blodinnsamling fra rotter for rutinemessig blod eller biokjemisk analyse, spesielt i farmakokinetikk- og toksikologiske studier, hvor gjentatt blodinnsamling er nødvendig for å bestemme absorpsjon, distribusjon og metabolisme av legemidler.
For tiden, selv om blodinnsamling i halevene er den vanligste metoden for blodprøvetaking fra rotter, til tross for at det ikke krever anestesi, kan denne metoden være utfordrende for gjentatte samlinger, og volumet av blod som samles inn er relativt lite 3,4. I tillegg, selv om blod kan samles fra saphenøse og penile årer, er mengden blod oppnådd begrenset, og anestesi kreves 1,5. Videre gir blodprøver samlet fra submandibulær venøs plexus, samt sublinguale, jugular, og subclavian vener høyere kvalitet prøver, men vanligvis krever anestesi eller hjelp av flere individer 1,6,7,8,9. Endelig krever retro-orbital sinus / kanalblodinnsamling ikke bare anestesi, men kan også potensielt forårsake skade og stress for rotter9.
Kvaliteten på blodprøver som vanligvis oppnås fra store vener er generelt av høyeste standard1. For tiden har noen studier funnet at kontinuerlig mikroprøvetaking gjennom halsvenen er en svært egnet metode for toksikologisk forskning hos rotter, selv om denne metoden vanligvis krever jugularveterisering 10,11,12. Derfor er det verdt å utforske hvordan man får blodprøver av høy kvalitet i samsvar med 3R-prinsippet for dyreforsøk uten kirurgisk inngrep. Hensikten med denne studien var å presentere en metode for effektivt å ekstrahere blod fra vena subclavia hos rotter. Denne teknikken muliggjør rask innsamling av tilfredsstillende prøver gjennom en enkeltpersonsprosedyre uten behov for anestesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien fulgte retningslinjene som er skissert i den 8. utgaven av Veiledning for stell og bruk av forsøksdyr13. Forskningen mottok godkjenning fra etikkomiteen ved Lanzhou University Second Hospital og ble dokumentert i samsvar med The ARRIVE guidelines 2.014. Tolv friske Wistar-rotter (seks hanner som veide 290-330 g og seks hunner som veide 250-280 g) i alderen 12-16 uker ble innkvartert i GLP Animal Laboratory ved Lanzhou University i 3 dager før selve forsøket. Rotteburene som ble brukt var av typen R5, målte 545 mm x 395 mm x 200 mm, og var utstyrt med autoklavert sengetøymateriale. Alle rottene fikk ubegrenset tilgang til både mat og vann. Laboratoriet opprettholdt en gjennomsnittlig luftfuktighet på 25 %, en gjennomsnittstemperatur på 24 °C og en lyssyklus som vekslet mellom dag og natt (kl. 07.00 / 19.00). Ved avslutningen av studien ble alle dyrene humant avlivet ved bruk av en overdose isofluran. For omfattende informasjon om materialer og instrumenter som brukes i denne studien, se materialfortegnelsen.
1. Beregning av prøvestørrelse og valg av dyr
- Velg ressursligningsmetode15 for å estimere dyrets prøvestørrelse ved hjelp av ligning (1).
E = Totalt antall dyr − Totalt antall grupper (1)
Hvor E er graden av frihetsanalyse av varians (ANOVA) og varierer fra 10 til 20.
MERK: I denne studien ble 12 dyr delt inn i to gruppe A og B (tre hanndyr og tre hunner per gruppe). - Definer det primære utfallet av denne studien som suksessrate og tidsforbruk av gjentatt blodprøvetaking av et enkelt individ.
- Definer sekundære utfallsmål som endringer i rottevekt, mat- og vanninntak, samt forekomst av bivirkninger (som kragebenfrakturer, subkutane hematomer, pneumothorax og dødelighet).
- Definer vellykket blodprøvetaking som oppfyller følgende kriterier: i) færre enn tre punkteringer for en enkelt blodsamling; ii) en total tid (fra rottesikring til fullføring av blodoppsamling) som ikke overstiger 5 minutter; og iii) oppnå det målrettede blodvolumet mens du oppnår klart plasma. Vurder ethvert avvik fra disse kriteriene som en prøvetakingsfeil.
2. Dyresikring og blodoppsamling
Blodprøver fra gruppe A - og B-rotter ble samlet inn av to erfarne forskere, som begge hadde tatt minst 100 blodprøver. Blodprøver ble tatt fra begge grupper av rotter totalt 96 ganger i løpet av 4 dager. Denne blodinnsamlingsmetoden krever ikke anestesi eller ekstra fastholdelsesanordninger for rotter. Det krever imidlertid dyktige håndteringsteknikker.
- Klokken 08:00 dagen før blodprøvetaking (dag 1), tilordne hver rotte til sitt individuelle bur mens maten og vannet veies. Deretter har en annen forsker, blindet for målingene, registrere rotternes vekt, matforbruk og vanninntak hver dag klokken 8:00 fra dag 1 og utover.
- For å følge denne protokollen, trekk først blod kl. 10:00 og deretter kl. 10:00 hver dag, og samle 0,15 ml blod vekselvis fra de subklaviske venene på begge sider.
MERK: Mengden blod som skulle samles inn ble bestemt av det maksimale volumet som rotten med lavest vekt kunne tolerere innen en uke. - Skyll en sprøyte med natriumheparin (25 E/ml) og desinfiser injeksjonsstedet med alkohol.
- Stryk forsiktig på rottens bakhud og klyp nakken gjentatte ganger for å hjelpe rotta med å slappe av (Video 1).
- Bruk den ikke-dominante håndens tommel og pekefinger til å gripe og løfte rottens nakkehud fast (figur 1A og Video 1).
- Med koordinering fra den dominerende hånden, bruk de resterende tre fingrene og håndflaten til den ikke-dominerende hånden for å sikre rottens bakhud og immobilisere fremre lemmer (figur 1B, C og Video 2).
MERK: Hvis rotta motstår eller sliter, kan denne prosedyren gjentas flere ganger for å hjelpe rotta til å bli vant til håndteringen. Følgende trinn er nøkkelen til vellykket blodinnsamling. - Bruk den ikke-dominerende håndens pekefinger, trykk forsiktig ned på rottens hodehud mens de andre fingrene, sammen med håndflaten, hjelper til med å rotere skulderleddet utover. Under denne prosessen, bruk den dominerende hånden til å utvide rottens skulderledd helt (figur 1D-F og Video 2).
- Grip rotta fast med den ikke-dominerende hånden for å justere rottens hode og kropp i en rett linje (figur 1G,H). Bruk deretter den dominerende hånden til å finne posisjonen til kragebenet og bekrefte stikkstedet (figur 1I, Video 2 og Video 3).
NOTAT: Barbering av rotta er ikke nødvendig. I figur 1 ble barberingen kun gjort for å vise kragebenet og punkteringsposisjonen i større grad. Når du holder fast rotter, spesielt rotter >350 g, vil det å la rotta hvile føttene på en solid overflate bidra til å støtte kroppsvekten. I tillegg bør fastholderen overvåke respirasjonsfrekvensen til hver rotte mens han samler blod for å sikre at fastholdelsen ikke er for stram, noe som kan forårsake åndedrettsstress. - Ved å holde sprøyten parallelt med rottens kropp i den dominerende hånden, med nålespissen vendt oppover og sprøyteskalaen mot eksperimentøren, opprettholder du en ca. 15° vinkel med midtlinjen på rottens kropp. Sett nålen 0,5 cm under kragebenets hakk (i krysset mellom den proksimale tredjedelen av kragebenet og brystbenet), og pass på at nålen forblir parallell med rottens kropp (figur 1J og video 3).
MERK: Spesiell oppmerksomhet bør rettes mot vinkelen og dybden på nålestikket for å unngå å stikke hull i blodkaret eller forårsake utilsiktet skade på tilstøtende kar. - Trekk sprøyten forsiktig litt ut for å skape et undertrykk, ofte ledsaget av en følbar følelse av gjennombrudd når den kommer inn i blodkaret (spesielt uttalt under den første blodansamlingen). Oppretthold denne posisjonen og samle 0,1-1,0 ml blod med konstant hastighet etter behov (etter IACUC-retningslinjene på ca. 4-5,3 ml / kg blod per uke1) (figur 1K og Video 3).
- Hvis det ikke er blod ved punktering, prøv forsiktig å justere vinkelen og dybden på nålen eller roter sprøyten forsiktig (Video 3). Hvis tre påfølgende forsøk på samme side mislykkes, stopp all blødning og bytt deretter til motsatt side for punkteringen.
NOTAT: Rask punktering gjennom huden anbefales for å forhindre at rotta sliter på grunn av ubehag. - Påfør en bomullspinne for hemostase og returner rotta til buret (Video 4).
- Behandle blodprøver i henhold til eksperimentelle krav.
3. Behandling av blodprøver
- Kast sprøytekanylen i en beholder for skarpe gjenstander. Overfør det oppsamlede blodet til et 1,5 ml mikrosentrifugerør som tidligere er skyllet med heparin. Plasser røret i en sentrifuge, sett det på 4 ° C og 1,200 x g, og sentrifuge i 10 minutter for å skille plasma. Overfør serumet med en 1,0 ml Pasteur-pipette til et rent mikrosentrifugerør og oppbevar det ved -80 °C.
MERK: For å forhindre hemolyse på grunn av trykk, fjern nålespissen når det er nødvendig. Under plasma aspirasjon, unngå å trekke blodceller fra bunnen av røret. Av og til kan overflaten på sprøyten samle; Pass på at du ikke lar pels komme inn i røret, da det kan føre til koagulering.
4. Statistisk analyse
- Presenter alle data som gjennomsnitt ± standardavvik og test dem for homogenitet i variansen.
- Bruk Fishers eksakte test for å sammenligne suksessraten mellom grupper.
- Bruk en uavhengig t-test med to utvalg for å sammenligne det samlede gjennomsnittet mellom de to gruppene.
- Bruk variansanalyse (ANOVA) for kontinuerlige målinger som blodprøvetid, kroppsvekt, matinntak og vannforbruk. Vurder P < 0,05 statistisk signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Plasmaprøver av høy kvalitet viser en blekgul nyanse, klarhet og gjennomsiktighet, uten rødt skjær eller koagulering, som vist i figur 2A. Figur 2B viser hemolyse (venstre side) eller koagulasjon (høyre side) som følge av henholdsvis feilaktige prosedyrer. I løpet av 96 blodinnsamlingsøkter innen 4 dager var gjennomsnittlig innsamlingstid for enkelt blod for gruppe A og B henholdsvis 119,87 ± 33,62 s og 123,28 ± 30,96 s. Det var ingen signifikant forskjell i blodinnsamlingstid mellom de to gruppene daglig (t = 0,66, P = 0,54, tabell 1). De korteste individuelle blodinnsamlingstidene var henholdsvis 78 s og 89 s.
Gjennomsnittlig antall forsøk som kreves for en vellykket enkelt blodinnsamling var 1,21 og 1,17 for henholdsvis gruppe A og B. Det var ingen signifikant forskjell i antall forsøk mellom de to gruppene (t = 0,58, P = 0,60, tabell 2). De samlede suksessratene var 93,8 % (45/48) og 95,8 % (46/48) for henholdsvis gruppe A og B, uten signifikant forskjell i den samlede suksessraten mellom de to gruppene (P > 0,05, tabell 1). Det var ingen signifikant forskjell i tidspunkt for blodinnsamling i gruppe B ved hvert tidspunkt. I gruppe A var blodinnsamlingstiden på den andre dagen mindre enn den på den fjerde dagen (105,75 ± 14,22s vs 144,5 ± 25,45 s, t = 12,39, P < 0,01; Tabell 1) . I tillegg indikerer flere forsøk og lengre punkteringstider ofte høyere feilfrekvens (figur 3A-C). På den tredje dagen opplevde gruppe B en feil som tilskrives hemolyse. På den fjerde dagen opplevde gruppe A tre feil: en på grunn av hemolyse og de to andre på grunn av manglende evne til å skaffe blodprøver. Gruppe B opplevde også en svikt på grunn av manglende evne til å ta blodprøve.
I løpet av 4 påfølgende dager med observasjon viste begge grupper av rotter jevn vektøkning. Vann- og matinntaket holdt seg relativt konstant blant rotter av samme kjønn. Gjennom hele blodinnsamlingsprosessen var det ingen tilfeller av rottedødelighet, og det ble heller ikke observert noen signifikante komplikasjoner, som kragebenfrakturer, pneumothorax eller punkteringsstedhematomer (figur 3D-F og tabell 3).
Figur 1: Fikserings- og blodinnsamlingsmetoder i vena subclavia hos rotter. (A-H) Manipulering av fiksering; (I) plassering av kragebeinet og blodinnsamlingsstedet; (J-L) prosessen med blodoppsamling og hemostase. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Vellykket og mislykket innsamling av blodprøver. (A) Typiske blodprøver og isolert plasma; (B) hemolyserte (venstre) og koagulerte (høyre) blodprøver Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Evaluering av effektiviteten og sikkerheten ved blodinnsamling. (A) Gjennomsnittlig tid for blodinnsamling per dag; (B) gjennomsnittlig antall punkteringer per dag; (C) suksess- og feilfrekvensen av blodinnsamling i begge grupper; (D-F) endringer i kroppsvekt, matinntak og vanninntak under blodinnsamling i begge grupper av rotter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Anatomi av rottehalskar. (A) Overfladiske anatomiske strukturer; (B) dype anatomiske strukturer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Gruppe | Tid | Gjennomsnittlig blodinnsamlingstid (er) | |||
| Dag 1 | Dag 2* | Dag 3 | Dag 4 | ||
| En | 10:00 | 92,83 ± 7,38 | 100,5 ± 17,36 | 117,83 ± 12,02 | 146,6 ± 24,76 |
| 22:00 | 108,67 ± 10,86 | 111.00 ± 6.95 | 158,33 ± 60,47 | 142,40 ± 25,96 | |
| Gjennomsnittlig tid | 100,75 ± 12,20 | 105.75 ± 14.22 | 138,08 ± 48,07 | 144,5 ± 25,45 | |
| Suksessrate | 100% (12/12) | 100% (12/12) | 100% (12/12) | 75% (9/12) | |
| Samlet suksessrate | 93.8% (45/48) | ||||
| Gjennomsnittlig tid totalt | 119,87 ± 33,62 | ||||
| B | 10:00 | 98,17 ± 7,24 | 110.17 ± 14.33 | 123,67 ± 30,99 | 147,2 ± 17,47 |
| 22:00 | 106.00 ± 14.35 | 126,67 ± 17,12 | 123.17 ± 17.50 | 165,67 ± 49,70 | |
| Gjennomsnittlig tid | 102.08 ± 12.02 | 118.42 ± 17.82 | 123,92 ± 25,16 | 157,27 ± 39,63 | |
| Suksessrate | 100% (12/12) | 100% (12/12) | 91.7% (11/12) | 91.7% (11/12) | |
| Samlet suksessrate | 95.8% (46/48) | ||||
| Gjennomsnittlig tid totalt | 123,28 ± 30,96 | ||||
Tabell 1: Blodinnsamlingstider og suksessrate for de to rottegruppene. *Blodinnsamlingstiden den andre dagen var mindre enn den fjerde dagen i gruppe A (t = 12,39 P < 0,01).
| Gruppe | Tid | Gjennomsnittlig antall punkteringer | |||
| Dag 1 | Dag 2 | Dag 3 | Dag 4 | ||
| En | 10:00 | 1 | 1 | 1 | 1.67 |
| 22:00 | 1 | 1 | 1.33 | 1.67 | |
| Gjennomsnitt | 1 | 1 | 1.17 | 1.67 | |
| Samlet gjennomsnitt | 1.21 | ||||
| B | 10:00 | 1 | 1 | 1.17 | 1.5 |
| 22:00 | 1.17 | 1 | 1.17 | 1.33 | |
| Gjennomsnitt | 1.08 | 1 | 1.17 | 1.42 | |
| Samlet gjennomsnitt | 1.17 | ||||
Tabell 2: Gjennomsnittlig antall punkteringer for blodinnsamling hos rotter.
| Kjønn | Gruppe | Vekt (g) | Matinntak (g) | Vanninntak (g) | |||||||||
| Dag 1 | Dag 2 | Dag 3 | Dag 4 | Dag 1 | Dag 2 | Dag 3 | Dag 4 | Dag 1 | Dag 2 | Dag 3 | Dag 4 | ||
| ♀ | En | 260 ± 7,5 | 267,7 ± 6,3 | 271 ± 5.4 | 278 ± 6,5 | 13,3 ± 0,79 | 13,5 ± 0,93 | 14,0 ± 0,29 | 14,0 ± 0,77 | 23,9 ± 0,36 | 23,1 ± 0,77 | 24,4 ± 0,70 | 24,6 ± 0,12 |
| B | 262 ± 12,8 | 268,3 ± 14,0 | 272,7 ± 9,4 | 279 ± 7,0 | 14,4 ± 0,45 | 13,9 ± 0,52 | 14,7 ± 0,26 | 14,3 ± 0,56 | 23,6 ± 0,73 | 23,7 ± 0,65 | 24,4 ± 0,91 | 24,1 ± 1,79 | |
| t/q | 0.35 | 0.09 | 0.38 | 0.23 | 2.44 | 1.22 | 2.34 | 1.12 | 0.43 | 0.76 | 0.00 | 0.71 | |
| Justert P-verdi | >0,99 | >0,99 | >0,99 | >0,99 | 0.68 | 0.98 | 0.71 | 0.99 | >0,99 | >0,99 | >0,99 | >0,99 | |
| ♂ | En | 313,7 ± 12,0 | 325,7 ± 9,1 | 329 ± 14,2 | 340 ± 15,6 | 15,9 ± 0,64 | 16,2 ± 0,08 | 15,7 ± 0,70 | 15,9 ± 0,73 | 26,2 ± 0,62 | 27,2 ± 0,9 | 26,9 ± 1,0 | 25.3 ± 1.1 |
| B | 311 ± 16,4 | 322,3 ± 18,0 | 330,7 ± 17,6 | 342 ± 16,9 | 15,3 ± 0,74 | 15,7 ± 0,85 | 15,1 ± 0,33 | 15,3 ± 0,86 | 27,1 ± 0,37 | 25,6 ± 1,27 | 27,5 ± 0,76 | 26,2 ± 0,99 | |
| q | 1.50 | 1.88 | 0.94 | 1.13 | 2.34 | 1.85 | 2.10 | 1.97 | 1.90 | 3.57 | 1.24 | 1.82 | |
| Justert P-verdi | 0.94 | 0.86 | >0,99 | 0.99 | 0.71 | 0.87 | 0.79 | 0.83 | 0.86 | 0.33 | 0.98 | 0.88 | |
Tabell 3: Endringer i daglig kroppsvekt, matinntak og vanninntak hos rotter.
Video 1: Beroligende og håndtering av rotter. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 2: Fastholdelsesprosedyrer for rotter. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 3: Blodinnsamlingsprosedyren for rotter. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 4: Hemostatisk kompresjon på stikkstedet. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om blodinnsamling i halevene er den vanligste metoden for gjentatt blodprøvetaking hos rotter, kan den påvirkes av anestesimedisiner, og på grunn av den lille størrelsen på halevenen er mengden blod som kan samles inn i et enkelt tilfelle begrenset, noe som fører til en lengre blodinnsamlingsvarighet 4,5. Selv om høyytelsesvæskekromatografi (HPLC) -tandem massespektrometri (MS / MS) -systemer kombinert med kapillær mikrosampling (CMS) av rottehaleårer kan redusere mengden blod som brukes hos rotter11, er ikke alle institusjoner utstyrt med dette dyre utstyret. Blodprøvetaking fra retrobulbar plexus / sinus forårsaker ofte angst og smerte hos rotter, og feil operasjon kan til og med skade synet og helsen til rotter. Derfor anbefales denne metoden ikke for blodprøvetaking hos rotter9.
Vena subclavia ligger mellom vena pectoralis major og deltamuskelen hos rotte og drenerer inn i vena jugularis ved en tredel av det indre kragebenet (figur 4). I studien til Yang et al. var suksessraten for blodinnsamling fra subklavisk vene hos rotter under anestesi ca. 90% av en dyktig operatør, hvis minimumstid fra start til slutt av punkteringen var 65 s7. I Wang et al.s studie ble blodprøver samlet inn fra rotte subclavia vene ved hjelp av en vertikal tilnærming. Selv om metoden deres ikke innebar anestesi, krevde den samarbeid mellom to personer for å begrense rotta6 på en sikker måte. Denne studieprotokollen viser en god fordel med blodinnsamling. Denne protokollen krever ingen spesielle fastholdelsesanordninger eller anestesianlegg. Ved riktig håndtering viser rotter generelt minimal motstand. Mediantiden fra rottesikring til fullføring av blodinnsamling var bare 2 minutter, og oppnådde en imponerende total suksessrate på 95%. Denne metoden sparer menneskelige ressurser betydelig og reduserer tiden som kreves for blodinnsamling. Videre er de oppnådde plasmaprøvene klare og gjennomsiktige, med minimal forekomst av hemolyse og koagulasjonshendelser, og minimerer dermed eksperimentrepetisjon. Ferdigheter i denne teknikken er spesielt verdifull for å håndtere storskala farmakokinetikk og toksikologiske eksperimenter hos rotter som krever repeterende blodoppsamling.
I vår studie var hovedforekomsten av blodtrekkingssvikt dag 4, noe som kan ha sammenheng med veneskaden ved gjentatte punksjoner. Gjentatte punkteringer kan føre til skade på vaskulærveggen og provosere en inflammatorisk respons, noe som får vaskulærveggen til å tykne og herdes, og til og med indusere vaskulær innsnevring. Hvis hemostase er utilstrekkelig etter punktering, kan ekstravasert blod ytterligere forårsake vevsødem og betennelse, noe som senere fører til dannelse av arrvæv. Disse arrvevene er vanskelige å trenge inn i og kan også trekke og føre til at blodårene skifter posisjon, som alle gjør blodkarene vanskeligere å lokalisere og punktere. I vår studie ble en 26G sprøyte (0.45mm) brukt til blodinnsamling, noe som er fint i forhold til menneskelige årer, men fortsatt forårsaker betydelig skade på rotteårer. Dette fremgår av den klare følelsen av penetrasjon når nålen passerer gjennom karet under den første blodtrekkingen, noe som avtar etter hvert som antall blodtrekk øker, med lengre blodinnsamlingstider og høyere feilfrekvenser. Derfor anbefaler vi å bruke en finere insulinnål til blodinnsamling, og tilstrekkelig trykk bør påføres etter blodinnsamling for å forhindre hematomdannelse, og alternativt blodtrekk bør utføres for å tillate tilstrekkelig venøs reparasjon. Vår erfaring er at en veltrent flebotomist kan bruke en 26G nål til vekselvis å trekke blod fra de bilaterale subklaviske venene hos samme rotte 8-10 ganger i løpet av 24 timer, med et gjennomsnittlig intervall på 2-3 timer mellom hver blodtrekking. Imidlertid kan det maksimale antall blodtrekk en rotte kan tolerere, gjenopprettingsperioden, og blodtrekksyklusen kan påvirkes av nålmåleren som brukes, blodtrekkintervallene som kreves av forskjellige eksperimenter og phlebotomistens ferdighet. Disse faktorene må utforskes videre i fremtidig forskning. For intensiv blodprøvetaking som kreves for farmakokinetikkeksperimenter, er det bedre å vekselvis samle blod fra venstre og høyre subklaviske vener. I tilfeller der det er virkelig utilgjengelig, kan andre metoder for blodinnsamling suppleres.
Kroppsvekt, vannforbruk og matinntak er de mest grunnleggende og enkle indikatorene for å vurdere helsestatusen til rotter16. En tidlig studie hadde vist at blodansamling via halsvenen på mindre enn 0,9 ml per dag ikke påvirket hemodynamikken til rotter og ikke resulterte i noe signifikant vekttap. Men når blodsamlingen overstiger 1,5 ml, kan det føre til vekttap17. I studien til Yokoya et al. påvirket ikke gjentatt mikrosampling fra halsvenen (50 μL hver gang, 6-7x innen 24 timer) rottens kroppsvekt eller matinntak10. I tillegg kan måten blodinnsamling påvirker kroppsvekten og matinntaket av rotter. I en tidligere studie ved bruk av sublingual veneblodsamling, resulterte en 24-timers samling av 0,5-1,0 ml blod på den første dagen i en reduksjon i rottekroppsvekt og redusert matinntak, selv om vekttapet ikke var signifikant18. I denne studien økte kroppsvekten til rottene fortsatt jevnt i blodinnsamlingsperioden, og det var ingen signifikante endringer i mat- og vanninntak, blodinnsamlingsrelaterte komplikasjoner og død av rotter, noe som indikerer at denne metoden er trygg og pålitelig.
Det er viktig å understreke at akklimatisering av rottene til fastholdelsesprosessen før blodinnsamling utføres, sannsynligvis vil redusere stress hos rotte og forbedre suksessraten for blodinnsamlingen. Utilstrekkelig fiksering og utilstrekkelig veneeksponering kan føre til blodinnsamlingssvikt og til og med forårsake lokal venebrudd på grunn av rotternes kamp i smerte. I mildere tilfeller kan dette resultere i merkbare subkutane hematomer, mens det i alvorlige tilfeller kan føre til dødsfall hos rotter. Videre kan dårlig fiksering føre til at rotter rømmer og forårsaker skade på enkeltpersoner. Derfor anbefaler vi på det sterkeste å mestre håndteringsteknikken grundig før du fortsetter med blodinnsamlingsprosedyren. Videre er det viktig å være forsiktig med kraften som påføres for å rotere skulderleddet utover, da for høyt trykk kan føre til kragebenbrudd hos rotter.
En begrensning av denne studien er at vi ikke systematisk evaluerte endringene i stress indusert av denne blodinnsamlingsmetoden hos rotter ved å måle endringene i kortikosteronnivå eller ved burovervåking, som må utforskes i fremtidig forskning. En annen begrensning i denne artikkelen er fraværet av alternative blodinnsamlingsmetoder som kontroll. Sammenligninger med andre blodinnsamlingsmetoder for deres fordeler og ulemper vil bli adressert i fremtidig forskning. Alt i alt introduserer denne studien en metode for enkeltpersonsblodinnsamling fra rotter uten behov for anestesi. Denne tilnærmingen gir en enkel, rask og sikker måte å skaffe blodprøver fra rotter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen relevante økonomiske eller ikke-finansielle interesser å opplyse.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av Cuiying Plan Project of Lanzhou University Second Hospital (Grant nr. PR0121015) og Gansu Provincial Key Laboratory of Urinary System Disease Research (Grant No. 0412D2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.75% normal saline | Gansu Fuzheng Pharmaceutical Technology Co., Ltd. | —— | Prepared heparin sodium solution |
| 1 mL Pasteur pipette | Biosharp | BS-XG-01-NS | Blood collection |
| 1 mL syringe (26 G, 0.45 mm x 12 mm) | Shinva Medical Instrument Co.,Ltd. | 0.45*12RWLB | Blood collection |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Biosharp | BS-15-M | Blood storage and collection |
| 75% medical alcohol | Shandong Lircon Medical Technology Co., Ltd. | —— | Disinfection of rat blood collection site |
| Centrifuge tube holder | Biosharp | BS-05/15-SM60 | —— |
| Electronic scale | Shanghai PUCHUN Measure Instrument Co., Ltd. | JE1002 | Weigh |
| Heparin sodium injection | Hebei Changshan Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd. | —— | Rinse the syringe and EP tube; dilute with normal saline to 25 U/mL |
| Low temperature centrifuge | HuNan Xiang Yi Centrifuge Instrument Co., Ltd. | H1750R | Separation of serum |
References
- UCSF Office of Research Institutional Animal Care and Use Program. Blood collection: The rat IACUC Guideline. , https://iacuc.ucsf.edu/sites/g/files/tkssra751/f/wysiwyg/GUIDELINE%20-%20Blood%20Collection%20-%20Rat.pdf (2022).
- Hattori, N., Takumi, A., Saito, K., Saito, Y. Effects of serial cervical or tail blood sampling on toxicity and toxicokinetic evaluation in rats. The Journal of Toxicological Sciences. 45 (10), 599-609 (2020).
- Liu, X., et al. Modified blood collection from tail veins of non-anesthetized mice with a vacuum blood collection system and eyeglass magnifier. Journal of Visualized Experiments. (144), e65513 (2019).
- Zou, W., et al. Repeated blood collection from tail vein of non-anesthetized rats with a vacuum blood collection system. Journal of Visualized Experiments. (130), e55852 (2017).
- Charlès, L., et al. Modified tail vein and penile vein puncture for blood sampling in the rat model. Journal of Visualized Experiments. (196), e65513 (2023).
- Wang, L., et al. Repetitive blood sampling from the subclavian vein of conscious rat. Journal of Visualized Experiments. (180), e63439 (2022).
- Yang, H., et al. Subclavian vein puncture as an alternative method of blood sample collection in rats. Journal of Visualized Experiments. (141), e58499 (2018).
- Tochitani, T., et al. Effects of microsampling on toxicity assessment of hematotoxic compounds in a general toxicity study in rats. The Journal of Toxicological Sciences. 47 (7), 269-276 (2022).
- Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S., Sørensen, D. B. A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare. Laboratory Animals. 52 (3), 253-264 (2018).
- Yokoyama, H., et al. Lack of toxicological influences by microsampling (50 µL) from jugular vein of rats in a collaborative 28-day study. The Journal of Toxicological Sciences. 45 (6), 319-325 (2020).
- Korfmacher, W., et al. Utility of capillary microsampling for rat pharmacokinetic studies: Comparison of tail-vein bleed to jugular vein cannula sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 76, 7-14 (2015).
- Lu, W., et al. Microsurgical skills of establishing permanent jugular vein cannulation in rats for serial blood sampling of orally administered drug. Journal of Visualized Experiments. (178), e63167 (2021).
- National Research Council of the National Academies, Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th edition, National Research Council, Washington D.C., USA. https://grants.nih.gov/grants/olaw/guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf (2011).
- Perciedu Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: updated guidelines for reporting animal research. The Journal of Physiology. 598 (18), 3793-3801 (2020).
- Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 4 (4), 303-306 (2013).
- Turner, P. V., Pang, D. S., Lofgren, J. L. A review of pain assessment methods in laboratory rodents. Comparative Medicine. 69 (6), 451-467 (2019).
- Kurata, M., Misawa, K., Noguchi, N., Kasuga, Y., Matsumoto, K. Effect of blood collection imitating toxicokinetic study on rat hematological parameters. The Journal of Toxicological Sciences. 22 (3), 231-238 (1997).
- Zeller, W., Weber, H., Panoussis, B., Bürge, T., Bergmann, R. Refinement of blood sampling from the sublingual vein of rats. Laboratory Animals. 32 (4), 369-376 (1998).
Tags
Denne måneden i JoVE utgave 201 rotte vena subclavia blodprøvetakingErratum
Formal Correction: Erratum: Subclavian Vein Blood Sampling in Conscious Rats
Posted by JoVE Editors on 03/21/2024.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Subclavian Vein Blood Sampling in Conscious Rats. The Discussion section was updated.
The third paragraph in the Discussion section was updated from:
In this study, the failure of blood sampling mainly occurred on day 4, which may be related to repeated punctures causing damage to the veins. During the first blood sampling, there was a noticeable sensation of penetration as the needle pierced the blood vessel. As the number of blood samples increased, this sensation diminished, prolonging blood collection and increasing the failure rate. Therefore, after each blood collection, local pressure hemostasis is necessary to promote vascular repair and prevent local hematoma formation. It is also recommended to try a finer needle, such as an insulin needle, for blood collection. Once puncture fails on one side, the puncture site should be applied with compression and the rat should be allowed to rest for a few minutes before changing to the contralateral side for blood collection. For intensive blood sampling required for pharmacokinetics experiments, it is better to alternately collect blood from the left and right subclavian veins. In cases where it is truly unavailable, other methods of blood collection may be complemented.
to:
In our study, the main occurrence of blood draw failure was on day 4, which might be related to the venous damage caused by repeated punctures. Repeated punctures can lead to damage of the vascular wall and provoke an inflammatory response, causing the vascular wall to thicken and harden, and even induce vascular narrowing. If hemostasis is inadequate after puncture, the extravasated blood can further cause tissue edema and inflammation, subsequently leading to the formation of scar tissue. These scar tissues are tough to penetrate and can also pull and cause blood vessels to shift position, all of which make the blood vessels more difficult to locate and puncture. In our study, a 26G syringe (0.45mm) was used for blood collection, which is fine relative to human veins but still causes considerable damage to rat veins. This is evidenced by the clear sensation of penetration when the needle passes through the vessel during the first blood draw, which diminishes as the number of blood draws increases, with longer blood collection times and higher failure rates. Therefore, we recommend using a finer insulin needle for blood collection, and adequate pressure should be applied after blood collection to prevent hematoma formation, and alternate blood draws should be performed to allow sufficient venous repair. In our experience, a well-trained phlebotomist can use a 26G needle to alternately draw blood from the bilateral subclavian veins of the same rat 8-10 times within 24 hours, with an average interval of 2-3 hours between each blood draw. However, the maximum number of blood draws a rat can tolerate, the recovery period, and the blood draw cycle may be influenced by the needle gauge used, the blood draw intervals required by different experiments, and the proficiency of the phlebotomist. These factors need to be further explored in future research. For intensive blood sampling required for pharmacokinetics experiments, it is better to alternately collect blood from the left and right subclavian veins. In cases where it is truly unavailable, other methods of blood collection may be complemented.
